CN109439785B

CN109439785B - 与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记zmm5932及其应用

Info

Publication number: CN109439785B
Application number: CN201811318728.3A
Authority: CN
Inventors: 王林海; 张秀荣; 张艳欣; 黎冬华; 周瑢; 杨梅; 盛晨
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2018-11-07
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2038-11-07
Also published as: CN109439785A

Abstract

本发明涉及与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM5932及其应用。该分子标记为ZMM5932的引物序列为：ZMM5932F：5’‑GCATGCAATCTTGGTTGAAA‑3’ZMM5932R：5’‑TTCTGAGTTCATGCCAATGC‑3’与上述芝麻主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM5932可用于鉴定矮杆类型，辅助在芝麻植株发育早期进行育种后代筛选，辅助选择矮杆表型，目标明确，成本较低。

Description

与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM5932 及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

芝麻(Sesamum indicum L.)是世界七大油料作物之一，也是我国传统特色油料作物，各地均有种植，我国是芝麻主产国，总产量仅次于印度。芝麻种子富含不饱和脂肪酸、维生素及钙、铁、锌等微量元素，味香质优，有益于人体健康，深受人们喜爱。随着生活水平提高，我国芝麻消费持续快速增长，从2003年的59万吨到2017年的164万吨，增加了近两倍，占世界消费总量的近30％，我国已成为世界上最大的芝麻消费国。因此，提高芝麻单产，对促进我国芝麻生产发展、解决总量自给不足问题十分迫切。

在长期以单株产量优势为主的育种目标下，芝麻生产主栽品种多数为高大株型，植株高度一般180cm左右甚至更高，在高水肥和传统精耕细作条件下，可获得较好的单株产量。但随着农业生产机械化程度的提高，芝麻生产急需降低品种的植株高度，改变松散株型为紧凑株型，以通过发挥群体优势获得较高的产量，并适应机械化种植的需求。

株高作为重要的农艺性状，与作物的产量密切相关，其遗传基础、分子机理以及株高相关基因的定位与克隆等成为热门研究领域之一。“绿色革命”极大程度地推动了作物矮化育种进程，主要粮食作物如水稻、小麦、玉米等均培育出矮杆或半矮秆品种，并进行了大面积推广，解决了粮食自给难题。1959年，我国水稻育种家黄耀祥培育出了第一个杂交矮秆籼稻品种“广场矮”，成为世界水稻育种的重大突破，也为矮化育种开创了一条新途径，不仅提高了水稻的产量，同时缓解了倒伏等问题。小麦育种家Borlaug应用了矮源材料“农林10号”与抗锈病的墨西哥小麦进行杂交，育成了多个半矮秆和矮秆品种，并被引入到部分国家和地区，为小麦矮化育种做出了重大贡献，小麦半矮秆品种的成功培育和有效推广，使得世界粮食总产逐渐增长。玉米、大豆等也相继展开了利用矮化基因资源选育品种的工作，获得了耐肥、抗倒伏能力强的新品种。

此外，水稻、玉米、小麦、大麦等作物均已克隆出许多重要的矮化基因，一些重要矮化基因的应用，推动了作物矮化育种进程，提高了单位面积产量。Monna等将水稻的重要半矮秆基因sd-1定位到6kb的区间范围内，通过分析确定了该基因的编码区域。滕峰在玉米中检测到一个矮化主效位点qPH3.1，位于12.6kb区间内，并克隆到与赤霉素合成相关的候选基因ZmGA3ox2。

国内外对芝麻株高矮化性状的研究起步较晚，QTL定位相关报道较少。Wang等利用RIL群体和测序技术，定位到10个芝麻株高相关QTL，表型贡献率3.03％-23.03％，分布在5个连锁群上，其中一个位点qPH-3.3贡献率为18.07％，推测qPH-3.3基因座位与芝麻矮化表型关联，该位点附近包含102个候选基因。然而，国内外尚未见有关芝麻矮杆相关分子标记的研究报道。

本发明在精细定位芝麻矮杆性状主效基因位点的基础上，开发获得与其紧密连锁的分子标记，用于芝麻育种后代矮杆表型的分子辅助选择。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种芝麻矮杆性状的主效基因位点qPHW8-1。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM5932及其引物。

本发明所要解决的技术问题之三是提供一种上述芝麻矮杆性状主效基因位点的分子标记鉴定方法。

本发明所要解决的技术问题之四是提供一种上述所述的分子标记ZMM5932的引物在芝麻育种后代矮杆性状筛选及早期预测中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种芝麻矮杆性状的主效基因位点以及与之紧密连锁的分子标记ZMM5932，其特征在于：，该标记的引物序列为：

ZMM5932F：5’-GCATGCAATCTTGGTTGAAA-3’

ZMM5932R：5’-TTCTGAGTTCATGCCAATGC-3’；

所述的主效基因位点命名为qPHW8-1，位于第8号连锁群，贡献率16.294％。

上述芝麻矮杆性状主效基因位点的分子标记鉴定方法，其特征在于：用ZMM5932F和ZMM5932R扩增芝麻叶片或其他组织总DNA，如果可扩增获得268bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的芝麻矮杆性状主效基因位点，预测该芝麻植株较矮。

上述与芝麻矮杆性状的主效基因位点qPHW8-1紧密连锁的分子标记ZMM5932在芝麻育种后代矮杆性状筛选及早期预测中的应用。

按上述方案，所述芝麻矮杆性状的主效基因位点qPHW8-1紧密连锁的分子标记ZMM5932在芝麻育种后代矮杆性状筛选及早期预测中的具体应用方法为：用所述的分子标记ZMM5932的引物扩增芝麻育种后代叶片或其他组织总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得268bp的扩增片段，则预测该芝麻植株较矮。

本发明所述的芝麻矮杆性状的主效基因位点是通过以下步骤筛选的：

(1)利用芝麻高杆品种中芝13(株高180cm以上)和矮杆种质ZZM2748(株高不足90cm)进行杂交，获得F₁种子，F₁植株自交产生F₂代种子，F₂植株自交产生F₃代种子，F₃代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F₈代分离群体，即重组自交系(RIL)群体；

(2)提取亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA；

(3)利用自主设计开发的SSR标记引物对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色及带型统计，筛选亲本间有多态性的引物；

(4)将筛选得到的多态性引物对重组自交系(RIL)群体进行基因型分析，构建遗传连锁图谱，结合其株高数据进行QTL定位，检测到芝麻第8号连锁群具有一个主效基因位点qPHW8-1，贡献率16.294％，加性效应为正(效应值9.749)，表明来自于矮杆种质ZZM2748的等位基因具有降低株高的表型效应，与其紧密连锁(遗传距离0.006cM)的分子标记为SSR标记ZMM5932，其引物序列为：

ZMM5932F：5’-GCATGCAATCTTGGTTGAAA-3’

ZMM5932R：5’-TTCTGAGTTCATGCCAATGC-3’

本发明的优点在于：

本发明首次定位了1个位于芝麻第8号连锁群上调控芝麻植株高矮的主效基因位点qPHW8-1，可解释株高表型16.294％的变异，同时发现了一个与其紧密连锁的分子标记ZMM5932，使得芝麻矮杆性状主效基因位点的定位工作居于同领域前列。

提出了芝麻矮杆性状主效基因位点的分子标记鉴定方法，可以预测芝麻株高，进而可以快速筛选矮杆株系，用于芝麻育种后代矮杆性状筛选及早期预测，辅助株高选择目标明确，成本较低。传统育种方法中，芝麻矮杆性状表型鉴定须等到终花期以后，且受环境影响较大。本发明中矮杆性状主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响，可以在苗期进行早期筛选和淘汰，大大提高了选择效率，节约了生产成本。

附图说明

图1为芝麻(中芝13×ZZM2748)RIL群体株高分布图。

图2为第8号连锁群图谱。图中星号所示为矮杆性状主效基因位点qPHW8-1在连锁群上的位置，与其紧密连锁的分子标记为ZMM5932。

图3为分子标记ZMM5932的引物在(中芝11×ZZM2748)RIL群体亲本及32个株系中扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳的胶板照片示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中按照《芝麻种质资源描述规范和数据标准》(张秀荣等，北京：中国农业出版社，2007)的方法鉴定株高(根颈至主茎顶部的高度)，按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所述的条件进行DNA提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。实验过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。

实施例1芝麻矮杆性状主效基因位点的发掘

(1)构建高杆/矮杆芝麻重组自交系(RIL)群体并鉴定株高

利用芝麻高杆品种中芝13(株高180cm以上)和矮杆种质ZZM2748(株高不足90cm)进行杂交，获得F₁种子，F₁植株自交产生F₂代种子，F₂植株自交产生F₃代种子，F₃代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F₈代分离群体，即重组自交系(RIL)群体。

在湖北武昌种植该群体，植株终花后，调查亲本及RIL各株系株高，结果见图1，统计分析表明株高表现分布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异范围很宽，说明株高属于数量性状。

(2)亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA的提取

利用CTAB法提取叶片基因组总DNA，具体步骤如下：

A.将各亲本及RIL分离群体叶片适量放入超低温冰箱-70℃存放，备用。使用时，自超低温冰箱(-70℃)取适量叶片样品，立即放入冰冻处理的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在65℃的水浴锅中预热过的CTAB提取液(2％CTAB，0.1MTris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，pH 7.5)，混合均匀，放入65℃的水浴锅中水浴40min；

B.取出离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合的混合液，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，1300g离心10min；

C.取离心后的上清于另一离心管中，重复B步骤一次。然后再取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇中，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。然后置于-20℃静置30min，挑出沉淀，用75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解；

D.再次重复B步骤一次，取上清，向其中加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，PH5.2)，混匀后缓慢加入2倍体积的冰冷无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用，即得各亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA。

(3)引物的开发及多态性的筛选

根据芝麻基因组序列(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)在第8号连锁群附近开发SSR引物。SSR引物具体的开发方法是先利用SSRHunter软件在每个scaffiold搜索SSR，然后用Primer5.0软件设计SSR引物。共设计了202对SSR引物，在此基础上，对这些引物进行亲本间多态性筛选。筛选结果表明，有63对引物在双亲间有差异，多态率为31％。多态性筛选程序如下：

A.自父母本中各随机选择5株的DNA等量混合，总浓度调整至20ng/ul，用作筛选引物的DNA模板。

B.PCR扩增反应。具体反应体系及扩增程序如下：

PCR反应体系：

PCR扩增程序：

(4)PCR扩增产物凝胶电泳测试获得多态性筛选结果

将以上获得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以获得双亲多态性筛选结果，具体步骤如下：

胶板制备：

玻璃板用10％(质量比)NaOH溶液浸泡24小时，洗净，晾干。短胶板用无尘纸巾均匀涂抹硅烷化剂(AMMRESCO)，长胶板涂抹1ml反硅烷化剂，放置5min后，将玻璃装好，并以边条隔开，四周用制胶夹夹紧。准备就绪后用注射器将6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液60ml缓慢注入玻璃间的缝隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部，注意避免产生气泡。小心插入梳子不带齿的一边，并用夹子夹牢，聚合2小时以上。

反硅烷化剂：500ml稀释液(95％无水乙醇，0.5％冰醋酸，4.5％ddH2O)中加1-2ml亲和硅烷；

6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液:5.7％(质量比)丙烯酰胺，0.3％(质量比)N,N’-甲叉二丙烯酰胺，42％(质量比)尿素，1×TBE缓冲液。灌胶前每60ml胶液加入10％(质量比)过硫酸铵390ul和TEMED 39ul；

电泳：

去掉制胶夹，取出胶板，小心的取出梳子，冲洗并擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml 1×TBE缓冲液，以恒功率75W电泳30min直到电压回升，用注水器冲洗凝胶的上表面以冲走析出的尿素和碎胶，插上梳子。在PCR产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，95℃变性5min，冰浴冷却3min以上，每个点样孔点样5ul，1800伏恒压电泳约80min，当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。取下胶板，用自来水冲洗降温。

1×TBE：Tris-base108g，硼酸55g，0.5M EDTA(PH8.0)40ml，定容至1000ml即成10×TBE，使用时稀释10倍即为1×TBE工作液；

上样缓冲液：98％(体积比)去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.005％(质量比)二甲苯青FF，0.005％(质量比)溴酚蓝。

银染法染色：

将两块玻璃板分离开来，长玻璃板连同凝胶用蒸馏水漂洗3次，每次3min，放入染色液(含0.15％的AgNO3)中染色10min，用蒸馏水快速漂洗5-6s。放入显影液(含0.2％的NaOH，0.04％的甲醛，35℃)中显影，至带型清晰，然后在蒸馏水中漂洗1次，室温下自然晾干，拍照保存。观察胶板上各引物在双亲中的扩增带型，双亲带型有差异的引物即为多态性引物。

(5)上述筛选得到的多态性引物在RIL群体中的分析及株高基因位点定位

将上述筛选得到的多态性引物在RIL群体中进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色及带型统计(父本带型统计为a，母本带型统计为b)，得到群体基因型数据，根据连锁交换规律，利用软件Joinmap3.0构建遗传连锁图谱(图2为第8号连锁群图谱)，最小LOD值设为2.5。然后利用RIL群体的432个株系的株高数据、基因型数据及遗传连锁图谱数据，运行Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法(Composite Interval Mapping,CIM)，进行基因定位分析。结果在第8号连锁群上定位到影响矮杆性状的主效基因位点qPHW8-1，可解释株高表型16.294％的变异(即贡献率16.294％)，加性效应为正(效应值9.749)，表明来自于矮杆种质ZZM2748的等位基因具有降低株高的表型效应，与其紧密连锁(遗传距离0.006cM)的分子标记为SSR标记ZMM5932，其引物序列为：

ZMM5932F：5’-GCATGCAATCTTGGTTGAAA-3’

ZMM5932R：5’-TTCTGAGTTCATGCCAATGC-3’

实施例2上述主效基因位点qPHW8-1紧密连锁的分子标记ZMM5932的引物在芝麻育种后代矮杆性状筛选及早期预测中的应用

利用另一高杆品种中芝11与矮杆种质ZZM2748杂交后构建包含411个株系的RIL群体(F₇代)，在苗期对各株系进行分子鉴定，具体步骤包括叶片总DNA的提取(具体如实施例1中的DNA提取方法)和利用矮杆性状主效基因位点qPHW8-1紧密连锁的分子标记ZMM5932的引物进行分子鉴定，即经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及带型统计(具体如实施例1中的PCR扩增、凝胶电泳及带型统计方法)，保留可得到268bp条带的株系(即含有矮杆性状主效基因位点qPHW8-1的株系)共176个，其中群体亲本及32个株系电泳后染色得到的胶板照片见图3，其中，第1、2号样品分别是母本、父本，第6、8、11、12、14、15、17、19、23、24、25、26、27、29、30、32、34号株系(扩增可得到与矮杆父本相同的268bp条带)就是鉴定出来的含有矮杆性状主效基因位点qPHW8-1的株系。另将该RIL群体411个株系于终花后进行株高测定，结果表明：通过分子标记辅助选择得到的176个株系中，株高低于该RIL群体均值(139cm)的株系占68％(见表1，共120个)，与常规育种方法相比，利用分子标记ZMM5932鉴定辅助选择株高较矮的株系，其选择效率可提高19个百分点(常规方法为49％)。该RIL群体株高低于100cm的株系共22个，其中通过分子标记辅助选择获得的株系比例高达82％(有18个)。由此，通过鉴定上述主效基因位点来预测芝麻育种后代的株高表现，可大大提高芝麻矮杆品种的育种效率。

表1分子标记辅助选择得到的株高低于群体均值的120个株系

Claims

1.一种与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM5932，其特征在于：该分子标记的引物序列为：

ZMM5932F：5’-GCATGCAATCTTGGTTGAAA-3’

ZMM5932R：5’-TTCTGAGTTCATGCCAATGC-3’。

2.根据权利要求1所述的分子标记ZMM5932在芝麻育种后代矮杆性状筛选及早期预测中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：具体应用方法为：用分子标记ZMM5932的引物ZMM5932F和ZMM5932R扩增芝麻育种后代叶片或其他组织总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得268bp的扩增片段，则预测该芝麻植株较矮；

ZMM5932F：5’-GCATGCAATCTTGGTTGAAA-3’

ZMM5932R：5’-TTCTGAGTTCATGCCAATGC-3’。