HUT62660A - Process for producing plant promoter sequences, expression cassettes comprising same and trnasformed plants - Google Patents

Process for producing plant promoter sequences, expression cassettes comprising same and trnasformed plants Download PDF

Info

Publication number
HUT62660A
HUT62660A HU9201479A HU9201479A HUT62660A HU T62660 A HUT62660 A HU T62660A HU 9201479 A HU9201479 A HU 9201479A HU 9201479 A HU9201479 A HU 9201479A HU T62660 A HUT62660 A HU T62660A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plant
protein
expression cassette
plants
promoter
Prior art date
Application number
HU9201479A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9201479D0 (en
Inventor
John Neill
John Howard
Original Assignee
Pioneer Hi Bred Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pioneer Hi Bred Int filed Critical Pioneer Hi Bred Int
Publication of HU9201479D0 publication Critical patent/HU9201479D0/hu
Publication of HUT62660A publication Critical patent/HUT62660A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

KIVONAT
A találmány kémiailag indukálható és hősokk-kal indukálható, általános célú növényi gén promotor szekvenciával foglalkozik, továbbá foglalkozik az említett szekvenciát magában foglaló kifejező kazettákkal, növényi sejtekkel és növényekkel. A találmány tárgyát képező promotor szekvencia a glutation-5-transzferáz I rendszerből származik. A promotor segítségével a növényekben idegen gének kifejezése segíthető elő, vagy eredetileg is meglevő gének fokozott kifejezése érhető el.
A* h
KÖZZÉTÉTELI.·
PÉLDÁNY ς
56.133/ΡΑ
S.B.G.&K.
Budapesti Nemzetközi
Szabadalmi Iroda
H-1061 Budapest, Dalszínház u. W.
Telefon: 153-3733, Fax: 153-3664
NÖVÉNYI PR0M0T0R SZEKVENCIÁK,^7 7» HTW J-H ^ε-cő vowzteTTo'iL er tiuujJ'ífor.hív'z.t üöwy/&i < c^ówzliTío/*!'^ Pioneer Hi-Bred International, Inc.
DES MOINES, Iowa,
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
Feltalálók: Neill John, DES MOINES
Howard John, WEST DES MOINES, Iowa
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
A bejelentés napja: 1992.04.30.
Elsőbbsége: 1991.05.01 (07/694,227)
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK • · « ·
A találmány olyan promotorokkal foglalkozik, amelyek alkalmasak a gén-aktivitás kifejezésére és szabályozására növényekben.
A növényekkel kapcsolatos genetikai manipulációknál, amelyeknél valamely gént iktatnak be egy növény genomjába, sok esetben szükséges, hogy lehessen szabályozni a gén kifejeződését. Más esetekben kívánatos, hogy módosítani lehessen egy gén kifejeződését, amely a genom számára egyébként temészetes.
így pl. a hímsterilitás megalkotásánál a haszonnövények hibridizálása céljából ki lehet választani azt a gént, amely normálisan szükséges a pollenképződéshez, és ezt a gént inaktiválni lehet olyan módon, hogy a gén kontroll szekvenciáiba beiktatunk egy normálisan inaktív promotort úgy, hogy a gén leáll és a növény hímsterillé válik, vagyis nem képes polleneket kialakítani. Ezt az eljárást Albertsen és munkatársai leírják a 07/537,183 számú, 1990. június 12-én benyújtott bejelentésben. Abból a célból, hogy a módosított genotípusú növényeket reprodukáljuk, szükség lehet a promotor aktiválására, kívánatosán bizonyos exogén serkentéssel. Következésképpen folytonos az igény olyan promotorokra, amelyek választ adnak a külső serkentésre, pl. nem fitotoxikus kémiai anyagokra.
Más esetekben kívánatos a gén kifejezését olyan promotor szabályozása alá helyezni, amely szokatlan környezeti körülményekre, pl. szárazságra és hősokkra ad választ.
A jelen találmány promotor-rendszert nyújt a kukoricában a glutation-5-transzferáz I (GST I) rendszerből. A GST-k az enzimek egy családját képezik, amelyek képesek detoxikálni egy sor olyan hidrofób, elektrofil vegyületet, amelyeket gyakran alkalmaznak megelőző herbicidekként és munkatársai: Messenger RNA
- 3 Encoding a Glutathione-5-Transferase Responsible fór Herbicide Tolerance in Maize is Induced in Response to Safener Treatment (A kukoricában a herbicid-tűrésért felelős glutation-5-transzferázt kódoló hírvivő RNS indukálódik a biztonságosabb kezelésre adott válaszban), Plánt Molecular Biology 1_, 235-243 ( 1 9 8 6 )J . Rájöttünk arra, hogy ha a kukorica magjait GST-vel kezeljük, fokozódik a kukorica tűrése a herbicidekre. A tanulmányok kimutatták, hogy a GST közvetlenül érdekelt ennek a fokozott tűrésnek az előidézésében. Ezt a tevékenységet elsődlegesen egy speciális, 0,9 kb-s mRNS átírási termék közvetíti. Röviden ismertetve, a kukorica rendelkezik egy sor természetben előforduló génnel, amely már jelen van, és amely exogén vegyi anyagokra válaszolni képes, és amelyet indukálni lehet, hogy egy géntermék képződjék. Egy ilyen gént már azonosítottunk és klónoztunk.
Azt is meghatároztuk, hogy az itt nyújtott promotor-rendszer választ ad hősokkra. így egy olyan gént, amely a hősokk körülményei között a növény számára hasznos, beültethetünk a növény genomjába ennek a promotor szekvenciának a szabályozása alá, és a beiktatott gén akkor fog kifejeződni, amikor a növény hősokk hatásának van kitéve.
Ennek megfelelően a jelen találmány egy növényi gén promotort nyújt, amelynek szekvenciája a SEQ.ID.NO.1-ben található. Ezt a promotort könnyen be lehet iktatni ismert eljárások alkalmazásával egy kifejező kazettába a kiválasztott gén növényekben való kifejezéséhez. A promotor előnyösen egy géntől fölfelé van működőképesen kapcsolva, amely gén egy növényben kifejezhető és glutation-5-transzferáztól eltérő fehérjét kódol. Az ilyen fehérjék között találjuk a magokban levő tároló fehérjéket, enzimeket (amelyek a glutation-5-transzferáztól eltérőek) transzkripciós aktivátorokat és inszekticid lektineket. Ezt a kazettát ismert technikákat alkalmazva beiktathatjuk egy célfaj növényi sejtjeibe, az ismert technikák közé értve pl. az elektroporációt, mikro részecskés bombázást, mikroinjekeiét , és Agrobacterium tumefaciens fertőzést. Ennek megfelelően ez a találmány növényi sejteket is szolgáltat, amelyeknek genomja a találmány szerinti promotort tartalmazó kifejező kazettát tartalmaz. Az ilyen sejteket tartalmazó teljes növények rendelkeznek azokkal az előnyös vonásokkal, amelyeket a fehérje kifejezése nyújt. Az ilyen növények lehetnek kétszikűek vagy egyszikűek; ezek között megemlíthetjük - a kor-
látozás szándéka nélkül - az alábbi nemzetségek fajait: Fragaria,
Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus,
Linum, Geránium, Manicot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus,
Sinapis, Atropa , Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nico-
tiana, Solanum, Petúnia, Digitális, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Ne mesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Triticum, és Datura.
Az előnyös növények, amelyek transzformálhatok a jelen találmány szerinti eljárással, a gabona- és takarmánynövények , elsősorban a kukorica, rozs, árpa, búza, cirok, zab, köles, rizs, tritikále, napraforgó, lucerna, repce és szója.
Megvalósítás és alkalmazhatóság
Az alábbi példák illusztrálják - a korlátozás szándéka nélkül - a találmány gyakorlati kivitelezését.
I. példa
A GSTI promotor terület^zolálása
G5TI cDNS kiónt kapunk egy diklormiddal indukált gyökér • · cDNS lambda könyvtárból, az átvizsgálást (próbázást) egy szintetikus oligonukleotid vizsgáló mintával végezve. A vizsgáló minta szekvenciáját Moore és munkatársai alapján kaptuk megjj'Cloning and Expression of A cDNA Encoding a Maize Glutathione-5-Transferase in E. coli (Kukorica glutation-5-transzferázt kódoló cDNS klónozása és kifejezése E. coliban), Nuc. Acids. Rés. 1 4 , 7227723 5 (19 8 3 )J. A pozitív tarfoltokat tisztítjuk és restrikciós térképüket elkészítjük, hogy igazoljuk azonosságukat. Egy GSTI cDNS-t alkalmazunk lambda W22 genomikus könyvtár átvizsgálására. Egy pozitív tarfoltot növesztünk és elvégezzük a restrikciós térképezést, hogy igazoljuk az azonosságot. Ez a klón tartalmazza a GSTI gén 5’ végét, valamint a teljes promotor területet. A promotor területet alklónozzuk pGEM4Z-ben, szekvenciaelemzésnek vetjük alá; a szekvenciát a SEQ. ID . NO.1-ben ábrázoltnak találjuk.
II. példa
Sejttenyészet
3-44-6 genotípusú embrionális kukorica szuszpenziós sejteket 237. tápközegben (MS sók és vitaminok; 100 mg/1 mio-inozit, 2 mg/1 2,4-D; 0,05 mg/1 zeatin; és 3 Só szacharóz) tartunk fenn. Az előkezelő tápközeg 237. tápközegből és 250 mmól/1 mannitból áll.
A 0. napon a sejteket átvisszük egy 710y4m-es szitán, hogy csökkentsük és egyneművé tegyük a sejtcsoportok méreteit. Az öszszes folyadékot eltávolítjuk és a sejteket lemérjük. 1 g sejtet nem bordázott lombikba helyezünk és újra szuszpendáljuk 20 ml 237. tápközegben (kontroll kezelés) vagy 20 ml olyan 237. tápközegben, tártaim.
amely 0,01 °ó Teepol-t és 15/Λ1/1 diklormidot (indukciós kezelés)' Mindkét szuszpenziót 100 fordulat/percnél rázajuk 28°C hőmérsék létén .
A 3. napon a használt tápközeget eltávolítjuk mindkét tenyészetből. A kontroll sejtek tápközegét 20 ml olyan 237. tápközeggel helyettesítjük, amely 250 mmól/1 mannitot is tartalmaz, és az indukált sejteken levő tápközeget olyan 237. tápközeggel kezeljük, amely 250 mmól/1 mannitot, 0,01 % Teepolt és 15 ml/1 diklormidot is tartalmaz. A szuszpenziókat 100 fordulat/percnél rázatjuk 28°C hőmérsékleten.
A 4. napon a sejteket mindkét kezelési típusból 2. fokozatú 617. szűrőpapírra visszük át, amelyet előzőleg átnedvesítettünk 237. tápközeggel és 1 ml 250 mmól/l-es mannit oldattal. A sejtek felét visszük át úgy, hogy lemezenként 25 g sejt legyen. A sejteket mindegyik lemezen központosítjuk, hogy a bombázásnak való kitevés maximális legyen.
III. példa
Kukorica-embrió előállítás
Közforgalomban levő B73 beltenyésztett kukorica vonal magjait felületükön sterilezzük 20 2ó-os hipoklorit oldatban, amely 0,5 °ó Tween 20-at is tartalmaz, 20 percen át szobahőmérsékleten. A magokat alaposan átöblítjük steril, ionmentesített vízben és átvisszük steril Petri-csészékbe olyan vízzel, amely 0,01 % Teepolt (kontroll) vagy 0,01 % Teepolt és 15JA1/1 diklormidot (indukált) tartalmaz. A lemezeket sötétben tartjuk 28°C hőmérsékleten 3 napon át. A koleoptil csúcsot az egyes magokról lemetsszük és 272. tápközegre helyezzük (MS sók, 4 ?□ szacharóz) egy éjszakára. A koleoptil csúcsokat (2) az egyes lemezek közepére irányítjuk , hogy a bombázásnak kitevés maximális legyen.
IV. példa
Mikrolövedékes bombázás
DuPont héliummal porlasztóit részecske-szolgáltató rendszerrel végezzük 10,/fg DNS koncentrációt alkalmazva wolframra kicsapva CaCl^-vel és spermidinnel. Az összes sejteket együtt bombázzuk az alábbi beállítást alkalmazva:
Változtatható fészek', magas
Rögzített fészek: magas
4,42 MPa repesztőtárcsa.
A bombázás után a szűrőn levő sejteket 115. tápközegre viszszük át (AT bázis; 1 g/1 mio-inozit; 0,75 mg/1 2,4-D; 700 mg/1 prolin és 2 % szacharóz), és sötétben inkubáljuk 28°C hőmérsékleten egy éjszakán át. A koleoptil csúcsokat a 272. tápközegen hagyjuk és hasonló módon inkubáljuk. 24 órával a bombázás után enzimes vizsgálatokat végzünk.
V. példa
Plazmidok
A plazmidok az alábbi, GST promotort tartalmazó plazmidokból származnak. pGST92 (pPHI511), pGST93 (pPHI1512), pGST94 (pPHI1513), és pGST95 (pPHI1514). A GUS-t tartalmazó plazmidok a pGST46 (pPHI1361), pGST96 (pPHI1515) , pGST97 (pPHI1516), pGST98 (pPHI1517) , és pGST99 (pPHI1518). A luciferázt tartalmazó plazmidok a pGST100 (pPHI1519), pGST101 (pPHI152O), pGST102 (pPHI1521), pGST1O3 (pPHI1522), és pGST104 (pPHI1655). Ezek az ábrákban bemutatott módon épülnek fel.
VI. példa
Luciferáz és GUS mérések
A GUS enzimaktivitást a bombázott szövetek citokémiai fes tésével mutatjuk ki. A bombázás után 1 nappal a vizsgálandó szövetet új lemezre visszük át és felülrétegezzük GUS citokémiai szubsztrátummal, amely az alábbiakból áll: 100 mmól/1 kálium-foszfát (pH 7,5), 5 mmól/1 kálium-ferri-cianid (Fe^+), 5 mmól/1 kálium ferro-cianid (Fe2+), 2 mmól/1 X-gluc., 1 % DMSO. A szuszpenziós sejteket 400/11 GUS szubsztrátummal rétegezzük felül. A koleoptil csúcsokat mikrotitráló lemez üregébe helyezzük és 100ytl GUS =Szubsztrátumot adunk hozzá. A szöveteket 3 7 0 C hőmérsékleten inkubáljuk 4-6 órán át. Letapogató mikroszkóp alatt megszámoljuk a kék foltokat.
A luciferáz enzimaktivitást a bombázott minták 200,/(.1 luciferáz felaprító pufferben jJOO mmól/1 kálium-foszfát (pH 7,8),
--7 mmól/1 DTIJ végzett felaprítása után határozzuk meg. A sejtüledéket mikrocentrifugában 4°C hőmérsékleten végzett centrifugálással üledékbe visszük. A luciferáz aktivitást úgy határozzuk meg, hogy egy 12 x 31 mm-es üveg luminométer küvettába beadunk
200 1 luciferáz vizsgáló puffért ^25 mmól/1 tricin (pH 7,8), mmól/1 MgCl^, 5 mmól/1 ATP, 500/tg/ml BSA (szarvasmarha szérum albumin)jés 10-20/(1 szövet-kivonatot. A küvettát behelyezzük a luminométerbe és a reakciót beindítjuk olyan módon hogy 100y4l
500yAmól/i~es luciferint (káliumsó) adunk a küvettába. A reak ciót a LED kijelzőből kapott fényegységekben olvassuk le.
VII. példa
Sejtmag-kivonatok
Diklormiddal kezelt és nem kezelt kukorica-gyökerekből ki vonatokat készítünk. Magokat ültetünk perlittel töltött csíráztató tálba (100 mag tálanként), és vízzel vagy 15 Ml/1 dikiormi- 9 dót és 0,01 Jó Teepolt tartalmazó vízzel öntözzük. A magokat csíráztatjuk és növényházi körülmények között növesztjük. Amikor a palánták mintegy 3,8 cm magasak lesznek, a tálakat átvisszük szabályozható kamrákba és ott tartjuk teljes sötétségben 2 napon át. A hőmérséklet 16 órán át 29,4°C és 8 órán át 22,2°C. A gyökereket összegyűjtjük, folyékony nitrogénben gyorsfagyasztjuk és finom porrá őröljük Waring őrlő-keverővei. A fagyasztott port 200 ml A pufferbe helyezzük ^10 mmól/1 MES(pH 6,0), 10 mmól/1 NaCl, mmól/1 EDTA, 0,15 mmól/1 spermin, 0,5 mmól/1 spermidin, 20 mmól/1 2-ME, 0,2 mmól/1 PMSF, 0,6 % triton X-100, 250 mmól/1 szacharózt.
A homogenizátumot alaposan összekeverjük és kétszer átszűrjük réteg Miracloth-on. A szűrletet 2000xg-nél centrifugáljuk Sorvall GSA rotorban 4°C hőmérsékleten, és az üledéket gyengéden újra szuszpendáljuk 20 ml A pufferban,A sejtmagokat 2000xg-nél Sorvall SS-34 rotorban végzett centrifugálásal újra üledékbe viszszük. Az üledéket gyengéden újra szuszpendáljuk 2 ml nagy sótartalmú pufferban^20 mmól/1 HEPES (pH 7,9), 25 °ó glicerin, 420 mmól/1 NaCl, 1,5 mmól/1 MgCl^, 0,2 mmól/1 EDTA, 0,5 mmól/1 PMSF, 0,5 mmól/1 DTTA sejtmagokat 4 mól/1 (NH^)^ hozzáadásával lizáljuk 0,3 mmól/1 koncentrációig. Ezt a keveréket jégre helyezzük 30 percre, időnként kevergetve. A keményítőt és a törmeléket Eppendorf mikrocentrifugában 4°C hőmérsékleten végzett 10 perces centrifugá1 ássa1 távolítjuk el. A felülúszót egy kis főzőpohárba visszük át, jégre helyezzük és egy kis keverőpálcát helyezünk bele. Szemcsés (NH^^SO^-et adunk hozzá (0,25 g/ml s e j t ma g -1 i z á t um mennyiségben) lassan és oldatba visszük. Az oldatot kevergetés mellett jégen tartjuk további 30 percen át. Az oldhatatlan fehérτ jét üledékbe visszük 10 perces, 4°C hőmérsékleten végzett centrifugálással. Az üledéket újra szuszpendáljuk 0,5 ml nagy sótartalmú pufferral, és a fehérjeoldatot egy előkészített dialízis memb- 10 ránba helyezzük, majd dializáljuk, legalább négyszer cserélve az
500 térfogat hideg dialízis puffért ^20 mmól/1 HEPES (pH 7,6), 20 °ó glicerin; 100 mmól/1 KC1; 0,2 mmól/1 EDTA; 0,5 mmól/1 OTT; 0,5 mmól/1 PMSF^ · A dialízis teljes ideje 6-8 óra. A kivonatból alikvotokat (50 ja.1 ) viszünk be mikrocentrifuga csövekbe, hirtelen lefagyaszt juk folyékony nitrogénben, és felhasználásig -80°C hőmérsékleten tároljuk. A fehérjekoncentrációt Bradford eljárásával határozzuk meg .
VIII. példa
Gél-elcsúszásos elemzés
A sejtmag-kivonatokat gél-elcsúszásos elemzésnek vetjük alá, hogy elhelyezzük a lehetséges cisz-működő szabályozó elemeket a G5TI promotor szekvenciákon belül. A GSTI promotorból spe-
2 ciális restrikciós fragmentumokat vég-jelzünk P-dXTP-vel (ez a négy radioaktívan jelzett dezoxinukleotid jelzőkeveréke), és ezt megtisztítjuk a be nem épített nukleotidoktól spun oszlopkromatográfiával. A beépülés mértékét szcintillációs számlálóval mérjük. Mintegy 20000 cpm-et alkalmazunk kötési reakcióként. A kötési reakciókeverék 10 mmól/1 trisz.HCl-ből (pH 7,6), 1 mmól/1 EDTA-ból, 1 mmól/1 DTT-ből, 1 y^g poli dI:dC-ből (nem-fajlagos versengő anyag), megfelelő mennyiségű extraktumból, hogy 2y<g sejtmag-fehérje legyen benne, 4 mmól/1 MgCl2-ből (kívánt esetben; ez ugyanis függ a speciális DNS-kötő fehérje kétértékű kation igényétől) áll, és 25y-tl teljes térfogatot képez. Speciális ver• · ·«« «4
J
I
- 1 1 sengési kísérletekben 1 /4 g nem jelzett speciális fragmentum is található a kötési reakciókeverékben. A kötési reakciókeverékeket szobahőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át, majd 6 %-os poliakrilamid gélre terheljük, trisz-glicin puffer rendszer alkalmazásával L.25 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,3), 190 mmól/1 glicin, 1 mmól/1 EDTAj. A gélt (amelyet előfuttattunk két órán át) addig futtatjuk, amíg a terhelő festékben levő brómfenolkék mintegy 2,5 cm-re fut fel a gél aljától. A gélt a berendezésből kivesszük, megszárítjuk, és felhasználjuk röntgenfilmen történő exponáláshoz egy éjszakán át, erősítő szűrő alkalmazásával -80°C hőmérsékleten. A csíkok eloszlását a filmen elemezzük, figyelemmel az elcsúszásokra a csíkok eloszlásában, amelyek a sejtmag-fehérjék kötődésének tulajdoníthatók a feltételezett, cisz-működő szabályozó szekvenciákhoz .
Az 1.-14. ábrák az alábbi plazmidok térképeit mutatják be: pGST46, pGST104, pGST103, pGST102, pGST101, pGST100, pGST99, pGST98, pGST97, pGST96, pGST95, pGST94, pGST93 és pGST92.
Az alábbiakban számítógépes szabvány formula kitöltésével jellemezzük a nevezett promotor szekvenciát; természetesen csak a rendelkezésünkre álló adatokat adjuk meg.
SZEKVENCIA ADATBÁZIS (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ (i) BEJELENTŐ (FELTALÁLÓ):
Neill John
Howard John (ii) A BEJELENTÉS CÍME: Növényi promotor szekvenciák (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 1
2 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(A) CÍMZETT: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
(B) UTCA: 700 Capital Square, 400 Locust Street (C) VÁROS: Des Moines (D) ÁLLAM: Iowa (E) ORSZÁG: AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK (F) IRÁNYíTÓSZÁM: 50309 (v) SZÁMÍTÓGÉPES OLVASÁSI FORMA:
(A) A KÖZEG TÍPUSA: Diszkett - 3,5 hüvelyk (<\z7,6 cm), 1,4
Mb tárolás (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM kompatibilis (C) MŰVELETI RENDSZER: MS-DOS (D) SZOFTVER: Microsoft WORD (vi) A JELEN BEJELENTÉS ADATAI:
(A) BEJELENTÉS SZÁMA:
(B) A BEJELENTÉS NAPJA:1991.05.01 (C) OSZTÁLYOZÁS (vii) AZ ELŐZETES BEJELENTÉS ADATAI:
(A) BEJELENTÉS SZÁMA:
(B) A BEJELENTÉS NAPJA:
(viii) INFORMÁCIÓK A SZABADALMI ÜGYV IVŐKRŐL/ÜGYNÖKÖKRŐL:
(A) NÉV: Roth Michael J.
(B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 29, 342 (C) REFERENCIA/DOSSZIÉ SZÁM: 0163 US (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:
(A) TELEFON: (515) 245-3594 (B) TELEFAX: (515) 245-3534 ί
- 13(2) INFORMÁCIÓ A SEQ.ID.NO-RÓL:
• * ♦ « · · · • · «»4 •••4 ···« · ·····♦
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 861 bázispár
(B) TÍPUS: nukleotid
(C) SZÁLTÍPUS: kettős
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
ii) MOLEKULATÍPUS: genomikus DNS
(A) LEÍRÁS:
(iü) KÖVETKEZTETETT: Nem
(iv) ANTI-SENSE (ÉRTELMETLEN): Nem
(v) FRAGMENTUM TÍPUS:
(vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: kukorica (Zea mays)
(B) TÖRZS: W22
(C) EGYEDI/IZOLÁTUM:
(D) FEJLŐDÉSI STÁDIUM:
(E) HAPLOTÍPUS:
(F) SZÖVETTÍPUS:
(G) SEJTTÍPUS:
(H) SEJTVONAL :
(I) ORGANELLUM: sejtmag
(vii) KÖZVETLEN FORRÁS
(A) KÖNYVTÁR:
(B) KLÓN:
(viii) ELHELYEZKEDÉS A GENOMBAN:
(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENS: 8 L
(B) TÉRKÉPHELY:
(Ο EGYSÉGEK :
( ix ) VONÁSOK
(A) NÉV/KULCS :
(B) ELHELYEZKEDÉS:
(C) AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS:
(D) TOVÁBBI INFORMÁCIÓ: A szekvencia magában foglal egy PstI helyet az 5’ végnél és egy Ncol helyet a 3’ végnél. Az Ncol hely magában foglal egy ATG iniciációs kodont is a transzláció beindításához. A transzkripció beindítása (vezető) a 692. nukleotid.
(x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:
(A) SZERZŐ:
(B) CÍM:
(C) FOLYÓIRAT:
(D) ÉVFOLYAM:
(E) SZÁM:
(F) OLDAL:
(G) DÁTUM:
(H) A DOKUMENTUM SZÁMA:
(I) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA:
(J) A PUBLIKÁCIÓ IDŐPONTJA:
(K) A RELEVÁNS GYÖKÖK A SEQ ID NO: ..... BÁN A ... TÓL A ....IG
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: kémiai úton indukálható, hősokk-kal indukálható, általános célú növényi gén promotor szekvencia
* ·· ···· • · · · • 9 ·♦·
- 15 SEq ID. NO. 1.
CTGCAGCCCC CTGCTCATGT GGGCCCCTCG GTGGCGCACT ACCGAGCGTA 50
ATCGCTGGCG TAATCGCGTC TCCTGATCTC TTGCGGTCTT TCCGGACAAT 100
AAAGGGGTGT TACTTGGAGG GACTAAAGAT TAGTCTCTAG. TTTTTAGTCT 150
TATTTAGTTC TTTTTTTATC AAACACTAGA ACTAAAATAT GAACTAAAAT 200
GATTTAGTCT TTAGTCCTTC ACATATGTGC TAAAATAAAC TAAACCATAT 250
TAATTCCACA TCTACCAGTT CAATTGTACT AATAGCAGAA GAATGTTAAA 300
GACTATTTTA gtcttattat GAGTCATTTA GTATATTTTT TCTATTTTTA 350
GCCTCTACAA ACAAACATGT TAGAGACTAA ATTTTAGTTC TTAGACTAAA 400
GAAACCAAAC ATGACAAAAA CGGACTCGTG TGAAAAGTAA GCAGAAGCAT 450
CTAGACGCGC GGGGGCGGTT GGGGCCTCGC TGACCATCAG AACTGACAAC 500
AGCGCTGCCG CACCTACCCC TCTCCACTAC GACTCCACAT TTTCCAACGG 550
ATTTTTATTT TTCTAAGAAA ATTAGTTTTT TTAGAAAAAT AGAAATCACT 600
TGGTTGCACT AAAAAAGCAG GCACACTCGT CACTCGGTCG CCGCGCGCCC 650
TCCCAGTTCG TCTATTAAAG GGGAACCAGT GAACCACCCG ATGCAACTTG 700
CGTAGAGAGT TGGGCGCAGA GAATAATTTC CCCTTGGTCA CTTGGTGGGC 750
TACGTTGAAC GCATCTCTCA ACCCGCGTCT CTTTCCCCAA GCAAACAAAC 800
AGGGTAGAGG GAGAGGAGAG GAGAGGAGAG GAGAGGAGAG GTTGGGTCTG 850
GGCCACCATG G
661

Claims (2)

  1. - 16 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    Növényi gén promotor azzal jellemezve, hogy a SEQ ID NO 1-ben bemutatott szekvenciával bír.
    Kifejező kazetta azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerinti promotort tartalmaz működőképesen összekapcsolva egy, növényekben kifejezhető, glutation-5-transzferáztól eltérő fehérjét kódoló génnel.
    A 2. igénypont szerinti kifejező kazetta azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje magban levő tároló fehérje.
    A 2. igénypont szerinti kifejező kazetta azzal jellemezve, Lf ehér je/ hogy a nevezettY’valamely , a glutation-5-transzferáztól eltérő enzim .
    A 2. igénypont szerinti kifejező kazetta azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje valamely transzkripciós aktivátor.
    A 2. igénypont szerinti kifejező kazetta azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje valamely lektin.
    Növényi sejt azzal jellemezve, hogy genomja tartalmaz egy
  2. 2. igénypont szerinti kifejező kazettát.
    Növény azzal jellemezve, hogy 7. igénypont szerinti sejteket tartalmaz.
    A 8. igénypont szerinti növény azzal jellemezve, hogy kétszikű növény. A 9. igénypont szerinti növény azzal jellemezve, hogy ez szó-' ja , repce, napraforgó vagy lucerna. A 8. igénypont szerinti növény azzal jellemezve, hogy egy- szikű növény. A 1 1 . igénypont szerinti növény azzal jellemezve , hogy ez ku-
    korica, búza, rozs, köles, cirok, rizs, árpa vagy zab.
    - 17 A meghatalmazott:
    Parragh Gáborié dr. szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Budapesti Nemzetközi
    Szabadalmi Iroda tagja H-1061 Budapest, Dalszínház u. 10. Telefon: 153-3733, Fax: 153-3664 • ····
    14/1 4 KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    1. ÁBRA .·>· •··· ·* ···♦
    PvuII, 1
    BglII, 98 piai, 109 EcoRI,116 SacI, 118 Kpn 1,124 Smal, 130
HU9201479A 1991-05-01 1992-04-30 Process for producing plant promoter sequences, expression cassettes comprising same and trnasformed plants HUT62660A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/694,227 US5907086A (en) 1991-05-01 1991-05-01 Plant promoter sequences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9201479D0 HU9201479D0 (en) 1992-07-28
HUT62660A true HUT62660A (en) 1993-05-28

Family

ID=24787943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201479A HUT62660A (en) 1991-05-01 1992-04-30 Process for producing plant promoter sequences, expression cassettes comprising same and trnasformed plants

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5907086A (hu)
EP (1) EP0515048A1 (hu)
JP (1) JPH05268965A (hu)
AU (1) AU651684B2 (hu)
CA (1) CA2067477A1 (hu)
HU (1) HUT62660A (hu)
NZ (1) NZ242522A (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0620281A3 (en) * 1993-03-31 1995-05-03 Mitsubishi Corp Oilseed plants producing valuable seeds with modified amino acid and fatty acid compositions.
US7148064B1 (en) * 1999-05-26 2006-12-12 National Research Council Of Canada Method for reducing phytate in canola meal using genetic manipulation involving myo-inositol 1-phospathe synthase gene
US6440674B1 (en) 2000-08-04 2002-08-27 University Of Victoria Innovation And Development Corporation Plant promoter derived from luminal binding protein gene and methods for its use
US20030100748A1 (en) * 2000-08-04 2003-05-29 University Of Victoria Innovation And Development Corporation Plant promoter derived from luminal binding protein gene and methods for its use
US7189776B2 (en) * 2001-06-12 2007-03-13 Akzo Nobel N.V. Aqueous composition
KR20060013369A (ko) 2003-03-28 2006-02-09 독립행정법인농업생물자원연구소 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산방법 및 신규 재조합 단백질
US7485461B2 (en) * 2005-03-16 2009-02-03 Athenix Corporation Cis-acting regulatory elements from Tripsacum dactyloides
CA2681661C (en) * 2007-03-23 2015-11-24 New York University Methods of increasing nitrogen-assimilation capacity in transgenic plants expressing cca1 and glk1
BRPI0909285B1 (pt) 2008-03-31 2020-01-28 Ceres Inc ácido nucleico, construção de vetor, método de condução de transcrição, método de expressão de uma região de codificação exógena em uma planta, método de alteração da expressão de um gene em uma planta, método de produção de uma planta transgênica
US8293101B2 (en) 2009-03-13 2012-10-23 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4885357A (en) * 1985-06-12 1989-12-05 Lubrizol Genetics Inc. Modified zein proteins containing lysine
GB8901677D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
EP0332104A3 (en) * 1988-03-08 1991-03-20 Ciba-Geigy Ag Chemically regulatable dna sequences and genes and uses thereof
EP0416032A4 (en) * 1988-05-20 1992-11-25 The Salk Institute Biotechnology Industrial Associates, Inc. Agrichemical screens
FR2633547A1 (fr) * 1988-06-30 1990-01-05 Rhone Poulenc Films Procede de microperforation de pellicules thermoplastiques par ultrasons
GB2225970A (en) * 1988-07-04 1990-06-20 Collins Motor Corp Ltd Low pressure casting of metal
GB8901673D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Gene switch
EP0388186A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company External regulation of gene expression
CA2042447C (en) * 1990-06-12 1999-09-28 Marc C. Albertsen Control of microsporogenesis by externally inducible promoter sequences
JP5790403B2 (ja) 2010-12-07 2015-10-07 株式会社リコー エレクトロクロミック表示装置

Also Published As

Publication number Publication date
AU1595692A (en) 1992-11-05
US5907086A (en) 1999-05-25
HU9201479D0 (en) 1992-07-28
EP0515048A1 (en) 1992-11-25
AU651684B2 (en) 1994-07-28
JPH05268965A (ja) 1993-10-19
NZ242522A (en) 1994-04-27
CA2067477A1 (en) 1992-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Alfenito et al. Functional complementation of anthocyanin sequestration in the vacuole by widely divergent glutathione S-transferases
Hudson et al. The FHY3 and FAR1 genes encode transposase‐related proteins involved in regulation of gene expression by the phytochrome A‐signaling pathway
Shen et al. ANKYRIN REPEAT-CONTAINING PROTEIN 2A is an essential molecular chaperone for peroxisomal membrane-bound ASCORBATE PEROXIDASE3 in Arabidopsis
Bernhardt et al. CUL4 associates with DDB1 and DET1 and its downregulation affects diverse aspects of development in Arabidopsis thaliana
Rogg et al. A gain-of-function mutation in IAA28 suppresses lateral root development
Reichheld et al. The multigenic family of thioredoxin h in Arabidopsis thaliana: specific expression and stress response
Reddy et al. KIC, a novel Ca2+ binding protein with one EF-hand motif, interacts with a microtubule motor protein and regulates trichome morphogenesis
Vlachonasios et al. Disruption mutations of ADA2b and GCN5 transcriptional adaptor genes dramatically affect Arabidopsis growth, development, and gene expression
Castellano et al. Expression and stability of Arabidopsis CDC6 are associated with endoreplication
Sugimoto et al. MYB-related transcription factor NtMYB2 induced by wounding and elicitors is a regulator of the tobacco retrotransposon Tto1 and defense-related genes
Wehmeyer et al. The expression of small heat shock proteins in seeds responds to discrete developmental signals and suggests a general protective role in desiccation tolerance
Guyer et al. Activation of latent transgenes in Arabidopsis using a hybrid transcription factor
Wang et al. ZmERF21 directly regulates hormone signaling and stress‐responsive gene expression to influence drought tolerance in maize seedlings
Wu et al. Repression of gene expression by Arabidopsis HD2 histone deacetylases
Freeman et al. Temporal and spatial control of transgene expression using a heat‐inducible promoter in transgenic wheat
Sunderland et al. An evolutionarily conserved translation initiation mechanism regulates nuclear or mitochondrial targeting of DNA ligase 1 in Arabidopsis thaliana
Sidorenko et al. Complex structure of a maize Myb gene promoter: functional analysis in transgenic plants
Kang et al. Hypersensitive to red and blue 1, a ZZ-type zinc finger protein, regulates phytochrome B–Mediated red and cryptochrome-mediated blue light responses
HUT62660A (en) Process for producing plant promoter sequences, expression cassettes comprising same and trnasformed plants
Foster et al. An Arabidopsis mutant with deregulated ABA gene expression: implications for negative regulator function
Thakur et al. A POLYCOMB group gene of rice (Oryza sativa L. subspecies indica), OsiEZ1, codes for a nuclear-localized protein expressed preferentially in young seedlings and during reproductive development
Singer et al. A gypsy-like sequence from Arabidopsis thaliana exhibits enhancer-blocking activity in transgenic plants
De Veylder et al. Increased leakiness of the tetracycline‐inducible Triple‐Op promoter in dividing cells renders it unsuitable for high inducible levels of a dominant negative CDC2aAt gene
EP0938572B1 (en) Promoter from tobacco
WO1998051806A2 (en) Recovery of transformed plants without selectable markers by nodal culture and enrichment of transgenic sectors

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary prot. due to refusal