CN108605595A - 一种抑制梨果锈形成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用相关技术抑制果皮木质素合成基因表达，进而抑制果皮果锈形成的方法，属于细胞生物学领域，设计针对木质素合成基因CAD6基因的互补链，用350µM的互补链溶液喷洒果面，在自然条件下完成果实发育。相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：1)使用互补链抑制梨果皮木质素合成基因表达的方法，可以更好了解到缺少木质素对果皮果锈覆盖率的影响，更好的研究木质素对果锈形成的作用机制；2)抑制果皮木质素合成基因表达的方法有反向调控转基因植物木质素生物合成和化学药剂处理，而使用互补链不但可以抑制果皮木质素合成基因表达而且能收到更好的成效。

Description

一种抑制梨果锈形成的方法
技术领域
本发明涉及利用相关技术抑制果皮木质素合成基因表达，进而抑制果皮果锈形成的方法，涉及互补链的设计，属于细胞生物学领域。
背景技术
研究表明果锈的形成与木质素的合成有关。对梨果皮进行转录组测序，获得木质素的合成通路。发现CAD6是木质素生物合成调控酶和限速酶。肉桂醇脱氢酶(CAD)作用于木质素单体生物合成的最后一步，催化多种不同的肉桂醛(香豆醛,芥子醛,松柏醛等)生成木质素单体的前体物质，是木质素合成途径的关键酶之一。
目前利用一些技术调控相关基因的特异表达已经成为国际研究趋势。为了更好掌握果锈形成过程中木质素的调控作用，申请人发明了利用互补链干扰CAD6的合成，从而抑制木质素的合成。在这一方法中，申请人可以观察到经由互补链处理的梨果皮果锈的覆盖率低于未处理的果锈覆盖率。这种抑制梨果皮木质素合成基因表达的方法，对于研究果皮其他基因的表达具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供抑制果皮木质素合成基因表达的方法，即抑制梨果锈形成的方法，为进一步研究相关基因在果皮中表达调控拓展思路。利用互补链抑制是这一方法的创新点。
本发明设计的互补链长度为15-30个核苷酸，通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长、分化等。其优点在于其理论上的高度靶特异性(碱基互补)、设计容易、多样且合成简单及高度的局部性和针对性。最近几年来，新的用于保护寡聚核苷酸免遭酶解、提高靶标亲和性的化学修饰技术的发展，使得该技术也获得巨大进步。
以梨果皮为例，抑制梨果皮木质素合成基因CAD6表达的CAD6ODNs，为CAD6-ODN1、CAD6-ODN2、CAD6-ODN3、CAD6-ODN4，其序列为：
CAD6-ODN1：5′-GGAGTAGACCCCAACAC-3′(seq NO.1)；
CAD6-ODN2：5′-GGCATTCGACATTAGCAT-3′(seq NO.2)；
CAD6-ODN3：5′-TCGGTACCTAACGTCGTT-3′(seq NO.3)；
CAD6-ODN4：5′-GCCACCGTAGGTGATAC-3′(seq NO.4)；
根据最小自由能原理，优选的，抑制梨果皮木质素合成基因CAD6表达的CAD6-ODN为CAD6-ODN3。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案为：一种抑制梨果锈形成的方法，通过抑制梨果皮木质素合成基因表达以抑制梨果锈形成。
设计针对木质素合成基因CAD6基因的互补链，用350μM的互补链溶液喷洒果面，在自然条件下完成果实发育。
抑制梨果锈形成的方法，具体步骤为：
1)互补链的设计：通过梨全基因组测序，筛选关键基因，获得CAD6序列片段，再通过IPCR反向扩增CAD6的全长；将CAD6mRNA全序列输入RNAdraw软件，选择计算结构，设置相关参数，按自由能最低原理产生模拟的二级结构；利用Sfold软件进行CAD6mRNA靶序列核酸单链的概率分析；根据靶mRNA的一级结构与模拟的二级结构，选择二级结构中可能形成单链的部位作为靶位点，设计若干长为16-18nt的CAD6ODNs，若干CAD6ODNs分别靶向CAD6mRNA的不同区域；用Sfold软件计算出CAD6mRNA全序列未配对碱基的概率，结合概率筛选出单链概率较高的序列作为CAD6ODNs的靶序列，将两种方法选出的CAD6ODNs进行比对，从中选择共同的序列作为最终设计的互补链，最终设计的互补链为CAD6-ODN3序列：5′-TCGGTACCTAACGTCGTT-3′，以硫代磷酸酯修饰合成；
2)互补链溶液配置：配置浓度为350μM的CAD6-ODN3的水溶液；
3)果实选择：在梨树盛花期后15d，在同一棵树树冠的向阳面选择长势一致的果实，设置10个处理，10个对照，10个处理组成实验组，10个对照组成对照组；
4)果实处理：以互补链溶液处理实验组的梨果皮，对照组保证在自然条件下发育；对实验组于开花15d后开始在自然条件下用350μM CAD6-ODN3水溶液对果面进行喷洒，需均匀喷洒；果实发育前期，每4d喷洒互补链溶液1次，果实发育前期指开花后15～67d；果实发育中期，每7d喷洒互补链溶液1次，果实发育中期指开花后67～88d；果实发育后期每14d喷洒互补链溶液1次，直至果实成熟，果实发育后期指开花后88d以后；
5)采样观察：在果实成熟时于田间摘取的梨果实，经肉眼观测果锈发生情况，用果锈覆盖率表示果锈发生程度。果锈覆盖率即果锈面积占果实表面积的百分率。
优选地，还包括木质素含量测定的步骤：取等量对照组和实验组梨果皮干粉5.0mg，置于10mL试管中，加入0.5mL 25％溴乙酰-乙酸溶液和0.02mL高氯酸，密封后于70℃恒温水浴锅中水浴30min；然后，将反应液移入含1mL 2mol/L NaOH和2.5mL冰乙酸混合液的容量瓶中，充分振荡混匀后，用冰乙酸定容5至10mL；以冰乙酸为空白溶液，在紫外分光光度计的280nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算木质素含量；取三次生物学重复平均值，以此得到木质素的含量。
优选地，还包括RT-PCR检测的步骤：取等量的对照组和实验组的成熟梨果实的果皮分别提取cDNA，再分别以转录的cDNA为模板，进行荧光定量PCR；荧光定量PCR的引物为：CDA6正向引物：5′-CGAAAGTTGGGAGCAACGTG-3′(seq NO.5)；CDA6反向引物：5′-CCGTAGGTGATACTGCCGTC-3′(seq NO.6)。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1)使用互补链抑制梨果皮木质素合成基因表达的方法，可以更好了解到缺少木质素对果皮果锈覆盖率的影响，更好的研究木质素对果锈形成的作用机制；
2)抑制果皮木质素合成基因表达的方法有反向调控转基因植物木质素生物合成和化学药剂处理，而使用互补链不但可以抑制果皮木质素合成基因表达而且能收到更好的成效；
3)本发明具有坚实的理论依据，利用果皮的渗透吸水使CDA6-ODN进入果皮，通过碱基互补原则结合于CAD6的mRNA上，封闭CAD6的表达，从而抑制其木质素合成基因表达，抑制果锈的形成，改善果实的外观品质，从而提高经济效益。方法较简便，易于操作和实际应用。可以广泛用于不同植物果皮果锈的抑制。
附图说明
图1本发明的实验流程图；
图2和图3梨果皮照片和果锈覆盖率测试图；从图中可以看出，CAD6-ODN3处理的实验组果锈受到了显著抑制；
图4果皮木质素含量图；从图中可以看出，CAD6-ODN3处理的实验组木质素含量显著下降；
图5CAD6相对表达量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
本实例以二十世纪梨果实为实验材料，过程如下(图1)：
1、互补链的设计：通过梨全基因组测序，获得木质素合成通路，筛选关键基因，获得CAD6序列片段，再通过IPCR反向扩增CAD6的全长。将CAD6mRNA全序列输入RNAdraw软件的新序列编辑窗口，选择计算结构，根据需要进行相关参数设置，程序按自由能最低原理产生出模拟的二级结构；利用Sfold软件进行CAD6mRNA靶序列核酸单链的概率分析。根据靶mRNA的一级结构与模拟的二级结构，选择二级结构可能形成单链的部位作为靶位点，如发卡环、内部环、膨胀环和多分枝环等，设计多个长16-18nt的CAD6ODNs，靶向CAD6mRNA的不同区域。用Sfold软件计算出CAD6mRNA全序列未配对碱基的概率，结合概率筛选出单链概率较高的序列作为CAD6ODNs的靶序列，将两种方法选出的CAD6ODNs进行比对，从中选择共同的序列作为最终设计的互补链，即得到CAD6-ODN3序列：5′-TCGGTACCTAACGTCGTT-3′,以硫代磷酸酯修饰合成。
2、反应液配置CAD6-ODN3配置浓度为350μM的水溶液。
3、果实选择果树选择来自扬州大学梨种质资源园，在盛花期后15d，在同一棵树树冠的南部(即向阳面)选择长势一致的果实，10个处理，10个对照。
4、果实处理本实验首次以反义链(即互补链)处理梨果皮，对照组保证在自然条件下发育，对实验组于开花15d后开始在自然条件下用350μM CAD6-ODN3水溶液对果面进行喷洒，注意喷洒均匀，果实发育前期(花后15～67d)每4d，中期(花后67～88d)每7d，后期(花后88d以后)每14d处理1次，直至果实成熟。
4、采样观察在果实成熟时于田间摘取的梨果实，经肉眼观测果锈发生情况，用果锈覆盖率(即果锈面积占果实表面积的百分率)来表示果锈发生程度(图2和3)。从图中可以看出，CAD6-ODN3处理的实验组果锈受到了显著抑制，果锈覆盖率由70％以上(对照组)降到20％(实验组)。
5、木质素含量测定取等量对照组和实验组梨果皮干粉5.0mg，置于10mL试管中，加入0.5mL 25％溴乙酰-乙酸溶液和0.02mL高氯酸，密封后于70℃恒温水浴锅中水浴30min。然后，将反应液移入含1mL 2mol/L NaOH和2.5mL冰乙酸混合液的容量瓶中，充分振荡混匀后，用冰乙酸定容5至10mL。以冰乙酸为空白溶液，在紫外分光光度计的280nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算木质素含量。取三次生物学重复平均值，以此得到木质素的含量(图4)。从图中可以看出，CAD6-ODN3处理的实验组木质素含量显著下降，且木质素含量由38mg·g-1DW降到28.5mg·g-1DW。
6、RT-PCR检测取等量的对照组和实验组的成熟梨果实的果皮分别提取cDNA，再分别以转录的cDNA为模板，进行荧光定量PCR。根据测序得到的梨属CAD6的基因序列设计：CDA6正向引物：5′-CGAAAGTTGGGAGCAACGTG-3′；CDA6反向引物：5′-CCGTAGGTGATACTGCCGTC-3′。
荧光定量PCR反应体系为：正向、反向引物(10μM)各0.5μL；模板0.5μL；SsoFastEvaGreen supermix 5μL；无酶水3.5μL。以此得到CAD6相对表达量(图5)。实验组中CAD6表达量为对照组的42％-45％。
本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种抑制梨果锈形成的方法
<130> xhx2018050801
<141> 2018-05-08
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Pyrus spp
<400> 1
ggagtagacc ccaacac 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Pyrus spp
<400> 2
ggcattcgac attagcat 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Pyrus spp
<400> 3
tcggtaccta acgtcgtt 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Pyrus spp
<400> 4
gccaccgtag gtgatac 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Pyrus spp
<400> 5
cgaaagttgg gagcaacgtg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Pyrus spp
<400> 6
ccgtaggtga tactgccgtc 20

Claims (6)

1.一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，通过抑制梨果皮木质素合成基因表达以抑制梨果锈形成。
2.根据权利要求1所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，设计针对木质素合成基因CAD6基因的互补链，用350µM的互补链溶液喷洒果面，在自然条件下完成果实发育。
3.根据权利要求1所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，具体步骤为：
1）互补链的设计：通过梨全基因组测序，筛选关键基因，获得CAD6序列片段，再通过IPCR反向扩增CAD6的全长；将CAD6 mRNA全序列输入RNAdraw软件，选择计算结构，设置相关参数，按自由能最低原理产生模拟的二级结构；利用Sfold软件进行CAD6mRNA靶序列核酸单链的概率分析；根据靶mRNA的一级结构与模拟的二级结构，选择二级结构中可能形成单链的部位作为靶位点，设计若干长为16-18nt的CAD6 ODNs，若干CAD6 ODNs分别靶向CAD6mRNA的不同区域；用Sfold软件计算出CAD6 mRNA全序列未配对碱基的概率，结合概率筛选出单链概率较高的序列作为CAD6 ODNs的靶序列，将两种方法选出的CAD6 ODNs进行比对，从中选择共同的序列作为最终设计的互补链，最终设计的互补链为CAD6-ODN3序列：5′-TCGGTACCTAACGTCGTT -3′，以硫代磷酸酯修饰合成；
2）互补链溶液配置：配置浓度为350μM的 CAD6-ODN3的水溶液；
3）果实选择：在梨树盛花期后15 d，在同一棵树树冠的向阳面选择长势一致的果实，设置10个处理，10个对照，10个处理组成实验组，10个对照组成对照组；
4）果实处理：以互补链溶液处理实验组的梨果皮，对照组保证在自然条件下发育；对实验组于开花 15 d 后开始在自然条件下用350μM CAD6-ODN3水溶液对果面进行喷洒，需均匀喷洒；果实发育前期，每 4 d喷洒互补链溶液1次，果实发育前期指开花后 15 ~ 67 d；果实发育中期，每 7 d喷洒互补链溶液1次，果实发育中期指开花后 67 ~ 88 d；果实发育后期每 14 d 喷洒互补链溶液1次，直至果实成熟，果实发育后期指开花后 88 d 以后；
5）采样观察：在果实成熟时于田间摘取的梨果实，经肉眼观测果锈发生情况，用果锈覆盖率表示果锈发生程度。
4.根据权利要求3所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，果锈覆盖率即果锈面积占果实表面积的百分率。
5.根据权利要求3所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，还包括木质素含量测定的步骤：取等量对照组和实验组梨果皮干粉5.0 mg，置于10 mL试管中，加入0.5 mL 25%溴乙酰-乙酸溶液和0.02 mL高氯酸，密封后于70 ℃恒温水浴锅中水浴30 min；然后，将反应液移入含1 mL 2 mol / L NaOH和2.5 mL冰乙酸混合液的容量瓶中，充分振荡混匀后，用冰乙酸定容5至10 mL；以冰乙酸为空白溶液，在紫外分光光度计的280 nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算木质素含量；取三次生物学重复平均值，以此得到木质素的含量。
6.根据权利要求3所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，还包括RT-PCR检测的步骤：取等量的对照组和实验组的成熟梨果实的果皮分别提取cDNA，再分别以转录的cDNA为模板，进行荧光定量PCR；荧光定量PCR的引物为：CDA6正向引物：5′-CGAAAGTTGGGAGCAACGTG-3′；CDA6反向引物：5′- CCGTAGGTGATACTGCCGTC-3′。
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