WO2022054941A1 - 異種タンパク質の大量生産が可能なナス科植物の変異体 - Google Patents

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WO2022054941A1
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dcl2
sequence
plant
protein
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PCT/JP2021/033522
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篤史 竹田
光洋 宮▲崎▼
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学校法人立命館
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a mutant of a Solanaceae plant capable of mass production of heterologous proteins. More specifically, the present invention relates to Solanaceae plant cells or plants lacking the function of a dicer-like protein (DCL), and a method for producing a heterologous protein using the cells or plants.
  • DCL dicer-like protein
  • Non-Patent Document 1 Potato virus X (PVX), Tobacco mosaic virus (TMV) and Cowpea mosaic virus (CPMV) are used in many transient expression systems (Non-Patent Documents 3 to 5).
  • PVX Potato virus X
  • TMV Tobacco mosaic virus
  • CPMV Cowpea mosaic virus
  • RNA interference By the way, animals prevent the growth of viruses mainly by the immune mechanism represented by antibody-antigen reaction, but since plants do not have the acquired immune mechanism, RNA interference (called RNA silencing in plants) is virus-resistant. Plays an important role in. Through this mechanism, gene expression is controlled and transposable element expression is suppressed.
  • small-interfering RNAs siRNAs
  • RNAi pathways that act as defense systems and precursor RNAs that have a hairpin structure.
  • miRNA microRNA
  • an object of the present invention is to provide a cell or a plant capable of efficiently producing a large amount of heterologous protein by one transformation.
  • RNA silencing is one of the defense mechanisms of virus infection, while advancing research on virus resistance.
  • the siRNA-mediated RNA silencing mechanism in plants is a gene complementary to the Post-transcriptional gene silencing (PTGS) pathway (Fig. 1), which cleaves and suppresses translation of mRNA complementary to siRNA.
  • PTGS Post-transcriptional gene silencing
  • TGS Transcriptional gene silencing
  • Fig. 2 the present inventors produced a transformant in which the DCL gene involved in the PTGS pathway was disrupted using N. benthamiana suitable for the Agrobacterium method. .. While conducting research using the transformant, it is surprising that the expression of the introduced gene is significantly (10 to 40 times) increased in the transformant as compared with the wild-type plant. The results were found and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • [6] The cell according to any one of [1] to [4], wherein the plant cell is a genetically modified organism.
  • [7] The cell according to [6], which does not have a transgene used for gene recombination.
  • [8] A plant having the cell according to any one of [1] to [7].
  • a method for producing a target protein which comprises a step of expressing the protein in a cell or a plant into which the nucleic acid has been introduced.
  • the step (1) comprises infecting a cell or a plant with Agrobacterium having a nucleic acid encoding a target protein.
  • the method according to [12], wherein the virus is a turnip mosaic virus.
  • [14] A step of infecting the cell according to any one of [1] to [7] or the plant according to [8] with the virus and propagating the virus, and (2) the step (1).
  • a method for propagating a virus which comprises a step of recovering the virus propagated by).
  • (1) Encodes a complex or a complex of a nucleic acid sequence recognition module targeting at least one gene selected from the group consisting of DCL2 gene, DCL4 gene and DCL3 gene, and a nuclease or deaminase.
  • the step (1) comprises infecting a cell or a plant with Agrobacterium having a nucleic acid encoding the complex.
  • a mutant of a Solanaceae plant capable of mass production of a heterologous protein is provided.
  • transient expression in the leaves of this variant allows 10-40-fold higher expression of foreign proteins as compared to in wild-type plants.
  • this mutant can be a null-isolated individual from which a foreign gene has been removed, it also has an advantageous effect that it can be excluded from the Cartagena method, and can be cultivated in an open system like wild-type plants.
  • DCL2 or DCL4 cleaves a long hairpin RNA derived from a foreign gene, or mRNA double-stranded by RDR6 and SGS3 to generate 21-base or 22-base siRNA.
  • the 2'-O position of the 3'end base of these siRNAs is methylated by HEN1.
  • One strand of methylated siRNA is predominantly incorporated into AGO1 to form a RISC complex.
  • the formed RISC complex binds to mRNA complementary to siRNA and cleaves the mRNA to suppress gene expression (Baumberger et al., 2005). It is a figure which shows the outline of the TGS route.
  • Hairpin RNA with long DCL3 or PollV transcript is cleaved by RDR2 to generate 24-base siRNA.
  • One strand of this siRNA is mainly incorporated into AGO4 to form a RISC complex.
  • the formed complex siRNA binds to the complementary mRNA sequence during transcription by Pol V. After that, cytosine in the target genomic DNA region is methylated via the methylating enzymes MET1, CMT3, DRM1, and DRM2, and the promoter region is heterochromatinized to suppress gene expression (Aufsatz et al., 2002). .. It is a figure which shows the plasmid pWAT135-FLAG-hcoCas9-3001, 3002, 3003, 3004.
  • DCL2-gRNA2, DCL3-gRNA1 and DCL4-gRNA1 are expressed under the control of the U6 promoter.
  • DCL2-gRNA3, DCL3-gRNA1 and DCL4gRNA1 are expressed under the control of the U6 promoter.
  • DCL2-gRNA2, DCL3-gRNA2, and DCL4-gRNA1 are expressed under the control of the U6 promoter.
  • DCL2-gRNA3, DCL3-gRNA2, and DCL4-gRNA1 are expressed under the control of the U6 promoter.
  • N. benthamiana Nicotiana benthamiana
  • a and B are schematic diagrams showing the gene structure of DCL2 in N. benthamiana.
  • the DCL2 cDNA consists of 4209 bases and has a gene sequence encoding the DEAD, Helicase C, dsRNA binding, PAZ, Ribonuclease IIIa, Ribonuclease IIIb, and dsrma domains.
  • gRNA2 represents a guide RNA targeting DCL2 (hereinafter, may be abbreviated as “gRNA”).
  • gRNA2 targets the DEAD sequence at bases 228 to 246 from the 5'end of the CDS on the cDNA of DCL2.
  • C indicates the genomic DNA sequence near the target sequence.
  • the 223rd to 522nd bases of the genomic DNA sequence of DCL2 in N. benthamiana are shown.
  • the darkest gray part of the background is the sequence encoding DEAD, the darkest gray part is the sequence targeted by NbDCL2-gRNA2, and the lightest gray part is the primer NbDCL2-g2-22F used for PCR to confirm mutation.
  • NbDCL2-g2-49R (Table 1), and the second light gray site is the binding site of primer NbDCL2-g2-25F (Table 1) used for sequence analysis of mutation confirmation.
  • Uppercase letters indicate exons, and lowercase letters indicate introns.
  • the sequence in C is represented as SEQ ID NO: 30.
  • D indicates a chromatogram of the genomic DNA sequence near the NbDCL2-gRNA2 target site.
  • the gray background is the target sequence for NbDCL2-gRNA2.
  • the three bases enclosed in the frame are the PAM sequence.
  • the sequence in D is represented as SEQ ID NO: 31. It is a figure which shows the gRNA3 target sequence of DCL2 in N. benthamiana.
  • a and B are schematic diagrams showing the gene structure of DCL2 in N. benthamiana.
  • the DCL2 cDNA consists of 4209 bases and has a gene sequence encoding the DEAD, Helicase C, dsRNA binding, PAZ, Ribonuclease IIIa, Ribonuclease IIIb, and dsrma domains.
  • gRNA3 represents a guide RNA targeting DCL2.
  • gRNA3 targets the region of bases 624 to 643 from the 5'end of the CDS on the cDNA of DCL2.
  • C indicates a genomic DNA sequence near the target sequence.
  • the 1858th to 2157th bases of the genomic DNA sequence of DCL2 in N. benthamiana are shown.
  • the darkest gray part is the target sequence of NbDCL2-gRNA3
  • the lightest gray part is the binding site of the primers NbDCL2-g3-185F and NbDCL2g3-213R (Table 1) used for PCR for mutation confirmation, and the second darkest part.
  • the gray site is the binding site of the primer NbDCL2-g3-188F (Table 1) used for the sequence analysis of mutation confirmation.
  • Uppercase letters indicate exons, and lowercase letters indicate introns.
  • the sequence in C is represented as SEQ ID NO: 32.
  • D indicates a chromatogram of the genomic DNA sequence near the NbDCL2-gRNA3 target site.
  • the gray background is the target sequence of NbDCL2-gRNA3.
  • the three bases enclosed in the frame are the PAM sequence.
  • the sequence in D is represented as SEQ ID NO: 33. It is a figure which shows the gRNA1 target sequence of DCL3 in N. benthamiana.
  • a and B are schematic diagrams showing the gene structure of DCL3 in N. benthamiana.
  • the cDNA of DCL3 consists of 4974 bases and has a gene sequence encoding the Helicase C, dsRNA binding, PAZ, Ribonuclease IIIa, Ribonuclease IIIb, and dsrma domains.
  • gRNA1 represents a guide RNA targeting DCL3.
  • gRNA1 targets the Helicase C sequence at bases 915-934 from the 5'end of the CDS on the cDNA of DCL3.
  • C indicates a genomic DNA sequence near the target sequence.
  • the 5933-6122 bases of the genomic DNA sequence of DCL3 in N. benthamiana are shown.
  • the light gray part with the third background is the exon sequence encoding Helicase C
  • the darkest gray part is the sequence targeted by NbDCL3-gRNA1
  • the lightest gray part is the primer NbDCL3-g1 used for PCR for confirmation of mutation.
  • the binding site between -593F and NbDCL3-g1-R-1 (Table 1), and the second dark gray site is the binding site of the primer NbDCL3-g1-596F (Table 1) used for the sequence analysis of mutation confirmation.
  • Uppercase letters indicate exons
  • lowercase letters indicate introns.
  • the sequence in C is represented by SEQ ID NO: 34.
  • D indicates a chromatogram of the genomic DNA sequence near the NbDCL3-gRNA1 target site.
  • the gray background is the target sequence of NbDCL3-gRNA1.
  • the three bases enclosed in the frame are the PAM sequence.
  • the sequence in C is represented as SEQ ID NO: 35.
  • a and B are schematic diagrams showing the gene structure of DCL3 in N. benthamiana.
  • the cDNA of DCL3 consists of 4974 bases and has a gene sequence encoding the Helicase C, dsRNA binding, PAZ, Ribonuclease IIIa, Ribonuclease IIIb, and dsrma domains.
  • gRNA2 represents a guide RNA targeting DCL3.
  • gRNA2 targets the region of bases 989-1008 from the 5'end of the CDS on the cDNA of DCL3.
  • C indicates a genomic DNA sequence near the target sequence.
  • the 6128-6402 bases of the genomic DNA sequence of DCL3 in N. benthamiana are shown.
  • the darkest gray part is the target sequence of NbDCL3-gRNA2, the lightest gray part is the binding site of the primers NbDCL3-g2-612F and NbDCL3g2-638R (Table 1) used for PCR for mutation confirmation, and the second darkest part.
  • the gray site is the binding site of the primer NbDCL3-g2-F-1 (Table 1) used for the sequence analysis of mutation confirmation.
  • the sequence in C is represented as SEQ ID NO: 36.
  • D indicates a chromatogram of the genomic DNA sequence near the NbDCL3-gRNA2 target site.
  • the gray background is the target sequence of NbDCL3-gRNA2.
  • the three bases enclosed in the frame are the PAM sequence.
  • the sequence in D is represented as SEQ ID NO: 37. It is a figure which shows the gRNA1 target sequence of DCL4 in N. benthamiana.
  • a and B are schematic diagrams showing the gene structure of DCL4a in N. benthamiana.
  • the cDNA of DCL4 consists of DCL4 (Niben101Scf11936) (named “DCL4a”) consisting of 4869 bases and DCL4 (Niben101Scf01789) (named “DCL4b”) consisting of 4866 bases, both of which are DEAD, Helicase C, and It has a gene sequence that encodes the dsRNA binding, PAZ, Ribonuclease IIIa, Ribonuclease IIIb, dsrma, and dsrmb domains.
  • gRNA1 represents a guide RNA that targets both DCL4a and DCL4b.
  • gRNA1 targets the region of bases 1050 to 1069 from the 5'end of the CDS on the cDNA of DCL4a and DCL4b.
  • C indicates the genomic DNA sequence near the target sequence on DCL4a.
  • the 14125-14474 bases of the genomic DNA sequence of DCL4a in N. benthamiana are shown.
  • the darkest gray part is the target sequence of NbDCL4-gRNA1, and the lightest gray part is the binding site of the primers NbDCL4-g1-1412F and NbDCL4-g1-1445R (Table 1) used in the PCR for mutation confirmation.
  • the dark gray site is the binding site of the primer NbDCL4-g1-1416F (Table 1) used for the sequence analysis of mutation confirmation.
  • the sequence in C is represented as SEQ ID NO: 38.
  • D and E show chromatograms of the genomic DNA sequence of DCL4a near the NbDCL4-gRNA1 target site. The underlined part is the target sequence of NbDCL4-gRNA1. The three bases enclosed in the frame are the PAM sequence.
  • the sequence in D is represented as SEQ ID NO: 39, and the sequence in E is represented as SEQ ID NO: 40.
  • a and B show the gene structure of DCL4b.
  • C indicates the genomic DNA sequence near the target sequence on DCL4b.
  • the 14125-14474 bases of the genomic DNA sequence of DCL4b in N. benthamiana are shown.
  • the darkest gray part is the target sequence of NbDCL4-gRNA1, and the lightest gray part is the binding site of the primers NbDCL4b-g1-F1 and NbDCL4b-g1-R1 (Table 1) used in the PCR for mutation confirmation, the second.
  • the dark gray site is the binding site of the primer NbDCL4b-g1-seq-F (Table 1) used for the sequence analysis of mutation confirmation.
  • Uppercase letters indicate exons, and lowercase letters indicate introns.
  • the sequence in C is represented as SEQ ID NO: 41.
  • D and E show chromatograms of the genomic DNA sequence of DCL4b near the NbDCL4-gRNA1 target site.
  • the underlined part is the target sequence of NbDCL4-gRNA1.
  • the three bases enclosed in the frame are the PAM sequence.
  • the sequence in D is represented as SEQ ID NO: 42
  • the sequence in E is represented as SEQ ID NO: 43.
  • the first generation transformed with Agrobacterium is the T0 generation.
  • the shoot and the rooted individual were habituated.
  • Genomic DNA was extracted from the obtained transformant, and PCR was performed using a primer for confirming mutation. Gel recovery of the PCR product was performed, and mutation was confirmed by sequence analysis. After that, T1 seeds were collected from T0 plants, and only the individuals into which the mutation was introduced were passed generations (T1 generation).
  • Genomic DNA was also extracted from T1 plants and mutations were confirmed. At the same time, in order to confirm the presence or absence of Cas9, PCR was performed and the presence or absence of the target band was confirmed by electrophoresis. Here, the transformant in which the mutation was fixed and Cas9 was removed was used as the mutant in which the transgene was null-separated. In addition, individuals whose mutations could not be fixed or Cas9 was not removed were transferred to the T2 and T3 generations to produce mutants. The result of confirming null separation by PCR is shown. Genomic DNA was extracted from each plant, and the isolation of the Cas9 gene was confirmed by PCR.
  • 25S represents a fragment in which the DNA region encoding 25S rRNA amplified by PCR is amplified as a control. It is a figure which shows the introduced mutation in dcl2-1.
  • A shows the sequence analysis result of the NbDCL2-gRNA3 target site of dcl2-1.
  • the gray background shows the target sequence of NbDCL2-gRNA3, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • a mutation with a 1-base insertion of G was confirmed at the 16th base upstream from the PAM sequence on the DCL2 genome.
  • the sequences in A are represented as SEQ ID NO: 44 (mutant) and SEQ ID NO: 45 (WT).
  • B shows the amino acid sequences near the NbDCL2-gRNA3 target sites of dcl2-1 and WT.
  • the black line indicates the target sequence of NbDCL2-gRNA3, the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence, and the gray line indicates the stop codon.
  • the upper amino acid sequence shows dcl2-1 and the lower amino acid sequence shows that of WT.
  • the insertion of one base of G caused a frameshift, resulting in a stop codon at base 661.
  • the resulting stop codon suggested that translation termination at 221 amino acids did not produce DCL2 protein.
  • the sequences in B are represented as SEQ ID NO: 46 (mutant base sequence) and SEQ ID NO: 47 (mutant amino acid sequence), and SEQ ID NO: 48 (WT base sequence) and SEQ ID NO: 49 (WT amino acid sequence).
  • A shows the sequence analysis result of the NbDCL2-gRNA3 target site of dcl2-2.
  • the gray background shows the target sequence of NbDCL2-gRNA3, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • a mutation in the 5-base deletion of AACCT was confirmed at the 11th base upstream from the PAM sequence on the DCL2 genome.
  • A The sequences in A are represented as SEQ ID NO: 50 (mutant) and SEQ ID NO: 51 (WT).
  • B shows the amino acid sequence near the NbDCL2-gRNA3 target site of dcl2-2 and WT.
  • the black line indicates the target sequence of NbDCL2-gRNA3, the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence, and the gray line indicates the stop codon.
  • the upper amino acid sequence shows dcl2-2, and the lower amino acid sequence shows that of WT.
  • a 5-base deletion of AACCT caused a frameshift, resulting in a stop codon at base 655.
  • the resulting stop codon suggested that translation was terminated at 219 amino acids and no DCL2 protein was produced.
  • the sequences in B are represented as SEQ ID NO: 52 (mutant base sequence) and SEQ ID NO: 53 (mutant amino acid sequence), and SEQ ID NO: 54 (WT base sequence) and SEQ ID NO: 55 (WT amino acid sequence). It is a figure which shows the introduced mutation in dcl4a-1.
  • A shows the sequence analysis result of the NbDCL4-gRNA1 target site of dcl4a-1.
  • the underlined part indicates the target sequence of NbDCL4-gRNA1, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • a mutation in the insertion of one base of A was confirmed at the third base upstream from the PAM sequence on the genome of DCL4a.
  • the sequence in A is represented as SEQ ID NO: 56.
  • B shows the amino acid sequence near the NbDCL4-gRNA1 target site of dcl4a-1 and WT.
  • the darkest gray part indicates the target sequence of NbDCL4-gRNA1
  • the framed 3 bases indicate the PAM sequence
  • the lightest gray part indicates the stop codon.
  • the upper amino acid sequence shows dcl4a-1
  • the lower amino acid sequence shows that of WT.
  • the insertion of one base of A caused a frameshift, resulting in a stop codon at base 1102.
  • the resulting stop codon suggested that translation termination at 368 amino acids did not produce the DCL4a protein.
  • the sequences in B are represented as SEQ ID NO: 57 (mutant base sequence) and SEQ ID NO: 58 (mutant amino acid sequence), and SEQ ID NO: 59 (WT base sequence) and SEQ ID NO: 60 (WT amino acid sequence).
  • A shows the sequence analysis result of the NbDCL4-gRNA1 target site of dcl4b-1.
  • the underlined part indicates the target sequence of NbDCL4-gRNA1, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • a mutation in the 1-base insertion of A was confirmed at the 3rd base upstream from the PAM sequence on the genome of DCL4b.
  • the sequence in A is represented as SEQ ID NO: 61.
  • B shows the amino acid sequence near the NbDCL4-gRNA1 target site of dcl4b-1 and WT.
  • the darkest gray part indicates the target sequence of NbDCL4-gRNA1
  • the framed 3 bases indicate the PAM sequence
  • the lightest gray part indicates the stop codon.
  • the upper amino acid sequence shows dcl4b-1
  • the lower amino acid sequence shows that of WT.
  • the insertion of one base of A caused a frameshift, resulting in a stop codon at base 1102.
  • the resulting stop codon suggested that translation was terminated at 368 amino acids and no DCL4b protein was produced.
  • the sequences in B are represented as SEQ ID NO: 62 (mutant base sequence) and SEQ ID NO: 63 (mutant amino acid sequence), and SEQ ID NO: 64 (WT base sequence) and SEQ ID NO: 65 (WT amino acid sequence). It is a figure which shows the introduced mutation in dcl2 / 4a-1.
  • A shows the sequence analysis result of the NbDCL2-gRNA3 target site of dcl2 / 4a-1.
  • the gray background shows the target sequence of NbDCL2-gRNA3, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • a mutation with a 1-base insertion of G was confirmed at the 16th base upstream from the PAM sequence on the DCL2 genome.
  • the sequence in A is represented as SEQ ID NO: 66.
  • B shows the amino acid sequences near the NbDCL2-gRNA3 target sites of dcl2 / 4a-1 and WT.
  • the black line indicates the target sequence of NbDCL2-gRNA3, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • the upper amino acid sequence shows dcl2 / 4a-1, and the lower amino acid sequence shows that of WT.
  • the insertion of one base of G caused a frameshift, resulting in a stop codon at base 661.
  • the resulting stop codon suggested that translation termination at 221 amino acids did not produce DCL2 protein.
  • the sequences in B are represented as SEQ ID NO: 67 (mutant base sequence) and SEQ ID NO: 68 (mutant amino acid sequence), and SEQ ID NO: 69 (WT base sequence) and SEQ ID NO: 70 (WT amino acid sequence).
  • C shows the sequence analysis result of the NbDCL4-gRNA1 target site of dcl2 / 4-1.
  • the gray background shows the target sequence of NbDCL4-gRNA1, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • a mutation in the 5-base deletion of TCTGA was confirmed at the 3rd base upstream from the PAM sequence on the DCL2 genome.
  • the sequence in C is represented as SEQ ID NO: 71.
  • D indicates the amino acid sequence near the NbDCL4-gRNA1 target site of dcl2 / 4a-1 and WT.
  • the black line indicates the target sequence of NbDCL4-gRNA1, the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence, and the gray line indicates the stop codon.
  • the upper amino acid sequence shows dcl2 / 4a-1, and the lower amino acid sequence shows that of WT.
  • a 5-base deletion in TCTGA caused a frameshift, resulting in a stop codon at base 1060.
  • the resulting stop codon suggested that translation was terminated at 354 amino acids and no DCL4a protein was produced.
  • the sequences in D are represented as SEQ ID NO: 72 (mutant base sequence) and SEQ ID NO: 73 (mutant amino acid sequence), and SEQ ID NO: 74 (WT base sequence) and SEQ ID NO: 75 (WT amino acid sequence).
  • A shows the sequence analysis result of the NbDCL2-gRNA3 target site of dcl2 / 4a-2.
  • the gray background shows the target sequence of NbDCL2-gRNA3, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • a mutation in the 5-base deletion of AACCT was confirmed at the 11th base upstream from the PAM sequence on the DCL2 genome.
  • the sequence in A is represented as SEQ ID NO: 76.
  • B shows the amino acid sequences near the NbDCL2-gRNA3 target sites of dcl2 / 4a-2 and WT.
  • the black line indicates the target sequence of NbDCL2-gRNA3, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • the upper amino acid sequence shows dcl2 / 4a-2, and the lower amino acid sequence shows that of WT.
  • a 5-base deletion of AACCT caused a frameshift, resulting in a stop codon at base 655.
  • the resulting stop codon suggested that translation was terminated at 219 amino acids and no DCL2 protein was produced.
  • the sequences in B are represented as SEQ ID NO: 77 (mutant base sequence) and SEQ ID NO: 78 (mutant amino acid sequence), and SEQ ID NO: 79 (WT base sequence) and SEQ ID NO: 80 (WT amino acid sequence).
  • C shows the sequence analysis result of the NbDCL4-gRNA1 target site of dcl2 / 4a-2.
  • the gray background shows the target sequence of NbDCL4-gRNA1, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • a mutation in the insertion of one base of A was confirmed at the third base upstream from the PAM sequence on the genome of DCL4a.
  • the sequence in C is represented as SEQ ID NO: 81.
  • D indicates the amino acid sequence near the NbDCL4-gRNA1 target site of dcl2 / 4a-2 and WT.
  • the black line indicates the target sequence of NbDCL4-gRNA1, and the three bases surrounded by the frame indicate the PAM sequence.
  • the upper amino acid sequence shows dcl2 / 4a-2, and the lower amino acid sequence shows that of WT.
  • the insertion of one base of A caused a frameshift, resulting in a stop codon at base 1102.
  • the resulting stop codon suggested that translation termination at 368 amino acids did not produce the DCL4a protein.
  • the sequences in D are represented as SEQ ID NO: 82 (mutant base sequence) and SEQ ID NO: 83 (mutant amino acid sequence), and SEQ ID NO: 84 (WT base sequence) and SEQ ID NO: 85 (WT amino acid sequence).
  • the wild-type N. benthamiana and leaf phenotypes in each DCL mutant are shown.
  • the leaf phenotype in each plant after 4 weeks of sowing is shown. I chose the 6th true leaf and took a picture.
  • dcl2 / 4b-1 and dcl4a-1 were rounded.
  • dcl2 / 4a / 4b-1 had elongated leaves.
  • A The plasmid of pAT006-Fluc-iFAD2 is shown. A plasmid that expresses the Fluc gene under promoter control.
  • B The plasmid of pAT010-Rluc-iFAD2 is shown. A plasmid that expresses the Rluc gene under promoter control.
  • i indicates an intron of the FAD2 gene derived from Arabidopsis thaliana. It is a schematic diagram of the agroinfiltration method in the establishment of the co-overexpression system of a plurality of genes using different promoters.
  • the GFP fluorescence of each plant 6 days after inoculation of pCB-TuMV-GFP (cultivated at 25 ° C) is shown.
  • the leaves of N. benthamiana WT, dcl2 / 4b-1, dcl4a-1 and dcl2 / 4a / 4b-1 were inoculated with pCB-TuMV-GFP and pAT010 as a control. GFP fluorescence of the inoculated leaves 6 days after inoculation was observed.
  • C GFP fluorescence in dcl2 / 4b-1
  • D GFP fluorescence in dcl4a-1
  • E GFP fluorescence in dcl2 / 4a / 4b-1.
  • Stronger fluorescence than WT was confirmed in all inoculated DCL mutants. It showed the strongest fluorescence in dcl2 / 4a / 4b-1, and dcl2 / 4b-1 showed stronger fluorescence than dcl4a-1.
  • the GFP accumulation of each plant 6 days after inoculation with pCB-TuMV-GFP is shown.
  • GFP protein in the inoculated leaves 6 days after inoculation was detected by Western blotting.
  • the signal intensity of the band was measured using ImageJ.
  • the signal intensity of the band in the lane where WT # 2 was passed was set to 1, and each band was quantified. Higher accumulation of GFP than WT was confirmed in all inoculated DCL mutants. It showed the highest accumulation of GFP in dcl2 / 4a / 4b-1, and showed higher accumulation in dcl2 / 4b-1 than in dcl4a-1.
  • the results of comparing the activities of different promoters and the same promoter at the time of simultaneous overexpression of multiple genes are shown. N.
  • the present invention is based on at least one dicer-like (DCL) -like (DCL) -like (DCL) protein selected from the group consisting of the DCL2 gene, the DCL4 gene and the DCL3 gene.
  • DCL; Dicer-like A plant cell having a loss-of-function mutation in a protein gene (also referred to as "DCL gene”) or a plant containing the cell (hereinafter, referred to as "variant of the present invention”). )I will provide a.
  • Dicer is a double-stranded RNA (dsRNA) -specific endoribonuclease, and in eukaryotic organisms, 21-24-nt single-stranded RNA with a stem-loop structure such as dsRNA or microRNA precursor transcripts. By cleaving into small RNAs, it plays an important role in inducing transcription and post-transcriptional gene silence.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • a stem-loop structure such as dsRNA or microRNA precursor transcripts.
  • the DCL protein plays an important role in RNA silencing as a defense mechanism against viruses, and in Arabidopsis, four DCL proteins (DCL1-4) that specifically produce siRNAs of different sizes Known (Bologna and Voinnet, 2014).
  • DCL3 is involved in antiviral defense against DNA viruses (Moissiarard and Voinnet, 2006). It is also involved in the production of 24-base viral siRNA (vsiRNA) derived from RNA virus, but its role in antiviral defense against RNA virus in plants is unknown (Deleris et al., 2006, Diaz-Pendon). et al., 2007).
  • DCL4 prefers a long dsRNA substrate and requires the dsRNA binding protein DRB4 for its activity.
  • DCL4 produces 21 bases of siRNA and is a major component of antiviral defense against RNA viruses (Bouche et al., 2006, Deleris et al., 2006).
  • DCL2 trans-acting siRNA
  • tasiRNA trans-acting siRNA
  • DCL2 produces 22 bases of vsiRNA, which have been reported to have lower virus silencing capacity than those of 21 bases (Wang et al., 2011).
  • DCL2 like DCL4, plays an important role in limiting systemic viral infections (Garcia-Ruiz, et al., The Plant Cell, 22 (2), 481-496, 2010).
  • the outline of the functions of DCL2 to 4 is shown in FIGS. 1 and 2.
  • the genomic sequence of DCL of the target plant cell may be identified by a method known per se based on the information of the known plant cell.
  • the genomic sequences of DCL2, DCL3, and DCL4 of Nicotiana rustica for example, it can be specified by the following method.
  • DCL2 (Niben101Scf08272)
  • DCL3 Genomic DNA sequences of (Niben101Scf06666), DCL4a (Niben101Scf11936), DCL4b (Niben101Scf01789) can be identified.
  • the CDS sequence (base sequence) of DCL2 of Nicotiana and Bensamiana identified by the above method is SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2
  • the CDS sequence (base sequence) of DCL3 is SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4, DCL4a.
  • the CDS sequence (base sequence) of is shown by SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence is shown by SEQ ID NO: 6
  • the CDS sequence (base sequence) of DCL4b is shown by SEQ ID NO: 7
  • the amino acid sequence is shown by SEQ ID NO: 8.
  • the mutant of the present invention is a loss-of-function mutation in only one gene.
  • both genes have loss-of-function mutations.
  • a "gene loss-of-function mutation” is defined as a nonsense mutation or a frameshift mutation introduced into a gene, or deletion or addition of a part or all of a sequence of a gene, or another. It means a mutation in which the function of the protein encoded by the gene is lost by substituting with the sequence of.
  • the variants of the invention preferably introduce homozygous loss-of-function mutations (ie, have loss-of-function mutations in the genes of all allyl DCL proteins). The loss-of-function mutation results in a shorter and incomplete DCL protein compared to the wild-type protein, or no expression of the DCL protein is observed.
  • the mutation position that causes the loss-of-function mutation is not particularly limited.
  • mutation positions include the middle of the double-stranded RNA-binding domain (dsrm a or dsrm b) existing on the C-terminal side or the upstream side from the domain starting point, but the region on the N-terminal side, for example, the DEAD domain. It is preferably a region consisting of a non-coding region and a helicase C domain or its vicinity.
  • the mutants of the present invention have the ability to express foreign genes due to the loss-of-function mutations in the DCL protein gene as compared to wild-type cells or plants. Is improved.
  • a foreign gene is introduced into a tissue (eg, leaf) of a mutant of the present invention in which a mutation has been introduced into the DCL2 gene and / or the DCL4 gene
  • the above is applied to all the genes of the DCL protein in the tissue. It expresses 6-fold or more (in a preferred embodiment, 10-fold or more, or 40-fold or more) of the protein as compared with the tissue of a plant (control plant) having no loss-of-function mutation.
  • the mutant (cell) of the present invention is 6 times or more (eg, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times) as compared with a cell having no loss-of-function mutation. , 15 times, 20 times, 25 times, 30 times, 35 times, 40 times or more) has the ability to express foreign genes.
  • the expression ability of such a foreign gene itself can be evaluated by comparing the amount of protein and enzyme activity by Western blotting, or the amount of mRNA measured by RT-PCR.
  • the expression level of GFP as a foreign gene introduced into cells using Agrobacterium is based on the value measured by Western blotting 6 days after inoculation with Agrobacterium.
  • the mutant of the present invention has the above-mentioned GFP gene as a foreign gene, and it is not essential to use a TuMV replication system or the like.
  • the foreign gene it is preferable to have a loss-of-function mutation in at least one of the DCL2 gene and the DCL4 gene, and it is more preferable to have a loss-of-function mutation in both the DCL2 gene and the DCL4 gene.
  • the mechanism by which the expression capacity of foreign genes is significantly improved by introducing a loss-of-function mutation into the DCL2 gene or DCL4 gene is as follows. Will be done. First, the mRNA expressed from the introduced foreign gene becomes a double-stranded RNA in the cell, and the double-stranded RNA is degraded by DCL2 or DCL4 to generate siRNA. Subsequently, the complex of the siRNA and the AGO protein forms a partial double strand with the mRNA expressed from the foreign gene, and the formation of the double strand causes cleavage of the mRNA. Therefore, for DCL3, which cleaves double-stranded RNA to generate siRNA, it is considered that the suppression of transcriptional level expression will not occur by introducing a loss-of-function mutation into the DCL3 gene. It is presumed that the expression ability of
  • Solanaceae plant from which the cells used in the present invention are derived examples include a plant belonging to the genus Nicotiana, a plant belonging to the genus Genus Solanum, a plant belonging to the genus Genus Capsicum, and the genus Datura. Examples include, but are not limited to, plants belonging to (Genus Datura) and plants belonging to the genus Datura (Genus Brugmansia).
  • Preferred Solanaceae plants are plants belonging to the genus Nicotiana (also referred to as "plants of the genus Nicotiana").
  • Examples of plants belonging to the genus Tobacco include Nicotiana acaulis, Nicotiana acuminata, Nicotiana africana, Nicotiana alata, and Nicotiana acuminata. amplexicaulis), Nicotiana arentsii, Nicotiana attenuata, Nicotiana benavidesii, Nicotiana benthamiana, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigerobii , Nicotiana cavicola, Nicotiana clevelandii, Nicotiana cordifolia, Nicotiana cordifolia, Nicotiana corymbosa, Nicotiana debneyi, Nicotiana debneyi excelsior), Nicotiana forgetiana, Nicotiana fragrans, Nicotiana glauca, Nicotiana glutinosa, Nicotiana goodspeedii, Nicotiana goodspeedii Nicotiana gossei, Nicotian ingulba, Nicotiana kawakamii, Nicotian knightiana, Nicotiana langsdorfi,
  • Examples of plants belonging to the genus Solanaceae include Solanum aethiopicum, Solanumamericanum, Solanumcarolinense, Solanumbetaceum, Solanumlycopersicum, and Solanum. Examples include Solanum mammosum, Solanum melongena, Pepino (Solanum muricatum), Inuhozuki (Solanum nigrum), Tama coral (Solanum pseudocapsicum), and potato (Solanum tuberosum).
  • Plants belonging to the genus Capsicum include, for example, Capsicum annuum, Locoto baccatum, Capsicum cardenasii, Capsicum chinense, Capsicum frutescens, and Capsicum frutescens. Can be mentioned.
  • Examples of plants belonging to the genus Datura include Datura metel, Datura inoxia, and Jimsonweed Datura stramonium.
  • Examples of plants belonging to the genus Angel's trumpets include Angel's trumpets (Brugmansia arborea) and Angel's trumpets (Brugmansia suaveolens).
  • plant body includes any of plant individuals, plant organs, plant tissues, plant cells, and seeds.
  • plant organs include roots, leaves, stems, and flowers.
  • plant cells also include cells in the plant body. Further included are various forms of plant cells such as suspended cultured cells, protoplasts, leaf sections, root sections, callus, immature embryos, pollen and the like.
  • some or all of the cells constituting the plant are variants of the present invention (that is, having a loss-of-function mutation in the DCL gene), it is preferable that all cells are variants of the present invention.
  • having no foreign gene means having at least no transgene (for example, CRISPR-Cas system, etc.) used in producing a genetically modified organism.
  • base insertion into the target site typically tens of base pairs or less
  • NHEJ non-homologous end binding
  • HDR homologous recombinant repair
  • “Foreign gene-free” cells or plants include cells and plants from which the above-mentioned introduction gene has been removed (eg, null-segregant, cells and plants from which the introduction gene has been removed by a transposon system, etc.). Not only (body, etc.) but also cells and plants having spontaneous mutations are included.
  • the "null mutant individual” is a progeny individual obtained by mating genetically modified organisms or a genetically modified organism with a non-genetically modified organism that does not have the introduced foreign gene. means.
  • the loss-of-function mutation of the DCL protein gene possessed by the mutant of the present invention may be, for example, a natural mutation or an artificially introduced mutation (mutation original treatment, homologous recombination of gene, genome editing).
  • the cell or plant having the gene into which the mutation is artificially introduced is also referred to as a "gene recombinant" or a "transformer”.
  • Spontaneous mutations in the above genes can occur spontaneously due to replication errors and gene damage.
  • the mutagen treatment include exposure of cells or plants to radiation, neutron rays, ultraviolet rays or a mutagen (for example, EMS).
  • Homologous recombination of a gene can be carried out by homologous recombination of a part or all of the target gene with a recombinant sequence containing a sequence homologous to such a region according to a known gene recombination technique.
  • Genome editing can be performed by known techniques (eg, zinc-finger nucleases: ZFN, transcription activator-like effector nucleases: TALEN, CRISPR / Cas9 system, etc.).
  • the mutant of the present invention can be produced by introducing a loss-of-function mutation into the DCL protein gene of Solanaceae plant cells by genome editing.
  • a complex of a nuclease or deaminase with a nucleic acid sequence recognition module targeting at least one gene selected from the group consisting of DCL2 gene, DCL4 gene and DCL3 gene (hereinafter, Provided is a method for producing a variant of the present invention, which comprises the step of introducing a nucleic acid encoding the "nucleic acid-modifying enzyme complex" into a plant cell of the family Nucleic acid.
  • the nucleic acid encoding the nucleic acid modifying enzyme complex includes a base sequence encoding a nucleic acid sequence recognition module and a base sequence encoding a nuclease or deaminase, and when the CRISPR-Cas system is used, the nucleic acid is said to be used.
  • the complex also contains a sequence encoding a guide RNA.
  • nucleic acid sequence recognition module means a molecule or molecular complex capable of specifically recognizing and binding to a target sequence on a DNA strand. The binding of the nucleic acid sequence recognition module to the target sequence allows the nuclease or deaminase linked to the module to act specifically on the sequence or its neighboring regions.
  • Nucleic acid sequence recognition modules include, for example, CRISPR-Cas system, zinc finger motif, TAL effector and PPR motif, as well as DNA binding domains of proteins that can specifically bind to DNA such as restriction enzymes, transcription factors and RNA polymerases. Examples include fragments containing. Preferred are the CRISPR-Cas system, zinc finger motif, TAL effector or PPR motif.
  • the zinc finger motif is a combination of 3 to 6 zinc finger units of different Cys2His2 types (1 finger recognizes about 3 bases), and can recognize the target nucleotide sequence of 9 to 18 bases.
  • Zinc finger motifs are Modular assembly method (Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141), OPEN method (Mol Cell (2008) 31: 294-301), CoDA method (Nat Methods (2011) 8: 67-69). , Escherichia coli one-hybrid method (Nat Biotechnol (2008) 26: 695-701) and the like.
  • Japanese Patent No. 4968498 can be referred to.
  • the TAL effector has a repeating structure of modules in units of about 34 amino acids, and the 12th and 13th amino acid residues (called RVD) of one module determine the binding stability and base specificity. Ru. Since each module is highly independent, it is possible to create a TAL effector specific to the target nucleotide sequence simply by connecting the modules together.
  • the TAL effector is a production method using open resources (REAL method (Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15), FLASH method (Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465), Golden Gate method (Nucleic Acids). Res (2011) 39: e82), etc.) has been established, and it is possible to design a TAL effector for a target nucleotide sequence relatively easily.
  • Japanese Patent Publication No. 2013-513389 can be referred to.
  • the PPR motif is composed of 35 amino acids and is configured to recognize a specific nucleotide sequence by a series of PPR motifs that recognize one nucleobase, and the 1st, 4th, and ii (-2) amino acids of each motif. Only recognize the target base. Since there is no dependence on the motif composition and there is no interference from the motifs on both sides, it is possible to produce a PPR protein specific to the target nucleotide sequence simply by connecting the PPR motifs, as with the TAL effector. For details of the production of the PPR motif, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-128413 can be referred to.
  • CRISPR-RNA containing sequences complementary to the target nucleotide sequence and, if necessary, trans-activating RNA (tracrRNA) and (tracrRNA) required for recruiting Cas proteins If necessary, it can be provided as a chimeric RNA with crRNA), as a complex with Cas protein.
  • RNA molecules consisting of crRNA alone or a chimeric RNA in which crRNA and tracrRNA are linked, which constitutes a nucleic acid sequence recognition module in combination with Cas protein are collectively referred to as "guide RNA”.
  • Cas protein used in the present invention is not particularly limited as long as it can form a complex with a guide RNA and recognize and bind to the target nucleotide sequence in the target gene and the adjacent protospacer adjacent motif (PAM).
  • PAM adjacent protospacer adjacent motif
  • Cas9 or Cpf1 includes, for example, Cas9 (SpCas9; PAM sequence NGG (N is A, G, T or C; the same applies hereinafter)) derived from Streptococcus pyogenes, and Cas9 (StCas9) derived from Streptococcus thermophilus.
  • Examples include, but are not limited to, the PAM sequence NNAGAAW), Cas9 (NmCas9; PAM sequence NNNNGATT) derived from Neisseria meningitidis, and the modified Cas9 group with modified PAM recognition specificity. SpCas9, which is less constrained by PAM, is preferred (substantially 2 bases).
  • Examples of Cpf1 include Cpf1 (FnCpf1; PAM sequence NTT) derived from Francisella novicida, Cpf1 (AsCpf1; PAM sequence NTTT) derived from Acidaminococcus sp., And Lachnospiraceae bacteria.
  • Cas proteins include those having the ability to cleave both strands of a double-stranded DNA strand, those having a nickase activity in which only the ability to cleave one strand has been deactivated, and those having the ability to cleave both strands inactivated. However, both can be used.
  • the 10th Asp residue is converted to an Ala residue and lacks the ability to cleave the opposite strand of the strand that forms a complementary strand with the guide RNA (hence, for the strand that forms a complementary strand with the guide RNA).
  • the D10A mutant (having nickase activity) or the chain in which the His residue at position 840 is converted with the Ala residue and forms a complementary strand with the guide RNA lacks the ability to cleave the strand to form a complementary strand with the guide RNA (hence, forms a complementary strand with the guide RNA).
  • H840A having nickase activity against the opposite strand of the strand
  • dCas9 double variant thereof
  • FnCpf1 a mutant lacking the ability to cleave both strands, in which the Asp residue at position 917 was converted to Ala residue (D917A) or the Glu residue at position 1006 was converted to Ala residue (E1006A).
  • D917A Asp residue at position 917 was converted to Ala residue
  • E1006A Glu residue at position 1006 was converted to Ala residue
  • a nucleic acid modifying enzyme complex By binding any of the above nucleic acid sequence recognition modules to a nuclease or deaminase, a nucleic acid modifying enzyme complex can be prepared.
  • a guide RNA that recognizes the target sequence and a Cas protein having nuclease activity recruited by the guide RNA form a nucleic acid modifying enzyme complex.
  • the guide RNA, Cas protein inactivated at least one of the DNA-cleaving abilities (also referred to as "mutant Cas protein"), and deaminase form a nucleic acid-modifying enzyme complex.
  • mutant Cas protein also referred to as "mutant Cas protein”
  • deaminase form a nucleic acid-modifying enzyme complex.
  • the "complex” includes not only those composed of a plurality of molecules but also those having a nucleic acid sequence recognition module and a nuclease or deaminase in a single molecule, such as a fusion protein. Therefore, the nucleic acid sequence recognition module can also be provided as a fusion protein with a nuclease or deaminase, or a protein binding domain such as SH3 domain, PDZ11 domain, GK domain, GB domain and their binding partners. Nucleic acid sequence recognition modules may be fused to nucleases or deaminases, respectively, and provided as a protein complex via interaction of the domain with its binding partner. Alternatively, the nucleic acid sequence recognition module and nuclease or deaminase can be fused with intein, respectively, and the two can be linked by ligation after each protein synthesis.
  • nuclease used in the present invention examples include Cas protein (eg, Cas9, Cpf1), endonuclease (eg, restriction enzyme such as FokI), exonuclease, and the like.
  • deaminase examples include cytosine deaminase capable of converting cytosine or 5-methylcytosine to uracil or thymine, adenosine deaminase capable of converting adenine to hypoxanthine, guanosine deaminase capable of converting guanine to xanthine, and the like.
  • the cytidine deaminase includes activation-induced cytidine deaminase (hereinafter, also referred to as AID), which is an enzyme that introduces a mutation into an immunoglobulin gene in acquired immunity of vertebrates.
  • AID activation-induced cytidine deaminase
  • deaminase is not particularly limited, but for example, PmCDA1 (Petromyzon marinus cytosine deaminase 1) derived from lamprey, AID (Activation-induced cytidine deaminase; AICDA) derived from mammals (eg, human, pig, bovine, horse, monkey, etc.) ) Or APOBEC protein can be used.
  • PmCDA1 Petromyzon marinus cytosine deaminase 1
  • AID Activation-induced cytidine deaminase
  • mammals eg, human, pig, bovine, horse, monkey, etc.
  • APOBEC protein Activation-induced cytidine deaminase
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of PmCDA1 cDNA can be referred to GenBank accession No. EF094822 and ABO15149
  • the nucleic acid modifying enzyme complex is typically introduced into the cell in the form of a nucleic acid encoding the complex, which may be DNA or RNA, but is preferably DNA. ..
  • a nucleic acid encoding the complex which may be DNA or RNA, but is preferably DNA. ..
  • DNA it is preferably double-stranded DNA and is provided in the form of an expression vector placed under the control of a functional promoter in the host cell.
  • Such nucleic acids may be prepared using genetic engineering techniques or may be chemically synthesized.
  • the nucleic acid is DNA
  • the DNA strand is chemically synthesized, or the synthesized oligo DNA short strands that partially overlap are connected by using the PCR method, Gibson Assembly method, or the like to form a protein. It is also possible to construct DNA that encodes the full length of the.
  • the advantage of constructing a full-length DNA in combination with chemical synthesis, PCR method, or Gibson Assembly method is that the codons used can be designed over the entire length of the CDS according to the host into which the DNA is introduced.
  • codons used When expressing heterologous DNA, it is expected that the protein expression level will increase by converting the DNA sequence into codons that are frequently used in the host organism.
  • the genetic code usage frequency database published on the homepage of Kazusa DNA Research Institute can be used, or the literature describing the codon usage frequency in each host can be used. You may refer to it.
  • Expression vectors containing a nucleic acid sequence recognition module and / or DNA encoding a nuclease or deaminase can be prepared, for example, by linking the DNA downstream of the promoter in a vector containing a promoter capable of functioning in plant cells. Can be done.
  • the vector that can be replicated in plant cells is not particularly limited as long as it has an origin of replication that functions in plant cells (eg, Ti plasmid, Ri plasmid ori, etc.), but it is not particularly limited as long as it has an origin of replication in Escherichia coli (eg, ColE1 ori). Etc.) is also preferable.
  • T-DNA fragments including borderline sequences RB and LB
  • T-DNA fragments including borderline sequences RB and LB
  • pBI101 derived from pBIN19.
  • PBI121 Cell Biotech
  • improved vectors using this as a backbone eg, pRI909, pRI910, pRI101, pRI201 (Takarabio), etc.
  • plant virus vectors eg, Potatovirus X (PVX) vector, cub mosaic virus (Turnip mosaic virus; TuMV) vector, tobacco mosaic virus (Tobacco mosaic virus; TMV) vector, sage mosaic virus (Cowpea mosaic)
  • PVX Potatovirus X
  • TuMV cub mosaic virus
  • TuMV tobacco mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • sage mosaic virus sage mosaic virus
  • the above-mentioned plasmid may be a virus-derived replication system.
  • the plasmid may contain only the region required for replication of the virus from the viral genome.
  • virus-derived replication systems include TuMV-derived replication systems, TMV-derived replication systems (eg, magnICON system), CPMV-derived replication systems (eg, Profica system), and Ingen yellow spot atrophy virus (Bean yellow dwarf virus). ; BeYDV) -derived replication system (for example, Tsukuba system (WO2018 / 220929)), but is not limited to these.
  • a plasmid that does not have the above-mentioned virus-derived replication system may be used.
  • the promoter may be any promoter as long as it can function in plant cells. Induced promoters (eg, injury, salicylic acid-induced PR1 ⁇ gene promoter, dry, low temperature, abscisic acid-induced rd29A gene promoter, dichloromid-treated GST-27 gene promoter, etc.) are used as promoters. Therefore, the number of cells may be increased by the start of induction.
  • a constituent promoter can also be used as the promoter. Examples of the constituent promoters include cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, CaMV19S promoter, noparin synthase (NOS) promoter, and parsley-derived ubiquitin promoter (Pcubi4-2).
  • Tandemly linked promoters or fragments thereof can also be used.
  • PClSV Peanutt chlorotic streak virus
  • FMV Figwortmosaic virus
  • plant DNA virus belonging to the genus Soymovirus and Calimo.
  • Flt (Flt) of each virus such as MMV (Mirabilis mosaic virus), which is a plant virus belonging to the genus Virus, CsVMV (Cassavavein mosaic virus), which is a plant virus belonging to the genus Cavemo virus, and DMV (Dahlia mosaic virus), which is a plant virus belonging to the genus Carimovirus.
  • MMV Malodors mosaic virus
  • CsVMV Cassavavein mosaic virus
  • DMV Denshlia mosaic virus
  • the Full length transcriptional) promoter can be used as a plant gene expression system in the same manner as the 35S promoter (especially the Flt promoter derived from MMV is highly effective).
  • the expression level is improved by expressing the foreign gene using a plurality of types of promoters instead of using one type of promoter when expressing the foreign gene. Therefore, it is preferable to use a plurality of promoters even when only one type of foreign gene is expressed.
  • the increase in expression is such that when a construct with the same promoter is introduced into a plant cell, it is more on the plant cell genome than when multiple promoters are used. It is presumed that TGS is relatively likely to occur due to the large number of promoters. Further, the Flt promoter may be free from the 5'UTR derived from the virus from which each promoter is derived.
  • Expression vectors can optionally be terminators (eg, NOS terminators, pea rbcS3A terminators, heat shock protein (HSP) 18.3 terminators, etc.), translation enhancers (eg, rice-derived alcohol dehydrogenase 5'untranslated regions (Os ADH-5'UTR)). , Tobacco mosaic virus (TMV) -derived ⁇ sequence, etc.), 3'regulatory region (eg, rice-derived actin gene (Act1) 3'UTR, etc.), Poly A addition signal, drug resistance gene (eg, G418 resistance gene (nPtII)) , Hyglomycin resistance gene (hpt), etc.) can contain selection markers and the like.
  • terminators eg, NOS terminators, pea rbcS3A terminators, heat shock protein (HSP) 18.3 terminators, etc.
  • translation enhancers eg, rice-derived alcohol dehydrogenase 5'untranslated regions (Os ADH-5'UTR)
  • the DNA encoding the guide RNA is a sequence encoding a crRNA sequence (for example, when Cpf1 is recruited as a Cas protein) containing a sequence homologous to the target sequence (also referred to as a targeting sequence), or a crRNA coding sequence.
  • a crRNA sequence for example, when Cpf1 is recruited as a Cas protein
  • a targeting sequence also referred to as a targeting sequence
  • an oligo DNA sequence linked with a known tracrRNA coding sequence for example, when Cas9 is recruited as a Cas protein
  • the length of the target targeting sequence is, for example, 15-30 nucleotides, preferably 18-25 nucleotides.
  • a target sequence means a sequence of a strand opposite to the strand forming a double strand with a guide RNA.
  • the DNA encoding the guide RNA can also be inserted into the same expression vector as above, but the promoters include polIII-based promoters (eg, SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U3, U6, H1 promoters, etc.). And a terminator (eg, poly T sequence (T6 sequence, etc.)) is preferably used.
  • the promoters include polIII-based promoters (eg, SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U3, U6, H1 promoters, etc.).
  • a terminator eg, poly T sequence (T6 sequence, etc.) is preferably used.
  • RNA encoding the nucleic acid sequence recognition module and / or the nuclease or deaminase is prepared, for example, by transcribing the above-mentioned vector encoding the DNA encoding the complex into mRNA using a known in vitro transcription system. can do.
  • a nucleic acid modifying enzyme complex can be expressed intracellularly by introducing a nucleic acid sequence recognition module and / or an expression vector containing DNA encoding a nuclease or deaminase into a host plant cell and culturing the host cell.
  • the introduction of the nucleic acid modifying enzyme complex into cells can be carried out by a method known per se, for example, a nucleic acid sequence recognition module and / or a DNA encoding a nuclease or deaminase (eg, a nucleic acid in the form of an expression vector). It can be introduced in the form of.
  • the introduction of the expression vector is performed by a known method (eg, Agrobacterium method, PEG method, electroporation, etc.) for an appropriate tissue (eg, callus, root, leaf, seed, growth point, etc.) depending on the type of plant. It can be carried out according to the method, particle gun method, direct whisker introduction method, etc.), but the Agrobacterium method is usually used.
  • a known method eg, Agrobacterium method, PEG method, electroporation, etc.
  • tissue eg, callus, root, leaf, seed, growth point, etc.
  • the Agrobacterium method is usually used.
  • a part of tobacco tissue eg, tobacco leaf
  • embryonic axis is cut out and infected with Agrobacterium (in other words, Agrobacterium is sown).
  • the recombinant plant can be obtained by inducing callus and then rooting after selecting the recombinant.
  • the callus may be infected with Agrobacterium.
  • agrobacterium is typically DNA that encodes a nucleic acid sequence recognition module and / or a nuclease or deaminase in the T-DNA fragment of the agrobacterium expression vector (when using the CRISPR-Cas system).
  • a DNA having a Cas protein or a complex of a mutant Cas protein and a deaminase and an expression cassette containing a DNA encoding a guide RNA incorporated therein) is used.
  • a protoplast is prepared from an appropriate cell / tissue according to a conventional method, and an expression vector is introduced into the protoplast.
  • an expression vector adsorbed on gold fine particles can be introduced into a callus, an immature embryo, a growth point existing in a shoot apex, an axillary bud, or the like by using a particle gun.
  • gene transfer is often chimeric, so sample cells in which the above nucleic acid is frequently introduced into germline cells are used for transformation. Need to use. For example, embryos, hypocotyl sections, embryogenic callus, isolated growth points and the like can be mentioned.
  • Culturing of plant cells into which a vector has been introduced can be carried out according to a known method according to the type.
  • a solid medium eg, agar medium, agarose medium, gellan gum medium, etc.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for the growth of the transformant.
  • N6 medium, MS medium, MSR medium, LS medium, B5 medium and the like are used as the basal medium.
  • Plant growth substances eg, auxins, cytokinins, etc.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • the culture temperature can be appropriately selected within the range of usually about 20 to about 35 ° C. depending on the type of plant cells.
  • a plant cell of the genus Nicotiana it can be usually cultured at 28 to 33 ° C, preferably 30 to 33 ° C.
  • the plant cell or plant body of the present invention can be selected by a person skilled in the art by a known method as appropriate according to the type of marker gene used.
  • a drug resistance gene eg, a drug resistance gene such as a canamycin resistance gene (nptII) or a hyglomycin resistance gene (hpt)
  • nptII canamycin resistance gene
  • hpt hyglomycin resistance gene
  • the transformant clone in which the introduction of mutation is confirmed can be redifferentiated into a plant by a redifferentiation method known per se. If a plant containing a plant cell in which a mutation has been introduced into the target region is obtained, it is possible to obtain offspring from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain breeding materials (for example, seeds, fruits, cut ears, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant, its descendants or clones, and mass-produce the plant based on them. Accordingly, the present invention includes a plant containing the plant cells of the present invention, progeny and clones of the plant, and reproductive materials for the plant, progeny thereof, and clones.
  • breeding materials for example, seeds, fruits, cut ears, strains, callus, protoplasts, etc.
  • the T1 plant obtained by self-pollinating the obtained plant is further self-pollinated to obtain the T2 plant, so that the plant is homozygously mutated. Can be obtained.
  • the plant for plants that have been homozygously mutated, by selecting an individual that does not have the foreign gene used for mutation introduction, that is, the gene encoding the nucleic acid modifying enzyme complex, or by further alternation of generations. By advancing, a null-separated individual can be produced.
  • the present invention relates to a method for producing a target protein using the variant of the present invention (hereinafter, "" It may be referred to as "a method for producing a protein of the present invention”).
  • the method is, for example, (1) A step of introducing a nucleic acid encoding a target protein (hereinafter, may be referred to as “target protein-encoding nucleic acid”) into a mutant of the present invention, and (2) a step (2) a target protein-encoding nucleic acid in step (1).
  • the target protein-encoding nucleic acid contains a gene encoding the target protein, and the gene may be a gene naturally possessed by the cell into which the nucleic acid is introduced (in this case, it is encoded by the gene). It is preferable that the gene (that is, the gene overexpressing the protein) is a gene that the cell does not naturally possess (that is, a gene encoding a heterologous protein).
  • the target protein-encoding nucleic acid may be DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • DNA it is preferably double-stranded DNA and is provided in the form of an expression vector placed under the control of a functional promoter in the host cell.
  • the method for producing the target protein-encoding nucleic acid, the type of expression vector, other elements such as promoters and terminators contained in the expression vector, the method for introducing the expression vector into cells, the method for culturing cells, etc. are described in the above-mentioned nucleic acid modifying enzyme complex.
  • the description of the nucleic acid encoding the body can be incorporated. In this case, "encoding the nucleic acid modifying enzyme complex" and "encoding the nucleic acid sequence recognition module and / or nuclease or deaminase” shall be read as "encoding the target protein".
  • the target protein is not particularly limited, but for example, an antibody, interferon (eg, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , etc.) and the like.
  • examples include high value-added proteins, antigens, and proteins that are difficult to express (eg, peroxidase of western wasabi).
  • viruses examples include Varisellovirus virus (eg, Varicella Zostervirus, etc.) and Simplexvirus virus (Herpessimplex). virus 2), etc.), Genus Roseolovirus virus (eg, human herpesvirus 6, 7), etc.) Herpesviridae virus; Genus Hepacivirus ) Virus (eg, hepatitis C virus, etc.), Flavivirus genus (Genus Flaviviridae) virus (eg, Japanese encephalitis virus, Zika virus, etc.) (Family Flaviviridae) virus; beta coronavirus (Genus Betacoronavirus) virus (eg, SARS coronavirus (Severe acute respiratory syndrome coronavirus: SARS-CoV), SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2)), MERS coronavirus ( MiddleEastrespiratory syndrome coronavirus), etc.) Coronavirus family (FamilyCoronaviridae) virus; type A influenza virus (Influenzavirus
  • Retroviridae virus includes, for example, Genus Lentivirus virus (eg, Human Immunodeficiency Virus, etc.) and other Retroviridae virus. ) Virus etc. can be mentioned.
  • the target protein can be expressed by culturing the cells into which the target protein-encoding nucleic acid has been introduced.
  • the target protein can also be expressed by infecting a part of the plant (eg, leaves) with Agrobacterium having the target protein-encoding nucleic acid and then growing the plant.
  • the target protein can be obtained by extracting and purifying useful components from the cells obtained in step (2) by a method known per se, or by secreting the target protein in a culture medium and recovering the target protein. Can be isolated. Alternatively, the cells may be frozen and dried and used as they are. Similarly, the target protein of a plant can be isolated by extracting and purifying a useful component from the plant by a method known per se. Alternatively, the plant body may be used as it is. Therefore, the method for producing a protein of the present invention may include a step of isolating the protein from the cells or plants expressing the target protein obtained in (3) step (2).
  • isolation method for example, a method of crushing a plant with a mixer or a mortar and then immersing it in an appropriate buffer solution such as physiological saline to remove the crushed residue by centrifugation or filtration. Can be mentioned.
  • the present invention comprises (A) a step of infecting a variant of the present invention with a virus and propagating the virus, and (B) a step of recovering the virus propagated by the step (A).
  • a method for spreading a virus including. Examples of such viruses include attenuated plant viruses used as biopesticides. Both the above steps (A) and (B) can be performed by a method known per se.
  • Attenuated plant virus means a virus with reduced pathogenicity to the host. Since it retains its ability to grow in the host, it can be used as a biopesticide because it can suppress the onset of diseases caused by viruses that infect it later by treating the plant in advance.
  • Attenuated plant viruses include, for example, tomato mosaic virus attenuated virus (eg TMV-L11A), cucumber mosaic virus attenuated virus, Togarashi mild mottle virus attenuated virus (eg TMV-P), watermelon green spot mosaic virus. Examples include, but are not limited to, attenuated viruses, attenuated viruses of Zucchini yellow spot mosaic virus, attenuated viruses of soybean mosaic virus, attenuated viruses of citrus tristeza virus, and the like.
  • a plant cell having a loss-of-function mutation of the dicer-like (DCL) protein produced in the present invention or a plant containing the cell can be infected with, for example, the above-mentioned attenuated plant virus and propagated in large quantities.
  • Example 1 Production of tobacco that does not cause PTGS and TGS
  • multiple genes were used while avoiding TGS based on the verification of transient gene expression in N. benthamiana using the agroinfiltration method. The purpose is to establish a system for overexpression.
  • the DCL3 protein involved in TGS (Fig. 2)
  • the DCL2 and DCL4 proteins involved in PTGS are expressed (Fig. 1). Therefore, in the transient expression experiment using the wild type, the action of PTGS could not be excluded, and it was considered difficult to evaluate the suppression of gene expression by TGS alone. Therefore, in this study, in order to produce N. benthamiana that does not cause PTGS, we performed genome editing targeting the NbDCL2 and NbDCL4 genes using the CRISPR / Cas9 system.
  • Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) strain (Koncz et al., 1986) was used for transient gene expression experiments by agroinfiltration.
  • the GV3101 strain has a rifampicin (Rif) resistance gene on the genome, and a Vir gene and a gentamicin (Gen) resistance gene required for transformation on a helper plasmid.
  • GV3101 strain (GV3101 pSoup-Spec) in which a conjugated plasmid pSoup-Spec (Kumakura et al., 2013) having a spectinomycin (Spe) resistance gene was introduced into the GV3101 strain to prepare a transformant of N. benthamiana. Was used.
  • Plasmid ⁇ pWAT135-FLAG-hcoCas9-3001, 3002, 3003, 3004 It is a plasmid derived from pWAT1 and has an RPS5A promoter and HSP18.2 terminator derived from Arabidopsis thaliana, and expresses the hcoCas9 gene under the control of this RPS5A promoter.
  • a cassette expressing the target gRNA is ligated (Fig. 3).
  • N. benthamiana's DCL2, DCL3, DCL4a and DCL4b genes were used for genome editing.
  • DCL2-gRNA2, DCL3-gRNA1 and DCL4-gRNA1 are expressed under the control of the U6 promoter.
  • DCL2-gRNA3, DCL3-gRNA1 and DCL4gRNA1 are expressed under the control of the U6 promoter.
  • DCL2-gRNA2, DCL3-gRNA2, and DCL4-gRNA1 are expressed under the control of the U6 promoter.
  • DCL2-gRNA3, DCL3-gRNA2, and DCL4-gRNA1 are expressed under the control of the U6 promoter.
  • Nicotiana benthamiana About 30 seeds of Nicotiana benthamiana were taken in a 1.5 mL tube, 1 mL of DW and 2 ⁇ L of PPM TM (Plant Cell Technology) were added thereto, and the mixture was inverted and mixed. The tube was allowed to stand overnight at 4 ° C and sterilized. Then, sterilized N. benthamiana seeds were uniformly spread on MS solid medium. Excess water on the MS solid medium was removed, and the petri dish was sprinkled with surgical tape and grown at 16 hours light period, 8 hours dark period, and 24 ° C. for about 2 weeks.
  • PPM TM Plant Cell Technology
  • Transformation of Agrobacterium pWAT135-FLAG-hcoCas9-3001, 3002, 3003, 3004 were transformed into Agrobacterium.
  • Each plasmid targets a cassette expressing gRNA2, 3 targeting NbDCL2 (Figs. 4 and 5), a cassette expressing gRNAs 1 and 2 targeting NbDCL3 (Figs. 6 and 7), and NbDCL4a and NbDCL4b.
  • Each 300 ng plasmid was added to 40 ⁇ L of competent cells of the Agrobacterium GV3101 pSoup-Spec strain, frozen in liquid nitrogen, and then incubated at 37 ° C. for 30 minutes to introduce the plasmid.
  • Transformation of N.benthamiana Single colonies of Agrobacterium GV3101 pSoup-Spec strain cultured on LB agar were pecked with a sterilized 10 ⁇ L chip, 50 ng / ⁇ L canamycin, 50 ng / ⁇ L gentamicin, 50 ng /
  • the cells were transferred to 5 mL of LB liquid medium containing ⁇ L of rifampicin and 50 ng / ⁇ L of gentamicin and cultured with shaking at 28 ° C. for 24 hours. Then, the supernatant was removed by centrifugation at 4,000 rpm and 4 ° C. for 15 minutes, and 25 mL of MS1 liquid medium was added to the Agrobacterium pellet and suspended.
  • the leaves and hypocotyls of N. benthamiana grown on MS8 medium for 2 weeks were cut out with a scalpel and floated on an agro suspension for 2 to 3 minutes.
  • the plant pieces were air-dried on a sterilized Kim towel to remove the suspension.
  • the plants were allowed to stand at 24 ° C. in the dark for 2 days.
  • the rooted individuals were removed from the MSR medium, the medium on the roots was washed away and then planted in soil in plastic pots. A plastic pot was put on the plant to block the light, and a wrap was put on it to keep the humidity, and it was acclimatized for several days. After acclimatization, the plants were cultivated in the same manner as wild-type plants, and seeds were collected.
  • Genomic DNA extraction was performed to confirm whether mutations were introduced into the target gene sequence of the obtained transformant.
  • One leaf disc was collected in a 2 mL tube containing one stainless bead. After recovery, the sample in the tube was instantly frozen in liquid nitrogen. The frozen sample was crushed on a shaker for 2 minutes. After crushing, the sample was crushed at 15,000 rpm at room temperature and the crushed leaves were dropped to the bottom. Then, the stainless beads were removed from the tube, 100 ⁇ L of DNA extraction buffer was added, the vortex was vortexed, and the mixture was centrifuged at 15,000 rpm at room temperature for 2 minutes.
  • NbDCL2 In the NbDCL2 gene, individuals in which the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (DCL3 and DCL4a are wild type, DCL4b is unconfirmed) are pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 # 1-3-1, # 1-3-3. A total of 4 lines, 6, # 1-3-7, and # 1-10-8, were obtained (Table 2). In the NbDCL4a gene, one line of pWAT135-FLAG-hcoCas9-3002 # 1-9-4 was obtained for individuals in which the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (DCL2, DCL3 and DCL4b are wild type) (Table). 3).
  • the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (DCL3 is wild type, DCL4b is unconfirmed), pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 # 1-5-3, # 1-5- A total of 4 lines of 9, # 1-10-12 and # 3-4-9 were obtained (Table 4).
  • one line of pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 # 3-4-11 was obtained for individuals in which the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (DCL3 and DCL4a are wild type) (Table). 5).
  • NbDCL2 NbDCL4a and NbDCL4b genes
  • one line of pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 # 3-4-7 was obtained for individuals in which the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (DCL3 is a wild type) (Table). 6). It was confirmed that the hcoCas9 gene was not present in the obtained line, and that the transgene was null-separated from the obtained line.
  • the name of the transformant (transgene), the line number, the generation in which the transgene was null-separated and homofixed, the introduced mutant, and the name of the mutant are shown.
  • the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (in # 1-9-4, DCL2, DCL3 and DCL4b are wild type. Except for # 1-9-4, DCL2 and DCL3 are wild type. , DCL4b is unconfirmed), 11 lines were obtained.
  • the name of the transformant (transgene), the line number, the generation in which the transgene was null-separated and homofixed, the mutation introduced in the DCL2 gene, the mutation introduced in the DCL4a gene, and the mutant name are shown.
  • the DCL2 and DCL4a genes 4 lines were obtained for double mutant individuals in which the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (DCL3 is wild type, DCL4b is unconfirmed).
  • null separation was confirmed by PCR. An example is shown in FIG.
  • the name of the transformant (transgene), the line number, the generation in which the transgene was null-separated and homofixed, the mutation introduced in the DCL2 gene, the mutation introduced in the DCL4b gene, and the mutant name are shown.
  • the DCL2 and DCL4b genes one line was obtained for double mutant individuals (DCL3 and DCL4a are wild type) in which the transgene was null-separated and the mutation was homofixed.
  • the name of the transformant (transgene), line number, the generation in which the transgene was null-separated and homofixed, the mutation introduced in the DCL2 gene, the mutation introduced in the DCL4a gene, and the mutation introduced in the DCL4b gene.
  • the mutant name In the NbDCL2, NbDCL4a and NbDCL4b genes, one line of pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 # 3-4-7 was obtained for individuals in which the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (DCL3 is a wild type).
  • a mutation with a 1-base insertion of A was introduced at the 3rd base upstream from the PAM sequence on the genome of DCL4b (Fig. 14).
  • Two types of double mutations introduced into the DCL2 and DCL4a genes were confirmed.
  • a mutation was introduced with a 1-base insertion of G at the 4th base downstream from the PAM sequence on the DCL2 genome and a 5-base deletion mutation of TCTGA at the 3rd base upstream from the PAM sequence on the DCL4a genome. (Fig. 15).
  • the second was the introduction of a 5-base deletion of AACCT at the 4th base downstream from the PAM sequence on the DCL2 genome and a mutation with a 1-base insertion of A at the 3rd base upstream from the PAM sequence on the DCL4a genome.
  • the transformant into which the former mutation was introduced was designated as DCL2 / 4a double mutant (dcl2 / 4-1), and the latter was designated as dcl2 / 4a-2.
  • dcl2 / 4-1 double mutant
  • dcl2 / 4a-2 One type of double mutation introduced into the DCL2 and DCL4b genes was confirmed.
  • a 5 base deletion of AACCT at the 4th base downstream from the PAM sequence on the DCL2 genome Fig.
  • Phenotype of DCL mutant In this study, we confirmed the phenotype of N. benthamiana, which succeeded in genome editing of DCL2 and DCL4 genes.
  • DCL3 mutant tobacco production plasmid pWAT135-FLAG-hcoCas9-NbDCL3g2 It is a plasmid derived from pWAT1 and has an RPS5A promoter and HSP18.2 terminator derived from Arabidopsis thaliana, and expresses the hcoCas9 gene under the control of this RPS5A promoter.
  • a cassette expressing a gRNA targeting the DCL3 gene (NbDCL3) of N. benthamiana has been inserted (Fig. 7).
  • the DCL3 gene of N. benthamiana was used for genome editing.
  • DCL3-gRNA2 is expressed under the control of the U6 promoter.
  • the name of the transformant (transgene), the line number, the generation in which the transgene was null-separated and homofixed, the mutation introduced in the DCL3 gene, and the name of the mutant are shown.
  • the transgene was null-separated and the mutation was homofixed (# 2-4 and # 2-8).
  • null separation was confirmed by PCR.
  • Example 2 Confirmation of functional deficiency of DCL2 and DCL4 using plant virus
  • N. benthamiana that succeeded in genome editing of DCL2 and DCL4 genes was created.
  • the function deficiency of DCL2 and DCL4 proteins can be obtained by inoculating each mutant with plant RNA virus. It was confirmed.
  • Plasmid ⁇ pAT006-Fluc-iFAD2 A plasmid derived from pMDC123, which has a CaMV-derived 35S promoter and terminator, and expresses the firefly luciferase (FLuc) gene under the control of the promoter.
  • FLuc firefly luciferase
  • an intron of the FAD2 gene derived from Arabidopsis thaliana is inserted into the Fluc gene to prevent erroneous translation of Fluc in Agrobacterium cells (Fig. 20A).
  • ⁇ PAT010-Rluc-iFAD2 A plasmid derived from pMDC123, which has a Nopaline Synthase (NOS) promoter and a terminator derived from Agrobacterium tumefaciens, and expresses the sea urchin luciferase (Rluc) gene under the control of the promoter.
  • NOS Nopaline Synthase
  • Rluc sea urchin luciferase
  • an intron of the Arabidopsis thaliana-derived FAD2 gene is inserted into the Rluc gene to prevent erroneous translation of Rluc in Agrobacterium cells (Fig. 20B).
  • ⁇ PAT006-GFP A plasmid derived from pMDC123, which has a CaMV-derived 35S promoter and terminator, and expresses the GFP gene under the control of the promoter.
  • the same 5'UTR (5'-AAGGAGATATAACA-3'; SEQ ID NO: 29) as pAT006-Fluc-iFAD2 was introduced on the 5'side of the GFP gene.
  • pAT006-Fluc-iFAD2 has a sequence encoding the firefly luciferase gene (Fluc) linked downstream of 35SP and CaMVT further downstream. In this study, we used it to verify co-overexpression using different promoters.
  • pAT006 was cleaved with XhoI and XbaI, subjected to BAP treatment, and then gel recovery was performed to obtain a vector.
  • PCR was performed for GFP gene fragment amplification using the primers Xho-Fluc-5UTR-GFP-F and Xba-smGFP-R2.
  • the PCR product was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio), cleaved with XhoI and XbaI, and the gel was recovered to obtain an insert. This insert was ligated with the vector to make pAT006-GFP.
  • ⁇ PAT003P-GFP A plasmid derived from pMDC123, which has an MMV-derived Flt promoter and terminator.
  • the GFP gene is expressed under the control of this MMV promoter.
  • the same 5'UTR as pAT006-Fluc-iFAD2 was introduced on the 5'side of the GFP gene.
  • pAT003P-Fluc-iFAD2 was cleaved with XhoI and XbaI, BAP-treated, and then gel-recovered to obtain a vector.
  • PCR was performed for GFP gene fragment amplification using the primers Xho-Fluc-5UTR-GFP-F and Xba-smGFP-R2.
  • the PCR product was purified, cleaved with XhoI and XbaI, and the gel was recovered to obtain an insert. This insert was ligated with the vector to make pAT003P-GFP.
  • PCB-TuMV-GFP It is a plasmid derived from pCB302 and has a 35S promoter derived from CaMV and a Nos terminator derived from Agrobacterium tumefaciens. It encodes the cDNA of the Turnip mosaic virus (TuMV) with smGFP inserted between P1 and HC-Pro (Garcia-Ruiz et al., 2010). In this study, we used TuMV to confirm the functional deficiency of DCL mutants.
  • TuMV Turnip mosaic virus
  • TuMV-GFP was used to detect GFP fluorescence in each DCL mutant. Observation and quantification were performed.
  • pCB-TuMV-GFP an empty vector as a control, was transformed into Agrobacterium, and Agrobacterium was shake-cultured. After shaking culture, the agro culture solution was centrifuged at 4,000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes to remove the supernatant. 10 mL of Infiltration Solution was added thereto and resuspended.
  • wild-type N. benthamiana grown for 4 to 5 weeks with pre-watering and stomata and each DCL variant the left side of a total of 4 leaves of each 2 individuals is in the (+) section, on the right side.
  • Luc Assay Method In order to measure the activity of the luciferase protein expressed under the control of each promoter, a dual luciferase assay was performed on the inoculated leaves 6 days after inoculation. For the enzymatic activity of the luciferase protein, the Dual-Luciferase Reporter Assay System was used. The luminometer DLR-0-INJ program was used for the measurement. N. benthamiana leaf discs were harvested using a 2 mL tube containing stainless beads and instantly frozen in liquid nitrogen. Frozen samples were crushed using a shaker for 2 minutes. After crushing, the sample was crushed at 15,000 rpm and 4 ° C, and the crushed leaves were dropped to the bottom.
  • the values of the four measured values (Fluc / Rluc) in the (-) section were averaged and the values were converted to 1.
  • the mean values of the four measured values in the (+) section were also standardized.
  • the average value of the standardized (-) group and the average value of the (+) group are compared, and if the value of the average value of the (+) group is larger than 1, significant gene expression is observed in the (+) group. Whether it was observed was examined using the one-sided, homoscedastic t-test.
  • the mean value of the (-) group of WT and the (+) group of WT and the mean value of each DCL variant are compared, and the luciferase activity level in the (-) group and (+) group of each plant is compared.
  • the luciferase activity level in the (-) group and (+) group of each plant is compared.
  • the multiple comparison method Tukey's test.
  • the luciferase activity in the (-) section of the WT to be compared is set to 1
  • a graph showing the average value and standard error of the luciferase activity in the (-) and (+) sections of each other plant is created. did.
  • SDS-PAGE SDS-PAGE was performed using a wide mini-real slab electrophoresis device (Bio Craft, BE-280G). First, a 10% polyacrylamide separation gel solution was prepared, poured into a glass plate and hardened. Then, a 4.5% polyacrylamide concentrated gel solution was prepared and poured onto a separation gel and solidified. Subsequently, the electrophoresis apparatus was filled with 1x SDS electrophoresis buffer, 5 ⁇ L of CLEARLY Stained Protein Ladder (Takara Bio) was applied as a marker, and 10 ⁇ L of each protein-extracted sample was applied to the wells.
  • the constant current is 20 mA (BIOCRAFT BP-T5), and after the BPB is transferred to the separation gel, the constant current is 40 mA (BIOCRAFT BP-T5). ) was set and migration was performed.
  • the membrane (Immobilon®-P Transfer Membrane, Millipore) was cut out larger than the gel, moistened with methanol, and shaken with 1x Towbin Buffer for 5 minutes. The gel was shaken in 1x Towbin Buffer for 5 minutes. After the electrophoresis, the gel and the membrane were overlapped, and after cutting out larger than the membrane in advance, the gel and the membrane were sandwiched between two filter papers soaked in 1x Towbin Buffer. Furthermore, both sides were sandwiched between transfer sponges soaked in 1x Towbin Buffer in advance, and set in a tank-type transfer device (NA-1050B, Nippon Aido) so that the cathode side was the gel and the anode side was the membrane. After that, transfer was performed at a constant voltage of 45 V (BIOCRAFT BP-T8) at room temperature for 60 minutes.
  • BIOCRAFT BP-T8 constant voltage of 45 V
  • Blocking antibody reaction After transcription was completed, the membrane was transferred to a tapper, 1x TBST was added so that the membrane was immersed, and the mixture was shaken at room temperature for 10 minutes. After discarding 1x TBST, Blocking buffer (3% skim milk / 1x TBST) was placed in a tapper and shaken at room temperature for 1 hour or overnight at 4 ° C. After discarding the Blocking buffer, 1x TBST was placed in a tapper and shaken twice at room temperature for 5 minutes. After repeating twice, the membrane was placed in hybrid back soft.
  • Blocking buffer 3% skim milk / 1x TBST
  • the membrane was removed from the hybrid bag and shaken 3 times at 1 x TB ST for 5 minutes. After repeating 3 times, the membrane was placed on a folded wrap on all sides, and 400 ⁇ L of LuminataTM Forte Western HRP Substrate (Millipore) was dropped evenly over the entire membrane, and GFP was detected by the ChemiDoc XRS + system.
  • TuMV inoculation experiment in DCL mutant TuMV-GFP was used to confirm the functional deficiency of DCL2 and DCL4 proteins.
  • the leaves of N. benthamiana WT, dcl2 / 4b-1, dcl4a-1 and dcl2 / 4a / 4b-1 were inoculated with pCB-TuMV-GFP and an empty vector as a control.
  • GFP fluorescence was observed in the inoculated leaves 6 days after inoculation.
  • stronger fluorescence than WT was confirmed in all inoculated DCL mutants, and the strongest fluorescence was shown in dcl2 / 4a / 4b-1 (Fig. 22).
  • dcl2 / 4b-1 showed stronger fluorescence than dcl4a-1.
  • GFP protein was detected by Western blotting in order to investigate the amount of GFP accumulated in each plant in which GFP fluorescence was observed.
  • the signal intensity of the band was measured using ImageJ.
  • the signal intensity of the band in the lane where WT # 2 was flown was set to 1, and each band was quantified. As a result, it was confirmed that all the inoculated DCL mutants accumulated much higher GFP than WT (Fig. 23). Similar to the results of GFP fluorescence observation, dcl2 / 4a / 4b-1 showed the highest accumulation, and dcl2 / 4b-1 showed higher accumulation than dcl4a-1.
  • DCL2 and DCL4 proteins were not functioning because the amount of virus accumulated in the produced dcl2 / 4b-1, dcl4a-1 and dcl2 / 4a / 4b-1 increased during TuMV inoculation.
  • DCL4 the DCL protein involved in the major antiviral defense in Arabidopsis
  • DCL2 also has strong resistance to the virus.
  • a Luc assay was performed to measure the activity of the luciferase protein expressed under the control of each promoter.
  • Example 3 Confirmation of verification of the expression ability of a foreign gene in a plant lacking the function of DCL2 and / or DCL4
  • a TuMV virus replication system was used, but when the system was used, the gene size and Viral growth can be constrained depending on the sequence. Therefore, it was verified whether or not the expression of the foreign gene was improved by the above mutant without using the above virus proliferation system.
  • Plasmid ⁇ pBICP35 A plasmid derived from pBIN19, a vector plasmid having a 35S promoter and CaMV terminator derived from Cauliflower mosaic virus (CaMV) (Takeda et al., FEBS Lett. 2002 Dec 4; 532 (1-2): 75- 9, 2002).
  • ⁇ PBICGFP It is a plasmid in which the GFP gene is inserted under the control of the 35S promoter of pBICP35 (Takeda et al., 2002). It is used for overexpression of the GFP gene.
  • ⁇ PAT006 A plasmid derived from pMDC123, a vector plasmid having a CaMV-derived 35S promoter and terminator (Tsuzuki et al., RNA 2014 Aug; 20 (8): 1320-7, 2014).
  • ⁇ PAT006-Fluc-iFAD2 A plasmid derived from pMDC123, which has a CaMV-derived 35S promoter and terminator, and expresses the firefly luciferase (FLuc) gene under the control of the promoter.
  • FLuc firefly luciferase
  • an intron of the FAD2 gene derived from Arabidopsis thaliana is inserted into the Fluc gene to prevent erroneous translation of Fluc in Agrobacterium cells (Fig. 20A).
  • pBICGFP was used to observe GFP fluorescence in each DCL mutant. Quantification was performed. pBICGFP and the control empty vector pBICP35 were transformed into Agrobacterium, and the Agrobacterium was shake-cultured. After shaking culture, the agro culture solution was centrifuged at 4,000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes to remove the supernatant. 10 mL of Infiltration Solution was added thereto and resuspended.
  • SDS-PAGE SDS-PAGE was performed using a wide mini-real slab electrophoresis device (Bio Craft, BE-280G). First, a 10% polyacrylamide separation gel solution was prepared, poured into a glass plate and hardened. Then, a 4.5% polyacrylamide concentrated gel solution was prepared and poured onto a separation gel and solidified. Subsequently, the electrophoresis apparatus was filled with 1x SDS electrophoresis buffer, 5 ⁇ L of CLEARLY Stained Protein Ladder (Takara Bio) was applied as a marker, and 3 ⁇ L of each protein-extracted sample was applied to the wells.
  • the constant current is 20 mA (BIOCRAFT BP-T5), and after the BPB is transferred to the separation gel, the constant current is 40 mA (BIOCRAFT BP-T5). ) was set and migration was performed.
  • the membrane (Immobilon®-P Transfer Membrane, Millipore) was cut out larger than the gel, moistened with methanol, and shaken with 1x Towbin Buffer for 5 minutes. The gel was shaken in 1x Towbin Buffer for 5 minutes. After the electrophoresis, the gel and the membrane were overlapped, and after cutting out larger than the membrane in advance, the gel and the membrane were sandwiched between two filter papers soaked in 1x Towbin Buffer. Furthermore, both sides were sandwiched between transfer sponges soaked in 1x Towbin Buffer in advance, and set in a tank-type transfer device (NA-1050B, Nippon Aido) so that the cathode side was the gel and the anode side was the membrane. Then, transfer was performed at a constant voltage of 45 V (BIOCRAFT BP-T8) at room temperature for 60 minutes.
  • Blocking antibody reaction After transcription was completed, the membrane was transferred to a tapper, 1x TBST was added so that the membrane was immersed, and the mixture was shaken at room temperature for 10 minutes. After discarding 1x TBST, Blocking buffer (1% skim milk / 1x TBST) was placed in a tapper and shaken at room temperature for 1 hour or overnight at 4 ° C. After discarding the Blocking buffer, 1x TBST was placed in a tapper and shaken twice at room temperature for 5 minutes. After repeating twice, the membrane was placed in hybrid back soft.
  • Blocking buffer 1% skim milk / 1x TBST
  • the membrane was removed from the hybrid bag and shaken 3 times at 1 x TB ST for 5 minutes. After repeating 3 times, the membrane was placed on a folded wrap on all sides, and 400 ⁇ L of Luminata TM Forte Western HRP Substrate (Millipore) was dropped evenly over the entire membrane, and GFP was detected by the LAS4000 system.
  • the activity was quantified.
  • pAT006-FLuc-iFAD2 and the control empty vector pAT006 were transformed into Agrobacterium, and the Agrobacterium was shake-cultured. After shaking culture, the agro culture solution was centrifuged at 4,000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes to remove the supernatant. 10 mL of Infiltration Solution was added thereto and resuspended.
  • luciferase assay was performed on the inoculated leaves 6 days after inoculation.
  • the Pickagene luminescence kit (PGL-1500) was used to measure the enzyme activity of the luciferase protein.
  • N. benthamiana leaf discs were harvested using a 2 mL tube containing stainless beads and instantly frozen in liquid nitrogen. Frozen samples were crushed using a shaker for 2 minutes. After crushing, the sample was crushed at 15,000 rpm and 4 ° C, and the crushed leaves were dropped to the bottom.
  • Example 4 Verification of suppression of PTGS in DCL2 and / or DCL4 function-deficient plants It was verified whether PTGS was suppressed in DCL2 and / or DCL4 function-deficient plants. In addition, the functional deficiency of DCL2 and / or DCL4 was confirmed by detecting the expression of GFP siRNA derived from exogenous double-stranded RNA (dsGFP) for GFP mRNA.
  • dsGFP exogenous double-stranded RNA
  • Plasmid ⁇ pBICP35 A plasmid derived from pBIN19, which is a vector plasmid having a 35S promoter and a CaMV terminator derived from Cauliflower mosaic virus (CaMV) (Takeda et al., 2002).
  • ⁇ PBICGFP It is a plasmid in which the GFP gene is inserted under the control of the 35S promoter of pBICP35 (Takeda et al., 2002). It is used for overexpression of the GFP gene.
  • ⁇ PBICdsGFP It is a plasmid in which the GFP gene is inserted in an inverted repeat state under the control of the 35S promoter of pBICP35.
  • the eighth intron of the Arabidopsis thaliana TOM1 gene is inserted between the GFP genes (Takeda et al., 2002). Since a large amount of double-stranded RNA of GFP is expressed from this construct, it is possible to induce stronger RNA silencing.
  • Agroinfiltration method for GFP and dsGFP expression Using pBICGFP and pBICdsGFP to confirm functional defects in the prepared DCL2 / 4a double mutants, DCL4a mutants and DCL2 / 4a / 4b triple mutants. Strong IR-PTGS was induced and GFP fluorescence was observed and quantified in each DCL mutant.
  • pBICGFP, pBICdsGFP and the control empty vector pBICP35 were transformed into Agrobacterium, and the Agrobacterium was shake-cultured. After shaking culture, the agro culture solution was centrifuged at 4,000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes to remove the supernatant.
  • SDS-PAGE SDS-PAGE was performed using a wide mini-real slab electrophoresis device (Bio Craft, BE-280G). First, a 10% polyacrylamide separation gel solution was prepared, poured into a glass plate and hardened. Then, a 4.5% polyacrylamide concentrated gel solution was prepared and poured onto a separation gel and solidified. Subsequently, the electrophoresis apparatus was filled with 1x SDS electrophoresis buffer, 5 ⁇ L of CLEARLY Stained Protein Ladder (Takara Bio) was applied as a marker, and 3 ⁇ L of each protein-extracted sample was applied to the wells.
  • the constant current is 20 mA (BIOCRAFT BP-T5), and after the BPB is transferred to the separation gel, the constant current is 40 mA (BIOCRAFT BP-T5). ) was set and migration was performed.
  • the membrane (Immobilon®-P Transfer Membrane, Millipore) was cut out larger than the gel, moistened with methanol, and shaken with 1x Towbin Buffer for 5 minutes. The gel was shaken in 1x Towbin Buffer for 5 minutes. After the electrophoresis, the gel and the membrane were overlapped, and after cutting out larger than the membrane in advance, the gel and the membrane were sandwiched between two filter papers soaked in 1x Towbin Buffer. Furthermore, both sides were sandwiched between transfer sponges soaked in 1x Towbin Buffer in advance, and set in a tank-type transfer device (NA-1050B, Nippon Aido) so that the cathode side was the gel and the anode side was the membrane. Then, transfer was performed at a constant voltage of 45 V (BIOCRAFT BP-T8) at room temperature for 60 minutes.
  • Blocking antibody reaction After transcription was completed, the membrane was transferred to a tapper, 1x TBST was added so that the membrane was immersed, and the mixture was shaken at room temperature for 10 minutes. After discarding 1x TBST, Blocking buffer (1% skim milk / 1x TBST) was placed in a tapper and shaken at room temperature for 1 hour or overnight at 4 ° C. After discarding the Blocking buffer, 1x TBST was placed in a tapper and shaken twice at room temperature for 5 minutes. After repeating twice, the membrane was placed in hybrid back soft.
  • Blocking buffer 1% skim milk / 1x TBST
  • the membrane was removed from the hybrid bag and shaken 3 times at 1 x TB ST for 5 minutes. After repeating 3 times, the membrane was placed on a folded wrap on all sides, and 400 ⁇ L of LuminataTM Forte Western HRP Substrate (Millipore) was dropped evenly over the entire membrane, and GFP was detected by the LAS4000 system.
  • FIG. 28 shows the results of co-aggroinfiltration of 35S: GFP together with 35S: dsGFP and comparison of the expression levels of GFP 2 days after inoculation. It was shown that IR (Inverted Repeat transgene-induced) -PTGS (IR-PTGS induces the expression of dsGFP) is suppressed in dcl2 / 4a / 4b plants. Therefore, in dcl2 / 4a / 4b plants, it is suggested that the stability of viral RNA having a long stem-loop that can be the target of DCL is improved.
  • IR Inverted Repeat transgene-induced
  • 35S: GFP was co-aggroinflated with 35S: dsGFP, and the result of detecting GFP siRNA 2 days after inoculation is shown in FIG. 29.
  • dcl2 / 4a / 4b plants only 24 nt siRNA excised into DCL3 was detected (in dcl2 / 4a / 4b, the lower band detected by WT etc. disappeared, that is, DCL2 / 4b. The 21 to 22 nt siRNA excised depending on 4 had disappeared). From the above, it was shown that the function of DCL2 / 4 is completely deficient in the dcl2 / 4a / 4b plant.
  • the genome-edited individual in which the DCL gene of the present invention is disrupted is extremely useful in that the transient expression in its leaves enables the expression of foreign proteins in a shorter period of time and with higher efficiency than in wild-type plants. It is possible to express high-value-added proteins such as antibodies and interferons, and to express proteins that are difficult to express in other species (for example, horseradish peroxidase). In addition, since this genome-edited individual lacks virus resistance, it is possible to efficiently propagate plant viruses lacking immunosuppressive ability, and attenuated plant virus strains used as biopesticides can be used. It is useful in that it can be mass-grown.

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Abstract

本発明は、DCL2遺伝子、DCL4遺伝子及びDCL3遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子に機能喪失型変異を有するナス科植物細胞であって、外来遺伝子の発現能力が向上した、細胞を提供する。

Description

異種タンパク質の大量生産が可能なナス科植物の変異体
　本発明は、異種タンパク質の大量生産が可能なナス科植物の変異体に関する。より詳細には、本発明は、ダイサー様タンパク質（DCL）の機能を欠損したナス科植物細胞又は植物体、並びに該細胞又は植物体を用いた異種タンパク質の製造方法に関する。
　異種タンパク質の産生に植物を利用したシステムは、細菌、酵母、及び動物細胞を利用したシステムの代替として注目されている。ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）などの特定の植物は、大規模で栽培することができ、異種タンパク質の大量産生を可能にする。植物で異種のタンパク質を産生する方法として、安定した形質転換を用いる方法と一過的な過剰発現方法の2つの方法がある。安定した形質転換は、再現性と大規模産生の面で利点があるものの、形質転換体の樹立に時間がかかるため、多種多様なコンストラクトの迅速な発現には適していない。一方、植物における一過的発現は短期間で高力価の異種タンパク質を産生することができる。一過的発現は、改変された植物ウイルスを用いる方法や、浸潤を介して体細胞組織に遺伝子を導入するAgrobacterium tumefaciensを利用する方法により可能になる。後者の方法で異種タンパク質を効率的に産生させるためには、転写活性を向上させ、mRNAレベルを増加させることや、翻訳活性を向上させ、mRNAを最大に翻訳させる必要がある（非特許文献１及び２）。多くの一過的な発現システムにPotato virus X（PVX）、Tobacco mosaic virus（TMV）及びCowpea mosaic virus（CPMV）などの植物ウイルスが利用されている（非特許文献３～５）。
　ところで、動物は、抗体抗原反応に代表される免疫機構を中心にウイルスの増殖を防ぐが、植物は獲得免疫機構を持たないため、RNA干渉（植物では、RNAサイレンシングと呼ぶ）がウイルス抵抗性において重要な役割を占めている。この機構を介して、遺伝子発現の制御や転位因子発現抑制も行っている。植物におけるRNAサイレンシングには、ウイルスなどの外来性の長い二本鎖RNA由来のsmall-interfering RNA（siRNA）が防御システムとして働くRNAi経路と、ヘアピン構造をとる前駆体RNAとしてゲノムにコードされ、発生、分化、環境応答などの生命現象の制御を行うmicroRNA（miRNA）の働くmiRNA経路の2つの経路が存在している。
Gleba, Y. Y. et al., In Plant viral vectors (pp. 155-192) (2013) Peyret, H. et al., Plant biotechnology journal, 13(8), 1121-1135 (2015) Canizares, M. C. et al., Immunology and Cell Biology, 83(3), 263-270 (2005) Giritch, A. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(40), 14701- 14706 (2006) Lindbo, J. A. Plant physiology, 145(4), 1232-1240 (2007)
　植物ウイルスを用いた植物における一過的な異種タンパク質の発現においては、RNAサイレンシングによりウイルスの増殖が妨げられ、また導入遺伝子の発現抑制も生じ得るため、従来の異種タンパク質の発現方法では、十分な量のタンパク質を得るためには時間もコストもかかるとの課題があった。従って、本発明の課題は、効率よく、また一度の形質転換で大量の異種タンパク質の生産を可能とする細胞又は植物体を提供することである。
　本発明者らは、ウイルス抵抗性の研究を進める中で、ウイルスの感染の防御機構の一つであるRNAサイレンシングに着目した。具体的には、植物におけるsiRNAを介したRNAサイレンシング機構は、siRNAと相補的なmRNAの切断及び翻訳抑制を行うPost-transcriptional gene silencing（PTGS）経路（図１）と、相補的な遺伝子をDNAのメチル化を介して抑制し、転写制御を行うTranscriptional gene silencing（TGS）経路（図２）の2種類の経路に着目した。本発明者らは、PTGSを引き起こさない植物を作製するため、アグロバクテリウム法に好適なN.benthamianaを用いて、上記PTGS経路に関与するDCL遺伝子を破壊された形質転換体の作製を行った。該形質転換体を用いて研究を進める中で、該形質転換体では、野生型植物体と比較して、導入した遺伝子の発現が顕著に（10～40倍）増加しているとの驚くべき結果を見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］　DCL2遺伝子、DCL4遺伝子及びDCL3遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子に機能喪失型変異を有するナス科植物細胞であって、外来遺伝子の発現能力が向上した、細胞。
［２］　DCL2遺伝子及びDCL4遺伝子の少なくともいずれかに機能喪失型変異を有する、［１］に記載の細胞。
［３］　前記ナス科植物がタバコ属に属する植物である、［１］又は［２］に記載の細胞。
［４］　前記タバコ属に属する植物がニコチアナ・ベンサミアナである、［３］に記載の細胞。
［５］　外来遺伝子を有さないことを特徴とする、［１］～［４］のいずれかに記載の細胞。
［６］　前記植物細胞が遺伝子組換え体である、［１］～［４］のいずれかに記載の細胞。
［７］　遺伝子組換えに用いた導入遺伝子を有さないことを特徴とする、［６］に記載の細胞。
［８］　［１］～［７］のいずれかに記載の細胞を有する植物体。
［９］　（１）［１］～［７］のいずれかに記載の細胞又は［８］に記載の植物体に、目的タンパク質をコードする核酸を導入する工程、及び
　（２）工程（１）で核酸が導入された細胞又は植物体で該タンパク質を発現させる工程
を含む、目的タンパク質の製造方法。
［１０］　（３）工程（２）で得られた目的タンパク質を発現する細胞又は植物体から、該タンパク質を単離する工程を含む、［９］に記載の方法。
［１１］　前記工程（１）が、目的タンパク質をコードする核酸を有するアグロバクテリウムを細胞又は植物体に感染させる工程を含む、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］　前記核酸がウイルス由来の複製システムを有する、［９］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］　前記ウイルスがカブモザイクウイルスである、［１２］に記載の方法。
［１４］　（１）［１］～［７］のいずれかに記載の細胞又は［８］に記載の植物体にウイルスを感染させ、該ウイルスを増殖させる工程、及び
　（２）前記工程（１）により増殖したウイルスを回収する工程
を含む、ウイルスの増殖方法。
［１５］　前記ウイルスが弱毒植物ウイルスである、［１４］に記載の方法。
［１６］　（１）DCL2遺伝子、DCL4遺伝子及びDCL3遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を標的とする核酸配列認識モジュールと、ヌクレアーゼ又はデアミナーゼとの複合体又は該複合体をコードする核酸をナス科植物細胞に導入する工程を含む、［１］～［７］のいずれかに記載の細胞を製造する方法。
［１７］　前記複合体がガイドRNAとCasタンパク質との複合体である、［１６］に記載の方法。
［１８］　DCL2遺伝子及びDCL4遺伝子の少なくともいずれかを標的とする、［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］　前記工程（１）が、前記複合体をコードする核酸を有するアグロバクテリウムを細胞又は植物体に感染させる工程を含む、［１６］～［１８］のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、異種タンパク質の大量生産が可能なナス科植物の変異体が提供される。一態様において、本変異体の葉における一過性発現によって、野生型植物における場合と比較して、外来タンパク質を10～40倍高発現することができる。また、本変異体は外来遺伝子を除去したヌル分離個体とすることもできるため、カルタヘナ法の対象外となり得るという有利な効果も有し、野生型植物同様、開放系で栽培が可能である。
PTGS経路の概要を示す図である。DCL2又はDCL4 が外来遺伝子由来の長いヘアピンRNA、もしくはmRNAがRDR6とSGS3により二本鎖化されたものを切断し、21塩基又は22塩基のsiRNAを生成する。これらのsiRNAの3’末端の塩基の2’-O位は、HEN1によってメチル化される。メチル化されたsiRNAの片方の鎖が主にAGO1に取り込まれ、RISC複合体を形成する。形成された RISC複合体がsiRNAと相補的なmRNAと結合し、mRNAを切断することによって遺伝子発現抑制が行われる（Baumberger et al.,2005）。 TGS経路の概要を示す図である。DCL3が長いヘアピンRNA、もしくはPol lV転写産物がRDR2により二本鎖化されたものを切断し、24塩基のsiRNAを生成する。このsiRNAの片方の鎖が主にAGO4に取り込まれRISC複合体を形成する。形成された複合体のsiRNAがPol Vによって転写中の相補的なmRNA配列と結合する。その後、メチル化酵素MET1やCMT3、DRM1、DRM2を介して標的ゲノムDNA領域のシトシンをメチル化し、プロモーター領域をヘテロクロマチン化することで遺伝子発現の抑制を行っている（Aufsatz et al., 2002）。 プラスミドpWAT135-FLAG-hcoCas9-3001、3002、3003、3004を示す図である。pWAT135-FLAG-hcoCas9-3001では、DCL2-gRNA2、DCL3-gRNA1、そしてDCL4-gRNA1がU6プロモーター制御下で発現される。pWAT135-FLAG-hcoCas9-3002では、DCL2-gRNA3、DCL3-gRNA1、そしてDCL4gRNA1がU6プロモーター制御下で発現される。pWAT135-FLAG-hcoCas9-3003では、DCL2-gRNA2、DCL3-gRNA2、そしてDCL4-gRNA1がU6プロモーター制御下で発現される。pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004では、DCL2-gRNA3、DCL3-gRNA2、そしてDCL4-gRNA1がU6プロモーター制御下で発現される。 ニコチアナ・ベンサミアナ（以下、「N.benthamiana」と略することがある。）におけるDCL2のgRNA2標的配列を示す図である。A及びBはN.benthamianaにおけるDCL2の遺伝子構造を示す模式図である。DCL2のcDNAは4209塩基から成り、DEAD、Helicase C、dsRNA binding、PAZ、Ribonuclease III a、Ribonuclease III b、dsrm aドメインをコードする遺伝子配列を持っている。また、gRNA2はDCL2を標的としたガイドRNA(以下、「gRNA」と略することがある。)を表す。gRNA2はDCL2のcDNA上のCDSの5’末端から228～246塩基目のDEAD 配列を標的としている。Cは標的配列付近のゲノムDNA配列を示す。N.benthamianaにおけるDCL2のゲノムDNA配列の223～522塩基目を示す。背景が2番目に濃い灰色の部分はDEADをコードする配列、最も濃い灰色の部分はNbDCL2-gRNA2の標的となる配列、最も淡い灰色の部分は変異確認のPCRに用いたプライマーNbDCL2-g2-22FとNbDCL2-g2-49R（表１）の結合部位、2番目に淡い灰色の部位は変異確認のシークエンス解析に用いたプライマーNbDCL2-g2-25F（表１）の結合部位である。大文字の配列はエキソン、小文字の配列はイントロンを示す。C中の配列を配列番号３０として表す。Dは、NbDCL2-gRNA2標的部位付近のゲノムDNA配列のクロマトグラムを示す。灰色の背景は、NbDCL2-gRNA2の標的となる配列である。枠で囲った3塩基がPAM配列である。D中の配列を配列番号３１として表す。 N.benthamianaにおけるDCL2のgRNA3標的配列を示す図である。A及びBは、N.benthamianaにおけるDCL2の遺伝子構造を示す模式図である。DCL2のcDNAは4209塩基から成り、DEAD、Helicase C、dsRNA binding、PAZ、Ribonuclease III a、Ribonuclease IIIb、dsrm aドメインをコードする遺伝子配列を持っている。また、gRNA3はDCL2を標的としたガイドRNAを表す。gRNA3はDCL2のcDNA上のCDSの5’末端から624～643塩基目の領域を標的としている。Cは、標的配列付近のゲノムDNA配列を示す。N.benthamianaにおけるDCL2のゲノムDNA配列の1858～2157塩基目を示す。最も濃い灰色の部分はNbDCL2-gRNA3の標的となる配列、最も淡い灰色の部分は変異確認のPCRに用いたプライマーNbDCL2-g3-185FとNbDCL2g3-213R（表１）の結合部位、2番目に濃い灰色の部位は変異確認のシークエンス解析に用いたプライマーNbDCL2-g3-188F（表１）の結合部位である。大文字の配列はエキソン、小文字の配列はイントロンを示す。C中の配列を配列番号３２として表す。Dは、NbDCL2-gRNA3標的部位付近のゲノムDNA配列のクロマトグラムを示す。灰色の背景は、NbDCL2-gRNA3の標的となる配列である。枠で囲った3塩基がPAM配列である。D中の配列を配列番号３３として表す。 N.benthamianaにおけるDCL3のgRNA1標的配列を示す図である。A及びBは、N.benthamianaにおけるDCL3の遺伝子構造を示す模式図である。DCL3のcDNAは4974塩基から成り、Helicase C、dsRNA binding、PAZ、Ribonuclease III a、Ribonuclease III b、dsrm aドメインをコードする遺伝子配列を持っている。また、gRNA1はDCL3を標的としたガイドRNAを表す。gRNA1はDCL3のcDNA上のCDSの5’末端から915～934塩基目のHelicase C配列を標的としている。Cは、標的配列付近のゲノムDNA配列を示す。N.benthamianaにおけるDCL3のゲノムDNA配列の5933～6212塩基目を示す。背景が3番目に淡い灰色の部分はHelicase Cをコードするエキソン配列、最も濃い灰色の部分はNbDCL3-gRNA1の標的となる配列、最も淡い灰色の部分は変異確認のPCRに用いたプライマーNbDCL3-g1-593FとNbDCL3-g1-R-1（表１）の結合部位、2番目に濃い灰色の部位は変異確認のシークエンス解析に用いたプライマーNbDCL3-g1-596F（表１）の結合部位である。大文字の配列はエキソン、小文字の配列はイントロンを示す。C中の配列を配列番号３４して表す。Dは、NbDCL3-gRNA1標的部位付近のゲノムDNA配列のクロマトグラムを示す。灰色の背景は、NbDCL3-gRNA1の標的となる配列である。枠で囲った3塩基がPAM配列である。C中の配列を配列番号３５として表す。 N.benthamianaにおけるDCL3のgRNA2標的配列を示す図である。A及びBは、N.benthamianaにおけるDCL3の遺伝子構造を示す模式図である。DCL3のcDNAは4974塩基から成り、Helicase C、dsRNA binding、PAZ、Ribonuclease III a、Ribonuclease III b、dsrm aドメインをコードする遺伝子配列を持っている。また、gRNA2はDCL3を標的としたガイドRNAを表す。gRNA2はDCL3のcDNA上のCDSの5’末端から989～1008塩基目の領域を標的としている。Cは、標的配列付近のゲノムDNA配列を示す。N.benthamianaにおけるDCL3のゲノムDNA配列の6128～6402塩基目を示す。最も濃い灰色の部分はNbDCL3-gRNA2の標的となる配列、最も淡い灰色の部分は変異確認のPCRに用いたプライマーNbDCL3-g2-612FとNbDCL3g2-638R（表１）の結合部位、2番目に濃い灰色の部位は変異確認のシークエンス解析に用いたプライマーNbDCL3-g2-F-1（表１）の結合部位である。大文字の配列はエキソン、小文字の配列はイントロンを示す。C中の配列を配列番号３６として表す。Dは、NbDCL3-gRNA2標的部位付近のゲノムDNA配列のクロマトグラムを示す。灰色の背景は、NbDCL3-gRNA2の標的となる配列である。枠で囲った3塩基がPAM配列である。D中の配列を配列番号３７として表す。 N.benthamianaにおけるDCL4のgRNA1標的配列を示す図である。A及びBは、N.benthamianaにおけるDCL4aの遺伝子構造を示す模式図である。DCL4のcDNAは4869塩基からなるDCL4 (Niben101Scf11936)（「DCL4a」と命名した。）と4866塩基からなるDCL4 (Niben101Scf01789)（「DCL4b」と命名した。）から成り、いずれも、DEAD、Helicase C、dsRNA binding、PAZ、Ribonuclease III a、Ribonuclease III b、dsrm a、dsrm bドメインをコードする遺伝子配列を持っている。また、gRNA1はDCL4aとDCL4bの両方を標的としたガイドRNAを表す。gRNA1はDCL4aおよびDCL4bのcDNA上のCDSの5’末端から1050～1069塩基目の領域を標的としている。Cは、DCL4a上の標的配列付近のゲノムDNA配列を示す。N.benthamianaにおけるDCL4aのゲノムDNA配列の14125～14474塩基目を示す。最も濃い灰色の部分はNbDCL4-gRNA1の標的となる配列、最も淡い灰色の部分は変異確認のPCRに用いたプライマーNbDCL4-g1-1412FとNbDCL4-g1-1445R（表１）の結合部位、2番目に濃い灰色の部位は変異確認のシークエンス解析に用いたプライマーNbDCL4-g1-1416F（表１）の結合部位である。大文字の配列はエキソン、小文字の配列はイントロンを示す。C中の配列を配列番号３８として表す。D及びEは、NbDCL4-gRNA1標的部位付近のDCL4aのゲノムDNA配列のクロマトグラムを示す。下線部分は、NbDCL4-gRNA1の標的となる配列である。枠で囲った3塩基がPAM配列である。D中の配列を配列番号３９として、E中の配列を配列番号４０として表す。 A及びBは、DCL4bの遺伝子構造を示す。Cは、DCL4b上の標的配列付近のゲノムDNA配列を示す。N.benthamianaにおけるDCL4bのゲノムDNA配列の14125～14474塩基目を示す。最も濃い灰色の部分はNbDCL4-gRNA1の標的となる配列、最も淡い灰色の部分は変異確認のPCRに用いたプライマーNbDCL4b-g1-F1とNbDCL4b-g1-R1（表１）の結合部位、2番目に濃い灰色の部位は変異確認のシークエンス解析に用いたプライマーNbDCL4b-g1-seq-F（表１）の結合部位である。大文字の配列はエキソン、小文字の配列はイントロンを示す。C中の配列を配列番号４１として表す。D及びEは、NbDCL4-gRNA1標的部位付近のDCL4bのゲノムDNA配列のクロマトグラムを示す。下線部分は、NbDCL4-gRNA1の標的となる配列である。枠で囲った3塩基がPAM配列である。D中の配列を配列番号４２として、E中の配列を配列番号４３として表す。 遺伝子組換え体の変異を固定するまでのフローチャートを示す図である。最初にアグロバクテリウムを用いて形質転換した世代がT0世代である。シュートと根が生えた個体を馴化した。得られた形質転換体からゲノムDNA抽出を行い、変異確認用のプライマーを用いてPCRを行った。PCR産物のゲル回収を行い、シークエンス解析により変異確認した。その後、T0植物からT1種子を回収し、変異が導入された個体のみ世代を回した（T1世代）。T1植物からも同様にゲノムDNAを抽出し、変異確認を行った。それと並行し、Cas9の有無を確認するために、PCRを行い、電気泳動により目的のバンドの有無を確認した。ここで、変異が固定され、Cas9が抜けた形質転換体を導入遺伝子がヌル分離された変異体とした。また、変異が固定できていない、もしくはCas9が抜けていない個体は、T2、T3世代へと回し、変異体の作出を行った。 PCRでヌル分離を確認した結果を示す。各植物よりゲノムDNAを抽出し、PCRによってCas9遺伝子の分離を確認した。25SはコントロールとしてPCRで増幅した25S rRNAをコードするDNA領域を増幅した断片を表す。 dcl2-1における導入された変異を示す図である。Aは、dcl2-1のNbDCL2-gRNA3標的部位のシークエンス解析結果を示す。灰色の背景は、NbDCL2-gRNA3の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL2のゲノム上のPAM配列から上流16塩基目にGの1塩基挿入の変異が確認された。A中の配列を配列番号４４(mutant)及び配列番号４５(WT)として表す。Bは、dcl2-1とWTのNbDCL2-gRNA3標的部位付近のアミノ酸配列を示す。黒線はNbDCL2-gRNA3の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列、灰色線は終止コドンを示す。上のアミノ酸配列はdcl2-1、下のアミノ酸配列はWTのものを示す。Gの1塩基挿入により、フレームシフトが起こり、終止コドンが661塩基目に生じた。生じた終止コドンにより、221アミノ酸で翻訳終結し、DCL2タンパク質が生成されないことが示唆された。B中の配列を配列番号４６（mutantの塩基配列）及び配列番号４７（mutantのアミノ酸配列）、並びに配列番号４８（WTの塩基配列）及び配列番号４９（WTのアミノ酸配列）として表す。 dcl2-2における導入された変異を示す図である。Aは、dcl2-2 のNbDCL2-gRNA3標的部位のシークエンス解析結果を示す。灰色の背景は、NbDCL2-gRNA3の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL2のゲノム上のPAM配列から上流11塩基目にAACCTの5塩基欠失の変異が確認された。A中の配列を配列番号５０(mutant)及び配列番号５１(WT)として表す。Bは、dcl2-2とWTのNbDCL2-gRNA3標的部位付近のアミノ酸配列を示す。黒線はNbDCL2-gRNA3の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列、灰色線は終止コドンを示す。上のアミノ酸配列はdcl2-2、下のアミノ酸配列はWTのものを示す。AACCTの5塩基欠失により、フレームシフトが起こり、終止コドンが655塩基目に生じた。生じた終止コドンにより、219アミノ酸で翻訳終結し、DCL2タンパク質が生成されないことが示唆された。B中の配列を配列番号５２（mutantの塩基配列）及び配列番号５３（mutantのアミノ酸配列）、並びに配列番号５４（WTの塩基配列）及び配列番号５５（WTのアミノ酸配列）として表す。 dcl4a-1における導入された変異を示す図である。Aは、dcl4a-1のNbDCL4-gRNA1標的部位のシークエンス解析結果を示す。下線部分は、NbDCL4-gRNA1の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL4aのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入の変異が確認された。A中の配列を配列番号５６として表す。Bは、dcl4a-1とWTのNbDCL4-gRNA1標的部位付近のアミノ酸配列を示す。最も濃い灰色の部分はNbDCL4-gRNA1の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列、最も淡い灰色の部分は終止コドンを示す。上のアミノ酸配列はdcl4a-1、下のアミノ酸配列はWTのものを示す。Aの1塩基挿入により、フレームシフトが起こり、終止コドンが1102塩基目に生じた。生じた終止コドンにより、368アミノ酸で翻訳終結し、DCL4aタンパク質が生成されないことが示唆された。B中の配列を配列番号５７（mutantの塩基配列）及び配列番号５８（mutantのアミノ酸配列）、並びに配列番号５９（WTの塩基配列）及び配列番号６０（WTのアミノ酸配列）として表す。 dcl4b-1における導入された変異を示す図である。Aは、dcl4b-1のNbDCL4-gRNA1標的部位のシークエンス解析結果を示す。下線部分は、NbDCL4-gRNA1の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL4bのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入の変異が確認された。A中の配列を配列番号６１として表す。Bは、dcl4b-1とWTのNbDCL4-gRNA1標的部位付近のアミノ酸配列を示す。最も濃い灰色の部分はNbDCL4-gRNA1の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列、最も淡い灰色の部分は終止コドンを示す。上のアミノ酸配列はdcl4b-1、下のアミノ酸配列はWTのものを示す。Aの1塩基挿入により、フレームシフトが起こり、終止コドンが1102塩基目に生じた。生じた終止コドンにより、368アミノ酸で翻訳終結し、DCL4bタンパク質が生成されないことが示唆された。B中の配列を配列番号６２（mutantの塩基配列）及び配列番号６３（mutantのアミノ酸配列）、並びに配列番号６４（WTの塩基配列）及び配列番号６５（WTのアミノ酸配列）として表す。 dcl2/4a-1における導入された変異を示す図である。Aは、dcl2/4a-1のNbDCL2-gRNA3標的部位のシークエンス解析結果を示す。灰色の背景は、NbDCL2-gRNA3の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL2のゲノム上のPAM配列から上流16塩基目にGの1塩基挿入の変異が確認された。A中の配列を配列番号６６として表す。Bは、dcl2/4a-1とWTのNbDCL2-gRNA3標的部位付近のアミノ酸配列を示す。黒線はNbDCL2-gRNA3の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。上のアミノ酸配列はdcl2/4a-1、下のアミノ酸配列はWTのものを示す。Gの1塩基挿入により、フレームシフトが起こり、終止コドンが661塩基目に生じた。生じた終止コドンにより、221アミノ酸で翻訳終結し、DCL2タンパク質が生成されないことが示唆された。B中の配列を配列番号６７（mutantの塩基配列）及び配列番号６８（mutantのアミノ酸配列）、並びに配列番号６９（WTの塩基配列）及び配列番号７０（WTのアミノ酸配列）として表す。Cは、dcl2/4-1のNbDCL4-gRNA1標的部位のシークエンス解析結果を示す。灰色の背景は、NbDCL4-gRNA1の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL2のゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にTCTGAの5塩基欠失の変異が確認された。C中の配列を配列番号７１として表す。Dは、dcl2/4a-1とWTのNbDCL4-gRNA1標的部位付近のアミノ酸配列を示す。黒線はNbDCL4-gRNA1の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列、灰色線は終止コドンを示す。上のアミノ酸配列はdcl2/4a-1、下のアミノ酸配列はWTのものを示す。TCTGAの5塩基欠失により、フレームシフトが起こり、終止コドンが1060塩基目に生じた。生じた終止コドンにより、354アミノ酸で翻訳終結し、DCL4aタンパク質が生成されないことが示唆された。D中の配列を配列番号７２（mutantの塩基配列）及び配列番号７３（mutantのアミノ酸配列）、並びに配列番号７４（WTの塩基配列）及び配列番号７５（WTのアミノ酸配列）として表す。 dcl2/4a-2における導入された変異を示す図である。Aは、dcl2/4a-2のNbDCL2-gRNA3標的部位のシークエンス解析結果を示す。灰色の背景は、NbDCL2-gRNA3の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL2のゲノム上のPAM配列から上流11塩基目にAACCTの5塩基欠失の変異が確認された。A中の配列を配列番号７６として表す。Bは、dcl2/4a-2とWTのNbDCL2-gRNA3標的部位付近のアミノ酸配列を示す。黒線はNbDCL2-gRNA3の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。上のアミノ酸配列はdcl2/4a-2、下のアミノ酸配列はWTのものを示す。AACCTの5塩基欠失により、フレームシフトが起こり、終止コドンが655塩基目に生じた。生じた終止コドンにより、219アミノ酸で翻訳終結し、DCL2タンパク質が生成されないことが示唆された。B中の配列を配列番号７７（mutantの塩基配列）及び配列番号７８（mutantのアミノ酸配列）、並びに配列番号７９（WTの塩基配列）及び配列番号８０（WTのアミノ酸配列）として表す。Cは、dcl2/4a-2のNbDCL4-gRNA1標的部位のシークエンス解析結果を示す。灰色の背景は、NbDCL4-gRNA1の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL4aのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入の変異が確認された。C中の配列を配列番号８１として表す。Dは、dcl2/4a-2とWTのNbDCL4-gRNA1標的部位付近のアミノ酸配列を示す。黒線はNbDCL4-gRNA1の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。上のアミノ酸配列はdcl2/4a-2、下のアミノ酸配列はWTのものを示す。Aの1塩基挿入により、フレームシフトが起こり、終止コドンが1102塩基目に生じた。生じた終止コドンにより、368アミノ酸で翻訳終結し、DCL4aタンパク質が生成されないことが示唆された。D中の配列を配列番号８２（mutantの塩基配列）及び配列番号８３（mutantのアミノ酸配列）、並びに配列番号８４（WTの塩基配列）及び配列番号８５（WTのアミノ酸配列）として表す。 野生型のN.benthamianaと各DCL変異体における葉の表現型を示す。播種4週間後の各植物体における葉の表現型を示す。6枚目の本葉を選び、撮影した。WTと比較すると、dcl2/4b-1とdcl4a-1は丸みを帯びていた。また、dcl2/4a/4b-1は細長い葉が形成されていた。 播種4週間後の野生型のN.benthamianaと各DCL変異体の表現型を示す。各植物体の大きさを比較すると、dcl2/4a/4b-1が最も小さく、他の植物体よりも生育が遅いことが確認された。 dcl3-1における導入された変異を示す図である。dcl3-1のNbDCL3-gRNA2標的部位のシークエンス解析結果を示す。下線で示す箇所は、NbDCL3-gRNA2の標的となる配列、枠で囲った3塩基がPAM配列を示す。DCL3のゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入の変異が確認された。図中の配列を配列番号８６として表す。 Ａ：pAT006-Fluc-iFAD2のプラスミドを示す。プロモーター制御下でFluc遺伝子を発現するプラスミドである。Ｂ：pAT010-Rluc-iFAD2のプラスミドを示す。プロモーター制御下でRluc遺伝子を発現するプラスミドである。iは、シロイヌナズナ由来のFAD2遺伝子のイントロンを示す。 異なるプロモーターを用いた複数遺伝子の同時過剰発現系の確立におけるアグロインフィルトレーション法の概略図である。（+）の区に、pAT006-Fluc-iFAD2 : pAT003P-GFP : pAT010-Rluc-iFAD2 = 2 : 1 : 2、（-）の区にpAT006-Fluc-iFAD2 : pAT006-GFP : pAT010-Rluc-iFAD2 = 2 : 1 : 2となるようにOD600 = 0.8に調整した各アグロバクテリウム溶液を混合した。その後、シリンジを用いて、調製した混合液をN. benthamianaのWT、dcl2-2、dcl4-1およびdcl2/4-2の葉に線対称に接種した。 pCB-TuMV-GFP接種6日後(25℃で栽培)における各植物体のGFP蛍光を示す。N.benthamianaのWT、dcl2/4b-1、dcl4a-1及びdcl2/4a/4b-1の葉にpCB-TuMV-GFP、コントロールとしてpAT010を接種した。接種6日後の接種葉のGFP蛍光を観察した。A :コントロール、B : WTにおけるGFP蛍光、C : dcl2/4b-1におけるGFP蛍光、D : dcl4a-1におけるGFP蛍光、E : dcl2/4a/4b-1におけるGFP蛍光。接種したすべてのDCL変異体でWTよりも強い蛍光が確認された。dcl2/4a/4b-1において最も強い蛍光を示し、dcl4a-1よりもdcl2/4b-1の方が強い蛍光を示した。 pCB-TuMV-GFP接種6日後における各植物体のGFP蓄積を示す。接種6日後の接種葉におけるGFPタンパク質をウェスタンブロッティングにより検出した。また、ImageJを用いてバンドのシグナル強度を測定した。WT #2を流したレーンのバンドのシグナル強度を1とし、それぞれのバンドを数値化した。接種したすべてのDCL変異体でWTよりもGFPの高い蓄積が確認された。dcl2/4a/4b-1において最も高いGFPの蓄積を示し、dcl4a-1よりもdcl2/4b-1の方が高い蓄積を示した。 複数遺伝子の同時過剰発現時における異なるプロモーターと同一プロモーターの活性比較結果を示す。N. benthamianaの葉の（+）区に、pAT006-Fluc-iFAD2 : pAT003P-GFP : 内部標準のpAT010-Rluc-iFAD2 = 2 : 1 : 2、（-）区にpAT006-Fluc-iFAD2 : pAT006-GFP : 内部標準のpAT010-Rluc-iFAD2 = 2 : 1 : 2混合液を接種し、接種6日後の発現されたルシフェラーゼタンパク質の発現量を測定することでTGSを軽減できるか検証した。（-）区の値を1とした時の相対活性を示す。6 dpi、n=4、エラーバーは標準誤差を表す。*：p<0.05、**：p<0.01（t検定）。各植物体における（+）区の活性と（-）区の活性を比較すると、WTで2.05倍、dcl2/4b-1で1.64倍、dcl4a-1で1.69倍、dcl2/4a/4b-1で1.40倍であった。 各植物体におけるルシフェラーゼ活性比較結果を示す。接種6日後の各植物体の（-）区および（+）区における発現された各ルシフェラーゼタンパク質の発現量を比較したものを示した。WTの（-）区の値を1とした時の相対活性を示し、有意差があるものに対して、アルファベットが混在しないように示している。6 dpi、n=4、エラーバーは標準誤差を示す。p<0.05（Tukey検定）。A : 野生型のN. benthamianaと各DCL変異体におけるFluc活性比較。各植物体におけるFlucの発現量を比較したものを示した。B : 野生型のN. benthamianaと各DCL変異体におけるRluc活性比較。各植物体におけるRlucの発現量を比較したものを示した。野生型のN. benthamianaと各DCL変異体の（-）区および（+）区における各ルシフェラーゼ活性を比較した結果、すべてのDCL変異体でWTの（-）区よりも高い活性を示した。 35S:Flucをアグロインフィルトレーションし、接種6日後のルシフェラーゼ活性を比較した結果を示す。野生型植物(WT)における発現量を1とした際の相対活性を表す。n=4、エラーバーは標準誤差を表す。 35S:GFPをアグロインフィルトレーションし、接種6日後のGFPタンパク質を検出した結果を示す。ホタルルシフェラーゼの場合と同様、GFPでもdcl2/4植物での高蓄積が確認された。ImageJで定量したところ、野生型植物(WT)における発現量を1とした際の相対活性は、dcl2/4b-1は2.97、dcl4a-1では2.24、dcl2/4a/4b-1では10.11であった。 35S:GFPを35S:dsGFPとともに共アグロインフィルトレーションし、接種2日後のGFPの発現量を比較した結果を示す。 35S:GFPを35S:dsGFPとともに共アグロインフィルトレーションし、接種2日後のGFP siRNAを検出した結果を示す。
１．ダイサー様（DCL）タンパク質の遺伝子に機能喪失型変異を有する植物細胞又は該細胞を含む植物体
　本発明は、DCL2遺伝子、DCL4遺伝子及びDCL3遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種のダイサー様(DCL；Dicer-like)タンパク質の遺伝子（「DCL遺伝子」ともいう。）に機能喪失型変異を有する植物細胞又は該細胞を含む植物体（以下、「本発明の変異体」と称することがある。）を提供する。
　ダイサー（Dicer）は、二本鎖RNA（dsRNA）特異的エンドリボヌクレアーゼをいい、真核生物では、dsRNAやマイクロRNA前駆体転写物などのステムループ構造を持つ一本鎖RNAを21～24-ntの小RNAに切断することで、転写及び転写後の遺伝子サイレンシングを誘発するために重要な役割を果たす。植物では、上記ダイサーと同様の機能を有するタンパク質として、ダイサー様（DCL）タンパク質が知られている。DCLタンパク質は、AGO及びRDRタンパク質と共に、ウイルスに対する防御機構としてのRNAサイレンシングに重要な役割を果たしており、シロイヌナズナでは、異なるサイズのsiRNAを特異的に産生する4つのDCLタンパク質（DCL1～4）が知られている（Bologna and Voinnet, 2014）。
　DCL3は、DNAウイルスに対する抗ウイルス防御に関与している（Moissiarard and Voinnet, 2006）。また、RNAウイルス由来の24塩基のウイルスsiRNA（vsiRNA）の生成にも関与しているが、植物におけるRNAウイルスに対する抗ウイルス防御への役割は不明である（Deleris et al., 2006、Diaz-Pendon et al., 2007）。DCL4は長いdsRNA基質を好み、その活性にはdsRNA結合タンパク質DRB4を必要とする。DCL4は21塩基のsiRNAを生成し、RNAウイルスに対する抗ウイルス防御の主要な構成要素である（Bouche et al., 2006、Deleris et al., 2006）。また、trans-acting siRNA（tasiRNA）の生合成にも関与している（Gasciolli et al., 2005）。DCL4が存在しない場合、DCL2によって22塩基のvsiRNAが生成されるが、これらのvsiRNAは21塩基のものと比較し、ウイルスのサイレンシング能が低いことが報告されている（Wang et al., 2011）。また、DCL2はDCL4と同様にウイルスの全身感染の制限に重要な役割を担っていることが報告されている（Garcia-Ruiz, et al., The Plant Cell, 22(2), 481-496, 2010）。DCL2～4の機能の概要を図１及び図２として示す。
　標的植物細胞のDCLのゲノム配列が公知でない場合には、DCLのゲノム配列が既知の植物細胞の情報に基づき、自体公知の方法により同定してもよい。例えば、ニコチアナ・ベンサミアナのDCL2、DCL3、DCL4のゲノム配列の場合、例えば以下の方法で特定することができる。文献Nakasugi et al., 2014 PLoS ONE, 9, e91776で報告されたDCL2、DCL3、DCL4のCDS配列をリファレンス配列として、Nicotiana benthamiana genome v1.0.1のScaffoldに対するBLAST検索を行い、DCL2 (Niben101Scf08272)、DCL3 (Niben101Scf06666)、DCL4a (Niben101Scf11936)、DCL4b (Niben101Scf01789)のゲノムDNA配列を同定することができる。上記方法により同定したニコチアナ・ベンサミアナのDCL2のCDS配列（塩基配列）を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２、DCL3のCDS配列（塩基配列）を配列番号３、アミノ酸配列を配列番号４、DCL4aのCDS配列（塩基配列）を配列番号５、アミノ酸配列を配列番号６、DCL4bのCDS配列（塩基配列）を配列番号７、アミノ酸配列を配列番号８で示す。
　上述のニコチアナ・ベンサミアナのDCL4aとDCL4bのように、同一ゲノム上に同じ機能を有すると考えられるDCL遺伝子が複数存在する場合には、本発明の変異体は、片方のみの遺伝子に機能喪失型変異を有していてもよいが、外来遺伝子の発現能力の観点からは、両方の遺伝子に機能喪失型変異を有していることが好ましい。
　本発明において、「遺伝子の機能喪失型変異」とは、遺伝子にナンセンス変異又はフレームシフト変異が導入されることにより、あるいは遺伝子の一部又は全部の配列を欠失させるか付加すること、又は別の配列に置換することなどにより、該遺伝子にコードされるタンパク質の機能が失われる変異を意味する。本発明の変異体は、好ましくは、ホモ接合性に機能喪失型変異が導入される（即ち、全てのアリルのDCLタンパク質の遺伝子に機能喪失型変異を有する）。上記機能喪失型変異により、野生型タンパク質と比較して短く不完全なDCLタンパク質が生じるか、あるいはDCLタンパク質の発現が認められなくなる。不完全なDCLの遺伝子産物は、mRNAレベル及びタンパク質レベルの両方で分解を受け得ることから、機能喪失型変異を生じる変異位置は、特に限定されない。かかる変異位置として、例えば、C末端側に存在する二本鎖RNA結合ドメイン(dsrm a又はdsrm b)の途中又は該ドメイン開始点より上流側が挙げられるが、N末端側の領域、例えばDEADドメイン、非コード領域及びヘリカーゼCドメインとからなる領域やその近傍であることが好ましい。
　下述の実施例で示す通り、本発明の変異体は、野生型の細胞又は植物体と比較して、DCLタンパク質の遺伝子に機能喪失型変異を有することに起因して、外来遺伝子の発現能力が向上する。一実施態様において、DCL2遺伝子及び／又はDCL4遺伝子に変異が導入された本発明の変異体の組織（例：葉）に外来遺伝子を導入した場合に、該組織において、DCLタンパク質の遺伝子全てに上記機能喪失型変異を有さない植物体（対照植物体）の組織と比較して、6倍以上（好ましい態様においては、10倍以上、あるいは40倍以上）のタンパク質を発現する。上記発現は植物体の組織での発現量の比較であるが、細胞レベルで比較した場合にも、同様の発現能力の向上が認められると推測される。従って、本発明の一態様において、本発明の変異体（細胞）は、機能喪失型変異を有さない細胞と比較して、6倍以上(例：7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍又はそれ以上)の外来遺伝子の発現能力を有する。かかる外来遺伝子の発現能力自体は、ウェスタンブロッティングによるタンパク質量や酵素活性、あるいはRT-PCRにより測定したmRNA量などの比較により評価することができる。ただし、上記6倍以上等の具体的な数値を指標とする場合には、実施例２で記載した方法のように、アグロバクテリウム法を用いて35Sプロモーター制御下のTuMVの複製システムを有する核酸を用いて細胞に導入した外来遺伝子としてのGFP発現量を、アグロバクテリウムの接種6日後にウェスタンブロッティングにより測定した数値を基準とする。当然のことながら、本発明の変異体が外来遺伝子として上記GFP遺伝子を有することが必須であるわけではなく、またTuMVの複製システムなどを用いることが必須であるわけではない。外来遺伝子の発現能力の観点からは、少なくとも、DCL2遺伝子及びDCL4遺伝子のいずれかに機能喪失型変異を有することが好ましく、DCL2遺伝子とDCL4遺伝子の両方に機能喪失型変異を有することがより好ましい。
　いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、DCL2遺伝子又はDCL4遺伝子に機能喪失型変異を導入することで、顕著に外来遺伝子の発現能力が向上したメカニズムとしては、以下のように推測される。まず、導入された外来遺伝子から発現したmRNAが細胞内で二本鎖RNAとなり、該二本鎖RNAがDCL2又はDCL4により分解されてsiRNAが生じる。その後、該siRNAとAGOタンパク質の複合体が外来遺伝子から発現したmRNAと部分二本鎖を形成し、該二本鎖の形成に起因してmRNAの切断が生じる。従って、二本鎖RNAを切断してsiRNAを生じさせるDCL3についても、DCL3遺伝子に機能喪失型変異を導入することで、転写レベルの発現抑制が起こらなくなると考えられるため、同様に顕著な外来遺伝子の発現能力の向上が推測される。
　下記の実施例で示される通り、DCL2及び／又はDCL4遺伝子に機能喪失型変異を有する変異体において、TGS経路を回避することで、外来遺伝子の発現能力の向上が確認された。従って、DCL3遺伝子単独に機能喪失型変異を導入するだけでなく、併せてDCL2及び／又はDCL4遺伝子に機能喪失型変異を導入することで、PTGS経路とTGS経路の両方を抑制することができ、外来遺伝子のさらなる発現能力の向上、及び長期間に亘る発現維持が期待される。
　本発明に用いる細胞の由来となるナス科植物としては、例えば、タバコ属（Genus Nicotiana）に属する植物、ナス属（Genus Solanum）に属する植物、トウガラシ属（Genus Capsicum）に属する植物、チョウセンアサガオ属（Genus Datura）に属する植物、キダチチョウセンアサガオ属（Genus Brugmansia）に属する植物などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいナス科植物は、タバコ属に属する植物（「タバコ属植物」ともいう。）である。
　タバコ属に属する植物としては、例えば、ニコチアナ・アカウリス（Nicotiana acaulis）、ニコチアナ・アカミナタ（Nicotiana acuminata）、ニコチアナ・アフリカナ（Nicotiana africana）、ニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）、ニコチアナ・アンプレクシカウリス（Nicotiana amplexicaulis）、ニコチアナ・アレンツィイ（Nicotiana arentsii）、ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata）、ニコチアナ・ベナビデシイ（Nicotiana benavidesii）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ・ビゲロビイ（Nicotiana bigelovii）、ニコチアナ・ボナリエンシス（Nicotiana bonariensis）、ニコチアナ・カビコラ（Nicotiana cavicola）、ニコチアナ・クレベランディイ（Nicotiana clevelandii）、ニコチアナ・コルディフォリア（Nicotiana cordifolia）、ニコチアナ・コリンボサ（Nicotiana corymbosa）、ニコチアナ・デブネイ（Nicotiana debneyi）、ニコチアナ・エクセルシオール（Nicotiana excelsior）、ニコチアナ・フォゲッチアナ（Nicotiana forgetiana）、ニコチアナ・フラグランス（Nicotiana fragrans）、ニコチアナ・グラウカ（Nicotiana glauca）、ニコチアナ・グルチノサ（Nicotiana glutinosa）、ニコチアナ・グッドスピーディイ（Nicotiana goodspeedii）、ニコチアナ・ゴセイ（Nicotiana gossei）、ニコチアナ・イングルバ（Nicotiana ingulba）、ニコチアナ・カワカミイ（Nicotiana kawakamii）、ニコチアナ・ナイチアナ（Nicotiana knightiana）、ニコチアナ・ラングスドルフィ（Nicotiana langsdorfi）、ニコチアナ・リニアリス（Nicotiana linearis）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora）、ニコチアナ・マリチマ（Nicotiana maritima）、ニコチアナ・メガロシフォン（Nicotiana megalosiphon）、ニコチアナ・ミエルシイ（Nicotiana miersii）、ニコチアナ・ノクチフロラ（Nicotiana noctiflora）、ニコチアナ・ヌディカウリス（Nicotiana nudicaulis）、ニコチアナ・オブツシフォリア（Nicotiana obtusifolia）、ニコチアナ・オクシデンタリス（Nicotiana occidentalis）、ニコチアナ・オトフォラ（Nicotiana otophora）、ニコチアナ・パニクラタ（Nicotiana paniculata）、ニコチアナ・パウクツユロラ（Nicotian a pauczjlora）、ニコチアナ・ペチュニオイデス（Nicotiana petunioides）、ニコチアナ・プランバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ニコチアナ・クアドリヴァルヴィス（Nicotiana quadrivalvis）、ニコチアナ・レイモンディイ（Nicotiana raimondii）、ニコチアナ・レパンダ（Nicotiana repanda）、ニコチアナ・ロズラタ（Nicotiana rosulata）、ニコチアナ・ロツンディフォリア（Nicotiana rotundifolia）、ニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）、ニコチアナ・セッチェルリイ（Nicotiana setchellii）、ニコチアナ・シムランス（Nicotiana simulans）、ニコチアナ・ソラニフォリア（Nicotiana solanifolia）、ニコチアナ・スペガウイニイ（Nicotiana spegauinii）、ニコチアナ・ストックトニイ（Nicotiana stocktonii）、ニコチアナ・スアヴェオレンス（Nicotiana suaveolens）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・チルシフロラ（Nicotiana thyrsiflora）、ニコチアナ・トメントサ（Nicotiana tomentosa）、ニコチアナ・トメントシフォミス（Nicotiana tomentosifomis）、ニコチアナ・トリゴノフィラ（Nicotiana trigonophylla）、ニコチアナ・アンブラティカ（Nicotiana umbratica）、ニコチアナ・アンドゥラタ（Nicotiana undulata）、ニコチアナ・ベルンチナ（Nicotiana velutina）、ニコチアナ・ウィガンディオイデス（Nicotiana wigandioides）、及びタバコ属植物のハイブリッドなどが挙げられる。中でもニコチアナ・ベンサミアナが好ましい。
　ナス属に属する植物としては、例えば、ソラヌム・エチオピクム（Solanum aethiopicum）、アメリカイヌホオズキ（Solanum americanum）、ワルナスビ（Solanum carolinense）、タマリロ（Solanum betaceum）、トマト（Solanum lycopersicum）、ヒヨドリジョウゴ（Solanum lyratum）、ツノナス（Solanum mammosum）、ナス（Solanum melongena）、ペピーノ（Solanum muricatum）、イヌホオズキ（Solanum nigrum）、タマサンゴ（Solanum pseudocapsicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）などが挙げられる。
　トウガラシ属に属する植物としては、例えば、トウガラシ（Capsicum annuum）、アヒ・アマリージョ（Capsicum baccatum）、ウルピカ（Capsicum cardenasii）、シネンセ種（Capsicum chinense）、キダチトウガラシ（Capsicum frutescens）、ロコト（Capsicum pubescens）などが挙げられる。
　チョウセンアサガオ属に属する植物としては、例えば、チョウセンアサガオ（Datura metel）、アメリカチョウセンアサガオ（Datura inoxia）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Datura stramonium）などが挙げられる。キダチチョウセンアサガオ属に属する植物としては、コダチチョウセンアサガオ（Brugmansia arborea）、キダチチョウセンアサガオ（Brugmansia suaveolens）などが挙げられる。
　本明細書において、「植物体」は、植物個体、植物器官、植物組織、植物細胞、及び種子のいずれをも包含する。植物器官の例としては、根、葉、茎、及び花などが挙げられる。また、植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、根の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。植物体を構成する細胞は、一部又は全部が本発明の変異体（即ち、DCL遺伝子に機能喪失型変異を有する）であるが、全部の細胞が本発明の変異体であることが好ましい。
　本明細書において、「外来遺伝子を有さない」とは、遺伝子組換え体を作製する際に用いた導入遺伝子（例えば、CRISPR-Casシステム等）を少なくとも有さないことを意味する。ここで、非相同性末端結合（NHEJ）修復を利用したゲノム編集の結果生じる標的部位への塩基挿入（典型的には数十塩基対以下である）、あるいは相同組換え修復（HDR）を利用したゲノム編集の結果生じる、標的部位へのドナーDNAに由来する配列以外の意図しない塩基挿入により生じた配列は、外来遺伝子とはみなされない。「外来遺伝子を有さない」細胞又は植物体には、上記導入遺伝子が取り除かれた細胞及び植物体（例：ヌル分離個体（null-segregant）、導入遺伝子をトランスポゾンシステム等で取り除いた細胞及び植物体等）だけでなく、自然突然変異を有する細胞及び植物体も包含される。また、「ヌル変異個体」とは、遺伝子組換え体同士又は遺伝子組換え体と非遺伝子組換え体を交配して得られた後代の個体の中で、導入した外来遺伝子を有さないものを意味する。
　本発明の変異体が有するDCLタンパク質の遺伝子の機能喪失型変異は、例えば、自然突然変異であってもよいし、人工的に導入した変異（変異原処理、遺伝子の相同組換えや、ゲノム編集の結果として生じる変異）であってもよく、かかる人工的に変異を導入した遺伝子を有する細胞又は植物体を、「遺伝子組換え体」又は「形質転換体」とも称する。上記遺伝子の自然突然変異は、複製エラー及び遺伝子の損傷によって自然に生じうる。上記変異原処理としては、例えば、放射線、中性子線、紫外線もしくは変異誘導物質（例えばEMSなど））への細胞又は植物体の暴露などが挙げられる。遺伝子の相同組換えは、公知の遺伝子組換え手法にしたがって、標的遺伝子の一部又は全部を、かかる領域に相同な配列を含む組換え配列によって相同的に組み換えることによって実施され得る。ゲノム編集は、公知の技術（例えば、zinc-finger nucleases：ZFN、transcription activator-like effector nucleases：TALEN、及びCRISPR／Cas9 systemなど）によって実施され得る。
　所望の遺伝子の機能喪失型変異を容易に導入できるとの観点からは、ゲノム編集により導入することが好ましい。従って、本発明の変異体は、ゲノム編集により、ナス科植物細胞のDCLタンパク質遺伝子に機能喪失型変異を導入することにより製造することができる。よって、本発明の別の態様において、DCL2遺伝子、DCL4遺伝子及びDCL3遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を標的とする核酸配列認識モジュールと、ヌクレアーゼ又はデアミナーゼとの複合体（以下、「核酸改変酵素複合体」と称する場合がある。）又は該複合体をコードする核酸をナス科植物細胞に導入する工程を含む、本発明の変異体の製造方法が提供される。本明細書において、核酸改変酵素複合体をコードする核酸は、核酸配列認識モジュールをコードする塩基配列と、ヌクレアーゼ又はデアミナーゼをコードする塩基配列とを含み、CRISPR-Casシステムを用いる場合には、該複合体にはさらにガイドRNAをコードする配列も含む。
　本明細書において、「核酸配列認識モジュール」とは、DNA鎖上の標的配列を特異的に認識して結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。核酸配列認識モジュールが標的配列に結合することにより、該モジュールに連結されたヌクレアーゼ又はデアミナーゼが該配列又はその近傍領域に特異的に作用することを可能にする。
　核酸配列認識モジュールとしては、例えば、CRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフなどの他、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のDNAと特異的に結合し得るタンパク質のDNA結合ドメインを含むフラグメントなどが挙げられる。好ましくは、CRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター又はPPRモチーフである。
　ジンクフィンガーモチーフは、Cys2His2型の異なるジンクフィンガーユニット（1フィンガーが約3塩基を認識する）を3～6個連結させたものであり、9～18塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、Modular assembly法（Nat Biotechnol(2002) 20: 135-141）、OPEN法（Mol Cell (2008) 31: 294-301）、CoDA法（Nat Methods (2011) 8: 67-69）、大腸菌one-hybrid法（Nat Biotechnol (2008) 26:695-701）等の公知の手法により作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、例えば、特許第4968498号公報を参照することができる。
　TALエフェクターは、約34アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、1つのモジュールの12及び13番目のアミノ酸残基（RVDと呼ばれる）によって、結合安定性と塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、モジュールを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なTALエフェクターを作製することが可能である。TALエフェクターは、オープンリソースを利用した作製方法（REAL法(Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15)、FLASH法(Nat Biotechnol(2012) 30: 460-465)、Golden Gate法(Nucleic Acids Res (2011) 39： e82)等）が確立されており、比較的簡便に標的ヌクレオチド配列に対するTALエフェクターを設計することができる。TALエフェクターの作製の詳細については、例えば、特表2013-513389号公報を参照することができる。
　PPRモチーフは、35アミノ酸からなり1つの核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されており、各モチーフの1、4及びii（-2）番目のアミノ酸のみで標的塩基を認識する。モチーフ構成に依存性はなく、両脇のモチーフからの干渉はないので、TALエフェクター同様、PPRモチーフを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なPPRタンパク質を作製することが可能である。PPRモチーフの作製の詳細については、例えば、特開2013-128413号公報を参照することができる。
　CRISPR-Casシステムを用いる場合には、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列を含むCRISPR-RNA（crRNA）と、必要に応じてCasタンパク質のリクルートに必要なtrans-activating RNA（tracrRNA）と（tracrRNAが必要な場合は、crRNAとのキメラRNAとして提供され得る）、Casタンパク質との複合体として提供される。Casタンパク質と組み合わせて核酸配列認識モジュールを構成する、crRNA単独あるいはcrRNAとtracrRNAとを連結したキメラRNAからなるRNA分子を「ガイドRNA」と総称する。
　本発明で使用されるCasタンパク質は、ガイドRNAと複合体を形成して、目的遺伝子中の標的ヌクレオチド配列とそれに隣接するprotospacer adjacent motif（PAM）を認識し結合し得る限り、特に制限はないが、好ましくはCas9又はCpf1である。Cas9としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9（SpCas9; PAM配列NGG(NはA、G、T又はC。以下同じ)）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のCas9（StCas9; PAM配列NNAGAAW）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のCas9（NmCas9; PAM配列NNNNGATT）等や、PAM認識特異性が改変された改変型Cas9群が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはPAMによる制約が少ないSpCas9である（実質2塩基である）。また、Cpf1としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のCpf1（FnCpf1; PAM配列NTT）、アシダミノコッカス sp.（Acidaminococcus sp.）由来のCpf1（AsCpf1;PAM配列NTTT）、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のCpf1（LbCpf1; PAM配列NTTT）等が挙げられるが、それらに限定されない。上記Casタンパク質としては、二本鎖DNA鎖の両方の鎖の切断能を有するもの、一方の鎖の切断能のみが失活したニッカーゼ活性を有するもの、及び両方の鎖の切断能が失活したものの、いずれも使用可能である。例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基がAla残基に変換した、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能を欠く（従って、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖に対するニッカーゼ活性を有する）D10A変異体、あるいは、840番目のHis残基がAla残基で変換した、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の切断能を欠く（従って、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖に対するニッカーゼ活性を有する）H840A変異体、さらにはその二重変異体（dCas9）を用いることができる。また、FnCpf1の場合、917番目のAsp残基がAla残基（D917A）に、あるいは1006番目のGlu残基がAla残基（E1006A）に変換した、両方の鎖の切断能を欠く変異体を用いることができる。]
　上記いずれかの核酸配列認識モジュールと、ヌクレアーゼ又はデアミナーゼとを結合させることで、核酸改変酵素複合体を作製することができる。また、CRISPR-Casシステムを用いる場合には、標的配列を認識するガイドRNAと、該ガイドRNAによりリクルートされるヌクレアーゼ活性を有するCasタンパク質とが、核酸改変酵素複合体を形成する。あるいは、ガイドRNAと、少なくともいずれか一方のDNA切断能が失活したCasタンパク質（「変異Casタンパク質」ともいう。）と、デアミナーゼとが、核酸改変酵素複合体を形成する。デアミナーゼを有する核酸改変酵素複合体の作製の詳細については、例えば、国際公開第2015/133554号公報を参照することができる。
　ここで「複合体」は複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールとヌクレアーゼ又はデアミナーゼとを単一の分子内に有するものも包含される。従って、前記核酸配列認識モジュールは、ヌクレアーゼ又はデアミナーゼとの融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、SH3ドメイン、PDZ11ドメイン、GKドメイン、GBドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、核酸配列認識モジュールと、ヌクレアーゼ又はデアミナーゼとにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、ヌクレアーゼ又はデアミナーゼとにそれぞれインテイン（intein）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。
　本発明で用いるヌクレアーゼとしては、Casタンパク質（例、Cas9、Cpf1）、エンドヌクレアーゼ（例：FokIなどの制限酵素）、エキソヌクレアーゼなどが挙げられる。デアミナーゼとしては、例えば、シトシン又は5-メチルシトシンをそれぞれウラシル又はチミンに変換し得るシチジンデアミナーゼ、アデニンをヒポキサンチンに変換し得るアデノシンデアミナーゼ、グアニンをキサンチンに変換し得るグアノシンデアミナーゼ等が挙げられる。シチジンデアミナーゼとして、より好ましくは、脊椎動物の獲得免疫においてイムノグロブリン遺伝子に変異を導入する酵素である活性化誘導シチジンデアミナーゼ（以下、AIDともいう）などが挙げられる。
　デアミナーゼの由来は特に制限されないが、例えば、ヤツメウナギ由来のPmCDA1（Petromyzon marinus cytosine deaminase 1）、哺乳動物（例、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）由来のAID（Activation-induced cytidine deaminase; AICDA）又はAPOBECタンパク質を用いることができる。例えば、PmCDA1のcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列は、GenBank accession No. EF094822及びABO15149を、ヒトAIDのcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列はGenBank accession No. NM_020661及びNP_065712を、それぞれ参照することができる。
　核酸改変酵素複合体は、典型的には該複合体をコードする核酸の形態で細胞に導入されるが、該核酸は、DNAであってもRNAであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。かかる核酸は、遺伝子工学的技術を用いて作製してもよいし、化学的に合成してもよい。核酸がDNAである場合には、化学的にDNA鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法などを利用して接続することにより、タンパク質の全長をコードするDNAを構築することも可能である。化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで全長DNAを構築することの利点は、該DNAを導入する宿主に合わせて使用コドンをCDS全長にわたり設計できる点にある。異種DNAの発現に際し、そのDNA配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公財）かずさDNA研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、又は各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。
　核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼ又はデアミナーゼをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、該DNAを、植物細胞で機能し得るプロモーターを含むベクター中の該プロモーターの下流に連結することにより製造することができる。植物細胞で複製可能なベクターとしては、植物細胞で機能する複製起点（例、Tiプラスミド、Riプラスミドのori等）を有するものであれば特に制限はないが、大腸菌の複製起点（例、ColE1 ori等）も有していることが好ましい。遺伝子導入法としてアグロバクテリウム法を用いる場合、Tiプラスミド、Riプラスミドの病原性遺伝子を除いたT-DNA断片（境界配列RB及びLBを含む）をさらに含む必要があり、例えば、pBIN19由来のpBI101、pBI121（クロンテック）やこれをバックボーンとする改良型ベクター（例、pRI909、pRI910、pRI101、pRI201（タカラバイオ）等）が挙げられるが、これらに限定されない。また、植物ウイルスベクター（例：ポテトウイルスX（Potato virus X；PVX）ベクター、カブモザイクウイルス（Turnip mosaic virus;TuMV）ベクター、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus;TMV）ベクター、ササゲモザイクウイルス（Cowpea mosaic virus;CPMV）ベクター等）を用いた方法（例：Genewareシステム等）であってもよい。
　発現量の観点からは、アグロバクテリウム法を用いる場合に、上記プラスミドは、ウイルス由来の複製システムであってもよい。換言すれば、上記プラスミドには、ウイルスゲノムから、該ウイルスの複製に必要な領域のみが組込まれたものであってもよい。かかるウイルス由来の複製システムとしては、例えば、TuMV由来の複製システム、TMV由来の複製システム（例えば、magnICONシステム）、CPMV由来の複製システム（例えば、Proficaシステム）、インゲン黄斑萎縮ウイルス（Bean yellow dwarf virus;BeYDV）由来の複製システム（例えば、つくばシステム(WO 2018/220929））などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、上記のウイルス由来の複製システムを有さないプラスミドを用いてもよい。
　プロモーターとしては、植物細胞で機能し得るプロモーターであればいかなるものでもよい。プロモーターとして誘導プロモーター（例、傷害、サリチル酸処理で誘導されるPR1α遺伝子プロモーター、乾燥、低温、アブシジン酸処理で誘導されるrd29A遺伝子プロモーター、ジクロロミド処理で誘導されるGST-27遺伝子プロモーター等）を使用することで、誘導開始までに細胞数を増やしてもよい。また、プロモーターとして構成プロモーターも使用することができる。構成プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、ノパリン合成酵素（NOS）プロモーター、パセリ由来ユビキチンプロモーター（Pcubi4-2）等が挙げられる。これらのプロモーター又はその断片をタンデムに繋げたもの（例、2x35S）を用いることもできる。また、本発明者らは以前、CaMVと同科のウイルスであるカリモウイルス属に属する植物DNAウイルスのPClSV（Peanut chlorotic streak virus）、Soymovirus属に属する植物DNAウイルスのFMV（Figwort mosaic virus）、カリモウイルス属に属する植物ウイルスのMMV（Mirabilis mosaic virus）、Cavemovirus属に属する植物ウイルスのCsVMV（Cassava vein mosaic virus）、およびカリモウイルス属に属する植物ウイルスのDMV（Dahlia mosaic virus）等各ウイルスのFlt（Full length transcriptional）プロモーターも、35Sプロモーター同様に植物遺伝子発現系として使用することができる（特にMMV由来のFltプロモーターで効果が高い）ことを実証している。また、外来遺伝子の発現に際して、１種類のプロモーターを用いるのではなく、複数種類のプロモーターを用いて外来遺伝子を発現させることで、発現量が向上することを確認している。従って、外来遺伝子を１種類のみ発現させる場合であっても、複数のプロモーターを用いることが好ましい。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、前記発現量の向上は、同一プロモーターを持つコンストラクトを植物細胞に導入すると、複数のプロモーターを用いた場合よりも植物細胞のゲノム上に該プロモーターの数が多くなるため、TGSが相対的に起こりやすいためだと推測される。また、上記Fltプロモーターは、各プロモーターの由来のウイルス由来の5’UTRが除かれていてもよい。
　発現ベクターは、所望によりターミネーター（例、NOSターミネーター、エンドウrbcS3Aターミネーター、熱ショックタンパク質（HSP）18.3ターミネーター等）、翻訳エンハンサー（例、イネ由来アルコールデヒドロゲナーゼ5’非翻訳領域（Os ADH-5’UTR）、タバコモザイクウイルス（TMV）由来Ω配列等）、3’調節領域（例、イネ由来アクチン遺伝子（Act1）3’UTR等）、ポリA付加シグナル、薬剤耐性遺伝子（例、G418耐性遺伝子（nPtII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hpt）等）の選択マーカーなどを含有することができる。
　一方、ガイドRNAをコードするDNAは、標的配列と相同な配列（ターゲッティング配列ともいう。）を含むcrRNA配列（例えば、Casタンパク質としてCpf1をリクルートする場合）をコードする配列、あるいは、crRNAコード配列と必要に応じて既知のtracrRNAコード配列（例えば、Casタンパク質としてCas9をリクルートする場合）とを連結したオリゴDNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。標的ターゲッティング配列の長さは、例えば15～30ヌクレオチド、好ましくは18～25ヌクレオチドである。なお、本明細書において、標的配列は、ガイドRNAと二本鎖を形成する鎖とは反対の鎖の配列を意味する。
　ガイドRNAをコードするDNAも、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、pol III系のプロモーター（例、SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U3、U6、H1プロモーター等）及びターミネーター（例、ポリT配列（T6配列等））を用いることが好ましい。
　核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼ又はデアミナーゼをコードするRNAは、例えば、上記した該複合体をコードするDNAをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。
　核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼ又はデアミナーゼをコードするDNAを含む発現ベクターを宿主植物細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって、核酸改変酵素複合体を細胞内で発現させることができる。核酸改変酵素複合体の細胞への導入には、自体公知の方法によって行うことができるが、例えば、核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼ又はデアミナーゼをコードするDNA（例：発現ベクターの形態の核酸）の形態で導入することができる。発現ベクターの導入は、植物の種類に応じ、適当な組織（例、カルス、根、葉、種子、生長点等）に対し、公知の方法（例えば、アグロバクテリウム法、PEG法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイスカー直接導入法等）に従って実施することができるが、通常、アグロバクテリウム法が用いられる。例えば、アグロバクテリウム法をタバコ属植物に適用する場合、例えば、タバコ組織（例：タバコ葉）や胚軸の一部を切り取ってアグロバクテリウムに感染させ（換言すれば、アグロバクテリウムを播種し）、組換え体を選別した後、カルスを誘導し、その後発根を誘導することで、遺伝子組換え植物体を得ることができる。あるいは、カルスにアグロバクテリウムを感染させてもよい。かかるアグロバクテリウムとしては、典型的には、アグロバクテリウム発現用ベクターのT-DNA断片中に核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼ又はデアミナーゼをコードするDNA（CRISPR-Casシステムを用いる場合には、Casタンパク質と、又は変異Casタンパク質とデアミナーゼとの複合体をコードするDNAと、ガイドRNAをコードするDNAを含む発現カセットを組込んだもの）を導入したものを用いる。PEG法やエレクトロポレーション法を用いる場合は、適当な細胞・組織から常法に従ってプロトプラストを調製し、これに発現ベクターを導入する。パーティクルガン法の場合は、カルスや、未熟胚、茎頂や腋芽に存在する生長点等に、金微粒子に吸着させた発現ベクターを、パーティクルガンを用いて導入することができる。パーティクルガン法やアグロバクテリウム法では、遺伝子導入がキメラとなる場合が多いので、生殖系列（germ line）の細胞に高頻度に上記核酸が導入されるような試料細胞を、形質転換のために使用する必要がある。例えば、胚、胚軸切片、胚形成カルス（embryogenic callus）、単離した生長点等が挙げられる。
　ベクターを導入した植物細胞の培養は、その種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。培養に使用される培地としては固形培地（例、寒天培地、アガロース培地、ゲランガム培地等）が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。例えば、基礎培地としてN6培地、MS培地、MSR培地、LS培地、B5培地などが用いられる。培地には、適宜、植物生長物質（例、オーキシン類、サイトカイニン類等）などを添加してもよい。培地のpHは好ましくは約5～約8である。培養温度は、植物細胞の種類に応じて、通常約20～約35℃の範囲内で適宜選択することができる。例えば、タバコ属植物細胞の場合、通常28～33℃、好ましくは30～33℃で培養することができる。
　本発明の植物細胞又は植物体の選抜は、当業者であれば用いるマーカー遺伝子の種類に合わせて適宜公知の手法により選択して行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子（例：カナマイシン耐性遺伝子（nptII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hpt）等の薬剤耐性遺伝子）を用いた場合には、本発明の機能喪失型変異を導入した植物細胞等を、対応する薬剤存在下にて培養することにより、標的領域に変異等が導入された植物細胞を選択することができる。
　本発明において、変異導入が確認された形質転換体クローンは、自体公知の再分化法により、植物体に再分化させることができる。標的領域に変異が導入された植物細胞を含む植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。従って、本発明には、本発明の植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。ヘテロ接合性に変異が導入されている場合、得られた植物体を自家受粉させて得られるT1植物を、さらに自家受粉させてT2植物を得ることにより、ホモ接合性に変異導入された植物体を得ることができる。また、ホモ接合性に変異導入された植物体について、変異導入の際に用いた外来遺伝子、即ち上記核酸改変酵素複合体をコードする遺伝子が存在しない個体を選択することで、あるいはさらに世代交代を進めることで、ヌル分離個体を作製することができる。
２．DCL遺伝子に機能喪失型変異を有する植物細胞又は該細胞を含む植物体におけるタンパク質の製造方法
　別の実施態様において、本発明は、本発明の変異体を用いた目的タンパク質の製造方法（以下、「本発明のタンパク質の製法」と称する場合がある。）を提供する。前記方法は、例えば、
　（１）本発明の変異体に、目的タンパク質をコードする核酸（以下、「目的タンパク質コード核酸」と称する場合がある。）を導入する工程、及び
　（２）工程（１）で目的タンパク質コード核酸が導入された本発明の変異体において該タンパク質を発現させる工程、
を含む。
　目的タンパク質コード核酸は、該目的タンパク質をコードする遺伝子を含むが、該遺伝子は核酸が導入される細胞が生来有している遺伝子であってもよい（この場合には、該遺伝子にコードされるタンパク質が過剰発現されることとなる）が、該細胞が生来有していない遺伝子（即ち、異種タンパク質をコードする遺伝子）であることが好ましい。
　目的タンパク質コード核酸は、DNAであってもRNAであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。目的タンパク質コード核酸の作製方法、発現ベクターの種類や発現ベクターに含まれるプロモーターやターミネーターなどの他の要素、あるいは細胞への発現ベクターの導入方法や細胞の培養方法などは、上述の核酸改変酵素複合体をコードする核酸についての説明を援用できる。この場合には、「核酸改変酵素複合体をコードする」及び「核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼ又はデアミナーゼをコードする」を「目的タンパク質をコードする」に読み替えるものとする。
　上記目的タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、抗体やインターフェロン（例：IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-κ、IFN-γ、IFN-λ等）などの高付加価値のタンパク質、抗原、発現が困難であるタンパク質（例：西洋ワサビのペルオキシダーゼ等）などが挙げられる。抗原として、例えばウイルスタンパク質の一部を用いることで、ウイルスに対するワクチンや抗体の開発の際に有用な抗原を大量生産することが可能となる。あるいは、抗がん剤の開発の際に有用ながん抗原を大量生産することもできる。
　かかるウイルスとしては、例えば、バリセロウイルス属（Genus Varicellovirus）ウイルス（例：水痘帯状疱疹ウイルス（Varicella Zoster virus）等）、シンプレックスウイルス属（Genus Simplexvirus）ウイルス（例：単純ヘルペスウイルス2型（Herpes simplex virus 2）等）、ロゼオロウイルス属（Genus Roseolovirus）ウイルス（例：ヒトヘルペスウイルス6,7型（human herpesvirus 6, 7）等）などのヘルペスウイルス科（Family Herpesviridae）ウイルス；ヘパシウイルス属（Genus Hepacivirus）ウイルス（例：C型肝炎ウイルス（hepatitis C virus）等）、フラビウイルス属（Genus Flaviviridae）ウイルス（例：日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、ジカウイルス（Zika virus）等)などのフラビウイルス科（Family Flaviviridae）ウイルス；ベータコロナウイルス属（Genus Betacoronavirus）ウイルス（例：SARSコロナウイルス（Severe acute respiratory syndrome coronavirus：SARS-CoV）、SARSコロナウイルス2（SARS-CoV-2））、MERSコロナウイルス（Middle East respiratory syndrome coronavirus）等）などのコロナウイルス科（Family Coronaviridae）ウイルス；A型インフルエンザウイルス（Influenzavirus A）、B型インフルエンザウイルス（Influenzavirus B）、C型インフルエンザウイルス（Influenzavirus C）などのオルトミクソウイルス科（Family Orthomyxoviridae）ウイルス；モルビリウイルス属（Genus Morbillivirus）ウイルス（例：麻疹ウイルス（Measles morbillivirus）等）、オルトニューモウイルス属（Genus Orthopneumovirus）ウイルス（例：RSウイルス（respiratory syncytial virus）等）などのパラミクソウイルス科（Family Paramyxoviridae）ウイルス；レトロウイルス科ウイルスとしては、例えば、レンチウイルス属（Genus Lentivirus）ウイルス（例：ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus）等）などのレトロウイルス科（Family Retroviridae）ウイルスなどが挙げられる。
　上記工程（２）において、目的タンパク質コード核酸を導入した細胞を培養することで、目的タンパク質を発現させることができる。あるいは、目的タンパク質コード核酸を有するアグロバクテリウムを、植物体の一部（例：葉）に感染させた後に該植物体を育成することによっても、目的タンパク質を発現させることができる。
　また、工程（２）で得られた細胞から、自体公知の方法により有用成分を抽出及び精製することで、又は培養液中に目的タンパク質を分泌させ、該タンパク質を回収することで、目的タンパク質を単離することができる。あるいは、細胞に凍結及び乾燥処理を行い、そのまま利用してもよい。同様に、植物体の目的タンパク質は、目的タンパク質を自体公知の方法により、該植物体から有用成分を抽出及び精製することで、該タンパク質を単離することができる。あるいは、植物体をそのまま利用してもよい。従って、本発明のタンパク質の製法は、（３）工程（２）で得られた目的タンパク質を発現する細胞又は植物体から、該タンパク質を単離する工程を含んでいてもよい。上記自体公知の単離方法として、例えば、植物体をミキサー若しくは乳鉢などで破砕した後、生理食塩水などの適切な緩衝液中に浸漬して、破砕残留物を遠心又は濾過により除去する方法などが挙げられる。
３．DCL遺伝子に機能喪失型変異を有する植物細胞又は該細胞を含む植物体におけるウイルスの増殖方法
　本発明において作製されたDCL遺伝子に機能喪失型変異を有する植物細胞又は該細胞を含む植物体は、ウイルス抵抗性が欠損しているため、免疫抑制能を欠損させた植物ウイルスであっても効率良く増殖させることができる。従って、さらに別の態様において、本発明は、（Ａ）本発明の変異体にウイルスを感染させ、該ウイルスを増殖させる工程、及び（Ｂ）前記工程（Ａ）により増殖したウイルスを回収する工程を含む、ウイルスの増殖方法を提供する。かかるウイルスとしては、例えば、生物農薬として利用されている弱毒植物ウイルスが挙げられる。上記工程（Ａ）及び（Ｂ）はいずれも、自体公知の方法により行うことができる。
　「弱毒植物ウイルス」とは、宿主に対する病原性が低下したウイルスを意味する。宿主での増殖能は保持しているため、植物に事前に処理することで後から感染するウイルスによる発病を抑えることができるため、生物農薬として利用される。弱毒植物ウイルスとして、例えば、トマトモザイクウイルスの弱毒ウイルス(例：TMV-L11A)、キュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、トウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒ウイルス(例：TMV-P)、スイカ緑斑モザイクウイルスの弱毒ウイルス、ズッキーニ黄斑モザイクウイルスの弱毒ウイルス、ダイズモザイクウイルスの弱毒ウイルス、カンキツトリステザウイルスの弱毒ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において作製されたダイサー様（DCL）タンパク質の機能喪失型変異を有する植物細胞又は該細胞を含む植物体に、例えば、前記の弱毒植物ウイルスを感染させて大量に増殖させることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１　PTGS及びTGSを引き起こさないタバコの作出
　本研究では、アグロインフィルトレーション法を用いたN.benthamianaでの一過的な遺伝子発現における検証をもとに、TGSを回避しつつ複数遺伝子を過剰発現させる系を確立することを目的としている。しかし、野生型のN.benthamianaでは、TGSに関与するDCL3タンパク質の他に(図２)、PTGSに関与するDCL2とDCL4タンパク質が発現する(図１)。そのため、野生型を用いた一過的発現実験においては、PTGSの働きを除外することが出来ず、TGSのみによる遺伝子発現抑制の評価が困難であると考えられた。そこで、本研究では、PTGSを引き起こさないN.benthamianaを作出するために、CRISPR/Cas9システムを用いてNbDCL2とNbDCL4遺伝子を標的としゲノム編集を行った。
＜材料及び方法＞
タバコ属植物（Nicotiana benthamiana）
　スーパーミックス A（サカタのタネ）：バーミキュライト＝1:1の割合で混合した土を詰めたプラスチックポットに播種した。気温24℃、蛍光灯による明期16時間、暗期8時間の長日条件下で育成を行った。農薬にはベストガード粒剤（住友化学園芸）及びオルトラン粒剤（住友化学園芸）を、肥料にはハイポネックス原液6-10-5（ハイポネックス ジャパン）を200倍希釈したものを使用した。アグロインフィルトレーションには、播種後約4週から5週目の植物体を用いた。また、形質転換個体の作製には無菌状態で生育させたN.benthamianaを用いた。
アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）
　アグロインフィルトレーションによる一過的な遺伝子発現実験には、Agrobacterium tumefaciensのGV3101（pMP90）株（Koncz et al., 1986）を用いた。GV3101株は、ゲノム上にリファンピシン（Rifampicin：Rif）耐性遺伝子、ヘルパープラスミド上に形質転換に必要なVir遺伝子とゲンタマイシン（Gentamicin：Gen）耐性遺伝子を有する。N.benthamianaの形質転換体の作製に、スペクチノマイシン（Spectinomycin：Spe）耐性遺伝子を有する共役プラスミドpSoup-Spec（Kumakura et al., 2013）をGV3101株に導入したGV3101 株（GV3101 pSoup-Spec）を用いた。
プラスミド
・pWAT135-FLAG-hcoCas9-3001、3002、3003、3004
　pWAT1由来のプラスミドで、シロイヌナズナ由来のRPS5Aプロモーター及びHSP18.2ターミネーターを有しており、このRPS5Aプロモーターの制御下でhcoCas9遺伝子を発現する。N.benthamianaのDCL2遺伝子（NbDCL2）を標的とするgRNAを発現するカセット、N.benthamianaのDCL3遺伝子（NbDCL3）を標的とするgRNAを発現するカセット及びN.benthamianaのDCL4遺伝子（NbDCL4aおよびNbDCL4b）を標的とするgRNAを発現するカセットが連結されている（図３）。本研究では、N.benthamianaのDCL2、DCL3、DCL4a及びDCL4b遺伝子をゲノム編集するために用いた。pWAT135-FLAG-hcoCas9-3001では、DCL2-gRNA2、DCL3-gRNA1、そしてDCL4-gRNA1がU6プロモーター制御下で発現される。pWAT135-FLAG-hcoCas9-3002 では、DCL2-gRNA3、DCL3-gRNA1、そしてDCL4gRNA1がU6プロモーター制御下で発現される。pWAT135-FLAG-hcoCas9-3003では、DCL2-gRNA2、DCL3-gRNA2が、そしてDCL4-gRNA1がU6プロモーター制御下で発現される。pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004では、DCL2-gRNA3、DCL3-gRNA2、そしてDCL4-gRNA1がU6プロモーター制御下で発現される。これらのプラスミドは、Golden gate cloning法により構築した。
種子滅菌
　N.benthamiana種子を30粒程度1.5 mL チューブに取り、そこに1 mLのDW及び2 μLのPPMTM（Plant Cell Technology）を加え、転倒混和した。このチューブを一晩4℃に静置し、滅菌した。その後、MS固体培地に滅菌したN.benthamianaの種子を均一に広げた。MS固体培地上の余分な水分を取り除き、シャーレをサージカルテープでまき、16時間明期、8時間暗期、24℃で約二週間生育した。
アグロバクテリウムの形質転換
　pWAT135-FLAG-hcoCas9-3001、3002、3003、3004をアグロバクテリウムへ形質転換した。各プラスミドはNbDCL2を標的とするgRNA2、3を発現するカセット（図４、図５）、NbDCL3を標的とするgRNA1、2を発現するカセット（図６、図７）、及びNbDCL4a及びNbDCL4bを標的とするgRNA1を発現するカセット（図８）が含まれている。300 ngの各プラスミドを40 μLのアグロバクテリウムGV3101 pSoup-Spec株のコンピテントセルに加え、液体窒素を用いて凍結後、37℃で30分間インキュベートしプラスミドを導入した。その後、SOCを360 μL加え、28℃で2時間インキュベートし回復培養した。その後、50 ng/μLのカナマイシン、50 ng/μLのゲンタマイシン、50 ng/μLのリファンピシン、及び50 ng/μLのスぺクチノマイシンを含むLB固体培地に50 μL植菌し、28℃で48時間培養した。
N.benthamianaの形質転換
　LB寒天培地で培養したアグロバクテリウムGV3101 pSoup-Spec株のシングルコロニーを、滅菌した10 μLチップでつつき、50 ng/μLのカナマイシン、50 ng/μLのゲンタマイシン、50 ng/μLのリファンピシン、及び50 ng/μLのスぺクチノマイシンを含む5 mLのLB液体培地に移して28℃で24時間振とう培養した。その後、4,000 rpm、4℃で15分間遠心し上清を取り除き、アグロバクテリウムのペレットにMS1液体培地を25 mL加えて懸濁した。続いて、MS8培地上で2週間生育したN.benthamianaの葉と胚軸をメスで切り出し、アグロ懸濁液に2～3分間浮かべた。滅菌しておいたキムタオル上で植物片を風乾し、懸濁液を取り除いた。その後、50 ng/μLのカナマイシン及び50 ng/μLのクラフォランを含むMS1固体培地上に植物片を並べた後、24℃、暗下で2日間静置した。2日後、これらの植物片を125 ng/μLのクラフォランを加えた25 mLのMS1液体培地を注いだシャーレに移し、24℃暗条件下で2日間静置した。2日後、滅菌済みのキムタオル上で、MS1液体培地中の植物片を風乾させた。風乾後、50 ng/μLのカナマイシン及び50 ng/μLのクラフォランを含むMS4固体培地に移し、24℃16時間照明条件下で培養させ、カルスを誘導した。MS4個体培地上の植物片にカルスが誘導された後、カルスから生えたシュートをメスで切り出し、それを50 ng/μLのカナマイシン及び50 ng/μLのクラフォランを含むMSR固体培地が入った滅菌済みの小型密閉植物培養器（Magenta）に移し、24℃、16時間照明条件下で生育させ形質転換体の発根を誘導した。
馴化
　根が生えた個体をMSR培地から取り出し、根についた培地を洗い流してからプラスチックポットに入れた土に植えた。植物体の上からプラスチックポットをかぶせて光を遮り、さらにラップをかぶせて湿度を保ち、数日間馴化を行った。馴化後、野生型の植物体と同様に育成し、種子を回収した。
ゲノムDNA抽出
　得られた形質転換体の標的遺伝子配列に変異が導入されているか確認するため、ゲノムDNA抽出を行った。ステンレスビーズが1個入った2 mLチューブで1枚のリーフディスクを回収した。回収後、チューブに入れたサンプルを液体窒素で瞬間凍結した。凍結したサンプルをシェーカーで2分間破砕した。破砕後、サンプルを15,000 rpm、室温で破砕した葉を底に落とした。その後、チューブからステンレスビーズを取り除き、100 μLのDNA抽出bufferを加えボルテックスし、15,000 rpm、室温、2分間遠心した。遠心後、50 μLの上清をあらかじめ50 μLのイソプロパノールを入れた1.5 mLチューブ に加え、ボルテックスした。その後、15,000 rpm、室温、5 分間遠心した。遠心後、上清を取り除き、ペレットが落ちないように風乾した。風乾後、25 μLの1x TEを加え、混合しDNA抽出物を得た。
選抜・変異確認
　標的遺伝子配列に変異が導入されているか確認するため、形質転換体から抽出したDNA
のシークエンス解析及び表現型の確認を行った。変異が確認されたラインの世代を進め、導入遺伝子をヌル分離し、変異をホモ固定した（図９）。使用したプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜結果＞
ヌル分離された変異体の作製
　PTGS及びTGSを引き起こさないN.benthamianaを作製することを目的としてDCL遺伝子が破壊された形質転換体の作製を行った。各DCL遺伝子に編集を加えるために、pWAT135-FLAG-hcoCas9-3001、3002、3003、3004を用いた。T2世代の形質転換体において導入遺伝子がヌル分離していることと、変異がホモ固定されたことの確認を行った。
　NbDCL2遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(DCL3及びDCL4aは野生型、DCL4bは未確認)は、pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 #1-3-1、#1-3-6、#1-3-7、#1-10-8の計4ライン得られた（表２）。NbDCL4a遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(DCL2、DCL3及びDCL4bは野生型)は、pWAT135-FLAG-hcoCas9-3002 #1-9-4の1ライン得られた（表３）。また、NbDCL4a遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(DCL2及びDCL3は野生型、DCL4bは未確認)は、pWAT135-FLAG-hcoCas9-3002 #1-9-2、#1-9-4、#1-9-6、#1-9-8、#1-9-11とpWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 #3-2-2、#3-2-3、#3-2-4、#3-2-6、#3-2-11、#3-2-12の計10ライン得られた（表３）。NbDCL2とNbDCL4a遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(DCL3は野生型、DCL4bは未確認)は、pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 #1-5-3、#1-5-9、#1-10-12、#3-4-9の計4ライン得られた（表４）。NbDCL2とNbDCL4b遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(DCL3及びDCL4aは野生型)は、pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 #3-4-11の1ライン得られた（表５）。NbDCL2、NbDCL4a及びNbDCL4b遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(DCL3は野生型)は、pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 #3-4-7の1ライン得られた（表６）。得られたラインにおいてhcoCas9遺伝子が存在しないことを確認し、得られたラインから導入遺伝子がヌル分離したことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　左から形質転換体（導入遺伝子）の名前、ライン番号、導入遺伝子がヌル分離しホモ固定された世代、導入された変異、変異体名を示す。DCL2遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(DCL3及びDCL4aは野生型、DCL4bは未確認)は、4ライン得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　左から形質転換体（導入遺伝子）の名前、ライン番号、導入遺伝子がヌル分離しホモ固定された世代、導入された変異、変異体名を示す。DCL4遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(#1-9-4では、DCL2、DCL3及びDCL4bは野生型。#1-9-4以外では、DCL2及びDCL3は野生型、DCL4bは未確認)は、11ライン得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　左から形質転換体（導入遺伝子）の名前、ライン番号、導入遺伝子がヌル分離しホモ固定された世代、DCL2遺伝子において導入された変異、DCL4a遺伝子において導入された変異、変異体名を示す。DCL2、DCL4a遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された二重変異個体(DCL3は野生型、DCL4bは未確認)は、4ライン得られた。また、PCRによりヌル分離を確認した。実施例を図１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　左から形質転換体（導入遺伝子）の名前、ライン番号、導入遺伝子がヌル分離しホモ固定された世代、DCL2遺伝子において導入された変異、DCL4b遺伝子において導入された変異、変異体名を示す。DCL2、DCL4b遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された二重変異個体(DCL3及びDCL4aは野生型)は、1ライン得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　左から形質転換体（導入遺伝子）の名前、ライン番号、導入遺伝子がヌル分離しホモ固定された世代、DCL2遺伝子において導入された変異、DCL4a遺伝子において導入された変異、DCL4b遺伝子において導入された変異、変異体名を示す。NbDCL2、NbDCL4a及びNbDCL4b遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体(DCL3は野生型)は、pWAT135-FLAG-hcoCas9-3004 #3-4-7の1ライン得られた。
　シークエンス解析により、DCL2遺伝子に導入された変異は2種類確認された。DCL2のゲノム上のPAM配列から下流4塩基目にGの1塩基挿入と、下流4塩基目にAACCT の5塩基欠失の変異が導入された（図１１、図１２）。前者の変異が導入された形質転換体をDCL2変異体（dcl2-1）とし、後者をdcl2-2とした。DCL4a遺伝子に導入された変異は1種類確認された。DCL4aのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入の変異が導入された（図１３）。この変異が導入された形質転換体をDCL4a変異体（dcl4a-1）とした。DCL4b遺伝子に導入された変異は1種類確認された。DCL4bのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入の変異が導入された（図１４）。DCL2とDCL4a遺伝子に導入された二重変異は2種類確認された。1つ目は、DCL2のゲノム上のPAM配列から下流4塩基目にGの1塩基挿入と、DCL4aのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にTCTGAの5塩基欠失の変異が導入された（図１５）。2つ目は、DCL2のゲノム上のPAM配列から下流4塩基目にAACCTの5塩基欠失と、DCL4aのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入の変異が導入された（図１６）。前者の変異が導入された形質転換体をDCL2/4a二重変異体（dcl2/4-1）とし、後者をdcl2/4a-2とした。DCL2とDCL4b遺伝子に導入された二重変異は1種類確認された。DCL2のゲノム上のPAM配列から下流4塩基目にAACCTの5塩基欠失（図１２）と、DCL4bのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入（図１４）の変異が導入された。これらの変異が導入された形質転換体をDCL2/4b二重変異体（dcl2/4b-1）とした。DCL2、DCL4a及びDCL4b遺伝子に導入された三重変異は1種類確認された。DCL2のゲノム上のPAM配列から下流4塩基目にAACCTの5塩基欠失（図１２）と、DCL4aのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入（図１３）と、DCL4bのゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入（図１４）の変異が導入された。これらの変異が導入された形質転換体をDCL2/4a/4b三重変異体（dcl2/4a/4b-1）とした。これらの変異体は、導入された挿入・欠失変異によりアミノ酸配列が変化し、中途終止コドンが生じたため、完全なDCL2、DCL4a及びDCL4bタンパク質が翻訳されないことが示唆された。以降の実験では、dcl2/4b-1、dcl4a-1、dcl2/4a/4b-1を用いた。
DCL変異体の表現型
　本研究で、DCL2とDCL4遺伝子のゲノム編集に成功したN.benthamianaの表現型を確認した。N.benthamianaのWTと、dcl2/4b-1、dcl4a-1、dcl2/4a/4b-1を比較した。各植物体の大きさを比較すると、dcl2/4a/4b-1が最も小さく、他の植物体よりも生育の遅れが確認された（図１７）。また、葉の表現型を比較すると、dcl2/4b-1とdcl4a-1は丸みを帯びていた（図１８）。また、dcl2/4a/4b-1は細長い葉が形成されていた。
DCL3変異体タバコの作出
プラスミド
・pWAT135-FLAG-hcoCas9-NbDCL3g2
　pWAT1由来のプラスミドで、シロイヌナズナ由来のRPS5Aプロモーター及びHSP18.2ターミネーターを有しており、このRPS5Aプロモーターの制御下でhcoCas9遺伝子を発現する。N.benthamianaのDCL3遺伝子（NbDCL3）を標的とするgRNAを発現するカセットが挿入されている（図７）。本研究では、N.benthamianaのDCL3遺伝子をゲノム編集するために用いた。pWAT135-FLAG-hcoCas9-NbDCL3g2では、DCL3-gRNA2がU6プロモーター制御下で発現される。
　NbDCL3遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された個体は、pWAT135-FLAG-hcoCas9-10xx #2-4、#2-8の計2ライン得られた（表７）。DCL3遺伝子に導入された変異は1種類確認された。DCL3のゲノム上のPAM配列から上流3塩基目にAの1塩基挿入の変異が導入された（図１９）。これらの変異体は、導入された挿入変異によりアミノ酸配列が変化し、中途終止コドンが生じたため、完全なDCL3タンパク質が翻訳されないことが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　左から形質転換体（導入遺伝子）の名前、ライン番号、導入遺伝子がヌル分離しホモ固定された世代、DCL3遺伝子において導入された変異、変異体名を示す。DCL3遺伝子において、導入遺伝子がヌル分離し変異がホモ固定された(#2-4及び#2-8)。また、PCRによりヌル分離を確認した。
実施例２　植物ウイルスを用いたDCL2、DCL4の機能欠損の確認
　上述の通り、DCL2とDCL4遺伝子のゲノム編集に成功したN.benthamianaを作出した。しかし、シークエンス解析による各遺伝子の変異確認だけでは、DCL2、DCL4タンパク質の機能が欠損している確証が得られないため、植物RNAウイルスを各変異体に接種することでDCL2、DCL4タンパク質の機能欠損を確認した。
＜材料及び方法＞
プラスミド
・pAT006-Fluc-iFAD2
　pMDC123由来のプラスミドで、CaMV由来の35Sプロモーターおよびターミネーターを有しており、プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ(FLuc)遺伝子を発現する。また、アグロバクテリウム細胞内で誤ってFlucが翻訳されるのを防ぐためにFluc遺伝子内にシロイヌナズナ由来のFAD2遺伝子のイントロンが挿入されている（図２０Ａ）。
・pAT010-Rluc-iFAD2
　pMDC123由来のプラスミドで、Agrobacterium tumefaciens由来のNopaline Synthase（NOS）プロモーターおよびターミネーターを有しており、プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼ（Rluc）遺伝子を発現する。また、アグロバクテリウム細胞内で誤ってRlucが翻訳されるのを防ぐためにRluc遺伝子内にシロイヌナズナ由来のFAD2遺伝子のイントロンが挿入されている（図２０Ｂ）。
・pAT006-GFP
　pMDC123由来のプラスミドで、CaMV由来の35Sプロモーターおよびターミネーターを有しており、プロモーターの制御下でGFP遺伝子を発現する。GFP遺伝子の5’側にpAT006-Fluc-iFAD2と同じ5’UTR(5’-AAGGAGATATAACA-3’;配列番号２９)を導入した。pAT006-Fluc-iFAD2は、35SPの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子(Fluc)をコードする配列が連結されており、さらにその下流にCaMVTを有する。本研究では、異なるプロモーターを利用した同時過剰発現の検証に用いた。また、pAT006をXhoIとXbaIで切断し、BAP処理を行った後、ゲル回収を行いベクターとした。プライマーXho-Fluc-5UTR-GFP-FとXba-smGFP-R2を用いてGFP遺伝子断片増幅のPCRを行った。NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（タカラバイオ）を用いてPCR産物を精製し、XhoIとXbaIで切断し、ゲル回収を行いインサートとした。このインサートをベクターとライゲーションし、pAT006-GFPを作製した。
・pAT003P-GFP
　pMDC123由来のプラスミドで、MMV由来のFltプロモーターおよびターミネーターを有している。プロモーターの転写開始点以降のMMV由来の5’UTRを取り除いてある。このMMVプロモーターの制御下でGFP遺伝子を発現する。GFP遺伝子の5’側にpAT006-Fluc-iFAD2と同じ5’UTRを導入した。本研究では、異なるプロモーターを利用した同時過剰発現の検証に用いた。簡潔にいえば、pAT003P-Fluc-iFAD2をXhoIとXbaIで切断しBAP処理を行った後、ゲル回収を行いベクターとした。プライマーXho-Fluc-5UTR-GFP-FとXba-smGFP-R2を用いてGFP遺伝子断片増幅のPCRを行った。PCR産物を精製し、XhoIとXbaIで切断し、ゲル回収を行いインサートとした。このインサートをベクターとライゲーションし、pAT003P-GFPを作製した。
・pCB-TuMV-GFP
　pCB302由来のプラスミドで、CaMV由来の35Sプロモーター及びAgrobacterium tumefaciens由来のNosターミネーターを有している。P1とHC-Proの間にsmGFPが挿入されているTurnip mosaic virus（TuMV）のcDNAをコードしている（Garcia-Ruiz et al.,2010）。本研究では、TuMVを利用したDCL変異体の機能欠損確認に用いた。
TuMV接種のためのアグロインフィルトレーション法
　作製したDCL2変異体、DCL4変異体及びDCL2/4二重変異体の機能欠損を確認するために、TuMV-GFPを用いて各DCL変異体におけるGFP蛍光の観察と定量を行った。pCB-TuMV-GFP、コントロールとして空ベクターをアグロバクテリウムへ形質転換を行い、アグロバクテリウムの振とう培養を行った。振とう培養後、アグロ培養液を4,000 rpm、4℃、15分間遠心し、上清を取り除いた。そこに10 mLのInfiltration Solutionを加え再懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液から200 μLを分取し、800 μLのInfiltration solutionを加えて5倍希釈し、濁度計を用いてOD600を測定した。その後、希釈前のアグロ懸濁液とInfiltration Solutionを用いて、OD600＝0.6になるようにアグロバクテリウム溶液を調製した。事前に水をやり気孔を開かせた4週間～5週間育成した野生型（WT）のN.benthamianaと各DCL変異体を用いて、各2個体の合計4枚の葉の全葉に注射針で数か所穴をあけ、各アグロバクテリウム溶液を2.5 mLシリンジを用いて葉の裏側から細胞間隙に注入した。その後、24℃、16時間照明条件下で生育させた。
異なるプロモーターを用いた複数遺伝子の同時過剰系の確立のためのアグロインフィルトレーション法
　pAT006-Fluc-iFAD2、pAT006-GFP、pAT003P-GFP、内部標準としてpAT010-Rluc-iFAD2をアグロバクテリウムへの形質転換を行い、アグロバクテリウムの振とう培養を行った。形質転換や振とう培養は、実施例１と同様に行った。振とう培養後、アグロ培養液を4,000 rpm、4℃、15分間遠心し、上清を取り除いた。そこに10 mLのInfiltration Solutionを加え再懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液から200 μLを分取し、800 μLのInfiltration solutionを加えて5倍希釈し、濁度計を用いてOD600を測定した。その後、希釈前のアグロ懸濁液とInfiltration Solutionを用いて、OD600 ＝ 0.8になるようにアグロバクテリウム溶液を調製した。（+）の区にpAT006-Fluc-iFAD2 : pAT003P-GFP : pAT010-Rluc-iFAD2 = 2 : 1 : 2、（-）の区にpAT006-Fluc-iFAD2 : pAT006-GFP : pAT010-Rluc-iFAD2 = 2 : 1 : 2となるようにOD600 = 0.8に調整した各アグロバクテリウム溶液を混合した。事前に水をやり気孔を開かせた4週間～5週間育成した野生型のN. benthamianaと各DCL変異体を用いて、各2個体の合計4枚の葉の左側を（+）区、右側を（-）区とし各区に注射針で数か所穴をあけ、混合したアグロバクテリウム溶液を2.5 mLシリンジを用いて葉の裏側から細胞間隙に注入した（図２１）。その後、24℃、16時間照明条件下で生育させた。
Luc Assay法
　各プロモーター制御下で発現されたルシフェラーゼタンパク質の活性を測定するために、接種6日後の接種葉で、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼタンパク質の酵素活性は、Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いた。測定には、ルミノメーターのDLR-0-INJプログラムを用いた。ステンレスビーズを入れた2 mLチューブを用いてN.benthamianaのリーフディスクを回収し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結したサンプルはシェーカーを用いて2分間破砕した。破砕後、サンプルを15,000 rpm、4℃で破砕した葉を底に落とした。その後、300 μLの1x Passive Lysis Bufferを加え2分間ボルテックスし、15,000 rpm、4℃、3分間遠心した。遠心後、上清を4 μL取り40 μLのLuciferase Assay Reagent IIに加えピペッティングし、10秒後にルミノメーターを用いてFluc活性を測定した。Fluc活性の測定後、40 μLのStop＆Glo Reagentを加えピペッティングし、10 秒後にルミノメーターを用いてRluc活性を測定した。その後、画面に発光測定結果（Fluc/Rluc）の数値が表示される。
　数値の統計処理法として、（-）区の4つの計測値（Fluc/Rluc）の値を平均し、その数値を1に変換した。この変換に使用した係数を用いて（+）区の4つの計測値の平均値の値も標準化した。次に、標準化した（-）区の平均値と（+）区の平均値を比較し、（+）区の平均値の値が1よりも大きい場合、（+）区で有意な遺伝子発現が認められたかどうかを片側、等分散のt検定を用いて調べた。比較対象とする（-）区のFluc/Rlucを1とした場合に、（+）区のFluc/Rlucの平均値と標準誤差を表すグラフを実験区ごとに作成した。加えて、WTの（-）区の4つの計測値（Fluc活性またはRluc活性）の値を平均し、その数値を1に変換した。この変換に使用した係数を用いて、WTの（+）区、各DCL変異体の（-）区および（+）区の4つの計測値の平均値の値も標準化した。次に、標準化したWTの（-）区の平均値とWTの（+）区、各DCL変異体の平均値を比較し、各植物体の（-）区および（+）区におけるルシフェラーゼ活性レベルを多重比較法（Tukey検定）で調べた。比較対象とするWTの（-）区のルシフェラーゼ活性を1とした場合に、それ以外の各植物体の（-）区および（+）区のルシフェラーゼ活性の平均値と標準誤差を表すグラフを作成した。
GFP蛍光の観察
　接種6日後、UVライト（UVP、95-0127-01）で長波長の紫外線（365 nm）を照射して、接種葉と上位葉のGFP蛍光を観察した。暗室中でUVライト照射下において、マクロレンズ（Canon、EF-S6028MU）及びフィルター（marumi、MC-Y2 52mm）を取り付けた一眼レフカメラ（Canon、EOS Kiss X7i）を用いて撮影した。
GFPの検出と定量
　各植物体のGFP蓄積量を調べるために、接種6日後の接種葉からタンパク質抽出を行った。抽出後、ウェスタンブロッティングを行い、GFPの検出とimageJを用いてバンドのシグナル強度から定量を行った。
ウェスタンブロッティング
タンパク質抽出
　N.benthamianaで一過的に発現させたGFPタンパク質の定量評価のために、タンパク質抽出を行った。植物体のタンパク質を抽出したい部分のリーフディスクを1個のステンレスビーズが入った2 mLチューブを用いて3枚取り、サンプルを液体窒素で瞬間凍結した。凍結したサンプルをシェーカーで3分間破砕した。破砕後、そこに60 μLの1x SDS sample bufferを加え、泡立たないように穏やかにピペッティングを行った。その後、サンプル溶液を95℃で5分間熱処理し、さらに氷上で5分間静置した。5分後、15,000 rpm、4℃で3分間遠心し、上清を1.5 mLチューブに移してタンパク質抽出サンプルを得た。
SDS-PAGE
　ワイドミニリアルスラブ電気泳動装置（Bio Craft, BE-280G）を用いて、SDS-PAGEを行った。まず、10%ポリアクリルアミド分離ゲル溶液を調製し、ガラス板に流し込んで固めた。その後、4.5%ポリアクリルアミド濃縮ゲル溶液を調製し、分離ゲルの上に流し固めた。続いて泳動装置を1x SDS 泳動 bufferで満たし、マーカーとしてCLEARLY Stained Protein Ladder（タカラバイオ）を5 μL、タンパク質抽出した各サンプルを10 μLずつウェルにアプライした。そして、サンプル中のブロモフェノールブルー（BPB）が濃縮ゲルに存在する時は定電流20 mA（BIOCRAFT BP-T5）で、BPBが分離ゲルに移動してからは定電流40 mA（BIOCRAFT BP-T5）に設定して泳動を行った。
メンブレンへの転写
　メンブレン（Immobilon（登録商標）-P Transfer Membrane, Millipore）をゲルよりも大きく切り出し、メタノールで湿らせた後、1x Towbin Bufferで5分間振とうした。ゲルを 1x Towbin Bufferで5分間振とうした。泳動後、ゲルとメンブレンを重ね、あらかじめメンブレンより大きく切り出した後に1x Towbin Bufferに浸しておいたろ紙2枚でゲルとメンブレンを挟んだ。さらに、あらかじめ1x Towbin Bufferに浸しておいた転写用スポンジで両側を挟み込み、タンク式転写装置（NA-1050B, 日本エイドー）に陰極側がゲル、陽極側がメンブレンとなるようにセットした。その後、定電圧45V（BIOCRAFT BP-T8）、室 温で60分間転写を行った。
ブロッキング・抗体反応
　転写終了後、メンブレンをタッパーに移し、メンブレンが浸るように1x TBSTを入れ、10分間室温で振とうした。1x TBSTを捨てた後、Blocking buffer（3% スキムミルク/1x TBST）をタッパーに入れ、室温で1 時間もしくは、一晩4℃振とうした。Blocking bufferを捨てた後、1x TBSTをタッパーに入れて室温で5分間振とう2回行った。2回繰り返した後、メンブレンをハイブリバック・ソフトに入れた。そこに10 mLのHRPラベルGFP抗体(MBL)の希釈液（2000倍希釈）を加え、シーラーで密封した後、4℃で1時間振とうした。ハイブリバックからメンブレンを取り出し、1 x TBSTで5分間振とうを3回行った。3回繰り返した後、メンブレンを四方を畳んだラップの上に置き、そこに400 μLのLuminataTM Forte Western HRP Substrate（Millipore）をメンブレン全体にまんべんなく滴下し、ChemiDoc XRS+システムでGFPの検出を行った。
＜結果＞
DCL変異体における TuMV接種実験
　DCL2、DCL4タンパク質の機能欠損を確認するために、TuMV-GFPを利用した。N.benthamianaのWT、dcl2/4b-1、dcl4a-1及びdcl2/4a/4b-1の葉にpCB-TuMV-GFP、コントロールとして空ベクターを接種した。接種6日後の接種葉におけるGFP蛍光の観察を行った。その結果、接種したすべてのDCL変異体でWTよりも強い蛍光が確認され、dcl2/4a/4b-1において、最も強い蛍光を示した（図２２）。また、dcl4a-1よりもdcl2/4b-1の方が強い蛍光を示した。
　GFP蛍光を観察した各植物体のGFP蓄積量を調べるために、GFPタンパク質をウェスタンブロッティングにより検出した。また、ImageJを用いてバンドのシグナル強度を測定した。WT #2 を流したレーンのバンドのシグナル強度を1とし、それぞれのバンドを数値化した。その結果、接種したすべてのDCL変異体でWTよりもはるかに高いGFPの蓄積が確認された（図２３）。GFP蛍光観察の結果同様に、dcl2/4a/4b-1において最も高い蓄積を示し、dcl4a-1よりもdcl2/4b-1の方が高い蓄積を示した。
　これらの結果より、作出したdcl2/4b-1、dcl4a-1及びdcl2/4a/4b-1はTuMV接種時にウイルスの蓄積量が増加したため、DCL2及びDCL4タンパク質が機能していないと示唆された。また、シロイヌナズナにおける主要な抗ウイルス防御に関与するDCLタンパク質はDCL4であるが、本研究では、DCL2もウイルスへの強い抵抗性を有することが示唆された。
異なるプロモーターを用いた複数遺伝子の同時過剰発現系の確立
　シロイヌナズナの35Sプロモーターを含んだT-DNA挿入変異体に新たに35Sプロモーターを含んだT-DNAを挿入すると同一プロモーターがゲノム上に複数コピー取り込まれることによってTGSが引き起こされる。これにより、導入遺伝子が発現しにくい問題が引き起こされることが報告されている（Lucia et al., 2008）。TGSの機構において、プロモーター領域がメチル化され、ヘテロクロマチン化されることで転写が抑制されるため、同一プロモーターを複数利用する場合、同一プロモーター由来の24塩基のsiRNAが生成される。そのため、プロモーターが標的とされやすくなることが考えられた。そこで、配列が異なるプロモーターを利用することでTGSを回避しつつ、複数遺伝子を同時に過剰発現できると仮説を立てた。本研究では、CaMV由来の35SプロモーターとMMV由来のFltプロモーターを用いて、TGSを回避した複数遺伝子の同時過剰発現系の構築を試みた。また、PTGSを引き起こさないN. benthamianaを利用することで、TGSのみによる遺伝子発現抑制を評価した。
　N. benthamianaのWT、dcl2/4b-1、dcl4a-1およびdcl2/4a/4b-1の葉の（+）区に、pAT006-Fluc-iFAD2 : pAT003P-GFP : 内部標準のpAT010-Rluc-iFAD2 = 2 : 1 : 2、（-）区にpAT006-Fluc-iFAD2 : pAT006-GFP : 内部標準のpAT010-Rluc-iFAD2 = 2 : 1 : 2混合液を接種した。接種6日後、各プロモーター制御下で発現されたルシフェラーゼタンパク質の活性を測定するためにLuc assayを行った。その結果、すべての植物体の（+）区で有意な上昇が確認された（図２４）。各植物体における（+）区の活性と（-）区の活性を比較すると、WTで2.05倍（n = 4、t検定、p < 0.05）、dcl2/4b-1で1.64倍（n = 4、t検定、p <0.05）、dcl4a-1で1.69倍（n = 4、t検定、p < 0.05）、dcl2/4a/4b-1で1.40倍（n = 4、t検定、p < 0.01）であった。また、各植物体における各ルシフェラーゼ活性を比較した結果、すべてのDCL変異体でWTの（-）区よりも高い活性が示された（図２５）。dcl2/4a/4b-1において最も高い活性を示し、dcl4a-1よりもdcl2/4b-1のほうが高い活性を示した。これより、作出したDCL変異体でPTGSの経路が抑制されていると考えられた。また、Flucの発現において、WTの（-）区では、PTGSとTGSによる抑制が引き起こされている。一方、dcl2/4a/4b-1の（+）区では、PTGSが起こらず、TGSによる抑制も引き起こされにくいため、dcl2/4a/4b-1の（+）区はWTの（-）区のFluc活性の18.59倍（n = 4、Tuckey検定、p < 0.0001）であった。これより、植物の外来遺伝子発現時におけるRNAサイレンシングの抑制能の強さが明らかとなった。また、dcl2/4a/4b-1の（-）区では、TGSのみによる抑制が引き起されるため、dcl2/4a/4b-1の（-）区はWTの（-）区のFluc活性の14.66倍（n = 4、Tuckey検定、p < 0.0001）であった。これは、6日目における遺伝子発現抑制は、PTGSによる抑制が強く関与していると考えられた。
　これらの結果から、野生型および各変異体において、異なるプロモーターを用いた方がTGSによる遺伝子発現抑制が引き起こされにくいことが示唆された。また、作出したDCL変異体ではPTGS経路が欠損しており、DCL2/4a/4b変異体を利用することでTGSのみによる遺伝子発現抑制を評価することができると示唆された。
実施例３　DCL2及び／又はDCL4の機能欠損植物体における外来遺伝子の発現能の検証の確認
　実施例２では、TuMVウイルスの増殖システムを利用したが、該システムを用いる場合には、遺伝子の大きさや配列次第でウイルス増殖が制約され得る。そこで、上記ウイルス増殖システムを用いずとも、上記変異体で外来遺伝子の発現が向上するか否かを検証した。
＜材料及び方法＞
プラスミド
・pBICP35
　pBIN19由来のプラスミドで、Cauliflower mosaic virus (CaMV)由来の35SプロモーターおよびCaMVターミネーターを有しているベクタープラスミドである(Takeda et al., FEBS Lett. 2002 Dec 4;532(1-2):75-9, 2002)。
・pBICGFP
　pBICP35の35Sプロモーター制御下にGFP遺伝子を挿入したプラスミドである(Takeda et al., 2002)。GFP遺伝子の過剰発現に利用する。
・pAT006
　pMDC123由来のプラスミドで、CaMV由来の35Sプロモーターおよびターミネーターを有しているベクタープラスミドである(Tsuzuki et al., RNA 2014 Aug;20(8):1320-7, 2014)。
・pAT006-Fluc-iFAD2
　pMDC123由来のプラスミドで、CaMV由来の35Sプロモーターおよびターミネーターを有しており、プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ(FLuc)遺伝子を発現する。また、アグロバクテリウム細胞内で誤ってFlucが翻訳されるのを防ぐためにFluc遺伝子内にシロイヌナズナ由来のFAD2遺伝子のイントロンが挿入されている（図２０Ａ）。
GFP発現のためのアグロインフィルトレーション法
　作製したDCL2変異体、DCL4変異体及びDCL2/4二重変異体の機能欠損を確認するために、pBICGFPを用いて各DCL変異体におけるGFP蛍光の観察と定量を行った。pBICGFPと、コントロール用空ベクターpBICP35をアグロバクテリウムへ形質転換を行い、アグロバクテリウムの振とう培養を行った。振とう培養後、アグロ培養液を4,000 rpm、4℃、15分間遠心し、上清を取り除いた。そこに10 mLのInfiltration Solutionを加え再懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液から200 μLを分取し、800 μLのInfiltration solutionを加えて5倍希釈し、濁度計を用いてOD600を測定した。その後、希釈前のアグロ懸濁液とInfiltration Solutionを用いて、OD600＝0.8になるようにアグロバクテリウム溶液を調製した。事前に水をやり気孔を開かせた4週間～5週間育成した野生型（WT）のN.benthamianaと各DCL変異体を用いて、各2個体の合計4枚の葉の全葉に注射針で数か所穴をあけ、各アグロバクテリウム溶液を2.5 mLシリンジを用いて葉の裏側から細胞間隙に注入した。その後、24℃、16時間照明条件下で生育させた。
GFPの検出と定量
　各植物体のGFP蓄積量を調べるために、接種6日後の接種葉からタンパク質抽出を行った。抽出後、ウェスタンブロッティングを行い、GFPの検出とImageJを用いてバンドのシグナル強度から定量を行った。
ウェスタンブロッティング
タンパク質抽出
　N.benthamianaで一過的に発現させたGFPタンパク質の定量評価のために、タンパク質抽出を行った。植物体のタンパク質を抽出したい部分のリーフディスクを1個のステンレスビーズが入った2 mLチューブを用いて3枚取り、サンプルを液体窒素で瞬間凍結した。凍結したサンプルをシェーカーで3分間破砕した。破砕後、そこに60 μLの1x SDS sample bufferを加え、泡立たないように穏やかにピペッティングを行った。その後、サンプル溶液を95℃で5分間熱処理し、さらに氷上で5分間静置した。5分後、15,000 rpm、4℃で3分間遠心し、上清を1.5 mLチューブに移してタンパク質抽出サンプルを得た。
SDS-PAGE
　ワイドミニリアルスラブ電気泳動装置（Bio Craft, BE-280G）を用いて、SDS-PAGEを行った。まず、10%ポリアクリルアミド分離ゲル溶液を調製し、ガラス板に流し込んで固めた。その後、4.5%ポリアクリルアミド濃縮ゲル溶液を調製し、分離ゲルの上に流し固めた。続いて泳動装置を1x SDS 泳動 bufferで満たし、マーカーとしてCLEARLY Stained Protein Ladder（タカラバイオ）を5 μL、タンパク質抽出した各サンプルを3 μLずつウェルにアプライした。そして、サンプル中のブロモフェノールブルー（BPB）が濃縮ゲルに存在する時は定電流20 mA（BIOCRAFT BP-T5）で、BPBが分離ゲルに移動してからは定電流40 mA（BIOCRAFT BP-T5）に設定して泳動を行った。
メンブレンへの転写
　メンブレン（Immobilon（登録商標）-P Transfer Membrane, Millipore）をゲルよりも大きく切り出し、メタノールで湿らせた後、1x Towbin Bufferで5分間振とうした。ゲルを 1x Towbin Bufferで5分間振とうした。泳動後、ゲルとメンブレンを重ね、あらかじめメンブレンより大きく切り出した後に1x Towbin Bufferに浸しておいたろ紙2枚でゲルとメンブレンを挟んだ。さらに、あらかじめ1x Towbin Bufferに浸しておいた転写用スポンジで両側を挟み込み、タンク式転写装置（NA-1050B, 日本エイドー）に陰極側がゲル、陽極側がメンブレンとなるようにセットした。その後、定電圧45V（BIOCRAFT BP-T8）、室温で60分間転写を行った。
ブロッキング・抗体反応
　転写終了後、メンブレンをタッパーに移し、メンブレンが浸るように1x TBSTを入れ、10分間室温で振とうした。1x TBSTを捨てた後、Blocking buffer（1% スキムミルク/1x TBST）をタッパーに入れ、室温で1 時間もしくは、一晩4℃振とうした。Blocking bufferを捨てた後、1x TBSTをタッパーに入れて室温で5分間振とう2回行った。2回繰り返した後、メンブレンをハイブリバック・ソフトに入れた。そこに10 mLのHRPラベルGFP抗体(nacalai tesque)の希釈液（4000倍希釈）を加え、シーラーで密封した後、4℃で1時間振とうした。ハイブリバックからメンブレンを取り出し、1 x TBSTで5分間振とうを3回行った。3回繰り返した後、メンブレンを四方を畳んだラップの上に置き、そこに400 μLのLuminataTM Forte Western HRP Substrate（Millipore）をメンブレン全体にまんべんなく滴下し、LAS4000システムでGFPの検出を行った。
FLuc発現のためのアグロインフィルトレーション法
　作製したDCL2変異体、DCL4変異体及びDCL2/4二重変異体の機能欠損を確認するために、pAT006-FLuc-iFAD2を用いて各DCL変異体におけるFLuc活性の定量を行った。pAT006-FLuc-iFAD2と、コントロール用空ベクターpAT006をアグロバクテリウムへ形質転換を行い、アグロバクテリウムの振とう培養を行った。振とう培養後、アグロ培養液を4,000 rpm、4℃、15分間遠心し、上清を取り除いた。そこに10 mLのInfiltration Solutionを加え再懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液から200 μLを分取し、800 μLのInfiltration solutionを加えて5倍希釈し、濁度計を用いてOD600を測定した。その後、希釈前のアグロ懸濁液とInfiltration Solutionを用いて、OD600＝0.8になるようにアグロバクテリウム溶液を調製した。事前に水をやり気孔を開かせた4週間～5週間育成した野生型（WT）のN.benthamianaと各DCL変異体を用いて、各2個体の合計4枚の葉の全葉に注射針で数か所穴をあけ、各アグロバクテリウム溶液を2.5 mLシリンジを用いて葉の裏側から細胞間隙に注入した。その後、24℃、16時間照明条件下で生育させた。
Luc Assay法
　各DCL変異体で発現されたルシフェラーゼタンパク質の活性を測定するために、接種6日後の接種葉で、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼタンパク質の酵素活性測定には、ピッカジーン発光キット(PGL-1500)を用いた。ステンレスビーズを入れた2 mLチューブを用いてN.benthamianaのリーフディスクを回収し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結したサンプルはシェーカーを用いて2分間破砕した。破砕後、サンプルを15,000 rpm、4℃で破砕した葉を底に落とした。その後、5×細胞溶解剤(ピッカジーンPGC-50)を5倍希釈したものを300 μL加え、混合した。15000 rpm 4℃ 3分遠心分離した後の上清4 μLとルシフェリン40 μLを混ぜ、その1分後にルミノメーター（プロメガ：GloMax（登録商標） Navigator System）で発光を検出した（測光時間は10秒間）。数値の統計処理法として、WT区の4つの計測値を平均し、その数値を1に変換した。この変換に使用した係数を用いて他の３つのdcl区の計測値の平均値も標準化した。比較対象とするWT区のFluc活性を1とした場合に、各dcl区のFluc活性の平均値と標準誤差を表すグラフを実験区ごとに作成した。
＜結果＞
　ルシフェラーゼ活性の結果を図２６に示す。また、GFP発現量の結果を図２７に示す。
いずれにおいても、DCL2及び／又はDCL4の機能欠損植物体において、野生型株よりもタンパク質レベルが高いことが示されたが、特にDCL2及びDCL4の両方の機能を欠損する植物体（dcl2/4a/4b植物体ともいう。）において、高いタンパク質の発現向上効果が認められた。
実施例４　DCL2及び／又はDCL4の機能欠損植物体におけるPTGSの抑制の検証
　DCL2及び／又はDCL4の機能欠損植物体において、PTGSが抑制されているかを検証した。また、GFP mRNAに対する外因性の二本鎖RNA（dsGFP）から誘導されるGFP siRNAの発現を検出することで、DCL2及び／又はDCL4の機能欠損を確認した。
＜材料及び方法＞
プラスミド
・pBICP35
　pBIN19由来のプラスミドで、Cauliflower mosaic virus (CaMV)由来の35SプロモーターおよびCaMVターミネーターを有しているベクタープラスミドである(Takeda et al., 2002)。
・pBICGFP
　pBICP35の35Sプロモーター制御下にGFP遺伝子を挿入したプラスミドである(Takeda et al., 2002)。GFP遺伝子の過剰発現に利用する。
・pBICdsGFP
　pBICP35の35Sプロモーター制御下にGFP遺伝子を逆位反復状態で挿入したプラスミドである。GFP遺伝子間にはシロイヌナズナTOM1遺伝子の第8イントロンが挿入してある(Takeda et al., 2002)。このコンストラクト由来でGFPの二本鎖RNAが大量に発現するため、より強力なRNAサイレンシングを誘導することが可能である。
GFPおよびdsGFP発現のためのアグロインフィルトレーション法
　作製したDCL2/4a二重変異体、DCL4a変異体及びDCL2/4a/4b三重変異体の機能欠損を確認するために、pBICGFPとpBICdsGFPを用いてより強いIR-PTGSを誘導し、各DCL変異体におけるGFP蛍光の観察と定量を行った。pBICGFP、pBICdsGFPと、コントロール用空ベクターpBICP35をアグロバクテリウムへ形質転換を行い、アグロバクテリウムの振とう培養を行った。振とう培養後、アグロ培養液を4,000 rpm、4℃、15分間遠心し、上清を取り除いた。そこに10 mLのInfiltration Solutionを加え再懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液から200 μLを分取し、800 μLのInfiltration solutionを加えて5倍希釈し、濁度計を用いてOD600を測定した。その後、希釈前のアグロ懸濁液とInfiltration Solutionを用いて、OD600＝0.8になるようにアグロバクテリウム溶液を調製した。その後、pBICGFPを含むアグロバクテリウム溶液とpBICdsGFPを含むアグロバクテリウム溶液を１：１で混合した。比較対象として、pBICGFPを含むアグロバクテリウム溶液とpBICP35を含むアグロバクテリウム溶液を１：１で混合した区と、空ベクターのみの区を設定した。事前に水をやり気孔を開かせた4週間～5週間育成した野生型（WT）のN.benthamianaと各DCL変異体を用いて、各2個体の合計4枚の葉の全葉に注射針で数か所穴をあけ、各アグロバクテリウム溶液を2.5 mLシリンジを用いて葉の裏側から細胞間隙に注入した。その後、24℃、16時間照明条件下で生育させた。
GFPの検出と定量
　各植物体のGFP蓄積量を調べるために、接種6日後の接種葉からタンパク質抽出を行った。抽出後、ウェスタンブロッティングを行い、GFPの検出を行った。
ウェスタンブロッティング
タンパク質抽出
　N.benthamianaで一過的に発現させたGFPタンパク質の定量評価のために、タンパク質抽出を行った。植物体のタンパク質を抽出したい部分のリーフディスクを1個のステンレスビーズが入った2 mLチューブを用いて3枚取り、サンプルを液体窒素で瞬間凍結した。凍結したサンプルをシェーカーで3分間破砕した。破砕後、そこに60 μLの1x SDS sample bufferを加え、泡立たないように穏やかにピペッティングを行った。その後、サンプル溶液を95℃で5分間熱処理し、さらに氷上で5分間静置した。5分後、15,000 rpm、4℃で3分間遠心し、上清を1.5 mLチューブに移してタンパク質抽出サンプルを得た。
SDS-PAGE
　ワイドミニリアルスラブ電気泳動装置（Bio Craft, BE-280G）を用いて、SDS-PAGEを行った。まず、10%ポリアクリルアミド分離ゲル溶液を調製し、ガラス板に流し込んで固めた。その後、4.5%ポリアクリルアミド濃縮ゲル溶液を調製し、分離ゲルの上に流し固めた。続いて泳動装置を1x SDS 泳動 bufferで満たし、マーカーとしてCLEARLY Stained Protein Ladder（タカラバイオ）を5 μL、タンパク質抽出した各サンプルを3 μLずつウェルにアプライした。そして、サンプル中のブロモフェノールブルー（BPB）が濃縮ゲルに存在する時は定電流20 mA（BIOCRAFT BP-T5）で、BPBが分離ゲルに移動してからは定電流40 mA（BIOCRAFT BP-T5）に設定して泳動を行った。
メンブレンへの転写
　メンブレン（Immobilon（登録商標）-P Transfer Membrane, Millipore）をゲルよりも大きく切り出し、メタノールで湿らせた後、1x Towbin Bufferで5分間振とうした。ゲルを1x Towbin Bufferで5分間振とうした。泳動後、ゲルとメンブレンを重ね、あらかじめメンブレンより大きく切り出した後に1x Towbin Bufferに浸しておいたろ紙2枚でゲルとメンブレンを挟んだ。さらに、あらかじめ1x Towbin Bufferに浸しておいた転写用スポンジで両側を挟み込み、タンク式転写装置（NA-1050B, 日本エイドー）に陰極側がゲル、陽極側がメンブレンとなるようにセットした。その後、定電圧45V（BIOCRAFT BP-T8）、室温で60分間転写を行った。
ブロッキング・抗体反応
　転写終了後、メンブレンをタッパーに移し、メンブレンが浸るように1x TBSTを入れ、10分間室温で振とうした。1x TBSTを捨てた後、Blocking buffer（1% スキムミルク/1x TBST）をタッパーに入れ、室温で1 時間もしくは、一晩4℃振とうした。Blocking bufferを捨てた後、1x TBSTをタッパーに入れて室温で5分間振とう2回行った。2回繰り返した後、メンブレンをハイブリバック・ソフトに入れた。そこに10 mLのHRPラベルGFP抗体(nacalai tesque)の希釈液（4000倍希釈）を加え、シーラーで密封した後、4℃で1時間振とうした。ハイブリバックからメンブレンを取り出し、1 x TBSTで5分間振とうを3回行った。3回繰り返した後、メンブレンを四方を畳んだラップの上に置き、そこに400 μLのLuminataTM Forte Western HRP Substrate（Millipore）をメンブレン全体にまんべんなく滴下し、LAS4000システムでGFPの検出を行った。
＜結果＞
　35S:GFPを35S:dsGFPとともに共アグロインフィルトレーションし、接種2日後のGFPの発現量を比較した結果を図２８に示す。dcl2/4a/4b植物体では、IR(Inverted Repeat transgene-induced)-PTGS（IR-PTGSでは、dsGFPの発現が誘導される）が抑制されることが示された。従って、dcl2/4a/4b植物体では、DCLの標的となりうる長いstem-loopを持つウイルスRNAなどの安定性向上が示唆される。また、35S:GFPを35S:dsGFPとともに共アグロインフィルトレーションし、接種2日後のGFP siRNAを検出した結果を図２９に示す。dcl2/4a/4b植物体では、DCL3に切り出される24 ntのsiRNAのみが検出された(dcl2/4a/4bでは、WTなどで検出された下側のバンドが消失している。即ち、DCL2/4に依存して切り出される21～22 ntのsiRNAが消失していた）。以上より、dcl2/4a/4b植物体では、DCL2/4の機能が完全に欠損していることが示された。
　本発明のDCL遺伝子を破壊したゲノム編集個体は、その葉における一過性発現によって、外来タンパク質発現を野生型植物よりも短期間で高効率に行うことが可能な点できわめて有用である。抗体やインターフェロンなどの高付加価値のタンパク質を高発現させることや、他種では発現が困難であるタンパク質（例えば、西洋ワサビのペルオキシダーゼなど）を発現させることが可能である。また、本ゲノム編集個体は、ウイルス抵抗性が欠損しているため、免疫抑制能を欠損させた植物ウイルスを効率良く増殖させることが可能であり、生物農薬として利用されている弱毒植物ウイルス株を大量増殖させることができる点で有用である。
　本出願は、2020年9月14日付で日本国に出願された特願2020-154178を基礎としており、ここで参照することによりその内容のすべてが本明細書に組み込まれる。

Claims (10)

  1. 　DCL2遺伝子、DCL4遺伝子及びDCL3遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子に機能喪失型変異を有するナス科植物細胞であって、外来遺伝子の発現能力が向上した、細胞。
  2. 　DCL2遺伝子及びDCL4遺伝子の少なくともいずれかに機能喪失型変異を有する、請求項１に記載の細胞。
  3. 　前記ナス科植物がタバコ属に属する植物である、請求項１又は２に記載の細胞。
  4. 　外来遺伝子を有さないことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞を有する植物体。
  6. 　（１）請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞又は請求項５の植物体に、目的タンパク質をコードする核酸を導入する工程、及び
    　（２）工程（１）で核酸が導入された細胞又は植物体において該タンパク質を発現させる工程
    を含む、目的タンパク質の製造方法。
  7. 　（３）工程（２）で得られた目的タンパク質を発現する細胞又は植物体から、該タンパク質を単離する工程を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記工程（１）が、目的タンパク質をコードする核酸を有するアグロバクテリウムを細胞又は植物体に感染させる工程を含む、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　（１）請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞又は請求項５に記載の植物体にウイルスを感染させ、該ウイルスを増殖させる工程、及び
    　（２）前記工程（１）により増殖したウイルスを回収する工程
    を含む、ウイルスの増殖方法。
  10. 　前記ウイルスが弱毒植物ウイルスである、請求項９に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CORDERO TERESA, LIDIA CERDÁN, ALBERTO CARBONELL, KONSTANTINA KATSAROU, KRITON KALANTIDIS, JOSÉ-ANTONIO DARÒS : "Dicer-like 4 Is Involved in Restricting the Systemic Movement of Zucchini yellow mosaic virus in Nicotiana benthamiana", MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS, vol. 30, no. 1, 26 January 2017 (2017-01-26), pages 63 - 71, XP055910571, DOI: 10.1094/MPMI-11-16-0239-R *
MATSUO KOUKI; MATSUMURA TAKESHI: "Repression of the DCL2 and DCL4 genes inNicotiana benthamianaplants for the transient expression of recombinant proteins", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 124, no. 2, 21 March 2017 (2017-03-21), NL , pages 215 - 220, XP085114986, ISSN: 1389-1723, DOI: 10.1016/j.jbiosc.2017.02.019 *
MATSUO, KOUKI: "Production of RNA silencing-related genes repressed Nicotiana benthamiana plants", AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY, vol. 3, no. 10, 20 September 2019 (2019-09-20), pages 61 (967) - 64 (970), XP009535484, ISSN: 2432-5511 *

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