ES2321821T3 - Promotores inducibles para la expresion de proteinas en plantas y metodos para detectarlos. - Google Patents
Promotores inducibles para la expresion de proteinas en plantas y metodos para detectarlos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2321821T3 ES2321821T3 ES03017114T ES03017114T ES2321821T3 ES 2321821 T3 ES2321821 T3 ES 2321821T3 ES 03017114 T ES03017114 T ES 03017114T ES 03017114 T ES03017114 T ES 03017114T ES 2321821 T3 ES2321821 T3 ES 2321821T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acid
- baselineskip
- plants
- plant
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 23
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 39
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 21
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- TWBYWOBDOCUKOW-UHFFFAOYSA-N isonicotinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=NC=C1 TWBYWOBDOCUKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 claims description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 66
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 9
- 101100187132 Arabidopsis thaliana NIMIN-1 gene Proteins 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 6
- 108700000707 bcl-2-Associated X Proteins 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 102000055102 bcl-2-Associated X Human genes 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N acibenzolar-S-methyl Chemical compound CSC(=O)C1=CC=CC2=C1SN=N2 UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101150060815 NIMIN-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150026414 NIMIN-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 101150024147 bax gene Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100187134 Arabidopsis thaliana NIMIN-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000742121 Arabidopsis thaliana Pathogenesis-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039339 Atrial natriuretic peptide receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000742139 Cucumis melo Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000961044 Homo sapiens Atrial natriuretic peptide receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 101710096342 Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
- C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
Abstract
Un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 que es ligada de forma operable a un transgen.
Description
Promotores inducibles para la expresión de
proteínas en plantas y métodos para detectarlos.
La presente invención se refiere a un ácido
nucleico que contiene secuencias reguladoras inducibles, en
particular promotores, para una expresión controlada de productos
de expresión deseados en organismos huéspedes de expresión
adecuados tales como las plantas transgénicas. Además, la presente
invención se refiere a un método para detectar la actividad de una
secuencia reguladora en células adecuadas, en las cuales un transgen
comprende una secuencia reguladora potencial ligada de forma
operable al gen Bax o un derivado funcional del mismo y la expresión
de Bax está en correlación con la actividad de la secuencia
reguladora en dichas células.
Con referencia a las aplicaciones industriales y
médicas (por ejemplo, enzimas para usos técnicos, anticuerpos
terapéuticos o de diagnóstico, vacunas), la expresión de las
proteínas en las plantas transgénicas es cada vez más interesante
para las compañías farmacéuticas y químicas. Los motivos más
importantes son la seguridad y los costes. Tradicionalmente, las
proteínas valiosas para aplicaciones farmacéuticas (hormonas,
anticuerpos, etc.) se producen en células cultivadas de animales.
Como la mayoría de los medios de cultivo contienen un 10% o más de
suero de ternera fetal (FCS), existe siempre un riesgo de
contaminación con agentes causales de la BSE. Además, los cultivos
de tejidos animales se pueden contaminar con virus que se pueden
transmitir a los humanos. Adicionalmente, debido al FCS y otros
aditivos, los medios de cultivo son a menudo muy caros. Los costes
adicionales proceden de la gran energía necesaria para el control de
temperaturas de grandes entidades de cultivo. Esto se comprueba
también para la producción de proteínas recombinantes en los
microorganismos.
El cultivo de plantas es barato debido a que se
necesitan solamente luz solar, agua y algunos productos nutritivos
para respaldar el crecimiento de las plantas. Además, las plantas se
pueden cultivar en campos en una cantidad casi ilimitada. Por lo
tanto, no existen problemas de ampliación. Sin embargo, un requisito
esencial para la producción con éxito de una proteína heteróloga en
un organismo transgénico es la combinación del transgen respectivo
con elementos reguladores fuertes y fiables, los promotores. Los
promotores conducen a una síntesis eficaz del mARN transgénico, que
se traslada luego a la proteína.
Además, la WO 95/19443 describe el aislamiento,
clonación e identificación de nuevos clones de cADN que codifican
para las proteínas relacionadas con la patogénesis.
Para la producción de proteínas recombinantes en
plantas transgénicas, se utiliza principalmente el ARN 35S
(Pietrzak y col., (1987) Nucleic Acids Res. 14:5857). El promotor
35S se aisló en un principio del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV) y esto llevó a una alta síntesis constitutiva de una
transcripción de los genes deseados. Otros promotores, que son
menos frecuentes en su uso son el promotor de ARN 19S procedente de
CaMV (Paszkowski y col., (1985) Mol. Gen. Genet. 199:178) y el
promotor procedente del gen nopalina sinteasa del Agrobacterium
tumefaciens (An y col., (1984) EMBO J. 4:277).
Todos estos promotores son activos durante toda
la vida de una planta y por lo tanto la proteína recombinante se
sintetiza todo el tiempo. Si estas proteínas se acumulan
continuamente durante el desarrollo de la planta, se pueden
degradar o modificar y en consecuencia pierden su actividad
biológica. En la mayoría de los casos, la proteína expresada es
nociva o incluso letal para la planta en particular. Esto puede
representar un obstáculo mayor en el establecimiento de plantas
transgénicas con altos niveles de expresión. En este caso, no es
posible obtener planta transgénica alguna, o solamente plantas que
muestran niveles muy bajos de expresión proteica.
Por lo tanto, sería muy deseable poseer un
promotor que pueda conectarse específicamente en cualquier momento
del desarrollo de la planta mediante el tratamiento de la planta con
productos químicos. Las plantas transgénicas podrían crecer hasta
un tamaño apropiado y luego la expresión de la proteína recombinante
se podría inducir a un alto nivel durante un corto tiempo. De esta
forma se podrían evitar problemas como la degradación de la
proteína o la muerte de las plantas por la proteína heteróloga.
Los promotores vegetales más destacados que
pueden ser inducidos por productos químicos son los promotores de
genes que codifican proteínas relacionadas con la patogénesis (PR).
Los genes de PR son inducidos durante la reacción de defensa en la
planta contra los patógenos. Se desconectan la mayor parte del
tiempo durante el desarrollo de la planta y pueden ser inducidos
por el ácido salicílico de las hormonas vegetales. El mayor
problema con estos promotores proviene del hecho de que son
inducidos también por un estímulo del desarrollo poco tiempo antes
de la floración de las plantas (Grüner and Pfitzner (1994) Eur. J.
Biochem. 220:247). Por lo tanto, resulta muy difícil obtener
semillas de plantas que expresan proteínas que son nocivas para
determinado organismo.
Además, para la producción de proteínas en
plantas transgénicas, es necesario conocer en qué partes de las
plantas las regiones reguladoras, en particular los promotores, de
los transgenes son activas e inducibles, respectivamente. Con el
fin de analizar las regiones reguladoras en plantas vivas, es
necesario expresar genes reporteros bajo el control de estas
regiones reguladoras. Actualmente, se utilizan en plantas los genes
reporteros GUS (\beta-Glucoronidasa), Luc
(luciferasa) y GFP (proteína fluorescente verde). Sin embargo, estos
genes reporteros no son muy sensibles y el análisis de todas las
plantas durante toda su vida no es posible. Además, por contraste
con las células animales, las células vegetales poseen una pared
celular rígida. Por lo tanto, la aplicación del substrato para los
genes reporteros GUS y Luc es difícil,
defectuosa, lleva mucho tiempo y es cara. Además, el uso de GFP en plantas es difícil debido a su autofluorescencia.
defectuosa, lleva mucho tiempo y es cara. Además, el uso de GFP en plantas es difícil debido a su autofluorescencia.
Actualmente, no se dispone de ningún gen
reportero para detectar de forma sensible, fácil y durante toda la
vida de una planta la actividad de las regiones reguladoras.
Así, el problema técnico subyacente en la
presente invención consiste en proporcionar secuencias reguladoras,
en particular para plantas, que puedan ser conectas selectivamente
por productos químicos añadidos externamente induciendo por este
medio la expresión de transgenes, caracterizada porque las
secuencias reguladoras no deberían ser conectadas durante el
desarrollo normal por ejemplo de la planta. Otro objeto de la
presente invención consiste en proporcionar un método para detectar
la actividad de una secuencia reguladora en plantas o partes de las
mismas, caracterizada porque la actividad reguladora es fácilmente
detectable durante toda la vida de la planta.
La solución de los problemas técnicos anteriores
es conseguida por las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
En particular, la presente invención se refiere
a un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos, SEQ
ID NO:1 que está ligada de forma operable a un transgen.
La secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO:1,
comprende una secuencia reguladora, en particular una secuencia
promotora. El término "secuencia reguladora" incluye una
secuencia de nucleótidos que contiene elementos necesarios para la
expresión/transcripción de un producto deseado. La secuencia
reguladora puede ser un elemento regulador que no exprese
constitutivamente, por ejemplo un gen, pero que sea inducible
selectivamente por productos químicos lo que resulta en una
expresión, por ejemplo de un gen, a su inducción. La expresión
"expresión no constitutiva" significa que la secuencia
reguladora tal como una secuencia promotora preferentemente es
totalmente inactiva antes de cualquier medida que resulte en una
inducción de la misma. En una realización preferente de la presente
invención, la primera secuencia de nucleótidos es un promotor
vegetal inducible.
En una realización preferente de la presente
invención, los productos químicos están seleccionados a partir del
grupo que se compone de compuestos orgánicos. Los productos químicos
especialmente están seleccionados a partir del grupo que incluye
compuestos fenólicos, tiamina, ácido benzoico, ácido isonicotínico
(INA), y los derivados de los mismos. Los compuestos fenólicos son
por ejemplo, ácido salicílico o los derivados estructural o
funcionalmente relacionados de los mismos.
El ácido nucleico definido anteriormente, SEQ ID
NO:1, está ligado de forma operable a una segunda secuencia de
nucleótidos que comprende una secuencia deseada (aquí denominada
también "transgen") que ha de expresarse como un gen
funcional. No existe ninguna limitación particular de la secuencia
que ha de expresarse, y a su expresión en un organismo huésped
adecuado, la secuencia resulta, por ejemplo en un polipéptido, una
proteína o una molécula de ARN.
El término "ligado de forma operable"
significa que la primera y la segunda secuencias de nucleótidos
están conectadas entre sí de modo tal que la primera secuencia de
nucleótidos controle la transcripción de la segunda secuencia de
nucleótidos.
La presente invención se refiere asimismo a
vectores que comprenden el ácido nucleico definido anteriormente,
de acuerdo con la invención. Los ejemplos de vectores son pBin19,
pGC4-00, pUC18/19, pBluescript.
La presente invención se refiere también a un
organismo huésped que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la
invención o el vector de acuerdo con la invención. El organismo
huésped es por ejemplo un organismo procariótico tal como E.
coli o Agrobacterium tumefaciens, o un organismo
eucariótico tal como una célula vegetal (incluida una planta
transgénica). El ácido nucleico de acuerdo con la presente
invención, puede estar incluido también en un virus o viroide
adecuado para la preparación de un organismo transgénico tal como
una planta transgénica.
Además, la presente invención se refiere al uso
del ácido nucleico definido anteriormente para la preparación de
una planta transgénica cuyo transgen es inducible selectivamente por
productos químicos añadidos exógenamente. La expresión "productos
químicos añadidos exógenamente" incluye productos químicos que no
son producidos por la planta misma (o producidos solamente en
cantidades que no causan sustancialmente inducción de la secuencia
reguladora definida anteriormente), y productos químicos que son
producidos por la planta en algún momento durante su vida. El
término "inducible selectivamente" significa que la expresión
del transgen es inducida sustancialmente ("conectada") sólo
mediante la adición de productos químicos específicos.
La presente invención se refiere además a una
planta transgénica tal como una planta de tabaco, planta de tomate
o planta de patata que comprende la secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la presente invención con el propósito de una expresión
regulada de cualquier transgen homólogo o heterólogo. El término
"planta transgénica" incluye toda la planta como tal y partes
de la misma, tal como raíz, tallo, hoja, células o tejido
específico del órgano, la materia reproductora de la misma,
especialmente las semillas y plantas de semillero de la misma. El
término "transgen heterólogo" significa un gen que deriva de
una fuente distinta del tipo salvaje de la planta transgénica. El
término "transgen homólogo" significa un gen que deriva del
tipo salvaje de la planta transgénica. En una realización de la
presente invención, la planta transgénica contiene el ácido
nucleico de la invención definido anteriormente integrado de forma
estable en el material genético. Alternativamente, la planta
transgénica expresa transitoriamente la secuencia deseada contenida
en el ácido nucleico definido anteriormente.
En una realización preferente de la presente
invención, la expresión del transgen definido anteriormente es
inducida después del tratamiento con productos químicos de la planta
transgénica.
Sorprendentemente, el ácido nucleico de acuerdo
con la presente invención es capaz de inducir selectivamente la
expresión de una secuencia deseada ("transgen") por ejemplo en
plantas transgénicas después de su tratamiento con ciertos
productos químicos. En consecuencia, es posible cultivar las plantas
transgénicas hasta una tamaño suficiente para obtener suficiente
material vegetal, y luego inducir la expresión de un transgen que
resulta en el producto deseado tal como, por ejemplo, un
polipéptido, una proteína o una molécula de ARN.
El ácido nucleico de acuerdo con la presente
invención y el vector de acuerdo con la presente invención se
pueden preparar por medio de métodos de la técnica anterior. Esto
incluye también los métodos para cultivar células huésped adecuadas
y recuperar dichos ácidos nucleicos o dichos vectores de dichas
células huésped y/o del medio de cultivo.
Las figuras muestran:
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
del promotor NIMIN-1 (SEQ ID NO:1).
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos
del promotor NIMIN-2 (SEQ ID NO:2).
La Figura 3 muestra un diagrama de barras que
compara la actividad GUS (beta-glucoronidasa) de las
construcciones de fusión PR1a-GUS
(321-9) y NIMIN2-GUS
(322-7) en plantas transgénicas después de la
inducción con ácido salicílico (SA) o Bion, caracterizado porque la
actividad GUS de las construcciones de fusión tratadas con agua en
plantas transgénicas se utiliza como control de fondo.
La Figura 4 muestra un diagrama de barras que
pone en correlación la cantidad de SA utilizada para el tratamiento
de la planta con la actividad GUS en dos plantas transgénicas
NIMIN2-GUS independientes (322-1 y
322-7) después de la inducción con ácido salicílico
(SA), caracterizado porque la actividad GUS de las construcciones de
fusión tratadas con agua en plantas transgénicas se utiliza como
control de fondo.
La Figura 5 muestra un Western Blot que pone en
correlación la cantidad de SA utilizada para el tratamiento de la
planta con la expresión de las proteínas PR-1
endógenas en la planta transgénica 322-2 tal como se
describe en la Fig. 4, y que se utiliza como control positivo.
La Figura 6 muestra la expresión espontánea del
gen Bax bajo el control del promotor PR-1a (A) en
hojas y (B) en el tallo de plantas transgénicas de tabaco.
La Figura 7 muestra plantas que contienen el gen
humano Bax bajo el control del promotor PR-1a (A),
el promotor NIMIN-2 (B) o el promotor
NIMIN-1 (C y D).
Ahora se ilustra además la presente invención en
los siguientes ejemplos, sin que se limite a los mismos.
Los cADN para las proteínas NIMIN,
NIMIN-1, NIMIN-2 y
NIMIN-3 han sido aislados como nuevas proteínas
interactuantes con la proteína reguladora NPR1 en Arabidopsis
thaliana (Weigel y col., (2001) Plant Mol. Biol. 46:143). Se
demostró que los mARN para las proteínas NIMIN-1 y
NIMIN-2 eran inducibles por el ácido salicílico y
Bion, sustancia que puede sustituir el ácido salicílico en algunas
de sus funciones (Weigel y col., (2001) Plant Mol. Biol. 46:143).
Para identificar los elementos reguladores responsables de esta
inducción, los elementos promotores se amplificaron mediante PCR de
ADN genómico de Arabidopsis thaliana utilizando los
iniciadores N1-P1 (SEQ ID NO:3) y
N1-P2 (SEQ ID NO:4) para NIMIN-1 y
N2-P1 (SEQ ID NO:5) y N2-P2 (SEQ ID
NO:6) para NIMIN-2 (N1-P1:
5'-CCAAGCTTGTCTCATGAATTCGTGGTATAGCG-3';
N1-P2:
5'-CCGGATCCTTAGA
GAAAGTGATTGATTTTGG-3'; N2-P1: 5'-CCCCACGTTAACGATGATCAC-3'; N2-P2: 5'-CTGGATCCCGTCG
TTTAAGCTTAGTCAA-3'). Se analizaron los fragmentos respectivos de PCR sobre un gel de agarosa y se produjeron los tamaños esperados (1,1 kb para NIMIN-1 y 1,2 kb para NIMIN-2). Se cortaron los fragmentos con las enzimas de restricción HindIII y BamHI (elemento del promotor NIMIN-1) o BgIII y BamHI (elementos del promotor NIMIN-2) y se ligaron en el vector de clonación pUC19. Se secuenciaron los clones resultantes y se muestra la secuencia de nucleótidos en la Figura 1 (NIMIN-1) y Figura 2 (NIMIN-2).
GAAAGTGATTGATTTTGG-3'; N2-P1: 5'-CCCCACGTTAACGATGATCAC-3'; N2-P2: 5'-CTGGATCCCGTCG
TTTAAGCTTAGTCAA-3'). Se analizaron los fragmentos respectivos de PCR sobre un gel de agarosa y se produjeron los tamaños esperados (1,1 kb para NIMIN-1 y 1,2 kb para NIMIN-2). Se cortaron los fragmentos con las enzimas de restricción HindIII y BamHI (elemento del promotor NIMIN-1) o BgIII y BamHI (elementos del promotor NIMIN-2) y se ligaron en el vector de clonación pUC19. Se secuenciaron los clones resultantes y se muestra la secuencia de nucleótidos en la Figura 1 (NIMIN-1) y Figura 2 (NIMIN-2).
Los fragmentos de ADN que contenían las
secuencias respectivas de los promotores se extirparon de los
subclones pUC19 y se ligaron en pUC/0-GUS (Beilmann
y col., (1991) Eur. J. Biochem. 196:415). Los productos de ligación
resultantes se analizaron mediante una digestión con enzimas de
restricción con EcoRI (NIMIN1-GUS) o XbaI y EcoRi
(NIMIN2-GUS). La banda de 3,2 kb, que representa la
fusión con el promotor-gen reportero se extirpó de
un gel de agarosa y se ligó en el vector pBin19 de
Agrobacterium, produciendo pBin19/N1-GUS y
pBin19/N2-GUS. Los plásmidos se trasladaron de
E. coli a Agrobacterium tumefaciens a través del
acoplamiento triparental.
Se utilizaron las coloraciones resultantes de
Agrobacteria para generar plantas transgénicas que contenían
las construcciones con genes reporteros.
Para caracterizar la influencia de los productos
químicos sobre la actividad de los promotores NIMIN, se perforaron
discos de hojas procedentes de las líneas transgénicas
NIMIN1-GUS y NIMIN2-GUS. Como
control, se utilizaron fusiones con el promotor
PR-1a. Se dejaron flotar los discos de hojas sobre 1
mM de SA, 140 mg/l de Bion (análogo funcional del ácido salicílico)
o agua. Después de 3 días, se prepararon extractos proteicos y se
sometió a ensayo la actividad del gen reportero GUS en los
extractos. Las actividades resultantes del gen reportero eran 5
veces más altas en las fusiones con el promotor
NIMIN-2 que en las fusiones con el promotor
PR-1a (véase la Figura 3). Además, los discos de
hojas procedentes de las líneas transgénicas
NIMIN1-GUS y NIMIN2-GUS se
incubaron con distintas concentraciones de ácido salicílico. La
actividad de los promotores NIMIN depende de la concentración de
ácido salicílico (véase las Figuras 4 y 5).
El vector pUC19/His(Bax) fue digerido con
las enzimas de restricción SacI y BgIII. El fragmento de ADN
resultante que contenía el gen alfa Bax humano respectivo con una
etiqueta N-terminal 6x His fue ligado en el vector
binario pBin19/PR1a-GUS (Beilmann y col., (1992)
Plant Mol. Biol. 18:65), en el cual se extirpó antes el GUS con las
enzimas de restricción SacI y BamHI. El producto de la ligación se
transformó en E. coli DH5\alpha, y las colonias
resultantes se analizaron mediante la digestión con enzimas de
digestión con EcoRI e HindIII así como PCR, produciendo el vector
pBin19/PR1a-Bax. El plásmido se trasladó de E.
coli a Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediante
electroporación. Se utilizó la cepa resultante de
Agrobacterium para generar plantas transgénicas de tabaco
(Nicotiana tabacum var. Samsun NN/nn) que contenían la
construcción con el gen reportero.
La característica más importante de un promotor
inducible no sólo es la inducibilidad por sustancias exógenas sino
también que el promotor se desconecta en condiciones normales. Para
investigar si los promotores NIMIN cumplen con estos requisitos, se
generaron plantas transgénicas de tabaco con fusiones con
Bax-promotor NIMIN tal como se describe
anteriormente. Bax es letal para cualquier célula. Por lo tanto,
toda falta de ajuste del promotor NIMIN conduciría a zonas
necróticas en las plantas. Se cultivaron las plantas en el
invernadero y se comprobó su fenotipo.
Aunque el uso del promotor PR-1a
resultó en mayores regiones necróticas más tarde en el desarrollo de
las plantas (véase la Figura 6 y la Figura 7), no se observaron
zonas necróticas en las plantas con NIMIN2-Bax y
sólo lesiones menores en las hojas inferiores de las plantas con
NIMIN1-Bax (véase la Figura
7B-D).
<110> Universität Hohenheim
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Promotores inducibles para la
expresión de proteínas en plantas y método para detectarlas.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> H 2269
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión patentIn 3.1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1033
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1226
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador N1-P1
para la amplificación del gen NIMIN-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagcttgt ctcatgaatt cgtggtatag cg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador N1-P2
para la amplificación del gen NIMIN-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggatcctt agagaaagtg attgattttg g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador N2-P1
para la amplificación del gen NIMIN-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccacgtta acgatgatca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador N2-P2
para la amplificación del gen NIMIN-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggatcccg tcgtttaagc ttagtcaa
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Un ácido nucleico que contiene la secuencia
de nucleótidos SEQ ID NO:1 que es ligada de forma operable a un
transgen.
2. El ácido nucleico según la reivindicación 1,
caracterizado porque la secuencia de nucleótidos es una
secuencia reguladora.
3. El ácido nucleico según la reivindicación 2,
caracterizado porque la secuencia reguladora es una secuencia
promotora selectivamente inducible por productos químicos.
4. El ácido nucleico según la reivindicación 3,
caracterizado porque los productos químicos están
seleccionados a partir del grupo que incluye compuestos
orgánicos.
5. El ácido nucleico según la reivindicación 4,
caracterizado porque los compuestos orgánicos están
seleccionados a partir del grupo que incluye compuestos fenólicos,
tiamina, ácido benzoico, ácido isonicotínico (INA) y los derivados
de los mismos.
6. El ácido nucleico según la reivindicación 5,
caracterizado porque el compuesto fenólico es ácido
salicílico o un derivado estructural o funcional del mismo.
7. Un vector que contiene el ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un organismo huésped no humano que contiene
el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o
el vector según la reivindicación 7.
9. El organismo huésped según la reivindicación
8, que está seleccionado a partir del grupo compuesto de una célula
bacteriana o de una célula vegetal.
10. Una planta transgénica que contiene al menos
el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6.
11. La planta transgénica según la
reivindicación 10, caracterizada porque el ácido nucleico se
integra de forma estable en el material genético.
12. La planta transgénica según la
reivindicación 10 u 11, caracterizada porque el transgen se
expresa transitoriamente.
13. La planta transgénica según cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque la
expresión del transgen se induce selectivamente a su tratamiento
con productos químicos.
14. La planta transgénica según la
reivindicación 13, caracterizada porque los productos
químicos están seleccionados a partir del grupo que incluye
compuesto orgánicos tal como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03017114A EP1502953B1 (en) | 2003-07-28 | 2003-07-28 | Chemically-inducible promoters for the expression of proteins in plants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2321821T3 true ES2321821T3 (es) | 2009-06-12 |
Family
ID=33522296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03017114T Expired - Lifetime ES2321821T3 (es) | 2003-07-28 | 2003-07-28 | Promotores inducibles para la expresion de proteinas en plantas y metodos para detectarlos. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060242728A1 (es) |
| EP (2) | EP2065469B1 (es) |
| AT (1) | ATE421995T1 (es) |
| DE (2) | DE60326038D1 (es) |
| ES (1) | ES2321821T3 (es) |
| WO (1) | WO2005014829A2 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7553234B2 (en) | 1995-11-22 | 2009-06-30 | Walker Digital, Llc | Method and apparatus for outputting a result of a game via a container |
| CN1954075B (zh) * | 2004-03-12 | 2012-09-05 | 辛根塔参与股份公司 | 可诱导启动子 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5614395A (en) * | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
| AU708850B2 (en) * | 1996-07-23 | 1999-08-12 | Novartis Ag | Chemically-inducible arabidopsis PR-1 promoter |
| US6706952B1 (en) * | 1999-12-15 | 2004-03-16 | Syngenta Participations Ag | Arabidopsis gene encoding a protein involved in the regulation of SAR gene expression in plants |
| US7199286B2 (en) * | 1999-12-15 | 2007-04-03 | Syngenta Participations Ag | Plant-derived novel pathogen and SAR-induction chemical induced promoters, and fragments thereof |
-
2003
- 2003-07-28 EP EP09000864A patent/EP2065469B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-07-28 DE DE60326038T patent/DE60326038D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-28 AT AT03017114T patent/ATE421995T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-07-28 DE DE60334340T patent/DE60334340D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-28 EP EP03017114A patent/EP1502953B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-28 ES ES03017114T patent/ES2321821T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-07-27 WO PCT/EP2004/008405 patent/WO2005014829A2/en active Application Filing
- 2004-07-27 US US10/566,201 patent/US20060242728A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2065469B1 (en) | 2010-09-22 |
| ATE421995T1 (de) | 2009-02-15 |
| US20060242728A1 (en) | 2006-10-26 |
| EP1502953A1 (en) | 2005-02-02 |
| EP2065469A3 (en) | 2009-06-10 |
| DE60326038D1 (de) | 2009-03-19 |
| EP1502953B1 (en) | 2009-01-28 |
| WO2005014829A2 (en) | 2005-02-17 |
| WO2005014829A3 (en) | 2005-05-12 |
| DE60334340D1 (de) | 2010-11-04 |
| EP2065469A2 (en) | 2009-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | A late embryogenesis abundant protein HVA 1 regulated by an inducible promoter enhances root growth and abiotic stress tolerance in rice without yield penalty | |
| Jang et al. | Expression and promoter analysis of the TaLTP1 gene induced by drought and salt stress in wheat (Triticum aestivum L.) | |
| Shen et al. | Populus euphratica HSF binds the promoter of WRKY1 to enhance salt tolerance | |
| Rerksiri et al. | Expression and promoter analysis of six heat stress-inducible genes in rice | |
| Zhang et al. | Molecular cloning and functional characterization of the dehydrin (IpDHN) gene from Ipomoea pes-caprae | |
| US20070174937A1 (en) | Plant having tolerance to environmental stress | |
| JP5343460B2 (ja) | 植物の開花時期制御方法 | |
| Koyama et al. | Promoter of Arabidopsis thaliana phosphate transporter gene drives root-specific expression of transgene in rice | |
| PT917583E (pt) | Sequencia promotora de milho para a expressao de genes de uma forma preferivel nas folhas e nos caules | |
| CN103695438A (zh) | 拟南芥MYB家族转录因子AtMYB17基因、编码序列及其应用 | |
| Park et al. | ATHB17 is a positive regulator of abscisic acid response during early seedling growth | |
| KR100781059B1 (ko) | 환경스트레스에 의해 활성화되는 유도성 프로모터 및 상기프로모터를 이용하여 공변세포에 특이적으로 목적단백질을생산하는 형질전환 식물을 얻는 방법 | |
| ES2321821T3 (es) | Promotores inducibles para la expresion de proteinas en plantas y metodos para detectarlos. | |
| CN102449154B (zh) | 植物中用于胁迫耐性的方法和组合物 | |
| JPH05268965A (ja) | 植物プロモーター配列 | |
| Kitajima et al. | Constitutive expression of the neutral PR-5 (OLP, PR-5d) gene in roots and cultured cells of tobacco is mediated by ethylene-responsive cis-element AGCCGCC sequences | |
| KR20200063569A (ko) | 고온 내성 관련 유전자 및 이의 용도 | |
| Khan et al. | Responses of rose RhACS1 and RhACS2 promoters to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis thaliana | |
| Gong et al. | Molecular characterization of a Phi-class mustard (Brassica juncea) glutathione S-transferase gene in Arabidopsis thaliana by 5′-deletion analysis of its promoter | |
| KR100859988B1 (ko) | 지상부 특이적 프로모터 및 이를 이용한 목적 단백질의지상부 특이적 발현 방법 | |
| KR101700102B1 (ko) | 감귤 유래의 ＣｕＣＲＴＩＳＯ 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR101687106B1 (ko) | 감귤 유래 CuCRTISO-like 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 | |
| KR101594977B1 (ko) | 전신 발현 프로모터 Ｂｒ１５ | |
| Yi et al. | Combinatorial interactions of two cis-acting elements, AT-rich regions and HSEs, in the expression of tomato Lehsp23. 8 upon heat and non-heat stresses | |
| Tuteja | A method to confer salinity stress tolerance to plants by helicase overexpression |