CN102363790A

CN102363790A - 拟南芥热激因子基因AtHsfA1d 的植物表达载体及其应用

Info

Publication number: CN102363790A
Application number: CN2011103064980A
Authority: CN
Inventors: 陈丽梅; 张道君; 年洪娟; 李昆志
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2011-10-11
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2031-10-11
Also published as: CN102363790B

Abstract

本发明公开了拟南芥热激因子AtHsfA1d植物表达载体及其应用，属于基因工程领域，本发明用拟南芥热激因子AtHsfA1d基因的cDNA构建植物表达载体pK₂-35S-AtHsfA1d，并通过农杆菌介导转入植物中，使植物提高对甲醛的吸收和耐受能力，克服植物本身吸收耐受甲醛能力低的缺点；实验结果表明过量表达AtHsfA1d转录因子的转基因烟草在含有6mmol/L甲醛的MS固体培养基上培养7天后，鲜重高于野生型烟草，在4mM甲醛处理液中转AtHsfA1d基因烟草的植株甲醛吸收速率高于野生型烟草。

Description

拟南芥热激因子基因AtHsfA1d 的植物表达载体及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及拟南芥热激因子基因AtHsfA1d 的植物表达载体及其在制备吸收甲醛能力增强的转基因植物中的应用。

背景技术

甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚。它反应能力极强，能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应(Feldman等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,1973,13:1-49)，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物来说都有很高的毒性。甲醛被广泛用于工业生产中，是制造树脂、胶粘剂、油漆、塑料、人造纤维的原料，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高，各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染公认最具代表性的化学物质。人们入住新居都要进行室内装饰和更新家具，其正是室内空气甲醛污染的主要来源。甲醛污染危害严重的场所是：居室、办公室、会议室、宾馆、KTV包房、家具商场、建材商场等。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08（mg／立方米），有调查表明新的宾馆客房室内空气中甲醛浓度最高达0.36mg/立方米，平均为0.173mg/立方米，是室外对照的13倍。而家具商场最高达0.873mg/立方米，平均为0.432mg/立方米，是室外对照的33倍。建成一所经过装饰的实验室，空气中甲醛平均浓度高达0.5mg/立方米，是室外的62.5倍。抽样检测发现单位及住户室内环境污染严重，查了11家只有1户合格，其中竟有1户甲醛超标25倍。

甲醛为较高毒性物质，当室内空气中甲醛含量为0.1mg/立方米时，就有异味和不适感；达到0.5 mg/立方米时，可刺激眼睛，引起流泪；达到0.6 mg/立方米时，可引起咽喉不适或疼痛。浓度更高时，可引起恶心呕吐，咳嗽胸闷，气喘甚至肺水肿；达到30 mg/立方米时，会立即致人死亡。长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，ＤＮＡ单链内交连和ＤＮＡ与蛋白质交连及抑制ＤＮＡ损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病（sick-house）。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TDI、VOC等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长（3-15年）、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。

Achkor等人为了检测甲醛脱氢酶在植物中的功能，对来源于拟南芥FALDH的基因进行遗传操作，得到了有不同FALDH表达水平的转基因拟南芥株系。过量表达此酶的拟南芥对外源甲醛的摄取效率提高25％，FALDH水平降低的植物（由于共抑制表型或者反义表达）和野生型拟南芥相比，甲醛脱毒速率显著缓慢，能力下降。这些结果证明在拟南芥中过量表达FALDH可以提高转基因拟南芥吸收外界环境中液体甲醛的能力(Achkor等，Plant Physiol, 2003, 132(4): 2248-2255)。

热激蛋白（HSPs）是高温诱导合成的蛋白，热激因子（HSFs）是一类转录因子，调控HSP基因的表达。HSFs是调控应答热激和大量化学胁迫的基因活性信号转导链的终端成分，在植物中有20到30不同的植物HSFs，在拟南芥中有21个HSFs。我们用甲醛处理拟南芥，通过半定量RT-PCR分析部分HSP基因的表达谱。结果显示，AtHsfA1d在没有甲醛胁迫下有低水平的表达，随着甲醛处理时间的延长，AtHsfA1d的表达量增加，说明热激因子AtHsfA1d参与了拟南芥对甲醛的胁迫应答，AtHsfA1d是甲醛胁迫的响应基因，且是受甲醛诱导上调的表达的基因，因此HsfA1d可能是提高植物耐受甲醛胁迫的一种候选基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有拟南芥热激因子基因（即AtHsfA1d基因）的植物表达载体pK₂-35S-AtHsfA1d，该载体含有拟南芥热激因子AtHsfA1d基因的cDNA及卡那霉素筛选标记基因K₂和组成型启动子CaMV 35S，CaMV 35S的组成型启动子位于热激因子cDNA的上游。

所述的热激因子基因AtHsfA1d的cDNA来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），拟南芥的热激因子基因AtHsfA1d的GenBank登录号为8405125，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pK2GW7（购自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology，VIB）。

本发明另一目的是利用拟南芥热激因子AtHsfA1d的植物表达载体制备快速吸收和耐受甲醛的转基因植物中。

本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的：

1. 植物表达载体的构建

（1）从GenBank中查找拟南芥AtHsfA1d基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：

上游引物 5'CGGAATTCATGGATGTGAGCAAAGTAACCACAAG3'（含有EcoRI位点）；

下游引物 5'GCCTCGAGTCAAGGATTTTGCCTTGAGAGATCTAAGG3'（含有XhoI位点）

上游引物5’端加GAATTC特征序列，并由此形成EcoRⅠ酶切位点；下游引物3’末端加XhoⅠ酶切位点，以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，通过PCR扩增得到AtHsfA1d基因的全长cDNA；

（2）回收并纯化AtHsfA1d全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-T-AtHsfA1d；

（3）构建入门载体pENTR2B-AtHsfA1d，用EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切pMD18-AtHsfA1d和pENTR2B （Invitrogen），回收AtHsfA1d的cDNA片段和载体DNA片段pENTR，进行连接、转化感受态细胞，得到入门载体pENTR2B-AtHsfA1d；

（4）构建植物表达载体pK₂-35S-AtHsfA1d，通过Gateway技术的LR反应把AtHsfA1d亚克隆到植物表达载体pK2GW7中,获得AtHsfA1d基因的植物表达载体pK₂-35S-AtHsfA1d。

本发明的植物表达载体对那些能实施转基因操作的植物都适用，如烟草、拟南芥、矮牵牛、非洲菊等，在本发明的实施例中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。

2．烟草遗传转化

采用电转化转化质粒pK₂-35S-AtHsfA1d进入农杆菌感受态细胞，涂布在Spe平板上生长两天后，用菌落PCR检测质粒是否转化到农杆菌中。PCR扩增用AtHsfA1d的上下游引物，扩增片段理论长度为1458 bp，PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，表明质粒已转入农杆菌中。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，筛选卡那霉素抗性植株。

3. PCR 检测目的基因在烟草中的整合情况

为了检测目的基因AtHsfA1d是否插入有卡那霉素抗性植株烟草的基因组，以抗性苗的基因组为模板，利用AtHsfA1d的上下游引物做PCR检测，PCR扩增产物片段理论长度为1458 bp，PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，说明目的基因AtHsfA1d已插入到烟草基因组中。

4. 目的基因转录水平的检测

为了检测目的基因AtHsfA1d在转基因烟草中是否转录，提取抗性苗的RNA，利用AtHsfA1d的上下游引物进行RT-PCR检测，RT-PCR扩增片段理论长度为1458 bp，RT-PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，说明目的基因AtHsfA1d已在转基因烟草中正常转录。

5. 目的基因编码蛋白表达水平的检测

为了检测目的基因AtHsfA1d编码的蛋白在烟草中是否表达，选取经RT-PCR检测正确的转基因株系的嫩叶，提取总蛋白进行Western分析。一抗为HSFA1d的鼠抗体。根据AtHsfA1d基因的核酸序列推测表达的蛋白大小约为54 kD，Western分析结果说明检测到的蛋白质条带大小与理论预测值相符，说明AtHsfA1d编码的蛋白在烟草中已成功表达。

6. 转基因烟草甲醛吸收速率检测

根据蛋白表达水平，选择高表达的转基因株系进行甲醛吸收速率检测，用4 mM甲醛溶液处理转基因烟草植株0 h，0.5 h，2 h，6 h，24 h，48 h和72 h，检测处理液中剩余甲醛的浓度。结果说明随着时间的延长，转基因烟草处理液中剩余甲醛的浓度比野生型烟草低，说明转基因烟草比野生型烟草应答甲醛的速率要快，这说明拟南芥热激因子AtHsfA1d在烟草中的过量表达可提高其甲醛吸收速率。

7. 转基因烟草对甲醛的抗性检测

取大小相当的野生型和转基因烟草无菌苗在含有6 mM甲醛的MS固体培养基上25℃持续光照培养，处理7天后测定其鲜重和总蛋白含量。结果说明在甲醛胁迫条件下，转基因烟草的鲜重比野生型烟草大，说明转基因烟草对高浓度的甲醛胁迫的抗性较野生型烟草强，这说明拟南芥热激因子AtHsfA1d在烟草中的过量表达可提高其对甲醛的抗性。

对烟草蛋白含量的测定发现：甲醛胁迫下转基因烟草总蛋白的含量比野生型烟草以及未用甲醛处理的转基因烟草高，这表明拟南芥AtHsfA1d的过量表达可能诱导了其他蛋白的高水平表达。

实验结果显示本发明的重组载体pK₂-35S-AtHsfA1d在转基因植株中的应用可提高植物对甲醛的吸收速率和抗性。

附图说明

图1 是pMD18－AtHsfA1d的TA克隆策略图。

图2 是TA克隆载体pMD18－AtHSFA1d的电泳检测图。

是PCR扩增AtHsfA1d基因的cDNA片段，M：Maker III；1-2：AtHsfA1d的扩增产物；B是质粒pMD18-T-AtHsfA1d的电泳检测，M：对照质粒；1-2：pMD18-T-AtHsfA1d；C是pMD18-T-AtHsfA1d质粒的PCR检测，M：Maker III；1-9：以pMD18-T-AtHsfA1d质粒为模板的PCR产物；10：负对照；D是重组质粒pMD18-T-AtHsfA1d单双酶切检测，M：Maker III ；1：EcoRI酶切pMD18-T-AtHsfA1d产物。

图3是入门载体pENTR2B-AtHsfA1d的构建策略图。

图4是入门载体pENTR2B-AtHsfA1d的电泳检测图。

是pENTR2B-AtHsfA1d质粒的菌落PCR检测，1-8：扩增产物；9：负对照；M：Maker III；B是 EcoRI和XhoI双酶切检测质粒pENTR2B-AtHsfA1d，M：Maker III；1：EcoRI和XhoI酶切产物；2：质粒pENTR2B-AtHsfA1d。

图5是用Gateway的LR反应构建AtHsfA1d基因cDNA植物表达载体的策略图。

图6是AtHsfA1d植物表达载体pK₂-35S-AtHsfA1d的电泳检测及其农杆菌转化子菌落的电泳检测图。

是重组质粒pK₂-35S-AtHsfA1d的菌落PCR检测，1-8：扩增产物9：负对照；10：以AtHsfA1d为模板作正对照；

B是EcoRI和XhoI双酶切检测重组质粒pK₂-35S-AtHsfA1d，M：Maker III；1：EcoRI和XhoI双酶切产物；

C是菌落PCR检测pK₂-35S-AtHsfA1d的转化效果，1-5：菌落PCR样品，6：正对照（以pENTR2B-AtHsfA1d为模板）；7：负对照（以pK₂GW₇为模板）；M：Maker III。

图7 是AtHsfA1d在转基因烟草中的插入情况以及表达水平的电泳检测。

是转AtHsfA1d烟草基因组PCR检测，M：Maker III；WT-1，WT-2：野生型烟草；1-9：转基因烟草株系；10：正对照；11：负对照；

B是转AtHsfA1d烟草的RT-PCR检测，M: Maker III，WT-1：野生型烟草，1－8：转基因烟草株系；

C是转基因烟草的Western 分析，WT，野生型烟草，5、6号株系：转基因烟草株系，正对照：AtHSFA1d重组蛋白。

图8 是转基因烟草吸收液体甲醛速率的测定；ck：空白对照；wt：野生型烟草；6号株系：转基因烟草。

图9是甲醛胁迫下转基因烟草鲜重和可溶性总蛋白含量变化的测定；其中

A是甲醛胁迫下烟草鲜重的变化。WT：野生型烟草；AtHsfA1d-6：转基因烟草；WT（HCHO）：用甲醛处理的野生型烟草； AtHsfA1d-6（HCHO）：用甲醛处理的转基因烟草；

B是甲醛胁迫下烟草可溶性总蛋白含量的变化。WT：野生型烟草；WT（HCHO）：用甲醛处理的野生型烟草；AtHSFA1d-6：转基因烟草6号株系；AtHSFA1d-6（HCHO）：用甲醛处理的转基因烟草6号株系。

具体实施方式

本实施例中采用的试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit购自invitrogen公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。

所有引物序列均在大连宝生物公司合成，本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：AtHsfA1d基因cDNA的PCR扩增及TA克隆

从GenBank中查找拟南芥AtHsfA1d基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：

上游引物 5'CGGAATTCATGGATGTGAGCAAAGTAACCACAAG3'（EcoRI）；

下游引物 5'GCCTCGAGTCAAGGATTTTGCCTTGAGAGATCTAAGG3'（XhoI）

上游引物5’端加GAATTC特征序列，并由此形成EcoRⅠ酶切位点；下游引物3’末端加XhoⅠ酶切位点，以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，得到AtHsfA1d基因的全长cDNA。

用TRIzoL Reagent（Invitrogen）从拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗中提取总RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min（12000rpm），转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min（12000rpm），弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min（7500rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit（TaKaRa）进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT) 50ng,10mM dNTP mix 1μl,用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl₂ 4μl，0.1M DTT 2μl,RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。

以cDNA为模板，用AtHsfA1d基因cDNA上下游特异性引物进行PCR，扩增得到AtHsfA1d的全长cDNA 1458 bp (图2A)。回收并纯化AtHsfA1d全长基因片段，并将其连接到pMD-18T (大连宝生物公司)载体上（图1），转化大肠杆菌感受态DH5α（天根生化科技），采用碱裂解法提取质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的PCR检测和双酶切检测（图2B）。以重组质粒为模板，用引物5’和3’引物扩增到的1458 bp的PCR产物（图2C）。根据阳性重组质粒pMD18-T-AtHsfA1d载体两端的多克隆位点，用EcoRI单酶切重组质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD18-T-AtHsfA1d单酶切产物理论上为2.7kb和1.4kb左右的条带（图2D）。

实施例2：构建入门载体pENTR2B-HsfA1d

用XhoI和EcoRI 双酶切pMD18-T-AtHsfA1d和pENTR2B-ccdB（图3），通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，分别回收pMD18-T-AtHsfA1d被切割后产生的AtHsfA1d基因的cDNA片段（1.4kb）和pENTR2B-ccdB被切割后产生的载体片段pENTR2B，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR2B和AtHsfA1d基因的cDNA片断产生入门载体pENTR2B-AtHsfA1d（图3）。用连接反应混合物转化高效率（10⁸）的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37^oC过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，选出连接成功的质粒载体pENTRB-AtHsfA1d。以pENTR2B-AtHsfA1d为模板，利用AtHsfA1d基因上下游引物进行PCR扩增，扩增结果得到约1.4 kb左右的条带（图4A）。用EcoRI（Takara）和Xho I（Takara）双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带，分别为约2.7kb和1.4kb（图4B）。确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR2B-AtHsfA1d。

实施例3：植物表达载体pK ₂ -35S- AtHsfA1d 的构建

通过Gateway技术的LR反应把AtHsfA1d亚克隆到植物表达载体pK2GW7（Gateway的目的载体, 比利时VIB/Gent公司）中（图5）。具体的做法是：用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR2B-AtHsfA1d和pK2GW7各150ng，1μl LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25^oC反应过夜，通过整合酶的作用把AtHsfA1d整合到pK2GW7中获得AtHsfA1d的植物表达载体质粒pK₂-35S-AtHsfA1d（图5）。用反应混合物转化高效率（10⁸）的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37^oC过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落。从Spe抗性重组子菌落中提取质粒，选出大小和对照质粒pK2GW7相似的整合成功的质粒pK₂-35S-AtHsfA1d进行PCR检测，正对照试验用pENTR2B-AtHsfA1d作为模板，负对照用pK2GW7作为模板。pK₂35S-AtHsfA1d和pENTR2B-AtHsfA1d扩增产物均出现约1.4kb目的条带，负对照没有扩增产物（图6A）。然后进一步用酶切验证重组质粒的正确性，用EcoRI和XhoI酶切检测pK₂-35S-AtHsfA1d，酶切结果得到11.1kb和1458bp左右的两条带（图6B）。确认是整合成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pK2GW7携带的筛选标记基因为卡那霉素抗性基因（Km^r），这样可用加有卡那霉素的平板筛选转基因植物。

实施例4：用HsfA1d的植物表达载体转化农杆菌

制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK₂-35S-AtHsfA1d转入农杆菌（C58Cl(pPMP90)）中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆,2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯,迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃, 200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20μl ddH₂O中，98℃处理5分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。PCR检测pK₂-35S-AtHsfA1d转化结果，正对照扩增体系模板使用pENTR2B-AtHsfA1d质粒，负对照使用pK2GW7质粒，扩增片断理论长度约为1.4 kb，PCR产物经电泳分析显示其片段大小与理论预测值相符,表明质粒已转入农杆菌（图6C）。

实施例5：用含有基因 AtHsfA1d 的植物表达载体的农杆菌转化烟草

挑取携带有质粒pK₂-35S-AtHsfA1d的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中（含Spe，100μg/ml），180rpm，28℃培养24h，待菌液OD₆₀₀至1.0左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD₆₀₀值为0.5。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1（MS+NAA02.1μg/ml+BAP 0.02μg/ml）上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4（MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml）上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50ug/ml)的MS培养基上进行根的诱导。

实施例6： AtHsfA1d 基因在转基因烟草中的插入情况及表达水平的检测

为了确认通过卡那霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液（Tris-HCl pH 7.5 100 mM,EDTA 20 mM,NaCl 1.4 M,CTAB 2%），65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μl氯仿－异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7500rpm）后转移上清至1.5ml EP管；再次加入500μl氯仿－异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7500rpm）；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5.2 醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min（12000rpm）；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase 的TE缓冲液溶解并降解RNA，获得的基因组DNA样品。以转AtHsfA1d烟草抗性苗基因组作为模板，用AtHsfA1d基因上下游引物进行PCR扩增检测AtHsfA1d是否插入烟草基因组。扩增产物大小约为1.4 kb左右，和预期推测一致，说明目的基因均已插入这些转基因株系的基因组,野生型烟草基因组PCR产物未出现目标条带（图7A）。

为了考察目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA, 反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测AtHsfA1d基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent（Invitrogen）提取RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min（12000rpm），转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min（12000rpm），弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min（7500rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA。所获得的RNA样品用凝胶电泳检测质量和浓度。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT) 50ng,10mM dNTP mix 1μl,用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl₂ 4μl，0.1M DTT 2μl,RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用AtHsfA1d基因的上下游引物进行RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果证明转基因烟草植株均有目的基因的转录物，而野生型的烟草则没有（图7B），说明目的基因AtHsfA1d已在转基因烟草中正常转录。

为了检测目的基因AtHsfA1d编码的蛋白在烟草中是否表达，选取经RT-PCR检测正确的转基因株系的嫩叶，提取总蛋白进行Western分析。一抗为AtHSFA1d的鼠抗体。根据AtHsfA1d基因的核酸序列推测表达的蛋白大小约为54 kD，Western分析结果说明检测到的蛋白质条带大小与理论预测值相符（图7C），说明AtHsfA1d编码的蛋白在烟草中已成功表达。

实施例7：转基因烟草吸收液体甲醛速率的测定

甲醛可与Nash试剂（醋酸氨：15%，冰醋酸：0.3%，乙酰丙酮：0.2%）发生化学反应产生有颜色的物质，该物质的最大吸收波长为410nm，因此可以制备标准曲线，根据HCHO-Nash标准曲线即可计算出反应液中甲醛的含量，利用该方法可以测定植物对甲醛的吸收速率。取1.5g左右植物材料放入小三角瓶中，加入50ml处理液（HCHO 4mM,KHCO₃5mM,MES 0.1%）,处理一定时间。取出40μl处理液，加水至500 μL，再加入500 μL Nash试剂在30℃保温30分钟后，测定OD₄₁₀，再根据标准曲线计算出处理液残存甲醛浓度（图8）。在4 mM甲醛处理0 h，0.5 h，2 h，6 h，24 h，48 h和72 h，检测剩余甲醛的含量，结果表明，随着时间的延长，转基因烟草的剩余甲醛含量比野生型烟草少，这说明转基因烟草吸收液体中甲醛的速率优于野生型。

实施例8：转基因烟草对甲醛的抗性检测

将转基因和野生型烟草无菌苗移入MS固体培养基（甲醛浓度为6 mM），在25℃持续光照培养7天后测定烟草的鲜重，结果表明，在未受到甲醛的胁迫时，转基因烟草和野生型烟草都能很好的生长，但是当受到甲醛胁迫的时候，转基因烟草的鲜重高于野生型烟草（图9A），说明转基因烟草对甲醛的抗性好于野生型烟草。对烟草蛋白含量的测定发现：甲醛胁迫下转基因烟草总蛋白的含量比野生型烟草以及未用甲醛处理的转基因烟草高（图9B），这表明拟南芥HsfA1d的过量表达可能诱导了其他蛋白的高水平表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明理工大学

<120> 拟南芥热激因子基因AtHsfA1d的植物表达载体及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggaattcat ggatgtgagc aaagtaacca caag 34

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcctcgagtc aaggattttg ccttgagaga tctaagg 37

Claims

1.拟南芥热激因子基因AtHsfA1d的植物表达载体pK₂-35S-AtHsfA1d，所述载体含有拟南芥热激因子AtHsfA1d基因的cDNA及卡那霉素筛选标记基因K₂和组成型启动子CaMV 35S。

2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于AtHsfA1d基因cDNA来源于拟南芥，GenBank登录号为8405125。

3.权利要求1所述的拟南芥热激因子AtHsfA1d的植物表达载体在制备吸收和耐受甲醛能力增强的转基因植物中的应用。