JPH05268965A - 植物プロモーター配列 - Google Patents
植物プロモーター配列Info
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- JPH05268965A JPH05268965A JP4139994A JP13999492A JPH05268965A JP H05268965 A JPH05268965 A JP H05268965A JP 4139994 A JP4139994 A JP 4139994A JP 13999492 A JP13999492 A JP 13999492A JP H05268965 A JPH05268965 A JP H05268965A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
-
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、植物における遺伝子活性の発現お
よび制御のためのプロモーターを提供する。 【構成】 本発明のプロモーター系は、トウモロコシに
おけるグルタチオン-S-トランスフェラーゼI（GSTI）系
から得られた。本発明の植物遺伝子プロモーター系は、
化学的に誘導可能な、かつ熱ショック誘導可能な植物遺
伝子プロモーター配列を有する。本発明のプロモーター
配列の制御下に、植物に発現可能なタンパク質をコード
する遺伝子を作動可能に連結して、発現カセットを作製
した。この発現カセットは植物細胞に導入され得る。本
発明はまた、発現カセットがゲノム中に含まれている植
物細胞および植物を提供する。
よび制御のためのプロモーターを提供する。 【構成】 本発明のプロモーター系は、トウモロコシに
おけるグルタチオン-S-トランスフェラーゼI（GSTI）系
から得られた。本発明の植物遺伝子プロモーター系は、
化学的に誘導可能な、かつ熱ショック誘導可能な植物遺
伝子プロモーター配列を有する。本発明のプロモーター
配列の制御下に、植物に発現可能なタンパク質をコード
する遺伝子を作動可能に連結して、発現カセットを作製
した。この発現カセットは植物細胞に導入され得る。本
発明はまた、発現カセットがゲノム中に含まれている植
物細胞および植物を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物における遺伝子活
性の発現および制御のためのプロモーターに関する。
性の発現および制御のためのプロモーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子を植物のゲノムに挿入する、植物
の遺伝子工学においては、大抵の場合、挿入した遺伝子
の発現を制御できることが望ましい。また、ゲノム本来
の遺伝子の発現を改変できることが望ましい場合もあ
る。
の遺伝子工学においては、大抵の場合、挿入した遺伝子
の発現を制御できることが望ましい。また、ゲノム本来
の遺伝子の発現を改変できることが望ましい場合もあ
る。
【０００３】例えば、ハイブリッドの作物を作製する目
的で雄性不稔性を作り出す際に、花粉形成に通常必要な
遺伝子を選択し、通常不活性なプロモーターをその遺伝
子の制御配列に挿入することによってその遺伝子を不活
性にすることが可能である。それによって、遺伝子は、
「ターンオフ（turned off）」され、植物は、雄性不稔
となる、すなわち、花粉を形成できなくなる。このシス
テムは、1990年6月12日提出のAlbertsenらの係属中の同
種出願第07/537,183号に開示されている。改変された遺
伝子型の植物を再生するためには、望ましくは、なんら
かの外因性刺激によってプロモーターを活性化させる必
要があるであろう。従って、非植物毒性の化学薬品のよ
うな外部刺激に応答するプロモーターが必要とされる。
的で雄性不稔性を作り出す際に、花粉形成に通常必要な
遺伝子を選択し、通常不活性なプロモーターをその遺伝
子の制御配列に挿入することによってその遺伝子を不活
性にすることが可能である。それによって、遺伝子は、
「ターンオフ（turned off）」され、植物は、雄性不稔
となる、すなわち、花粉を形成できなくなる。このシス
テムは、1990年6月12日提出のAlbertsenらの係属中の同
種出願第07/537,183号に開示されている。改変された遺
伝子型の植物を再生するためには、望ましくは、なんら
かの外因性刺激によってプロモーターを活性化させる必
要があるであろう。従って、非植物毒性の化学薬品のよ
うな外部刺激に応答するプロモーターが必要とされる。
【０００４】また、乾燥および熱ショックのような異常
な環境条件に応答するプロモーターの制御下で、遺伝子
を発現させることが望まれる場合がある。
な環境条件に応答するプロモーターの制御下で、遺伝子
を発現させることが望まれる場合がある。
【０００５】
【発明の要旨】本発明の植物遺伝子プロモーターは、配
列表の配列番号１に記載の配列を有する。
列表の配列番号１に記載の配列を有する。
【０００６】本発明の発現カセットは、グルタチオン-S
-トランスフェラーゼ以外の、植物中において発現可能
なタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結する
配列表の配列番号１に記載の配列を有する植物遺伝子プ
ロモーターを含む。
-トランスフェラーゼ以外の、植物中において発現可能
なタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結する
配列表の配列番号１に記載の配列を有する植物遺伝子プ
ロモーターを含む。
【０００７】好ましい実施態様においては、前記タンパ
ク質は種子貯蔵タンパク質である。好ましい実施態様に
おいては、前記タンパク質はグルタチオン-S-トランス
フェラーゼ以外の酵素である。
ク質は種子貯蔵タンパク質である。好ましい実施態様に
おいては、前記タンパク質はグルタチオン-S-トランス
フェラーゼ以外の酵素である。
【０００８】好ましい実施態様においては、前記タンパ
ク質は転写活性因子である。
ク質は転写活性因子である。
【０００９】好ましい実施態様においては、前記タンパ
ク質はレクチンである。
ク質はレクチンである。
【００１０】本発明の植物細胞は、そのゲノムには前記
発現カセットが含まれている。
発現カセットが含まれている。
【００１１】本発明の植物は、前記植物細胞を含む。
【００１２】好ましい実施態様においては、前記植物は
双子葉植物である。
双子葉植物である。
【００１３】好ましい実施態様においては、前記双子葉
植物は、大豆、ナタネ、ヒマワリおよびアルファルファ
から選択される種である。
植物は、大豆、ナタネ、ヒマワリおよびアルファルファ
から選択される種である。
【００１４】好ましい実施態様においては、前記植物は
単子葉植物である。
単子葉植物である。
【００１５】好ましい実施態様においては、前記単子葉
植物は、トウモロコシ、小麦、イネ、アワ、モロコシ、
ライ麦、大麦およびオート麦から選択される種である。
植物は、トウモロコシ、小麦、イネ、アワ、モロコシ、
ライ麦、大麦およびオート麦から選択される種である。
【００１６】
【発明の構成】本発明は、トウモロコシにおけるグルタ
チオン-S-トランスフェラーゼI（GSTI）系からのプロモ
ーター系を提供する。GSTは、発芽前散布除草剤として
頻繁に使用される多数の疎水性求電子化合物を解毒し得
る酵素のファミリーである（Wiegandら、"Messenger RN
A Encoding a Glutathione-S-Transferase Responsible
for Herbicide Tolerance in Maize is Induced in Res
ponse to Safener Treatment". Plant Molecular Biol
ogy 7: 235-243, 1986）。トウモロコシ種子をGSTで処
理することによって、トウモロコシの除草剤に対する耐
性を増加させることが発見されている。GSTが、この増
加した耐性を引き起こすことに直接関与していることが
研究の結果示されている。この作用は、主に、特異的な
0.9 kb mRNA転写産物によるものである。要するに、ト
ウモロコシは、外因性化学薬品に応答し得、遺伝子産物
を生ずるように誘導され得る、天然にすでに存在する一
連の遺伝子を有する。このような遺伝子の１つが、すで
に同定され、クローン化されている。
チオン-S-トランスフェラーゼI（GSTI）系からのプロモ
ーター系を提供する。GSTは、発芽前散布除草剤として
頻繁に使用される多数の疎水性求電子化合物を解毒し得
る酵素のファミリーである（Wiegandら、"Messenger RN
A Encoding a Glutathione-S-Transferase Responsible
for Herbicide Tolerance in Maize is Induced in Res
ponse to Safener Treatment". Plant Molecular Biol
ogy 7: 235-243, 1986）。トウモロコシ種子をGSTで処
理することによって、トウモロコシの除草剤に対する耐
性を増加させることが発見されている。GSTが、この増
加した耐性を引き起こすことに直接関与していることが
研究の結果示されている。この作用は、主に、特異的な
0.9 kb mRNA転写産物によるものである。要するに、ト
ウモロコシは、外因性化学薬品に応答し得、遺伝子産物
を生ずるように誘導され得る、天然にすでに存在する一
連の遺伝子を有する。このような遺伝子の１つが、すで
に同定され、クローン化されている。
【００１７】また、本願で提供されているプロモーター
系が、熱ショックに応答することが決定されている。従
って、熱ショックの条件下で、植物に有益な遺伝子は、
このプロモーター配列の制御下で、植物のゲノムに挿入
され得、その挿入された遺伝子は、植物が熱ショックを
受けたときに、発現される。
系が、熱ショックに応答することが決定されている。従
って、熱ショックの条件下で、植物に有益な遺伝子は、
このプロモーター配列の制御下で、植物のゲノムに挿入
され得、その挿入された遺伝子は、植物が熱ショックを
受けたときに、発現される。
【００１８】このように、本発明は、配列表の配列番号
１に掲載されている配列を有する植物遺伝子プロモータ
ーを提供する。この植物遺伝子プロモーターは、化学的
に誘導可能、熱ショック誘導可能な汎用植物遺伝子プロ
モーター配列を有する。このプロモーターは、既知の方
法を使用して、植物中での選択された遺伝子の発現のた
めの発現カセットへと容易に挿入され得る。好ましく
は、プロモーターは、グルタチオン-S-トランスフェラ
ーゼ以外の植物中で発現可能なタンパク質をコードする
遺伝子の上流側に作動可能に結合される。このようなタ
ンパク質は、好ましくは、種子貯蔵、グルタチオン-S-
トランスフェラーゼ以外の酵素、転写活性因子、および
殺虫性レクチンを含む。このカセットは、エレクトロポ
レーション、微粒子砲撃法（microparticle bombardmen
t）、マイクロインジェクションおよびアグロバクテリ
ウム チュメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）感染を含む既知の技術を使用して、目的の植物種の
植物細胞へと挿入され得る。このように、本発明はま
た、そのゲノムが本発明のプロモーターを有する発現カ
セットを包含する、植物細胞を提供する。このような細
胞を含む完全植物体は、タンパク質の発現によって提供
される特徴または利益を有する。このような植物は、制
限なく、Fragaria、Lotus、Medicago、Onobrychis、Tri
folium、Trigonella、Vigna、Citrus、Linum、Geraniu
m、Manicot、Daucus、Arabidopsis、Brassica、Raphanu
s、Sinapis、Atropa、Capsicum、Datura、Hyoscyamus、
Lycopersicon、Nicotiana、Solanum、Petunia、Digital
is、Majorana、Cichorium、Helianthus、Lactuca、Brom
us、Asparagus、Antirrhinum、Hemerocallis、Nemesi
a、Pelargonium、Panicum、Pennisetum、Ranunculus、S
enecio、Salpiglossis、Cucumis、Browallia、Glycin
e、Lolium、TriticumおよびDatura属からの種を含む双
子葉植物または単子葉植物であり得る。
１に掲載されている配列を有する植物遺伝子プロモータ
ーを提供する。この植物遺伝子プロモーターは、化学的
に誘導可能、熱ショック誘導可能な汎用植物遺伝子プロ
モーター配列を有する。このプロモーターは、既知の方
法を使用して、植物中での選択された遺伝子の発現のた
めの発現カセットへと容易に挿入され得る。好ましく
は、プロモーターは、グルタチオン-S-トランスフェラ
ーゼ以外の植物中で発現可能なタンパク質をコードする
遺伝子の上流側に作動可能に結合される。このようなタ
ンパク質は、好ましくは、種子貯蔵、グルタチオン-S-
トランスフェラーゼ以外の酵素、転写活性因子、および
殺虫性レクチンを含む。このカセットは、エレクトロポ
レーション、微粒子砲撃法（microparticle bombardmen
t）、マイクロインジェクションおよびアグロバクテリ
ウム チュメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）感染を含む既知の技術を使用して、目的の植物種の
植物細胞へと挿入され得る。このように、本発明はま
た、そのゲノムが本発明のプロモーターを有する発現カ
セットを包含する、植物細胞を提供する。このような細
胞を含む完全植物体は、タンパク質の発現によって提供
される特徴または利益を有する。このような植物は、制
限なく、Fragaria、Lotus、Medicago、Onobrychis、Tri
folium、Trigonella、Vigna、Citrus、Linum、Geraniu
m、Manicot、Daucus、Arabidopsis、Brassica、Raphanu
s、Sinapis、Atropa、Capsicum、Datura、Hyoscyamus、
Lycopersicon、Nicotiana、Solanum、Petunia、Digital
is、Majorana、Cichorium、Helianthus、Lactuca、Brom
us、Asparagus、Antirrhinum、Hemerocallis、Nemesi
a、Pelargonium、Panicum、Pennisetum、Ranunculus、S
enecio、Salpiglossis、Cucumis、Browallia、Glycin
e、Lolium、TriticumおよびDatura属からの種を含む双
子葉植物または単子葉植物であり得る。
【００１９】本発明の方法によって形質転換される好ま
しい植物は、トウモロコシ、ライ麦大麦、小麦、モロコ
シ、オート麦、アワ、イネ、ライコムギ、ヒマワリ、ア
ルファルファ、ナタネおよび大豆を含む禾穀類である。
しい植物は、トウモロコシ、ライ麦大麦、小麦、モロコ
シ、オート麦、アワ、イネ、ライコムギ、ヒマワリ、ア
ルファルファ、ナタネおよび大豆を含む禾穀類である。
【００２０】
【実施例】以下の実施例は、本発明の実施を例示するも
のであって、本発明を限定するものではない。
のであって、本発明を限定するものではない。
【００２１】（実施例Ｉ）ＧＳＴＩプロモーター領域の単離 ジクローミド（dichlormid）で誘導した根のcDNAλライ
ブラリーから、合成オリゴヌクレオチドプローブでプロ
ーブすることによって、GSTIのcDNAクローンを得た。プ
ローブの配列を、Mooreら、"Cloning and Expression o
f A cDNA Encoding a Maize Glutathione -S-Transfera
se in E. Coli.", Nuc. Acids Res. 14:7227-7235 (198
3)から得た。陽性プラークを精製し、それを同定するた
めに制限酵素地図を作成した。１つのGSTI cDNAをW22ゲ
ノムλライブラリーをプローブするのに使用した。１つ
の陽性プラークを増殖させ、それを同定するために制限
酵素地図を作成した。このクローンは、GSTI遺伝子の5'
末端およびプロモーターの全領域を含んでいた。このプ
ロモーター領域をpGEM4Zにサブクローン化し、配列決定
し、この配列は、配列表の配列番号１に示されるように
同定された。
ブラリーから、合成オリゴヌクレオチドプローブでプロ
ーブすることによって、GSTIのcDNAクローンを得た。プ
ローブの配列を、Mooreら、"Cloning and Expression o
f A cDNA Encoding a Maize Glutathione -S-Transfera
se in E. Coli.", Nuc. Acids Res. 14:7227-7235 (198
3)から得た。陽性プラークを精製し、それを同定するた
めに制限酵素地図を作成した。１つのGSTI cDNAをW22ゲ
ノムλライブラリーをプローブするのに使用した。１つ
の陽性プラークを増殖させ、それを同定するために制限
酵素地図を作成した。このクローンは、GSTI遺伝子の5'
末端およびプロモーターの全領域を含んでいた。このプ
ロモーター領域をpGEM4Zにサブクローン化し、配列決定
し、この配列は、配列表の配列番号１に示されるように
同定された。
【００２２】（実施例ＩＩ）細胞培養物 トウモロコシの不定胚形成能懸濁細胞（embryonic susp
ension cells）、遺伝子型3-44-6を、培地237（MSの塩
類およびビタミン類、100 mg/lのミオイノシトール、2
mg/lの2,4-D、0.05 mg/lのゼアチン、および3%のショ
糖）中に維持した。前処理培地は、250 mMのマンニトー
ルを含む培地237からなっていた。
ension cells）、遺伝子型3-44-6を、培地237（MSの塩
類およびビタミン類、100 mg/lのミオイノシトール、2
mg/lの2,4-D、0.05 mg/lのゼアチン、および3%のショ
糖）中に維持した。前処理培地は、250 mMのマンニトー
ルを含む培地237からなっていた。
【００２３】０日目、細胞を710 μｍのスクリーンでふ
るいにかけ、細胞群の大きさを減らし、大きさをそろえ
た。液体をすべて除去し、細胞を検量した。１グラムの
細胞をnon-baffledの普通のフラスコに入れ、20 mlの培
地237（コントロール処理）、または0.01%のTeepolおよ
び15 μl/lのジクローミドを含む培地237（誘導処理）2
0 ml中で再懸濁した。両懸濁物を28℃、100 rpmで振盪
した。
るいにかけ、細胞群の大きさを減らし、大きさをそろえ
た。液体をすべて除去し、細胞を検量した。１グラムの
細胞をnon-baffledの普通のフラスコに入れ、20 mlの培
地237（コントロール処理）、または0.01%のTeepolおよ
び15 μl/lのジクローミドを含む培地237（誘導処理）2
0 ml中で再懸濁した。両懸濁物を28℃、100 rpmで振盪
した。
【００２４】３日目、古い培地を、両培養物から除去し
た。コントロール細胞の培地を、250 mMのマンニトール
を含む20 mlの培地237と交換し、誘導細胞の培地を、25
0 mMのマンニトール、0.01%のTeepolおよび15 μl/lの
ジクローミドを含む20 mlの培地237と交換した。懸濁物
を28℃、100 rpmで振盪した。
た。コントロール細胞の培地を、250 mMのマンニトール
を含む20 mlの培地237と交換し、誘導細胞の培地を、25
0 mMのマンニトール、0.01%のTeepolおよび15 μl/lの
ジクローミドを含む20 mlの培地237と交換した。懸濁物
を28℃、100 rpmで振盪した。
【００２５】４日目、両処理からの細胞をそれぞれ、予
め250 mMマンニトールを含む培地237 1 mlで湿らせた
グレード617濾紙上にまいた。１プレート当り25 gの細
胞になるように0.5 mlの細胞をまいた。砲撃（bombardm
ent）を最大限にするために、細胞を各プレートの中央
によせた。
め250 mMマンニトールを含む培地237 1 mlで湿らせた
グレード617濾紙上にまいた。１プレート当り25 gの細
胞になるように0.5 mlの細胞をまいた。砲撃（bombardm
ent）を最大限にするために、細胞を各プレートの中央
によせた。
【００２６】（実施例ＩＩＩ）トウモロコシ胚の調製 公然の近交系B73のトウモロコシの種子を、0.5%のTween
20を含む20%の次亜塩素酸塩溶液中で室温で20分間表面
殺菌した。この種子を滅菌脱イオン水中で充分すすぎ、
滅菌ペトリ皿中に、0.01%のTeepolの水溶液（コントロ
ール）、または0.01%のTeepolおよび15 μl/lのジクロ
ーミドを含む水（誘導）に浸した。これらのプレートを
28℃で３日間暗所に静置した。子葉鞘の先端を各種子か
ら切り取り、培地272（MSの塩類、４％のショ糖）上に
一昼夜置いた。砲撃を最大限にするために、子葉鞘の先
端（２つ）を各プレート中央によせた。
20を含む20%の次亜塩素酸塩溶液中で室温で20分間表面
殺菌した。この種子を滅菌脱イオン水中で充分すすぎ、
滅菌ペトリ皿中に、0.01%のTeepolの水溶液（コントロ
ール）、または0.01%のTeepolおよび15 μl/lのジクロ
ーミドを含む水（誘導）に浸した。これらのプレートを
28℃で３日間暗所に静置した。子葉鞘の先端を各種子か
ら切り取り、培地272（MSの塩類、４％のショ糖）上に
一昼夜置いた。砲撃を最大限にするために、子葉鞘の先
端（２つ）を各プレート中央によせた。
【００２７】（実施例ＩＶ）マイクロプロジェクタイル砲撃(Microprojectile Bomba
rdment) CaCl2およびスペルミジンでタングステン上に沈澱させ
た、10 μgのDNA濃度を使用し、Dupontのヘリウム粉末
粒子発射システムを使用して、細胞に砲撃を与え、以下
のシステムセッティングを使用して、すべての細胞に１
回砲撃を与えた。 可変ネスト（Variable nest）：高い 固定ネスト（Fixed nest）：高い 650 psi破裂ディスク 砲撃の後、フィルター上の細胞を、培地115（ATをベー
スにした、1 g/lのミオイノシトール、0.75 mg/lの2,4-
D、700 mg/lのプロリンおよび2%のショ糖を含む）に移
し、28℃で一昼夜暗所でインキュベートした。子葉鞘先
端を培地272に放置し、同様にインキュベートした。酵
素アッセイを、砲撃の24時間後に行った。
rdment) CaCl2およびスペルミジンでタングステン上に沈澱させ
た、10 μgのDNA濃度を使用し、Dupontのヘリウム粉末
粒子発射システムを使用して、細胞に砲撃を与え、以下
のシステムセッティングを使用して、すべての細胞に１
回砲撃を与えた。 可変ネスト（Variable nest）：高い 固定ネスト（Fixed nest）：高い 650 psi破裂ディスク 砲撃の後、フィルター上の細胞を、培地115（ATをベー
スにした、1 g/lのミオイノシトール、0.75 mg/lの2,4-
D、700 mg/lのプロリンおよび2%のショ糖を含む）に移
し、28℃で一昼夜暗所でインキュベートした。子葉鞘先
端を培地272に放置し、同様にインキュベートした。酵
素アッセイを、砲撃の24時間後に行った。
【００２８】（実施例Ｖ）プラスミド GSTIプロモーターを含む以下のプラスミド：pGST92（pP
HI1511）、pGST93（pPHI1512）、pGST94（pPHI1513）、
およびpGST95（pPHI1514）からプラスミドを得た。図に
示すように、プラスミドpGST46（pPHI1361）、pGST96
（pPHI1515）、pGST97（pPHI1516）、pGST98（pPHI151
7）、およびpGST99（pPHI1518）を得、ルシフェラーゼ
を含むプラスミドは、pGST100（pPHI1519）、pGST101
（pPHI1520）、pGST102（pPHI1521）、pGST103（pPHI15
22）およびpGST104（pPHI1655）で示され、これらのプ
ラスミドを得た。
HI1511）、pGST93（pPHI1512）、pGST94（pPHI1513）、
およびpGST95（pPHI1514）からプラスミドを得た。図に
示すように、プラスミドpGST46（pPHI1361）、pGST96
（pPHI1515）、pGST97（pPHI1516）、pGST98（pPHI151
7）、およびpGST99（pPHI1518）を得、ルシフェラーゼ
を含むプラスミドは、pGST100（pPHI1519）、pGST101
（pPHI1520）、pGST102（pPHI1521）、pGST103（pPHI15
22）およびpGST104（pPHI1655）で示され、これらのプ
ラスミドを得た。
【００２９】（実施例ＶＩ）ルシフェラーゼおよびGUSアッセイ GUS酵素活性を、砲撃を受けた組織の細胞化学染色によ
って検出した。砲撃の１日後、アッセイされる組織を、
新しいプレートに移し、GUSの細胞化学基質（100 mMの
リン酸カリウム、(pH 7.5)、5 mMのフェリシアン化カリ
ウム(3+Fe)、5mMのフェロシアン化カリウム（2+Fe)、2
mMのX-gluc.、1%のDMSO）を加えた。懸濁細胞に、400
μlのGUSの基質を加えた。子葉鞘先端を、マイクロタイ
タープレートのウェルに入れ、100 μlのGUSの基質を加
えた。組織を37℃で４から６時間インキュベートした。
解剖顕微鏡で、青いスポットを数えた。
って検出した。砲撃の１日後、アッセイされる組織を、
新しいプレートに移し、GUSの細胞化学基質（100 mMの
リン酸カリウム、(pH 7.5)、5 mMのフェリシアン化カリ
ウム(3+Fe)、5mMのフェロシアン化カリウム（2+Fe)、2
mMのX-gluc.、1%のDMSO）を加えた。懸濁細胞に、400
μlのGUSの基質を加えた。子葉鞘先端を、マイクロタイ
タープレートのウェルに入れ、100 μlのGUSの基質を加
えた。組織を37℃で４から６時間インキュベートした。
解剖顕微鏡で、青いスポットを数えた。
【００３０】砲撃を受けたサンプルを、200 μlのルシ
フェラーゼ粉砕緩衝液（100 mMのリン酸カリウム(pH 7.
8)、1 mMのDTT）中で粉砕した後、ルシフェラーゼ酵素
活性を測定した。細胞残渣を、微量遠心分離機中で４℃
で遠心分離することによってペレット状にした。200 μ
lのルシフェラーゼアッセイ緩衝液（25 mMのトリシン(p
H 7.8)、15 mMのMgCl2、5 mMのATP、500 μg/mlのBSA）
および10〜20 μlの組織抽出物を、12 x 31 mmのガラス
のルミノメーターキュベットに加えることによってルシ
フェラーゼ活性をアッセイした。このキュベットを、ル
ミノメーターに置き、500 μMのルシフェリン（カリウ
ム塩）100 μlをキュベットに加えることによって反応
を開始した。この反応を、LED読み出しから得た光単位
として測定した。
フェラーゼ粉砕緩衝液（100 mMのリン酸カリウム(pH 7.
8)、1 mMのDTT）中で粉砕した後、ルシフェラーゼ酵素
活性を測定した。細胞残渣を、微量遠心分離機中で４℃
で遠心分離することによってペレット状にした。200 μ
lのルシフェラーゼアッセイ緩衝液（25 mMのトリシン(p
H 7.8)、15 mMのMgCl2、5 mMのATP、500 μg/mlのBSA）
および10〜20 μlの組織抽出物を、12 x 31 mmのガラス
のルミノメーターキュベットに加えることによってルシ
フェラーゼ活性をアッセイした。このキュベットを、ル
ミノメーターに置き、500 μMのルシフェリン（カリウ
ム塩）100 μlをキュベットに加えることによって反応
を開始した。この反応を、LED読み出しから得た光単位
として測定した。
【００３１】（実施例ＶＩＩ）核抽出物 ジクローミドで処理された、および処理されていないト
ウモロコシの根から抽出物を調製した。パーライトで満
たした平たいパット中に種子（１パット当り100個の種
子）を植え、水、または15 μl/lのジクローミドおよび
0.01%Teepolを含む水を吸収させた。種子を発芽させ、
温室条件下で成長させた。苗木が高さ約1.5インチに達
したとき、パットを環境制御チェンバーに移し、２日間
完全な暗所に放置した。温度は、85。Ｆで16時間、72。Ｆ
で８時間であった。根を収集し、液体窒素中で瞬間的に
凍結し、ワーリングブレンダー中で細かい粉末に粉砕し
た。凍結した粉末を、200 mlの緩衝液Ａ（10 mMのMES(p
H 6.0)、10 mMのNaCl、5 mMのEDTA、0.15 mMのスペルミ
ン、0.5 mMのスペルミジン、20 mMの2-ME、0.2 mMのPMS
F、0.6%のトリトン X-100、250 mMのショ糖）中に入れ
た。ホモジェネートを充分攪拌し、２枚のミラクロース
で２回濾過した。この濾過液を、４℃でSorvall GSAロ
ーター中2000 Gで遠心分離し、ペレットを、20 mlの緩
衝液Ａ中でゆるやかに再懸濁した。核を、Sorvall SS-3
4ローター中2000 Gで再び遠心分離することによってペ
レット状にした。このペレットを、2 mlの高塩濃度緩衝
液（20 mMのHEPES(pH 7.9)、25%のグリセロール、420 m
MのNaCl、1.5 mMのMgCl2、0.2 mMのEDTA、0.5 mMのPMS
F、0.5 mMのDTT）中でゆるやかに再懸濁した。最終濃度
を0.3 mMになるように4 M(NH4)2SO4を加え、核を溶解し
た。これを30分間氷上に置き、ときどきかきまぜた。Ep
pendorf微量遠心分離機を用いて、４℃で10分間遠心分
離することによって、澱粉および残渣を除去した。上清
を、小さな回転子を入れた小ビーカー（氷上）に移し
た。顆粒状の(NH4)2SO4（0.25 g/mlの核溶解物）を溶け
るまでゆっくりと加えた。この溶液を氷上でさらに30分
間攪拌した。４℃、10分間の遠心分離によって、不溶性
タンパク質をペレット状にした。このペレットを0.5 ml
の高塩濃度緩衝液中で再懸濁し、調製した透析膜にタン
パク質溶液を入れ、500 容量の冷えた透析緩衝液（20 m
MのHEPES(pH 7.6)、20%のグリセロール、100 mMのKCl、
0.2 mMのEDTA、0.5 mMのDTT、0.5 mMのPMSF）を少なく
とも４回替えて透析した。全透析時間は、６から８時間
であった。抽出物を微量遠心分離チューブに分割（50
μl)し、液体窒素中で瞬間的に凍結し、使用するまで-8
0℃で保存した。タンパク質の濃度は、Bradford法によ
って決定した。
ウモロコシの根から抽出物を調製した。パーライトで満
たした平たいパット中に種子（１パット当り100個の種
子）を植え、水、または15 μl/lのジクローミドおよび
0.01%Teepolを含む水を吸収させた。種子を発芽させ、
温室条件下で成長させた。苗木が高さ約1.5インチに達
したとき、パットを環境制御チェンバーに移し、２日間
完全な暗所に放置した。温度は、85。Ｆで16時間、72。Ｆ
で８時間であった。根を収集し、液体窒素中で瞬間的に
凍結し、ワーリングブレンダー中で細かい粉末に粉砕し
た。凍結した粉末を、200 mlの緩衝液Ａ（10 mMのMES(p
H 6.0)、10 mMのNaCl、5 mMのEDTA、0.15 mMのスペルミ
ン、0.5 mMのスペルミジン、20 mMの2-ME、0.2 mMのPMS
F、0.6%のトリトン X-100、250 mMのショ糖）中に入れ
た。ホモジェネートを充分攪拌し、２枚のミラクロース
で２回濾過した。この濾過液を、４℃でSorvall GSAロ
ーター中2000 Gで遠心分離し、ペレットを、20 mlの緩
衝液Ａ中でゆるやかに再懸濁した。核を、Sorvall SS-3
4ローター中2000 Gで再び遠心分離することによってペ
レット状にした。このペレットを、2 mlの高塩濃度緩衝
液（20 mMのHEPES(pH 7.9)、25%のグリセロール、420 m
MのNaCl、1.5 mMのMgCl2、0.2 mMのEDTA、0.5 mMのPMS
F、0.5 mMのDTT）中でゆるやかに再懸濁した。最終濃度
を0.3 mMになるように4 M(NH4)2SO4を加え、核を溶解し
た。これを30分間氷上に置き、ときどきかきまぜた。Ep
pendorf微量遠心分離機を用いて、４℃で10分間遠心分
離することによって、澱粉および残渣を除去した。上清
を、小さな回転子を入れた小ビーカー（氷上）に移し
た。顆粒状の(NH4)2SO4（0.25 g/mlの核溶解物）を溶け
るまでゆっくりと加えた。この溶液を氷上でさらに30分
間攪拌した。４℃、10分間の遠心分離によって、不溶性
タンパク質をペレット状にした。このペレットを0.5 ml
の高塩濃度緩衝液中で再懸濁し、調製した透析膜にタン
パク質溶液を入れ、500 容量の冷えた透析緩衝液（20 m
MのHEPES(pH 7.6)、20%のグリセロール、100 mMのKCl、
0.2 mMのEDTA、0.5 mMのDTT、0.5 mMのPMSF）を少なく
とも４回替えて透析した。全透析時間は、６から８時間
であった。抽出物を微量遠心分離チューブに分割（50
μl)し、液体窒素中で瞬間的に凍結し、使用するまで-8
0℃で保存した。タンパク質の濃度は、Bradford法によ
って決定した。
【００３２】（実施例ＶＩＩＩ）ゲルシフト解析 核抽出物をゲルシフト解析に使用して、GSTIプロモータ
ー配列内に強力なシス作用調節因子の位置を検出した。
GSTIプロモーターからの特定の制限フラグメントを32P-
dXTP（放射標識された４種類のすべてのデオキシ−ヌク
レオチドの標識混合物）で末端標識し、スパンカラムク
ロマトグラフィーによって取り込まれなかったヌクレオ
チドを除去し、精製した。取り込み量をシンチレーショ
ン・カウンターで測定した。結合反応当り、約20,000 c
pmを使用した。結合反応は、全容量25 μl中、10 mMの
トリス−HCl（pH 7.6）、1 mMのEDTA、1 mMのDTT、1 μ
gのポリdI:dC（非特異的競合剤）、2 μgの核タンパク
質を供給する容量の抽出物、4 mMのMgCl2（特異的DNA結
合タンパク質の二価カチオンの要求性に応じて随意であ
る）から構成されている。特異的競合実験において、1
μgの標識されていない特定のフラグメントを結合反応
に含ませた。結合反応を室温で15分間インキュベート
し、トリス−グリシン緩衝液系（25 mMのトリス−HCl
(pH 8.3)、190 mMのグリシン、1 mMのEDTA）を使用する
６％のポリアクリルアミドゲル上にのせた。ローディン
グ色素中のブロモフェノールブルーが、ゲルの底部から
１インチ上に移動するまで、ゲル（あらかじめ２時間流
しておいたもの）を流した。このゲルを装置から取りは
ずし、乾燥して、-80℃で増強スクリーン上において、
一昼夜Ｘ線フィルムにさらした。フィルム上のバンドパ
ターンを、核タンパク質の推定シス作用調節配列への結
合によるバンドパターンのシフトについて解析した。
ー配列内に強力なシス作用調節因子の位置を検出した。
GSTIプロモーターからの特定の制限フラグメントを32P-
dXTP（放射標識された４種類のすべてのデオキシ−ヌク
レオチドの標識混合物）で末端標識し、スパンカラムク
ロマトグラフィーによって取り込まれなかったヌクレオ
チドを除去し、精製した。取り込み量をシンチレーショ
ン・カウンターで測定した。結合反応当り、約20,000 c
pmを使用した。結合反応は、全容量25 μl中、10 mMの
トリス−HCl（pH 7.6）、1 mMのEDTA、1 mMのDTT、1 μ
gのポリdI:dC（非特異的競合剤）、2 μgの核タンパク
質を供給する容量の抽出物、4 mMのMgCl2（特異的DNA結
合タンパク質の二価カチオンの要求性に応じて随意であ
る）から構成されている。特異的競合実験において、1
μgの標識されていない特定のフラグメントを結合反応
に含ませた。結合反応を室温で15分間インキュベート
し、トリス−グリシン緩衝液系（25 mMのトリス−HCl
(pH 8.3)、190 mMのグリシン、1 mMのEDTA）を使用する
６％のポリアクリルアミドゲル上にのせた。ローディン
グ色素中のブロモフェノールブルーが、ゲルの底部から
１インチ上に移動するまで、ゲル（あらかじめ２時間流
しておいたもの）を流した。このゲルを装置から取りは
ずし、乾燥して、-80℃で増強スクリーン上において、
一昼夜Ｘ線フィルムにさらした。フィルム上のバンドパ
ターンを、核タンパク質の推定シス作用調節配列への結
合によるバンドパターンのシフトについて解析した。
【００３３】本発明は、化学的に誘導可能、熱ショック
誘導可能な、かつ汎用植物遺伝子プロモーター配列、発
現カセット、本発明の植物遺伝子プロモーター配列を含
む植物細胞および植物を提供する。
誘導可能な、かつ汎用植物遺伝子プロモーター配列、発
現カセット、本発明の植物遺伝子プロモーター配列を含
む植物細胞および植物を提供する。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【図１】pGST46のプラスミド地図である。
【図２】pGST104のプラスミド地図である。
【図３】pGST103のプラスミド地図である。
【図４】pGST102のプラスミド地図である。
【図５】pGST101のプラスミド地図である。
【図６】pGST100のプラスミド地図である。
【図７】pGST99のプラスミド地図である。
【図８】pGST98のプラスミド地図である。
【図９】pGST97のプラスミド地図である。
【図１０】pGST96のプラスミド地図である。
【図１１】pGST95のプラスミド地図である。
【図１２】pGST94のプラスミド地図である。
【図１３】pGST93のプラスミド地図である。
【図１４】pGST92のプラスミド地図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/29 15/52 15/82 (72)発明者 ジョン ネイル アメリカ合衆国 アイオワ 50310，ポー ク カウンティ，デモイン，エヌ．ダブリ ュー． フィフティース ストリート 4834 (72)発明者 ジョン ハワード アメリカ合衆国 アイオワ 50265，ポー ク カウンティ，ウェスト デモイン，バ リー リッジ コート 3211
Claims (12)
- 【請求項１】配列表の配列番号１に記載の配列を有する
植物遺伝子プロモーター。 - 【請求項２】グルタチオン-S-トランスフェラーゼ以外
の、植物中において発現可能なタンパク質をコードする
遺伝子に作動可能に連結される請求項１に記載のプロモ
ーターを含む、発現カセット。 - 【請求項３】前記タンパク質が種子貯蔵タンパク質であ
る、請求項２に記載の発現カセット。 - 【請求項４】前記タンパク質が、グルタチオン-S-トラ
ンスフェラーゼ以外の酵素である、請求項２に記載の発
現カセット。 - 【請求項５】前記タンパク質が転写活性因子である、請
求項２に記載の発現カセット。 - 【請求項６】前記タンパク質がレクチンである、請求項
２に記載の発現カセット。 - 【請求項７】植物細胞であって、そのゲノムが請求項２
に記載の発現カセットを含む、植物細胞。 - 【請求項８】請求項７に記載の細胞を含む植物。
- 【請求項９】双子葉植物である、請求項８に記載の植
物。 - 【請求項１０】請求項９に記載の植物であって、大豆、
ナタネ、ヒマワリおよびアルファルファから選択される
種である植物。 - 【請求項１１】単子葉植物である、請求項８に記載の植
物。 - 【請求項１２】請求項１１に記載の植物であって、トウ
モロコシ、小麦、イネ、アワ、モロコシ、ライ麦、大麦
およびオート麦から選択される種である植物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/694,227 | 1991-05-01 | ||
| US07/694,227 US5907086A (en) | 1991-05-01 | 1991-05-01 | Plant promoter sequences |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268965A true JPH05268965A (ja) | 1993-10-19 |
Family
ID=24787943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4139994A Withdrawn JPH05268965A (ja) | 1991-05-01 | 1992-05-01 | 植物プロモーター配列 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5907086A (ja) |
| EP (1) | EP0515048A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05268965A (ja) |
| AU (1) | AU651684B2 (ja) |
| CA (1) | CA2067477A1 (ja) |
| HU (1) | HUT62660A (ja) |
| NZ (1) | NZ242522A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2256189A1 (en) | 2003-03-28 | 2010-12-01 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Process for producing a plant storage organ in which a GLP-1 derivative recombinant protein is highly produced. |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0620281A3 (en) * | 1993-03-31 | 1995-05-03 | Mitsubishi Corp | Oilseed plants producing valuable seeds with modified amino acid and fatty acid compositions. |
| US7148064B1 (en) * | 1999-05-26 | 2006-12-12 | National Research Council Of Canada | Method for reducing phytate in canola meal using genetic manipulation involving myo-inositol 1-phospathe synthase gene |
| US20030100748A1 (en) * | 2000-08-04 | 2003-05-29 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Plant promoter derived from luminal binding protein gene and methods for its use |
| US6440674B1 (en) | 2000-08-04 | 2002-08-27 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Plant promoter derived from luminal binding protein gene and methods for its use |
| US7189776B2 (en) * | 2001-06-12 | 2007-03-13 | Akzo Nobel N.V. | Aqueous composition |
| DE602006016756D1 (de) * | 2005-03-16 | 2010-10-21 | Athenix Corp | Auf cis einwirkende regulierende elemente aus tripsacum-dactyloiden |
| CA2681661C (en) * | 2007-03-23 | 2015-11-24 | New York University | Methods of increasing nitrogen-assimilation capacity in transgenic plants expressing cca1 and glk1 |
| WO2009146015A2 (en) | 2008-03-31 | 2009-12-03 | Ceres, Inc. | Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof |
| US8277651B2 (en) | 2009-03-13 | 2012-10-02 | Terrasep, Llc | Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4885357A (en) * | 1985-06-12 | 1989-12-05 | Lubrizol Genetics Inc. | Modified zein proteins containing lysine |
| GB8901677D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Hybrid seed production |
| NZ228234A (en) * | 1988-03-08 | 1992-09-25 | Ciba Geigy Ag | Non-coding chemically regulatable dna fragments, their use and preparation |
| JPH05504046A (ja) * | 1988-05-20 | 1993-07-01 | シビア・ニユーロサイエンシズ・インコーポレイテツド | 農業用化学物質スクリーニング法 |
| FR2633547A1 (fr) * | 1988-06-30 | 1990-01-05 | Rhone Poulenc Films | Procede de microperforation de pellicules thermoplastiques par ultrasons |
| GB2225970A (en) * | 1988-07-04 | 1990-06-20 | Collins Motor Corp Ltd | Low pressure casting of metal |
| GB8901673D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Gene switch |
| EP0463056A1 (en) * | 1989-03-17 | 1992-01-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | External regulation of gene expression |
| CA2042447C (en) * | 1990-06-12 | 1999-09-28 | Marc C. Albertsen | Control of microsporogenesis by externally inducible promoter sequences |
| JP5790403B2 (ja) | 2010-12-07 | 2015-10-07 | 株式会社リコー | エレクトロクロミック表示装置 |
-
1991
- 1991-05-01 US US07/694,227 patent/US5907086A/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-04-28 CA CA002067477A patent/CA2067477A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-28 NZ NZ242522A patent/NZ242522A/en unknown
- 1992-04-29 EP EP92303858A patent/EP0515048A1/en not_active Ceased
- 1992-04-30 HU HU9201479A patent/HUT62660A/hu unknown
- 1992-05-01 JP JP4139994A patent/JPH05268965A/ja not_active Withdrawn
- 1992-05-01 AU AU15956/92A patent/AU651684B2/en not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2256189A1 (en) | 2003-03-28 | 2010-12-01 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Process for producing a plant storage organ in which a GLP-1 derivative recombinant protein is highly produced. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ242522A (en) | 1994-04-27 |
| HUT62660A (en) | 1993-05-28 |
| CA2067477A1 (en) | 1992-11-02 |
| HU9201479D0 (en) | 1992-07-28 |
| AU651684B2 (en) | 1994-07-28 |
| US5907086A (en) | 1999-05-25 |
| EP0515048A1 (en) | 1992-11-25 |
| AU1595692A (en) | 1992-11-05 |
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