CN103202127B

CN103202127B - 破除南方红豆杉种子休眠的方法

Info

Publication number: CN103202127B
Application number: CN201310089480.9A
Authority: CN
Inventors: 张春椿; 熊耀康; 俞冰; 张水利; 李效贤; 蒋剑平
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2013-03-19
Filing date: 2013-03-19
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2033-03-19
Also published as: CN103202127A

Abstract

本发明属于植物种子萌发技术领域，涉及一种破除南方红豆杉种子休眠的方法。它解决了现有技术萌发速度慢，出芽率低等技术问题。本方法包括下述步骤：A.酸蚀处理：将南方红豆杉种子浸泡于质量浓度为55%～65%硫酸的中2～4小时，取出后用流水冲洗12～36小时；B.浸泡处理：将酸蚀后的南方红豆杉种子浸泡于预先配置的混合溶液中至少3小时，取出后在清水中浸泡至少3天；C.层积处理：将浸泡后的南方红豆杉种子进行低温层积处理或变温层积处理。其优点在于：省时、有效、经济地破除休眠方法，以解决其休眠深、萌发难且发芽率低的问题，并为种子种苗市场流通提供标准，保证种子质量，对南方红豆杉的育种栽培发展具有重大的意义。

Description

破除南方红豆杉种子休眠的方法

技术领域

本发明属于植物种子萌发技术领域，尤其是涉及一种破除南方红豆杉种子休眠的方法。

背景技术

南方红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物，广泛分布在欧洲、北美洲及东亚等北半球地区，国内主要分布在我国长江流域及其以南各省。现代研究表明，其主要含有紫杉醇、10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ等紫杉烷类成分，以及少量的黄酮和多糖类等成分。其中，抗癌活性成分紫杉醇可通过抑制肿瘤细胞微管解聚而诱导癌细胞的凋亡，因其独特的抗癌机制和显著的疗效而被用于治疗肺癌、乳腺癌、卵巢癌和食管癌等恶性肿瘤。但紫杉醇在红豆杉属植物中含量普遍很低，其需求量逐年增加，剥皮、挖根、乱采滥伐等对红豆杉属植物的生存造成空前的压力。大量的砍伐不仅对红豆杉属植物的物种保护和地区分布带来威胁，而且也会造成资源的枯竭和物种的灭绝。

南方红豆杉种子具有深休眠，种皮的透性、胚的发育情况、种子的发芽抑制物、温度等影响其萌发，自然条件下需要两冬一夏才能萌发，未经特殊处理的形态成熟种子，一般需一年以上层积催芽方能解除休眠，发芽率低且不整齐，往往造成有限种子资源的极大浪费。南方红豆杉存在完整种皮时，种子处于明显的无氧呼吸状态，而高度缺氧条件下，可导致种子内抑制物的形成，从而影响种子的生理后熟和萌发。种子形态成熟时，胚基本成熟，离体培养可以生长成苗；但外种皮的不透气性和胚中的某些抑制物质可能是抑制南方红豆杉种子萌发的因素。有研究表明南方红豆杉种子中含有的可能具有发芽抑制活性的物质共有27种，有机酸类化合物9种，酯类化合物7种，醇类化合物7种，胺类化合物1种，醚类化合物1种，未知物质2种。种子种皮效应确实为影响南方红豆杉种子萌发的因素之一，主要包括种皮的不透气性和机械障碍。

为此，人们进行了长期的探索，提出了各种各样的解决方案。例如，中国专利文献公开了一种打破南方红豆杉种子休眠的方法[申请号：201110113040.3]，其特征在于利用变温处理南方红豆杉的种子，包括如下步骤：a、浸泡；b、贮藏；c、播种。通过该方法所实现了播种当年出苗率可达30％。第二年还能再出苗50％左右，提高了育苗效率。上述方案虽然在一定程度上提高了南方红豆杉种子萌发速度和萌发率，但是仍然存在着操作较为繁琐，成本较高，发芽率较低等技术问题。还有人发明了一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法[申请号：201210201360.9]，包括：(1)种子外种皮剥离：利用机械破壳，手工剥离外种皮；(2)外植体消毒：依次经70％酒精消毒90s和0.1％氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用；(3)种子预处理：用无菌水密封常温浸种1-5天；(4)分离合子胚；(5)试管苗的离体培养：将种胚接种到试管苗诱导培养基上，可以获得99.9％的种子萌发率。这种方法虽然有效提高了发芽率，但是需要将种子外种皮剥离，显然操作操作，种子外种皮剥离过程中容易导致种胚被损坏，整个过程费时费力。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种易于实施，成本较低，能够有效提高南方红豆杉种子发芽率的破除南方红豆杉种子休眠的方法。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本破除南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，本方法包括下述步骤：

A、酸蚀处理：将南方红豆杉种子浸泡于质量浓度为55％～65％的硫酸中2～4小时，取出后用流水冲洗12～36小时；

B、浸泡处理：将酸蚀后的南方红豆杉种子浸泡于预先配置的含有萌发刺激素和细胞分裂素的混合溶液中至少3小时，取出后在清水中浸泡至少3天；

C、层积处理：将浸泡后的南方红豆杉种子进行低温层积处理或变温层积处理。

硫酸处理在加快胚形态后熟方面具有显著效果，原因在于浓硫酸处理改善种皮透气性，加快营养物质转化；另外浓硫酸处理过程中所释放的短暂热量有可能激活与代谢和呼吸相关的酶，加快种子完成形态发育浓硫酸处理效果明显，但易受种子个体发育差异、处理放热、处理强度以及处理后冲洗状况等因素的影响，使得处理时间难以掌握，过度浸泡有可能腐蚀种子。因此本发明将浓硫酸稀释至质量浓度为55％～65％后再对种子进行酸蚀处理，这样更容易确定酸蚀时间。浓硫酸优化的质量浓度为60％。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，在上述的步骤A中，所述的硫酸的质量浓度为58％-62％，浸泡时间为2.5～3.5小时，流水冲洗时间为20～28小时。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，在上述的步骤B中，所述的混合溶液为外源生长调节剂，该外源生长调节剂包括GA₃溶液、6-BA溶液和爱多收溶液，且外源生长调节剂浸泡时间为20～28小时。

GA₃是一种萌发刺激物质，在种子萌发的过程中，它能诱导产生水解酶，使种子中的贮藏物质从大分子水解为可溶性的小分子，如淀粉水解为糖，蛋白质水解为氨基酸，从而为胚所利用，促进胚的生长和种子的萌发。6-BA属于细胞分裂素类，对植物不同生长过程中起着重要作用，它能促进细胞分裂，打破植物休眠。爱多收有效成份是单硝化愈创木酚钠，是植物细胞赋活剂，能迅速渗透到植物体内，以促进细胞的原生质流动，加快植物发根速度，对植物发根、生长、生殖及结果等发育均有不同程度的促进作用。GA₃、6-BA和爱多收浓度过高或过低均不利于种子发芽。GA₃溶液的浓度过高会抑制胚的生长。爱多收溶液浓度过高或者过低都不利于葫芦种子萌发率的提高。这与爱多收本身的双重作用有关，即低浓度促进种子萌发，而浓度过高时对植物有抑制作用。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，所述的GA₃溶液的质量浓度为180～220mg·L^-1；所述的6-BA溶液的质量浓度为4～6mg·L^-1；所述的爱多收溶液稀释5800～6200倍。爱多收溶液稀释5800～6200倍是指爱多收稀释5800～6200倍。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，所述的GA₃溶液的优化质量浓度为200mg·L^-1；所述的6-BA溶液的优化质量浓度为5mg·L^-1；所述的爱多收溶液优化稀释倍为6000倍。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，在上述的步骤B中，所述的混合溶液为混合营养液，该混合营养液包括GA₃、6-BA、硼酸、柠檬酸、维生素E、维生素D、多效唑、谷氨酸钠、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸铵、KNO₃、PEG，且混合营养液浸泡时间为3.5～4.5小时。

混合营养液中GA₃、6-BA等可调节代谢，诱导种子萌发酶的生成，促进萌发；维生素E、维生素D、谷氨酸钠、甘氨酸等可以在种子萌发过程中提高其所需要的营养成分。KNO₃、PEG等具有渗透调节作用，可以去除种皮和胚中不透气的蜡质；硼酸、柠檬酸、多效唑、吲哚丁酸、硝酸铵等可促进种子萌发。PEG是一种高分子渗压剂，可以提高种子的发芽率、幼苗活力等。钾是植物体内各种重要酶的活化剂，促进糖分运输、转化及氮代谢，激活种子脱氢酶活性和增加呼吸强度，调节溶液水势延缓种子吸水过程，使种子在萌发前有足够的时间进行膜系统修复和重要酶系的活化，改善细胞内环境和代谢状态，从而促进种子萌发。KNO₃渗调处理打破休眠，促进种子萌发有一定的作用。柠檬酸、苹果酸等有机酸可以刺激植物生长，并可以将其作为生长调节物质，在种子萌发的前处理中用有机酸浸种具有有促进种子萌发、打破休眠、提高种子活力的效应。多效唑作为一种植物生长调节物质，多效唑浸种可显著提高决明子幼苗的叶绿素和可溶性糖含量，有利于光合产物的积累，增强幼苗根系活力，提高种子的简易活力指数。对植物种子用少量硼酸处理，不仅能增强作物的抗旱、抗寒、抗病能力，还可以促进种子发芽。吲哚丁酸是人工合成的生长素类植物生长调节剂，对种子萌发和幼苗生长有一定的促进作用。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，所述的混合营养液的质量份数：GA₃为0.8～1.2份、6-BA为1.8～2.2份、硼酸为0.8～1.2份、柠檬酸为0.8～1.2份、维生素E为0.8～1.2份、维生素D为0.8～1.2份、多效唑为1.8～2.2份、谷氨酸钠为3.5～4.5份、甘氨酸为3.5～4.5份、吲哚丁酸为0.8～1.2份、硝酸铵为0.8～1.2份、KNO₃为0.8～1.2份、PEG为4.5～5.5份、余量为水。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，所述的混合营养液的优化质量份数：GA₃为1份、6-BA为2份、硼酸为1份、柠檬酸为1份、维生素E为1份、维生素D为1份、多效唑为2份、谷氨酸钠为4份、甘氨酸为4份、吲哚丁酸为1份、硝酸铵为1份、KNO₃为1份、PEG为5份、余量为水。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，在上述的步骤C中，所述的低温层积处理的温度为2～5℃、沙子湿度为65％～75％、层积时间为42～48天。

在上述的破除南方红豆杉种子休眠的方法中，在上述的步骤C中，所述的变温层积处理过程如下：放置3.5～4.5℃冰箱处理38～42天，每隔4～6天翻动检查一次，保持种子湿润；然后取出，筛掉沙子，薄层阴干，移至20～24℃恒温室沙藏48～52天；最后，3.5～4.5℃低温沙藏28～32天。

与现有的技术相比，本破除南方红豆杉种子休眠的方法的优点在于：省时、有效、经济地破除休眠方法，以解决其休眠深、萌发难且发芽率低的问题，并为种子种苗市场流通提供标准，保证种子质量。将其运用于实际生产栽培中，提高种子资源的利用率，对南方红豆杉的育种栽培发展具有重大的意义。

具体实施方式

本破除南方红豆杉种子休眠的方法包括下述步骤：

在上述的步骤A中，硫酸的质量浓度为58％-62％，浸泡时间为2.5～3.5小时，流水冲洗时间为20～28小时。

在上述的步骤B中，所述的混合溶液为外源生长调节剂，该外源生长调节剂包括GA₃溶液、6-BA溶液和爱多收溶液，且外源生长调节剂浸泡时间为20～28小时。具体地说，GA₃溶液的质量浓度为180～220mg·L^-1；所述的6-BA溶液的质量浓度为4～6mg·L^-1；所述的爱多收溶液稀释5800～6200倍。爱多收溶液稀释5800～6200倍是指爱多收稀释5800～6200倍。其中，GA₃溶液的优化质量浓度为200mg·L^-1；6-BA溶液的优化质量浓度为5mg·L^-1；爱多收溶液优化稀释倍为6000倍。

作为另一种方案，在上述的步骤B中，所述的混合溶液为混合营养液，该混合营养液包括GA₃、6-BA、硼酸、柠檬酸、维生素E、维生素D、多效唑、谷氨酸钠、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸铵、KNO₃、PEG，且混合营养液浸泡时间为3.5～4.5小时。具体地说，混合营养液的质量份数：GA₃为0.8～1.2份、6-BA为1.8～2.2份、硼酸为0.8～1.2份、柠檬酸为0.8～1.2份、维生素E为0.8～1.2份、维生素D为0.8～1.2份、多效唑为1.8～2.2份、谷氨酸钠为3.5～4.5份、甘氨酸为3.5～4.5份、吲哚丁酸为0.8～1.2份、硝酸铵为0.8～1.2份、KNO₃为0.8～1.2份、PEG为4.5～5.5份、余量为水。其中，混合营养液的优化质量份数：GA₃为1份、6-BA为2份、硼酸为1份、柠檬酸为1份、维生素E为1份、维生素D为1份、多效唑为2份、谷氨酸钠为4份、甘氨酸为4份、吲哚丁酸为1份、硝酸铵为1份、KNO₃为1份、PEG为5份、余量为水。

在上述的步骤C中，所述的低温层积处理的温度为2～5℃、沙子湿度为65％～75％、层积时间为42～48天。

作为另一种方案，在上述的步骤C中，所述的变温层积处理过程如下：放置3.5～4.5℃冰箱处理38～42天，每隔4～6天翻动检查一次，保持种子湿润；然后取出，筛掉沙子，薄层阴干，移至20～24℃恒温室沙藏48～52天；最后，3.5～4.5℃低温沙藏28～32天。

实施例1(含对比实施例)：

本实施例所用试剂如下：GA₃:分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110418；6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110505；爱多收：分析纯，旭化学有限公司，批号：20110701；浓硫酸：分析纯，杭州高晶精细化工有限公司，批号：20101009；NaClO：分析纯，杭州高晶精细化工有限公司，批号：20101230；无水乙醇：分析纯，金华市先科化工厂，批号：110404。

①种子选取和处理

选取饱满的南方红豆杉种子，用质量浓度60％浓硫酸浸泡3小时，流水冲洗24小时，分别配制0、50、200、400mg·L^-1的GA₃溶液，0、5、10、20mg·L^-16-BA溶液，将爱多收溶液分别稀释2000、4000、6000倍。

正交实验因素水平表和试验安排表分别见表2-1和表2-2。种子浸泡24小时后，蒸馏水冲洗，然后再将其浸泡于清水中4天。试验重复3次。

表1-1试验因素和水平表

表1-2不同种类和浓度生长调节剂正交试验安排表

②变温层积处理

取经过上述处理的种子沙藏(沙与种子的体积比为3:1)，放置4℃冰箱处理40天，每隔5天翻动检查一次，保持种子湿润。然后取出，筛掉沙子，薄层阴干，用外源生长调节剂浸泡24天，移至23℃恒温室沙藏50天，最后，4℃低温沙藏30天。当然，也可以采用上述的低温层积处理进行处理。

③种子发芽试验

先进行种子消毒，种子发芽条件为：温度25℃，光照16h/黑暗8h，光强80μmol·cm^-2·s^-1。

④观察与记录

5天为一个记录周期，试验共持续120天。如发现种子发芽立即将其取出放入新的培养皿中，作隔离培养。统计不同处理下种子发芽初始时间、发芽率、发芽势。

发芽实验结果

表1-3正交试验各组种子发芽实验结果表：

由表:1-3可知，联合使用植物外源生长调节剂的种子的发芽率及发芽势远远高于未经生长调节剂处理的种子(第1组)，其中第10组南方红豆杉种子发芽率(78.67％)及发芽势(70.00％)最高，远远高于第1组的发芽率及发芽势(33.33％、25.33％)。即200mg·L^-1GA3、5mg·L^-16-BA及稀释6000倍的爱多收联合使用，破除种子休眠效果最好。

实施例2(含对比实施例)：

本实施例所用试剂如下：GA₃:分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110418；6-BA：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110505；维生素D：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110623；维生素E：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110720；吲哚丁酸：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110810；多效唑：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：20111015；L-谷氨酸钠：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110328；甘氨酸：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司，批号：110915；柠檬酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20101117；KNO₃：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20110110；硼酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20101109；硝酸铵：分析纯，天津市登丰化学药品有限公司，批号：2009514；聚乙二醇(PEG)：分析纯，上海浦东高南化工厂，批号：071131；NaClO：分析纯，杭州高晶精细化工有限公司，批号：20101230；无水乙醇：分析纯，金华市先科化工厂，批号：1104041；浓硫酸：分析纯，杭州高晶精细化工有限公司，批号：20101009。

①种子选取和处理

选取饱满的南方红豆杉种子，用质量浓度60％浓硫酸浸泡3小时，流水冲洗24小时，然后用混合营养液浸泡种子4天，在清水中浸泡4天。另以清水中浸泡5天的种子为对照。混合营养液中GA₃、6-BA、硼酸、柠檬酸、维生素E、维生素D、多效唑、谷氨酸钠、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸铵、KNO₃、PEG等按1:2:1:1:1:1:2:4:4:1:1:1:5比例混合。

②变温层积处理

③种子发芽试验

④观察与记录

实验结果

南方红豆杉种子经混合营养液激素处理后，种子发芽率高达81.33％，发芽势为71.33％，远远高于对照种子(33.33％、25.33％)。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims

1.一种破除南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，本方法包括下述步骤：

C、层积处理：将浸泡后的南方红豆杉种子进行低温层积处理或变温层积处理；

在上述的步骤B中，所述的混合溶液为外源生长调节剂，该外源生长调节剂包括GA₃溶液、6-BA溶液和爱多收溶液，且外源生长调节剂浸泡时间为20～28小时；所述的GA₃溶液的质量浓度为180～220mg·L^-1；所述的6-BA溶液的质量浓度为4～6mg·L^-1；所述的爱多收溶液稀释5800～6200倍；

或者，在上述的步骤B中，所述的混合溶液为混合营养液，该混合营养液包括GA₃、6-BA、硼酸、柠檬酸、维生素E、维生素D、多效唑、谷氨酸钠、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸铵、KNO₃、PEG，且混合营养液浸泡时间为3.5～4.5小时；所述的混合营养液的质量份数：GA₃为0.8～1.2份、6-BA为1.8～2.2份、硼酸为0.8～1.2份、柠檬酸为0.8～1.2份、维生素E为0.8～1.2份、维生素D为0.8～1.2份、多效唑为1.8～2.2份、谷氨酸钠为3.5～4.5份、甘氨酸为3.5～4.5份、吲哚丁酸为0.8～1.2份、硝酸铵为0.8～1.2份、KNO₃为0.8～1.2份、PEG为4.5～5.5份、余量为水。

2.根据权利要求1所述的破除南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，在上述的步骤A中，所述的硫酸的质量浓度为58％-62％，浸泡时间为2.5～3.5小时，流水冲洗时间为20～28小时。

3.根据权利要求1所述的破除南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，所述的GA₃溶液的质量浓度为200mg·L^-1；所述的6-BA溶液的质量浓度为5mg·L^-1；所述的爱多收溶液稀释倍为6000倍。

4.根据权利要求1所述的破除南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，所述的混合营养液的质量份数：GA₃为1份、6-BA为2份、硼酸为1份、柠檬酸为1份、维生素E为1份、维生素D为1份、多效唑为2份、谷氨酸钠为4份、甘氨酸为4份、吲哚丁酸为1份、硝酸铵为1份、KNO₃为1份、PEG为5份、余量为水。

5.根据权利要求1所述的破除南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，在上述的步骤C中，所述的低温层积处理的温度为2～5℃、沙子湿度为65％～75％、层积时间为42～48天。

6.根据权利要求1所述的破除南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，在上述的步骤C中，所述的变温层积处理过程如下：放置3.5～4.5℃冰箱处理38～42天，每隔4～6天翻动检查一次，保持种子湿润；然后取出，筛掉沙子，薄层阴干，移至20～24℃恒温室沙藏48～52天；最后，再进行3.5～4.5℃低温沙藏28～32天。