PT917583E - Sequencia promotora de milho para a expressao de genes de uma forma preferivel nas folhas e nos caules - Google Patents

Description

Descrição “Sequência promotora de milho para a expressão de genes de uma forma preferível nas folhas e nos caules”

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito genericamente a mecanismos de expressão de genes em plantas e mais especificamente diz respeito à regulação da expressão de genes em plantas de uma forma “preferível num tecido”. A regulação da expressão é conseguida utilizando um promotor capaz de comandar a expressão de genes em determinados tecidos de uma planta. Em última instância, o referido promotor irá ser utilizado para comandar a expressão de genes que confiram a uma planta uma vantagem selectiva.

Descrição da Técnica Congénere

Foram já descritos os elementos de regulação transcricional que comandam nas plantas a expressão de genes “gerais dos tecidos” ou “constitutivos”. Como exemplos refere-se os promotores do gene da nopalalina-sintase de Agrobacterium (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1982; 1(6):561-73) e o gene da ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 1992 Feb, 18(4):675-89). Estes promotores foram já perfeitamente caracterizados e são utilizados para comandar a expressão de genes em plantas trangénicas [v.g., CaMV35S(Odell et al., Nature 1985 Feb 28-Mar, 313(6005):810-2)]. Há um interesse cada vez maior em efectuar a co-transformação de plantas com unidades múltiplas de transcrição das plantas e há também um interesse cada vez maior na resolução de diversos problemas potenciais associados a esta técnica. As questões associadas à utilização de sequências regulativas vulgares para comandar a expressão de genes múltiplos incluem, mas não de forma limitativa: a) a recombinação resultante do emparelhamento ao longo de regiões homologas, transposições e perda da região interveniente quer antes da integração (no caso de um plasmídeo) quer depois da integração; b) laços fechados originados por duas cópias da sequência com orientação oposta e adjacentes entre si, mais uma vez com possibilidades de excisão e perda das regiões regulativas; c) competição entre cópias diferentes da mesma região promotora para efeitos de ligação de factores de transcrição específicos do promotor ou de outras proteínas de ligação do ADN regulativo; d) a potência relativas de expressão de diferentes promotores quer na mesma espécie quer entre espécies, em que um promotor pode proporcionar níveis óptimos de expressão para um gene num determinado tipo ou numa determinada espécie de células, mas pode ser ou muito forte ou muito fraco para proporcionar o nível necessário de expressão de um gene diferente num determinado tipo ou espécie de células.

Como parte dos nossos esforços para encontrar mecanismos para regular a expressão que em última instância venham a ser utilizados para combater pragas de insectos, essencialmente Ostrinia rmbilalis, que é a broca do milho europeu (BME), efectuamos o isolamento e/ou a caracterização de clones que revelam uma expressão entre intermédia e forte nos tecidos de que a BME essencialmente se alimenta ou onde vai escavando canais durante o seu ciclo de vida; estes tecidos compreendem as folhas, a gola das folhas, a casca e a medula dos caules e ainda, no caso de segunda geração de BME, o pólen (Showers et al., em “European Com Borer: Development & Management”, 1989, North Central Regional Extesion Publication N° 327, obra publicada em Maio de 1989 por “Iowa State University, Ames, Iowa”, E.U.A). Embora se tenha demonstrado já que os promotores constitutivos ou “não preferíveis em tecidos” sejam eficazes para tal fim, tais como o promotor 35S de VMCf (em inglês CaMV) que comanda o gene de cryIA(b) do Bacillus íhurigiensis que permite uma regulação da BME nos campos (Koziel et al., “Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thurigiensis>’; Nature Publishing Company” Fevereiro de 1993, 11(2):194-200), há várias vantagens em utilizar promotores que funciouem de um modo preferível em tecidos. Entre tais vantagens referc-sc uma utilização reduzida de recursos pela planta ao fazer constitutivamente um produto génico e também a localização ou a compartimentalização da expressão de genes nos casos em que o produto génico tenha de ficar limitado a determinados tecidos ou seja proveniente de determinados tecidos. Os referidos produtos génicos podem compreender inibidores celulares gerais, tais como as RNnases e outras citotoxinas.

Como exemplo, Mariani et al. (Nature 347:737, 1990) manipularam vectores que manifestavam expressão desses genes inibidores específicos das anteras, utilizáveis em sistemas de esterilidade masculina, uma vez que a expressão em regiões que não fossem as anteras de uma planta poderia ser tóxica. Como um exemplo de expressão preferível em tecidos, Koziel et al. (1993, supra) utilizaram uma combinação do promotor de PEP-carboxilase do milho e um promotor de pólen, em que cada um deles comanda a expressão de crylAfb) em arquétipos separados, daí resultando a geração de plantas do milho tolerantes à BME. E possível encontrar exemplos de outros promotores preferíveis em tecidos nas obras a seguir indicadas: Matsuoka et al, Proc Nad Acad Sei USA 90:9586-9590, 1993; pedido de patente de invenção PCT com o n° WO 93/18169, publicada a 16 de Setembro de 1993; e pedido de patente de invenção europeia n° 0 452 269 A2, publicada a 16 de Outubro de 1991. É possível encontrar uma outra obra publicada que refere um fragmento de EST no banco de dados “EMBL Sequence Database”, com o n° W21735(8.5.1996) de admissão. É necessário, no domínio da técnica, que haja novos elementos transcricionais que sejam capazes de comandar nas plantas a expressão de genes preferíveis em tecidos. Os especialistas na matéria consideram que é importante continuar a proporcionar unidades de transcrição preferíveis em tecidos, capazes de comandar a expressão de genes que possam conferir uma vantagem selectiva a uma planta.

DESCRICÃO ABREVIADA DA DESCRIÇÃO A presente invenção proporciona uma região promotora de um gene que irá servir para construir um vedor de expressão para comandar a expressão gémea “preferível em tecidos” em plantas transformadas com o referido vector de expressão, de tal modo que as referidas plantas venham a conservar uma vantagem selectiva, comparativamente com as plantas não transformadas. Essa vantagem selectiva pode ser conferida às referidas plantas por expressão de um gene que codifique um polipeptido que confira resistência contra os insectos ou contra outras pragas. Neste domínio da técnica é necessário que haja elementos regulativos transcricionais de genes de plantas que comandem a expressão dos referidos genes de uma forma específica ou preferencialmente em determinados tecidos de uma planta. A presente invenção diz respeito ao isolamento, caracterização e utilização de uma região regulativa transcricional de um gene das plantas que é expresso de uma forma preferível em tecidos. A invenção inclui métodos para a preparação de vectoies que compreendem regiões regulativas transcricionais preferíveis em tecidos e métodos para gerar plantas transgénicas que compreendem genes repórteres ou efectores sob o controlo transcricional de uma região regulativa transcricional preferível em tecidos.

Constitui um objecto da presente invenção proporcionar moléculas de ADN que representem uma região regulativa transcricional de um gene cuja expressão ocorra de um modo preferível em tecidos.

Também constitui um objecto da presente invenção proporcionar um arquétipo de referência útil para testar a aptidão da referida região regulativa transcricional para comandar a expressão de um gene repórter in vivo de uma forma preferível em tecidos.

Constitui um outro objecto da invenção proporcionar moléculas de ADN que irão ser úteis no combate às pragas das plantas.

Em particular, a invenção proporciona uma molécula de ADN subcromossómico, isolada e purificada, que contém um bloco de leitura ininterrupta (BLI) de MS8-15, tal como indicado na SEQID NO: 1 e na figura 2. A invenção também proporciona uma região promotora do referido gene preferível em tecidos. Assim, a invenção proporciona uma molécula de ADN subcromossómico, isolada e purificada, que compreende uma região promotora de um gene MS8-15, conforme ilustrado na SEQ ID NO:3 e na figura 3.

Além disso, a invenção proporciona uma molécula de ADN subcromossómico, isolada e purificada, que compreende uma região promotora de MS8-15, isolada por RCP, utilizando os oligonucleótidos específicos de MS8-15. A sequência da referida molécula de ADN está ilustrada na SEQ ID NO:5 e na figura 4.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona um vector de clonagem que compreende uma região promotora de MS8-15, conforme ilustrado na figura 5.

Ainda de acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona um vector de expressão em que a expressão de um produto gémeo experimentável se encontra sob o controlo de um promotor de MS8-15, conforme ilustrado na figura 6.

Ainda de acordo com mais uma outra variante da invenção, esta proporciona plantas transgénicas úteis para a identificação de tecidos em que o promotor de MS8-15 comanda a expressão gémea de um produto experimentável. As referidas plantas transgénicas são úteis

para se analisar a aptidão da região regulativa transcricional de MS8-15 para comandar in vivo a expressão gémea preferível em tecidos.

Estes e outros objectos da presente invenção são evidentes para os especialistas na matéria, à luz da memória descritiva minuciosa de uma variante preferida da invenção.

Posto isto, a invenção proporciona: uma sequência de ADN isolada, capaz de actuar como um promotor preferível de tecidos verdes de uma planta e que compreende a sequência de 1012 pares de bases que fica adjacente e a montante do codão deduzido ATG de início da tradução do gene MS8-15, sendo essa sequência de 1012 pares de bases ilustrada pela SEQ ID NO:3; ou um seu fragmento capaz de actuar como um promotor preferível de tecidos verdes das plantas; um vector que compreende a molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, em particular um vector de expressão que compreende um gene funcionalmente ligado a um promotor da invenção; uma célula vegetal transformada com um vector da invenção; um método para a produção de uma planta transgénica, o qual consiste em transformar uma célula vegetal com um vector da invenção e a partir daí regenerar uma planta; um método para exprimir de forma selectiva um gene nos tecidos verdes de uma planta, consistindo esse método em transformar uma planta ou uma célula vegetal com um vector de expressão da presente invenção; um oligonucleótido, tal como ilustrado nas SEQ ID NOS:6 ou 7.

Para a finalidade da presente invenção são preferíveis as células ou as plantas do milho. DESCR1CÃO ABREVIADA DOS DESENHOS Figura 1. Autorradiografia à Northern obtida a partir de ARN total de diferentes tecidos de milho hibridados com um fragmento interno de um clone de ADNc do pMS8-15. O clone de ADNc do pMS8-15 foi isolado recorrendo à pesquisa diferencial, em banco de ADNc, da expressão genica em tecidos específicos de milho e efectuando a clonagem dos ADNc que representam os genes que manifestem um padrão de expressão preferível em tecidos. A autorradiografia à Northern desta figura demonstra o padrão de expressão, preferível em tecidos, de um desses clones, o pMS8-15.

Figura 2. Sequência do segmento intercalar de ADNc de MS8-15 que mostra os blocos de leitura ininterrupta (BLI) de MS8-15. O clone de ADNc , pMS8-15, foi completamente sequenciado e a sequência de nucleótidos e a sequência deduzida de aminoácidos estão indicadas na figura. Para além de um BLI completo do MS8-15, foram identificados mais dois BLI parciais no interior do clone de ADNc, o pMS8-15. Estão indicadas a sequência de aminoácidos do BLI completo e também as sequências dos BLI parciais. Observa-se que há homologia entre o BLI parcial e o homólogo GRP90, conforme ilustrado.

Figura 3. Sequência da região a montante de 5’ (promotora) de MS8-15, incluindo uma parcela curta da sequência codificadora. Utilizou-se uma parcela da região codificadora de MS8-15, pertencente ao clone de ADNc, o pMS8-15, para hibridar um banco genómico de milho. Isolou-se um clone que continha a sequência de nucleótidos de uma região de 5’ de um gene de MS8-15, conforme ilustrado nesta figura.

Figura 4. Sequência do promotor de MS8-15 amplificada por RCP. Amplificou-se uma parcela da região de montante de 5’ de um gene de MS8-15 (o promotor de MS8-15) por RCP, utilizando oligonucleótidos complementares para a sequência de um gene de MS8-15. Coda um dos referidos oligonucleótidos possui pelo menos um local de enzima de restrição para a clonagem do ADN amplificado por RCP, no interior de vectores de clonagem e de expressão.

Figura 5. Mapa do vector pPHI8245 que contém o PROMOTOR de MS8-15 (ilustrado na figura 4) clonado no interior de ‘pBlueScriptH(SK+)\

Figura 6. Mapa do pPHI5933 que contém o promotor de MS8-15 que comanda a expressão do gene repórter GUS e que inclui a sequência do terminador de 3’ Pinll. Efectuou-se a clonagem de um gene repórter, o uidA (GUS) com uma orientação cis para jusante relati-vamente ao promotor de MS8-15 para se gerar o vector de expressão pPHI5933. O gene uidA codifica um produto génico experimentável.

Quadro I. Expressão de GUS do promotor de pMS8-15 em tecidos de milho Tl. Foram colhidas plantas de milho transgénicas em cujo genoma estava incorporado o vector de expressão pPHI5933 e foram testados diversos tecidos para pesquisa da expressão do gene uidA /GUS). Os dados indicam um padrão “preferível em tecidos verdes” de expressão comandada pelo promotor de MS8-15.

DESCR1CÂO MINUCIOSA PA INVENÇÃO

No âmbito da presente memória descritiva, uma resião reeulativa transcricional é qualquer elemento envolvido na regulação da transcrição de um gene, incluindo promotores, intensificadores e repressores, mas sem que isso constitua qualquer limitação. As regiões regulativas transcricionais previstas na invenção funcionam como promotores de plantas preferíveis em tecidos verdes.

Define-se um irasmento de ADN como sendo um segmento de ADN de cadeia singular ou dupla, obtido a partir de uma fonte qualquer.

Define-se um arquétipo de ADN como sendo um plasmídeo, vírus» sequência que se replica de forma autónoma, um fogo ou um segmento linear de ARN ou de ADN de cadeia singular ou dupla, provenientes de uma fonte qualquer.

Um produto génico que confere uma vantasem selectiva é qualquer produto gémeo que confira, ao ocorrer a sua expressão na referida planta, um maior ritmo de crescimento, maior produção ou maior resistência às ameaças à aptidão da referida planta para resolver os efeitos nocivos de agentes patogénicos, pragas e condições climatéricas adversas, mas sem que isso constitua qualquer limitação, e para lhes conferir maior resistência aos herbicidas, comparativamente com as plantas em que não ocorra a expressão do referido produto génico. O termo funcionalmente lieado designa uma combinação de um primeiro fragmento de ácido nucleico que representa uma região de controlo transcricional que possui actividade numa célula, unido a um segundo fragmento de ácido nucleico que codifica um gene repórter ou efector, de tal modo que a expressão do referido gene repórter ou efector seja influenciada pela presença da referida região de controlo transcricional.

Um gene cuja expressão ocorra de uma forma preferível em tecidos é aquele que demonstra uma maior intensidade de expressão num tecido, em contraposição a um ou vários tecidos secundários num espécime vegetal.

Um gene definido como preferível em tecidos verdes é um gene cuja expressão ocorre com um nível mais elevado em órgãos de plantas constituídos pelo menos parcialmente por células que realizem a síntese da clorofila.

Uma cultura resenerável é uma cultura de células ou de tecidos que possam ser manipulados de modo a permitir a regeneração das plantas.

Define-se uma planta transsénica como sendo uma planta a que se acrescentou um gene aos órgãos embrionários da referida planta.

Define-se uma planta madura como sendo uma planta em que tenha ocorrido o desenvolvimento normal de todos os órgãos vegetativos e reprodutivos.

Define-se um produto eénico útil para combater prosas como sendo um gene que sirva para inibir o crescimento, a migração, a existência ou o comportamento de qualquer praga que possa ameaçar o ciclo de vida normal de um ou vários organismos.

Designa-se por produto experimentável todo o produto codificado por um gene que seja detectável por meio de um ensaio experimental. Além disso, desde já se afirma que:-a detecção e a quantificação do referido produto experimentável é directamente proporcional ao nível de expressão do referido gene.

Define-se por arquétipo repórter uma molécula de ADN subcromossómico e purificado que compreenda um gene que codifique um produto experimentável.

Designa-se por vector de expressão nma molécula de ADN subcromossómico e purificado que compreenda uma região regulativa transcricional que comande a expressão de um gene.

Para se isolar as regiões promotoras úteis para comandar a expressão, preferível em tecidos, de genes efectoies em plantas, é necessário identificar os genes que demonstrem um padrão, preferível em tecidos, de expressão em plantas. Um método de identificação é a análise de tipo diferencial baseada na RCP (Liang et aL, ‘Science’ 257:967). Esta metodologia implica a utilização de iniciadores oligonucleotídicos aleatórios, a amplificação de ADNc-TA por RCP e a comparação de padrões de expressão entre duas amostras, pelo menos. As referidas amostras podem ser, mas sem que isso constitua qualquer limitação, diferentes tipos de células ou tecidos, células ou tecidos em diversas fases de desenvolvimento, ou células ou tecidos que tenham sido expostos a diversos produtos químicos ou a diversas condições de que possa resultar uma modificação na expressão genica das referidas células ou tecidos. Os padrões não idênticos de obtenção de bandas de ADN, com ADN amplificado a partir das referidas amostras, indicam que há uma diferença na expressão gémea entre amostras. As moléculas de ADN correspondentes às bandas que exibam os referidos padrões não idênticos de obtenção de bandas de ADN são clonadas e utilizadas para identificar os genes a que correspondam as bandas de ADN. Há um método alternativo que consiste em utilizar a hibridação subtractiva (Lee et al., ‘Proc. Nafl. Acad. Sei.’ 88:2825). Esta metodologia implica a hibridação de ADNc (anti-sentido) de uma amostra A e de ARN biotinilado de uma amostra B. As moléculas de ARN biotiniládo da amostra B, representando os genes expressos nas duas amostras, vão hibridar com as moléculas complementares de ADNc da amostra A e irão ser destruídas por tratamento enzimático subsequente. A seguir à purificação das restantes moléculas de ARN biotinilado da amostra B, constrói-se um banco de ADNc, utilizando o referido ARN biotinilado restante da amostra B. Há um outro método que consiste em pesquisar um banco de ADNc de uma primeira amostra utilizando ARN marcado representativo de uma segunda amostra. Os clones do referido banco de ADNc da referida primeira amostra que não hibridem com o referido ADN marcado da referida segunda amostra representam espécies de ARNm que não são expressas na referida segunda amostra. Em alternativa, é possível pesquisar individualmente vários bancos, utilizando para tal ARN marcado proveniente de várias amostras independentes. Se as referidas amostras forem diferentes tecidos de uma planta, a observação de padrões alterados de hibridação numa amostra, comparativamente com outra amostra, indica a existência de um padrão, preferível em tecidos, de expressão génica. Os clones de ADNc isolados pelo processo supramencionado representam espécies de ARNm que são expressas preferencialmente numa amostra ou num grupo de amostras. É necessário então confirmar se um ADNc, isolado por meio de qualquer das técnicas supramencionadas on por meio de qualquer outra técnica de que resulte 0 isolamento de genes de plantas, potencialmente preferível em tecidos, é expresso de uma forma preferível em 754 12 tecidos. A RCP-TA é uma metodologia segundo a qual um AKNm representado por um ADNc potencialmente preferível cm tecidos é amplificado a partir de uma célula ou de um tecido relevante (Berchtold et ai, ‘Nuc. Acids Res.’ 17:453). A amplificação do referido ARNm, a partir de vários tecidos diferentes, permite fazer uma comparação e permite determinar o nível relativo de expressão de ARNm do relérido gene de plantas potencialincnte preferível em tecidos. Um outro método, que pode ser utilizado para a determinação do nível da expressão genica numa célula vegetal ou num tecido vegetal, é o dos ensaios de protecção contra a RNase (Melton et al., ‘Nuc. Acids Res.’ 12:7035). O ARN retirado das amostras que se pretende comparar é hibridado com uma sonda de ARN anti-sentido, marcada e gerada a partir de um ADNc que representa um ARNm de um gene da planta potencialmente expresso de uma forma específica dos tecidos. A isto segue-se a adição de RNase. Todo o ARN que tenha hibridado com a referida sonda de ARN anti-sentido marcada é protegido contra a degradação (designa-se por transcrito protegido) por acção da RNase, ao passo que o ARNm que não tenha hibridado com a referida sonda de ARN anti-sentido marcada é degradado. Os produtos são separados depois por electroforese em gel e os transcritos protegidos são detectados recorrendo a métodos de detecção entre os quais se inclui os métodos autoiradiográficos, mas sem que isso constitua qualquer limitação. A intensidade relativa da banda correspondente aos referidos transcritos protegidos é proporcional ao nível de expressão que tem lugar na espécie de ARN protegido em cada tecido. Um outro método que permite determinar a expressão preferível em tecidos é a metodologia de análise pelas manchas de Northern (Alwine et al., ‘Proc. Naíl. Acad. Sei.’ 74:5350). Isola-se e separa-se por electroforese o ARN proveniente de uma amostra relevante. A espécie de ARN separado é depois transferida para uma membrana e é hibridado com uma sonda de ácido nucleico marcado que é complementar do ARN que representa o gene relevante. Detecta-se a hibridação utilizando um método de detecção que inclui o método autorradiográfico, mas sem que isso constitua qualquer limitação. Determina-se a intensidade das bandas correspondentes ao ARN que representa o gene relevante, que é proporcional ao nível da expressão gémea em cada amostra. Identifica-se um gene preferível em tecidos pela maior hibridação num tecido, comparativamente com um segundo tecido de uma planta.

Assim, é desejável isolar a região promotora responsável pelo comando da expressão do referido gene relevante de umá fòhna preferível em tecidos. Esta região pode ser isolada por diversos métodos, incluindo a amplificação de uma região de ADN que compreenda a referida região regulativa transcricional, mas sem que isso constitua qualquer limitação. O referido ADN é amplificado a partir do ADN genómico mantido sob a forma de um banco de ADN genómico num vector de clonagem que compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, fegos, plasmídeos, cosmídeos, cromossomas de leveduras artificiais (CLA, em inglês YAC), ou qualquer outro vector capaz de alojar fragmentos de ADN cromossómico. A referida região regulativa transcricional do referido gene expresso de uma fora preferível em tecidos pode ser isolada por amplificação das sequências genómicas que codificam a sequência de ADNc. São utilizados numa RCP dois iniciadores oligonucleotídicos, compreendendo o primeiro a sequência complementar para uma região no interior da sequência de nucleótidos do referido vector de clonagem e compreendendo o segundo uma sequência complementar para uma região de 5’ do referido ADNc que codifica um gene expresso de uma forma preferível em tecidos. A matriz para a referida RCP compreende uma parte do referido banco de ADN genómico. Os produtos (te amplificação podem ser, mas sem que isso constitua qualquer limitação, ADN que compreenda uma região regul ativas transcricional de 5’ do referido gene relevante, a sequência restante de 3’ do referido ADNc que inclui uma região não traduzida de 3’, ou os seus fragmentos. A sequenciação de ADN de cada produto amplificado tem como resultado a identificação dos clones que compreendam uma região potencial regulativa transcricional (Frohman et aL, ‘Proc. Nad. Acad. Sei.’ 85:8998). Um outro método para o isolamento da região transcricional de um gene expresso de uma forma preferível em tecidos consiste na utilização do ADNc ou de um seu fragmento que codifique o gene relevante, enquanto sonda de ADNc para pesquisar o referido banco de ADN genómico por hibridação. Os clones para os quais se tenha verificado que houve hibridação com a referida sonda de ADNc são isolados e caracterizados por cartografia-com enzimas de restrição e por análise das sequências de nucleótidos.

Para se construir os vectores de expressão, úteis para testar a região promotora de um gene expresso de uma forma preferível em tecidos, determina-se e isola-se os elementos responsáveis pela referida aptidão para comandar a expressão de genes de uma maneira preferível em tecidos. Os referidos elementos, em particular o promotor, são inseridos na região de controlo transcricional de um vector de expressão, de tal modo que a referida região de controlo transcricional fique ligada em posição cis a um gene codificador de um produto experimentável. O referido produto experimentável pode ser, sem que isso constitua qualquer limitação, β-glucoronidase (GUS™), luciferase, β-galactosidase, proteína fluorescente verde (PFV) ou cloranfenicol-acetil-transferase (CAT). Os referidos elementos responsáveis pela expressão de genes de uma maneira preferível em tecidos são isoláveis utilizando métodos que compreendem, sem que isso constitua qualquer limitação, os procedimentos a seguir descritos. Determina-se a sequência de nucleótidos e os mapas das enzimas de restrição dos referidos clones genómicos que demonstrem hibridar com a referida sonda de ADNc. Utilizando métodos de digestão com enzimas de restrição e métodos de subclonagem bem conhecidos pelos especialistas na matéria, efectua-se a construção de vectores de expressão que compreendem diversas regiões do referido clone genómico ligado em posição cis a um gene que codifica o referido produto experimentável para se gerar um vector de expressão cm que a expressão de um produto experimentável é comandada pelas diversas regiões do referido clone genómico. Outro método de síntese consiste em utilizar um oligonucleótido que compreende a sequência de nucleótidos complementar da região de 5’ da referida região de controlo transcncional do referido gene expresso de uma forma preferível cm tecidos e um oligonucleótido que compreende a sequência de nucleótidos complementar da região de controlo transcricional de 3’ do referido gene expresso de uma forma preferível em tecidos. De preferência, cada oligonucleótido compreende também a sequência de nucleótidos correspondente aos locais das enzimas de restrição compatíveis para efeitos de clonagem num vector de expressão que codifique um produto experimentável. A seguir à amplificação do ADN que compreende a região de controlo transcricional, executa-se a clonagem da referida região no interior do referido vector de expressão, utilizando para tal técnicas bem conhecidas na especialidade. A utilização das metodologias supramencionadas tem como consequência a construção de vectores de expressão que compreendem potenciais regiões de controlo transcricional independentes e ligadas em posição cis a um gene que codifica um produto génico experimentável.

Para se confirmar se a referida região promotora funciona nas plantas, de uma fonna preferível em tecidos, efectua-se a transfecção do referido vector de expressão que compreende uma região de controlo transcricional de um gene expresso em plantas, de uma forma preferível em tecidos, ligado em posição cis a um produto experimentável, para o interior de células ou tecidos de plantas. O método utilizado para a transfecção dos diversos tipos de células de plantas ou tecidos de plantas pode ser escolhido, mas sem que isso constitua qualquer limitação, entre o bombardeamento com partículas, a transfecção mediada pelos lipossomas, a transfecção mediada pelo fosfato de cálcio, a transferência de genes mediada por bactérias ou vírus, a electroporação ou uma transformação mediada por Agmbacterium. As diversas células ou os diversos tecidos referidos podem ser transfectados in vitro após a excisão para fora da referida planta. Decorrido um intervalo de tempo definido após a transfecção do referido arquétipo para o interior dos tecidos referidos, estes são colhidos e executa-se um ensaio que permita detectar o referido produto experimentável. A quantidade de produto experimentável detectado nas referidas células ou nos referidos tecidos é proporcional à aptidão da referida região de controlo transcricional para funcionar nessas células ou nesses tecidos. Deste modo, determina--se assim a aptidão da referida região promotora para comandar a expressão genica preferível em tecidos. Em alternativa, as referidas células ou os referidos tecidos podem ser utilizados para gerar uma planta transgénica. As referidas plantas transgénicas possuem pelo menos uma cópia desse vector de expressão que compreende a referida região de controlo transcricional ligada em posição eis a um gene que codifica um produto experimentável incorporado no genoma da planta. Assim, a referida cópia encontra-se presente em cada célula ou tecido da referida planta transgénica Depois da colheita desses tecidos, estes são então testados para pesquisa da expressão do referido produto experimentável. Determina-se a quantidade do referido produto experimentável em cada um desses tecidos, a qual é proporcional ao nível de expressão do referido gene que codifica o referido produto experimentável em cada um desses tecidos. Determina-se deste modo a aptidão da região de controlo transcricional do referido ADNc para comandar a expressão génica preferível em tecidos.

Também é possível testar a aptidão da referida região promotora para comandar a expressão de genes, preferível em tecidos, mediante a geração de plantas transgénicas em que o transgene compreende uma região de controlo transcricional, preferível em tecidos, que comanda a expressão de um gene efector e que confere uma vantagem selectiva às plantas que possuam o referido transgene. Deixa-se amadurecer as referidas plantas transgénicas que são então estimuladas com uma praga que pode suscitar eventualmente uma resposta à expressão do referido gene efeclor numa planta. De preferência, essa praga é escolhida entre o conjunto de pragas que existem pelo menos durante uma parte do seu período de vida num tecido em que a referida região de controlo transcricional comanda a expressão dos genes. Demonstra-se que o comportamento da referida praga se encontra alterado nos tecidos cm que o gene efector está expresso. A modificação do referido comportamento dessa praga compreende, sem que issò constitua qualquer limitação, a alteração das características de desenvolvimento, a incapacidade para fluorescer ou a morte. Como exemplo de um desses genes efectores refere-se o gene cry lA(b) para o qual se demonstrou que funciona na geração de plantas resistentes à Broca do Milho Europeu (Koziel et al., 1993, supra). A referida região promotora também pode ser utilizada para comandar a expressão de genes envolvidos noutros aspectos da fisiologia da planta, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a resistência a outras pragas diferentes das pragas de insectos, a resistência aos herbicidas, o desenvolvimento da planta, a resistência de frutos ou de vegetais contra a deterioração ou a resistência contra condições climatéricas adversas. Essas pragas, diferentes das pragas de insectos, podem compreender também, mas sem que isso constitua qualquer limitação, pragas de bactérias, parasitas, fungos, agentes virais, viróides» incluindo fungos, fusário e famonsina ou o vírus conhecido pela designação de Vírus do Mosaico do Tabaco. As características de desenvolvimento de uma planta são, sem que isso constitua qualquer limitação, as que resultam na produção de quantidades mais avultadas de frutos, maiores quantidades de sementes, o crescimento a um ritmo mais rápido ou mais lento ou o crescimento numa estação do ano diferente daquela que é considerada normal para a referida planta. As condições climatéricas adversas contra as quais a planta se toma resistente são, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as temperaturas superiores ou inferiores àquelas em que a planta não consegue normalmente sobreviver, as inundações e a falta de água.

Os exemplos a seguir descritos ilustram variantes particulares da presente invenção. EXEMPLO 1. Isolamento e caracterizacSo do clone MS8-15 de ADNc

Para se isolar a partir de milho um gene preferível em tecidos efectuou-se a construção de quatro bancos de ADNc que foram utilizados para pesquisa diferencial para se identificar os clones de ADNc com padrões de expressão específicos de tecidos. Isolou-se ARN a partir de raízes com uma semana de idade, a partir de caules com as idades de 1 semana e 8 semanas e a partir dos tecidos de folhas lesionadas de plantas da espécie de Zea mays L. (cv. B73) com a idade de 4 semanas, praticando para tal métodos convencionais. Dito de forma abreviada, efectuou-se a trituração dos tecidos até se obter um pó em azoto líquido, tendo então o pó sido recolocado em suspensão em tampão (LiCl 100 mM, Tris 100 mM-HCl a pH 8,0, EDTA 100 mM e 1% de DSS) e a seguir extraiu-se com fenol:clorofóimio:álcool isoamflico (25:24:1) e manteve-se o sobrenadante a incubar de um dia para o outro com LiCl 2 mM (concentração final). Fez-se precipitar o ARN em etanol, lavou-se e colocou-se novamente em suspensão em água estéril isenta de RNase. Isolou-se o ARNm de poh(A)+, utilizando para isso o método cromatográfico sobre celulose com ohgo(dT) (Aviv e Leder, 1972) e utilizou-se para a construção dos bancos de ADNc no vector ‘LambdaGEM-4’ (Promega, Madison, WT), tendo para tal sido utilizado um estojo de síntese de ADNc (Boehrinegr Manheim, Indianapolfis, IN). Dito de forma abreviada, efectuou-se a recombinação de um iniciador poli(dT), que continha bases suplementares na extremidade 5’, estando incluída a sequência de reconhecimento para Xbal, com o apêndice poli(A) do ARNm e depois sintetizou-se o ADNc utilizando transcriptase reversa. Seguiu-se a síntese da segunda cadeia por adição de um ligador EcoRI à extremidade 5’ do ADNc de cadeia dupla e a subsequente clonagem direccional no interior do vector ‘LambdaGEM-4’.

Foram aplicadas sobre lamelas aproximadamente 1 x 106 placas de cada um desses bancos e foram pesquisadas diferencialmente, utilizando como sondas os ARNm de poli(A) marcados, provenientes de outros tecidos (Negruk et al., ‘J. Virol. Meth.’ 1:229, 1980). No processo de selecção das placas que exibiam padrões de expressão preferíveis em tecidos, efectuou-se a identificação de algumas placas que depois de uma pesquisa secundária e terciária hibridaram fortemente com as sondas de tecidos das folhas e dos caules. Um desses clones, designado por pMS8-15, foi escolhido para análises posteriores.

Foi necessário confirmar que o clone de ADNc do pMS8-15 representava uma espécie de ARNm que era expressa numa planta de uma forma preferível em tecidos. Hibridou-se o ARN isolado a partir de diversos tecidos de milho, utilizando como sonda hihridante o pMS8-15 para analisar os padrões de expressão, preferíveis em tecidos, do ARNm de MS8-15. Congelou--se em azoto líquido 2 g de tecidos selecdonados entre diversos tipos de tecidos de milho (cv. B73), incluindo folhas lancioladas, verticilos foliares, golas de folhas, cascas de caules, medula dos carrles, nodos dos caules e raízes de plantas não transplantadas, com 11 semanas de idade, e isolou-se ARN total utilizando o produto ‘TRIREAGENT (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH), conforme indicado pelo fornecedor. Congelou-se em azoto líquido 8 g de grãos de milho, decorridos 4, 14 e 27 dias após a polinização, e isolou-se ARN total conforme descrito por Wessler (“Isolation of RNA from Wx and wx endosperms”, pág. 545-546; Spinger-Verlag, Nova Iorque, Inc., 1994). Recolocou-se o ARN em suspensão em formamida e ajustou-se as concentrações para 5 pg/pL. Aplicou-se aproximadamente 10 pg de cada ARN sobre um gel desnaturante com fonnaldeído a 1,4%. Aqueceu-se as amostras a 65°C antes do carregamento e foram experimentadas em tampão experimental à base de formaldeído. Depois efectuou-se a lavagem do gel durante 30 minutos com água duplamente destilada e tratada com DEPC, e a seguir obteve-se a sua fotografia. Os geles foram transferidos para uma membrana de tipo ‘Magna Charge’ (MSI, Westborough, MA) por absorção capilar, de um dia para o outro. As membranas foram cozidas a 80°C durante 1 hora e foram submetidas a um procedimento de interligação por acção dos UV, utilizando um dispositivo ‘Suatalinkcr’ (Strataegne, La Jolla, CA). Efectuou-se a pré-hibridação das membranas durante 2 horas em formamida a 50%, meio de Denhardt 5X, SSPE 5X e DSS a 0,1% contendo ADN de-esperma de arenque desnaturado tennicamente e na concentração de 200 pg/mL e ARNt na concentração de 50 pg/mL. As sondas de ADN foram marcadas com 32P-dCTP, tendo para tal sido utilizado o estojo de marcação estimulado aleatoriamente (Boehringer Manheim, Indianapolis, IN). Desnaturou-se a sonda de ADN a 95°C durante 10 minutos, juntou-se às membranas em solução recente de pré-hibridação e deixou-se a hibridar de um dia para o outro a 42°C. As manchas obtidas foram lavadas em meio SSC 2X e DSS a 0,1% duas vezes durante 20 minutos a 65°C, seguindo-se mais duas lavaegns em meio SSC 0,1X e DSS a 0,1% duas vezes durante 20 minutos a 65°C. Enxaguou-se as membranas rapidamente com água, tendo depois sido envolvidas em celofane e colocadas à temperatura de -80°C em presença de uma película Kodak XAR5 e de dois ecrãs intensificadores para se obter uma autorradiografia. A análise pelas manchas de Northern, em que ARN total proveniente de uma grande variedade de tecidos de milho foi hibridado com o implante do clone de ADNc de pMS8-15, revelou uma hibridação diferencial em diversos tecidos examinados (figura 1). As bandas hibridantes encontram-se presentes na maior parte dos tecidos, sendo observados os sinais mais fortes no ARN das folhas e dos nodos dos caules. A banda hibridante corresponde a um ARNm que tem um comprimento aproximadamente compreendido entre 1,1 e 1,2 kb. Há um segundo ARNm (aproximadamente com 1,4 kb) que parece estar expresso nos grãos em maturação e com menor intensidade nos tecidos dos verticilos e da medula. Esta observação coincide com os resultados inferidos pelas manchas de Southern (não representadas) que indicam que há provavelmente dois genes que revelam uma homologia significativa com o implante intercalar de ADNc (dados não representados). O promotor para o clone pMS8-15 pode eventualmente ser útil para comandar a expressão de genes, de uma forma preferível em folhas/caules, e por tal motivo pode ser adequado para comandar a expressão de genes, tais como aqueles que são úteis para combater a broca do milho europeu.

Num esforço para se identificar o gene MS8-15, efectuou-se a sequenciação completa do implante intercalar de ADNc do pMS8-15 de 1,207 kb, nos dois sentidos, utilizando para tal o método de terminação de cadeias didesoxi (Sanger et al., ‘Proc. Natl. Acad. Sei. USA Dec.’, 74(12):5463-7,1977), utilizando vários iniciadores ao longo do comprimento do clone de ADNc (figura 2; SEQ ID NO:l). A sequenciação completa do clone de ADNc do pMS8-15 de 1,207 kb e a comparação subsequente do BLI interno com sequências dos bancos de dados ‘GenEMBL’ e ‘Swissprot’, utilizando para tal o protocolo ‘BLAST’, revelaram que não havia nenhuma semelhança significativa entre essa sequência e as sequências de genes já conhecidos. A análise revelou realmente que o implante 8-15 era de facto uma fusão de três blocos de leitura ininterrupta. As primeiras 200 bases (aproximadamente) revelaram uma homologia de 87% ao nível dos nucleótidos e superior a 90% ao nível dos aminoácidos no ADNc de Hordeum vulgare (cevada) que codifica um homologo de GRP90. As últimas 50 bases também revelaram uma homologia de 100% com o ADNc da álcool-desidrogenase do rato. Embora pareça que estes dois ADNc parciais suplementares foram incorporados no clone de pMS8-15 durante o processo de clonagem, toda a caracterização foi completada utilizando as sequências correspondentes ao BLI do pMS8-15. O bloco de leitura ininterrupta completo interno do MS8-15 indicou uma certa homologia com diversos EST do arroz, com um de milho e um de Arabidopsis, não possuindo nenhum deles qualquer função definida até ao momento presente. Não é possível determinar se a identidade da sequência observada poderia reflectir uma similitude funcional sem a completa caracterização dos diversos produtos génicos. A ênfase para o isolamento do promotor foi concentrada no BL1 interno não identificado, uma vez que o referido BLI representava o maior BLI de comprimento completo e era constituído pela região do ADN utilizado como sonda na análise das manchas de Northern. Isolou-se, sequenciou--se e caracterizou-se um clone genómico correspondente ao MS8-15.

Para se determinar a região regulativas transcricional do gene MS8-15, utilizou-se ADNc de pMS8-15 para isolar os clones genómicos que representam o gene MS8-15. Isolou-se um fragmento de 1,25 kb de EcoRI/Xbal a partir do clone de ADNc de pMS8-15 e marcou-se com digoxigenina-ll-dUTP pelo método dos iniciadores aleatórios, utilizando o protocolo tal qual como explicitado no guia do utilizador do sistema ‘Genius™’ (Boehringer Manheim, Indianapolis, IN). Foram pesquisadas aproximadamente 1 x 106 placas provenientes de um banco genómico de milho, construído cm lambda-DASH (Stratagene, La Jolla, CA), utilizando como sonda os fragmentos marcados combinados, tendo rido recuperados dois clones positivos. O ADN de cada um destes dois clones genómicos foi isolado e digerido com diversas enzimas de restrição (algumas delas efectuam cortes intemamente no ADNc) e foi separado sobre gel de agarose a 1%, transferido para membranas e hibridado com um fragmento de 1,25 kb de EcoRI/Xbal marcado com digoxigenina. Os dois clones (15-30 e 34-1) são idênticos. Isolou-se e efectuou-se a subclonagem de um fragmento de 4,7 kb de EcoRI e de um fragmento de 6,0 kb de Sall a partir de cada clone genómico. O fragmento clonado de EcoRI foi ainda submetido a múltiplas digestões de cadeia singular e dupla que permitiram gerar um mapa de restrição pardal, tendo rido subclonados a partir desse fragmento outros dois fragmentos, um fragmento com 1,7 kb de EcoRI/Notl e um fragmento de 3,0 lcb de EcoRI/NotL, nos locais correspondentes ao ‘ptílueScriptII(SK+), (Stralagene, La Jolla, CA). Os fragmentos dos implantes genómicos foram parcialmente sequenciados com o intuito de se determinar a orientação dos fragmentos clonados relativamente à sonda de ADNc, uma vez que se presumia que o ADNc abrangia os dois fragmentos. Sequenciou-se o fragmento de 1,7 kb de EcoRI/Notl na sua totalidade e concluiu-se que continha sequências correspondentes à região de montante de 5’ (promotor) do clone pMSB-15. ........ . A sequeneiação do ADN do clone genómico comprovou a existência de identidade entre sequências ao longo do comprimento da parte codificadora do BLI interno do clone de ADNc de MS8-15. A analise da região de 5’ do local de início de tradução ATG putativo observado neste clone genómico revela a existência de uma sequência óbvia TATAAA situada a -126 a partir do início da tradução (figura 3). Além disso, a sequência do ADNc e a sequência do ADN genómico coincidem exactamente ao longo de 88 nucleótidos directamente a montante do local de início da tradução, até ao ponto onde termina o BLI parcial de montante (comparar com a figura 2). Este ponto de divergência também está 32 nucleótidos a jusante da sequência TATAAA putativa. Além disso, há um local de remate potencial do ARNm no interior da região de montante proximal de 5’ (indicado na figura 3). Há uma sequência que tem semelhança com um local de ligação do factor de transcrição e que está situada a cerca de 220 nucleótidos a montante de ATG. Este local revela possuir homologia com o local do factor de ligação do bloco CAAT e com o local de ligação NF1 nos mesmos promotores de mamíferos, tais como o promotor de albumina (Jones et al, ‘Cell’ de 16 de Janeiro de 1987, 48(1):79-89). O conteúdo de GC cai para 44% nos primeiros 1000 pares de bases do promotor. Há também um número significativo de segmentos poli(T) na região distai de 5’ do promotor. Além disso, há repetições de polipirimidina constituídas por cinco ou seis resíduos T a que se segue CTC (TTTTTTCTC) respectivamente a -358, -437 e -804. A análise das supressões ou das mutações poderia ajudar a determinar a funcionalidade associada a estas sequências repetidas. F.XF.lVfPLO 2. Construção dos vectores de expressão do promotor MS8-15

Como consequência do nosso sucesso anterior, utilizando a RCP para amplificar as sequências de promotores putativos de genes de plantas para testar a funcionalidade em plantas transgénicas (Baszczynski et al., trabalho não publicado), adoptámos esta metodologia para conceber um par de iniciadores oligonucleotídicos (ver materiais e métodos) que pudessem permitir simultaneamente a amplificação da sequência do promotor destinatário e proporcionar locais de restrição convenientes nas extremidades deste promotor para clonagem em vectores de transformação de plantas (Boutíllier et al., ‘Plant MoL Biol.’ 26:1711-1723, 1994). Define*se o promotor MS8-15 pelos 1012 pb do gene de MS8-15 que ficam adjacentes e a montante do codão deduzido AUG de início da tradução. Subentende-se também que as regiões mais curtas do referido promotor MS8-15, que poderiam ser geradas e estudadas recorrendo a técnicas de análise das supressões, podem proporcionar os níveis suficientes de expressão génica preferível em tecidos. A sequência de nucleótidos do produto final amplificado por RCP está ilustrada na figura 4 e é designada por SEQID NO:5, a qual foi utilizada, após uma digestão conveniente, para gerar dois vectores, conforme se ilustra nas figuras 5 e 6.0 pPHI8245 (figura 5) contém simplesmente o promotor MS8-15 em ‘pBhieScriptn (SK+)’ (Stratagene, La Jolla, CA) para utilização na clonagem subsequente. O pPHI5933 (figura 6) é um vector de transformação de plantas que compreende o promotor de MS8-15 e o gene uidA (GUS) para testar a funcionalidade do promotor em plantas transgénicas.

Foram sintetizados e utilizados dois oligonucleótidos para amplificar, por RCP, 1012 pb da região de 5’ directamente a montante do codão deduzido de início da tradução AUG, tal como determinado pelo alinhamento da sequência com a sequência de ADNc e pela presença das sequências associadas ao promotor, tais como o bloco TATA. Os olignnucleótidos possuíam uma sequência de 5’ suplementar para acrescentar locais de restrição e para ajudar a fazer a clonagem do produto final amplificado por RCP. O oligonucleótido D02461 (5’--CCGGTTAACTCTAGAGGGTAGCAGAGCATAGTCAGTG, SEQIDNO:6), complementar para a extremidade 5’ do promotor putativo, possuía os locais introduzidos Hpal e Xbal. O oligonucleótido D02460 (5’-GCCGTCCATGGCGATGGTGCC; SEQ ID NO:7), complementar para a cadeia anti-sentido na extremidade 3’ do promotor putativo, continha as sequências concebidas para se introduzir, por mutação, um local Ncol no codão de arranque ATG. O local Ncol foi gerado com a finalidade de se criar fusões traducionais com outros genes relevantes.

Combinou-se 10 ng de ADN matricial do fragmento de 1,7 kb de EcoRI/Notl, sobre gelo, com 50 ng de cada um dos iniciadores D02460 e D02461 numa mistura de reacção de 50 pL contendo (concentrações finais) KQ 50 mM, Tris 10 mM-HCl (pH 8,3), MgP2 2 mM, 0,001% de gelatina, 200 μΜ de cada um dos dATP, dCTP, dGTP e dTTP e 5U de polimerase de ‘AmpliTaq’ (Peridn-Elmer/Cetus, Norwalk, CT). Aqueceu-se o tubo de ensaio a 94°C durante 2 minutos para se desnaturar o ADN matricial e depois submeteu-se a 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 63°C e 2,5 minutos a 72°C, seguindo-se uma operação final de incubação durante 10 minutos a 72°C, utilizando o aparelho de modelo ‘Thermal Cycler 480’ da Perkin Elmer. Fez-se digerir com Xbal e Ncol uma amostra do promotor amplificado por RCP e clonou-se nos locais correspondentes do ‘pBlueScriptíl (SK+)’ (Stratagene, La Jolla, CA) para se produzir o vector pPHI8245. Fez-se digerir com Xbal e Ncol uma segunda amostra do promotor amplificado por RCP, combinou-se com u m fragmento de 2188 pb de NcoI/EcoRI que continha o gene uidA (GUS) fundido com a região não codificadora de 3’ (terminadora) de um gene inibidor da proteinase da batata (Pinll) e clonou-se conjuntamente nos locais Xbal/EcoKI do ‘pBlueScriptn (SK+)’ para proporcionar o pPHI5933. EXEMPLO 3. Análises de expressão do promotor de MS8-15 em milhn tramgénira

Foi necessário demonstrar que a referida região promotora MS8-15 poderia comandar a expressão de uma forma preferível em tecidos, in vivo. Engendrou-se um sistema modelar que permitiu testar ò vector de expressão do promotor MS8-15 no milho. Utilizou-se ADN do plasmídeo pPHI5933 ou de uma região do implante proveniente do pPHI5933, sem as sequências do vector ‘pBlueScriptn (SK+)’ para transformar de um modo estável culturas de caules regeneráveis de milho Hi-Π, pelo método do bombardeamento com uma pistola de partículas. O método utilizado para a transfecção dos diversos tipos de células de plantas ou de tecidos de plantas também pode ser, mas sem que isso constitua qualquer limitação, seleccionado entre os métodos de transfecção mediada por lipossomas, transfecção mediada pelo fosfato de cálcio, transferência de genes mediada por bactérias ou vírus, electroporação ou transformação mediada pelo microrganismo Agrobacterium. Bombardeou-se conjuntamente um segundo vector, quer o pPHI5675 portador do gene do marcador seleccionável ‘bar’ por trás de um promotor 35S do VMCÇ quer o pPHI5702 portador do gene do marcador seleccionável ‘pat’ por trás do promotor 35S do VMC£ e utilizou-se para seleccionar os casos transformados. Os vectores ou implantes intercalares em que o gene uidA estava sob o controlo de um promotor 35S do VMCf (pPHI264) foram bombardeados em experiências paralelas para comparação das actividades dos promotores. Imediatamente a seguir ao bombardeamento, manteve-se a incubar os casos das culturas de Hi-Π a 27°C ao abrigo da luz durante 6 dias, a que se seguiu a transferencia para meios selectivos que continham ‘bialophos’ na concentração de 3 mg/L (Meiji Seika, Japão). Decorridas cerca de mais 6 semanas, as colónias putativas transformadas foram transferidas para meios de regeneração. Ao fim de várias semanas, os embriões em desenvolvimento, ou as estruturas cm forma de escamas cárneas, foram transferidos e criados em cultura separadamente, com exposição à luz, e recuperou-se então as pequenas plantas de milho transgénicas. A seguir à regeneração das pequenas plantas em tubos de ensaio, a partir das culturas de caules Hi-Π, contrastou-se cinco plantas ainda novas, de cada caso, utilizando para tal o corante de McCabe para seleccionar os casos positivos que foram levados para a estufa Paga todos os casos que revelaram uma certa contrastação de GUS nas plantas novas, efectuou-se o envasamento das plantas provenientes da mesma origem, tendo ficado a crescer em estufa até atingirem a maturidade. Depois de regeneradas até 15 plantas transgénicas (TO) por cada caso, efectuou-se a polinização das espigas com um pólen de HG11 e esperou-se que se desenvolvessem plenamente na estufa. Decorridos 5 a 9 dias após a polinização (DAP) efectuou--se uma colheita de amostras a partir de secções de folha da bandeira, da folha por baixo do nodo da espiga (folha média), da nervura mediana, da gola da folha, da parte superior do caule, da parte inferior do caule, da raiz e da espiga e efectuou-se o seu tratamento para estudo. Para efeitos de análise visual da actividade do promotor, manteve-se os tecidos das plantas trans-génicas a incubar durante 18 a 36 horas em corante de McCabe. Para efeitos de comparação estudou-se também as plantas transgénicas com arquétipos equivalentes 35S-GUS e as plantas transgénicas de contraprova negativas. Além disso, congelou-se em azoto líquido pequenos segmentos de tecidos de milho que foram utilizados para estudos quantitativos de GUS através de um sistema de detecção quimioluminescente ‘GUS-Light™’, trabalhando em condições e com soluções especificadas pelo fabricante (Tropix, Inc., Bedford, MA). Mediu-se as concentrações totais das proteínas solúveis, utilizando para tal o ensaio proteínico ‘BCA’ (Pierce, Rockford, IL) e utilizando a ASB (em inglês BSA) como padrão. Para cada determinação ~7ζ/ ^ '2Γ' foram utilizados 2 pL de extracto retirado de duas amostras de tecidos recolhidos a partir de duas plantas de cada um dos casos. A expressão de GUS foi apresentada sob a forma de ng de GUS/mg de proteína (ppm) e traçou-se os gráficos correspondentes a todos os casos transgénicos analisados. Deixou-se as sementes TI recolhidas a partir de plantas com a mesma origem completarem o seu desenvolvimento até atingirem a plena maturidade numa estufa, tendo as amostras sido recolhidas e analisadas mais uma vez tal como se havia feito para as plantas da geração Τ0Γ" —

Em todos os casos positivos de plantas novas contrastadas com o corante de McCabe, vistas a olho nu, observou-se a expressão distinta de GUS essencialmente ao longo dos feixes vasculares na parte basal da folha e da bainha, havendo também um certo grau de expressão noutras regiões da lâmina foliar. Não foi observada nenhuma expressão nas raízes das plantas novas coradas. Os tecidos retirados de plantas transgénicas maduras revelaram geralmente níveis baixos de contrastação de GUS. Houve um caso de contraprova positiva 35S-GUS em que a coloração foi intensa na maior parte dos tecidos estudados e das fases examinadas. O sistema de detecção quimioluminescente ‘GUS-Light™’ e a análise proteínica BCA foram utilizados subsequentemente para se quantificar a quantidade de expressão de proteína GUS nos diferentes tecidos. O quadro 1 resume os dados de expressão de GUS em plantas de geração TI para cada um dos tecidos examinados dos diversos casos conseguidos a partir da transformação com o pPHI5933, ou para dois casos conseguidos com o arquétipo de GUS-promotor 35S do VMCf (o pPHI264), em que um era positivo e o outro era negativo à expressão de GUS. Cada ponto representa uma amostra analisada para se pesquisar a expressão de GUS. Há uma nítida variação nos níveis de expressão entre os diversos casos, conforme se observa tipicamente nas experiências de transformação de plantas, utilizando métodos tais como o bombardeamento com pistola de partículas. Esta variação pode ser atribuível a locais de integração múltiplos ou variáveis (efeitos de posição), rearranjos de ADN durante a integração ou instabilidade ou aquietação transgénica, especificas dc cada caso. Os dados revelam que embora o promotor MS8-15 seja um promotor mais fraco do que o 35S, aquele (o MS8-15) manifesta uma expressão preferível em tecidos foliares nos casos em que houve expressão. Os casos 1-25 e 2-27 manifestaram a mais forte expressão entre todos os casos de MS8-15 nas duas gerações TO (dados não representados) e TI (dados do quadro 1). Embora a expressão não esteja restringida exclusivamente às folhas, esta preferência em termos teciduais é útil sempre que seja desejável não ter uma expressão forte de transgenes em todos os tecidos de uma planta. Além disso, níveis superiores de expressão, tais como os que se obtêm com o promotor 35S do VMCf ou com o promotor ubiquitina do milho (Christensen et ai, 1992) podem eventualmente não ser necessários ou desejados em determinadas aplicações, tal como sucede com a expressão de produtos génicos altamente eficazes [v.g., cryIA(b)] ou potencialmente citotóxicos (v.g., RNAase). Assim, este promotor proporciona uma alternativa adequada para exprimir genes em plantas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) ENDEREÇO: PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC. (B) RUA: Darwin Building, 7100 N.W. 52nd Ave., P.O. Box 1000 (C) CIDADE: Johnston (D) ESTADO: Iowa (E) PAÍS: E.U.A.......... (F) CÓDIGO POSTAL: 50131 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Sequência promotora de milho para a expressão de genes de uma forma preferível nas folhas e nos caules” (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 7 (iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão “1.30 (v) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT NÃO ATRIBUÍDO (B) DATA DE DEPÓSITO: concomitante (C) CLASSIFICAÇÃO: (vi) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/667 809 (B) DATA DE DEPÓSITO: 21-JUN-1996 (o\ TNrcnwx/íArXn ρδη δ δ «ρπτιβμγτα mwrvi·

31 (A) COMPRIMENTO: 1207 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: junção (12..197,291.905) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 1:

GAAnOOGIT c CIG TOG GAC TOG TGG AAG AAG GOC CIG GAG AGC GAG AAC 50 Leu Ser Asp Tip Trp lis Lis Ala Leu Qu Ser Gu Asn 1 5 10 GIG GAC TOG GIG AAG AIC AGC AAC GGG CIG CAC GAC ACC COC TQC GIC 98 Vai Asp Ser Vai Lis Be Sa Asn Aig Leu His Asp Thr Pro Cis Vai 15 20 25 GIG GIC ACC T0C AAG TAC GGG TOG AGC GOC AAC ATG GAG AAG AIC ATO 146 Vai Vai Thr Ser Lis Tír GE Tip Ser Ala Asn Met Ou Lis Be Met 30 35 40 45 CAG GGG CAG ACC CIG TOG GAC TOG AGC AAG CAG GGG TAC AIG CGC GGC 194 C3n Ala On Thr Leu Ser Asp Ser Ser Lis Gn Ala Tír Met Aig GS 50 55 60 AM GAGGGCCTCT CGATCGCTCA TCAGTCGCCA GAGGAGTAGT TGATCGAGGT 247

Lis GAGTGAGGTT GAAAAGCAGG CGGCGAACAA AGGCACCATC GIC ATO GAC GGC GGA Mi Asp (2 GS 65 TAC TAC GGC GGC COC GAI CAG CGC TAC AGC GGC GGG TAC TAC GOC GGC Tir Tír GE GE Aig Asp On Arg Tir Ser GB GE Tir Tir ca GE 70 75 80 GGT GGC AIC GOG ACG COG GGG TAC GCT COG GOG GIC COG TAC GGG ATO Gfi Gi Be Ala Thr Pro GS Tir Ala Pro Ala Vai Pro Tir GE Met 85 90 95 TOG CAG GIG AAC AIC GAG GGC AAC GGG TGC GGG CGG GOG CIG COG COG Ser Ctfn Vai Asn Be Ou GH Asn (3 C5s GB Aig Ala Leu Pro Pro 100 105 110 446

CAG CCG AOC GIG AAG GIG TAC TOC OGC GGC AAC G0C AAC TAC GGC AIG 494 Gin Pro Ur Vai Lis Vai Trr Os Aig Ala Asn Pro Asn Tir Ala Ma 115 120 125 130 AOC GIC OGC GAC GGG AAG GIG GIG CIG GGG COG GGG AAC CDC AAG GAC 542 Ser Vai Aig Asp O Lis Vai Vai Leu Ala Pro Ala Asn Pro Lis Asp 135 140 145 GAG TAC CAG CAC TGG AIC AAG GAC AIG GGG TGG AGC AOG AGC AIC AAG 590 C3u Tir Gin m ΤΦ le Lis Asp Ma Aig Trp Sa Thr Ser Be Lis 150 155 160 G4C GAG GAA. GGT TAC COG G0G TIC G0G CIG GIG AAC AAG GGG AGC GGG 638 Asp Glu Ghi a Tir Pro Ala Phe Ala Leu Vai Asi Lis Ala Thr GE 156 . 170 175 GAG OOC AIC AAG CAC TGG CIG GGG CAG TOC CAC COG GIG OOC CIG GIG 686 GEi Ala He Lis Hs Ser Leu GE On Sa Hs Pro Vai Arg Leu Vai 180 185 190 OOC TAC AAC COG GAC Tir TIG GAC GAG TO3 GIG CIG TGG AOG GAG AGC 734 Pio Tir Asn Pro Asp Phe Leu Asp Glu Ser Vai Leu Trp Thr Qu Ser 195 200 205 210 OGC GAC GIC GGC AAC GGC TIC OGC TOC GIC GGC ATC GIC AAC AAC AIC 782 Aig Asp Vai GE Asn GE Phe Aig Qs Vál Arg Ma Vai Asn Asn Be 215 220 225 TAC CIC AAC TIC GAC GCC CIC CAC GGC GAC AAG TGG CAC GGC GGC GIC 830 Tir Leu Asn Phe Asp Ala Leu Hs GE Asp Lis Trp Hs Gfi GE Vai 230 235 240 CGT GAC GGC AOC GAC GIC GIG CIC TGG AAG TGG TOC GAG GGC GAC AAC 878 Arg Asp GE Tk Asp Vai Vai Leu Trp Tis Trp Os <3u GE Asp Asn 245 250 255 CAG OGC TGG AAG AIC CAG OOC TAC TAC TGAACCAACG < GATGATATGA 925 Gn Arg Trp Lis le On Pro Tw Tir 260 265 CCATCGCGCC CATCGATCGT GCACATGCAT GCATACGTAC TAGCAGAATA ACAGGGGTCT 985 TATCTCCCGA GGCGTCTTTT GCATGCATGC i CAGCAGTTGC . ATAGTATAAAG CAGGAGCGAG 1045 ACAAAGGGTG TTCATGTATA TTGCAGCTGT ATCACTGTAT GTATGTGCCA TTGTGCCTTG 1105 TAATAATACA TATAATAATA AAGTTGCTCG GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAATCTAGAG 1165 TCGACCTGCA GCCCAAGCTT QTATTCTATA GTGTCACCTA AA 1207 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 267amiiioácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ 1D NO: 2:

Leu Se- Asp Tip Τφ Lis lis Ala Leu Glu Ser Qu Asn Vd Αφ Sa 1 5 10 15 Vd Iis Se Ser Asn Arg Leu His Αφ Thr Pro Gs Vd Vd Vd Thr 20 25 30 Ser Tis Tff Gfi Τφ Ser Ala Asn Met Glu Lis Be Met On Ala On 35 40 45 Thr Leu Ser Asp Ser Ser Lis Gin Ala Tr Ma Arg d Lis Ma Αφ 50 55 60 ca Gfi Tír Tir Gfi d Aig Αφ Gin Aig Tir Ser d d Tir Tir 65 70 75 80 d Gfi Gfi d Be Ala Thr Pro d Tir Ala Pro Ala Vd Pro Tir 85 90 95 d Met Ser Gin Vd Asn Be dl d Asn d Gs d Arg Ala Leu 100 105 110 Pno Pno Gin Pro Thr Vd Lis Vd Tir Gs Arg Ala Asn Pro Asn Tir 115 120 125 Ala Met Ser Vd Aig Asp d Lis Vd Vd Leu Ala Pro Ala Asn Pro 130 135 140 Lis Asp Ou Tir Gin His Trp Be Lis Αφ Met Arg Τφ Ser Thr Ser 145 150 155 160 Se Lis Asp Gfii Ou d Tir Pro Ala Phe Ala Leu Vd Asn T is Ala 156 170 175 Thr Gfi Qu Ala Be Lis Hís Ser Leu d On Sa- His Piro Vd Aig 180 185 190 Leu Vd Pro Tir Asn Pro Asp Phe Leu Αφ Qu Ser Vd Leu Τφ Thr 195 200 205 Qu Ser Aig Asp Vd d Asn d Phe Aig Gs Vd Arg Ma Vd Asn 210 215 220 Asn Be Tir Leu Asn Phe Αφ Ala Leu Hs d Αφ Tis Τφ His d 225 230 235 240 Gfi Vd Arg Αφ d Thr Αφ Vd Vd Leu Τφ Lis Τφ Gs Qu d 245 250 255 Asp Asn Gin Arg Τφ Lis Be Gh Pro Tir Tir 260 265 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1997 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1928..1996 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) NO. 3: TACCGGGCCC CaXICGAGG TCGACGGTAT CXjATAAGCIT GATATCGAAT TCTAACTCAA 60 ACGAACATGC CCITATCGAT TTAGCTAGAG AGATGCX5AGG AAAACTCITA TTAGTATTGr 120 TGCnTGGTG GTGGCGTAGA TAAAATAGAG CAAATAGAAA GGCACATCAG AGGTGGCACr 180 GGAGACGATG ttgacagtgg CGrTCGCACIT (XTCIGGAAG CTOGACCATG CCTGGCAGCA m CAACGTGTAT GACCCGCATG ACGCCCTCGA CGTTGACCTA GATCAGTTGC GCAGCAGCTÇ 300 CICATOCACC cogtgccagt AGIGCGCGTA CGGATAAGAC AAOXATCAT ACXXATGGAT 360 GGAGTCTCGA GCATCTCGAC GCCGG<XACC AGCCCCTCGA GATCCTTGCT GGAGGCXXXXj 420 GCCTCGAGGA GGAGGAGATG GGCGAAGGTG AGGGAGGGGA CCAAGGGGGT CTATCGCGGT 480 AGGACAGGGG GCCAGGAAGG CAGGGGCAAC ACATGGGGGC AGCACAAGCA GGGGCXX3GAG 540 TGGAGGGAGG CAAGGATGGT AGGCXjmXjG CXjTCGCGAAG GAGGCX3AGGA GCGCX3GTGCA 600 GCGCTGCATG GAACGCGGGA TGGGCITGCG ACIGACGATG GCGTGGAGGG ACGACATCAG 660 TATAGATGGC CAAATGGGTC GTACCTATCA GACTGGCCTG AACTACGAAC CATITAATAG 720 TUTUGICGCC CAACCTQACA ΤΤΑΤΤΑΑΑΛΤ GGGCTCGTGC ΓΑGCACGGCA CGAGAGGCXjT 780 GCCATGCTTG AGCCGTTGTC TCGGCCCGTA GTGCCGGnT GGCCTAATA GATTAT1TIT 840 ΤΓΑΤΤΑΤΠΤ HAAAACTCAG CCGACACATA TTTATAACAC CTATTGACTA TTAGGCACAA 900 ACTTGATTGG GCTCAAGTGG GTAGCAGAGC ATAGTCAGTG TCTGITGCCT TTACCAAGGC 960 GCACGGGTIT GATCCCCCTC CCTGCGCTAT AATTTTGGAC ΤΑΤΠΤΠΤΓΑ TAGGCGTCGA 1020 Ω >Α GACGAAGCAT GATTOCACCA GTGATCTACA CTATTATCTRR AATATGTAGT AGAGATAGAG 35--^ 1080 ATTTATAGA TTCAGAGCCC T6AAAOCTTTA ATGAGATTAT TTTTCrCAGC TACTCAAATA 1140 AAGGGGAGAA CTCTCCTCCC CAATTAAOCG τπτπτατ CATATTTTCT ACACTACATA 1200 TGCXTAAAAT AAATAATTGA GAGATGAGIT AAGAGAAAGA AAAGGTAATG TATAATGCIG 1260 GmTCAGGA TGGTTGGITT TAAGATCTAA TKJITATTAT TCAOOGOCTA AACGAACCIT 1320 TAAAATAAGA CATAACACAG ΟΊΧΧΠΤΑΑΤΓ TCTCATTGGG CATGGAGTTT TCIlGUllG 1380 CTGGAGAGAA AGAAGACCTT TGAAATTTCA AAACACTCIT nUIOGCTAG TTTGAAAACT 1440 CGAATCATCT CCAGGATCGA CCX3GAATTAG GGAATAAATA AACTATmT TCTCTCAATC 1500 TCAAAGACAA nTAAGITTC CAAACTAGCXj ATTAATCTTA ACCAATGACT AGACnTGTG 1560 ΤΚΧΠΤΠΊΤ CTCITACrGC TGGAGATGCT AAGGATTCTT CTTCCAAGAA CGACTAGAAA 1620 CCGAATCGCT TITTCCCIOG GCTAGITTCG CATGGCATCG TccrrccrGc CCATGCGCGC 1680 ACAACCATOC ATCCACTGAC GATGOGAIX3C CTADOCADCA CCTCGCGCAG CGTGAGCTA 1740 ACGCCACCAC ATGCAOCACC AGTGGGGCAG CTGGGGACGC CGGGAGCAAC CGGCAGCGOC 1800 CTATAAATCT GOX3GCCCGG CXXjTTGCATT GTCTGCGTCA GGGCCTCITG ATCATCAGTC 1860 GCCAGAGGAG CTGTTGATCG AGGTGAGTGA GGTTGAAAAG CAGGCGGCGA ACAAAGGCAC 1920 CATOGIC aig i GAC GGC GG\ TAC TAC GGC GOC OOC CAC OQC GGT GGA GCT 1960 Mel ; Asp Gfi Gfi Tír Tn· GS Gfi Aig His Aig Gfi Gfi Ala 1 OCA GCT ΤΓΓ Pro Ala Phe 15 GTT COC : Vai Pro 5 ΤΓΓ AGT GAG Phe Ser GUu 20 GGT T G® 10 1997 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Met Asp Gfi G® Tír Tír Gfi Gfi Aig His Aig G® GS Ala Pio Ala 15 10 15

Phe Vai Pro Phe Ser Gfii Gfi 20

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1033 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ϋ) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: CCGGTTAACT CTAGAGGGTA GCAGAGCATA GTCAGTGTCT GTTGCCnTA CCAAGGCGCA 60 CGGGTTTGAT cccccnxcr GCGCTATAAT TITGGACrAT TmCTATAG GCGTCGAGAC 120 GAAGCATGAT TCCACCAGTG ATCTACACTA TTATCTTAAT ATGTAGTAGA GATAGAGATT 180 TTATAGATTC AGACCCCTAA ACCITTAATG AGATTATTIT TCICAGCTAC TCAAATAAAG 240 GGGAGAACTC TCCIXXCCAA TTAACCGrTT TTITCITCAT ATITrCTACA CTACATATGC 300 CTAAAATAAA TAATTGAGAG ATGAGITAAG AGAAAGAAAA GGTAATGTAT AATGCTGGTT 360 TTCAGGATGG TTGGmTAA GATCTAATTG TTATTATTCA CCGCCTAAAC GAACXJTTTAA 420 AATAAGACAT AACACAGCTC CITAATnCr CATTGGGCAT GGAGimUT TGfnTGCTG 480 GAGAGAAAGA AGACCnTGA AATTTCAAAA CACIUmTG TGGCTAGm GAAAACIXDGA . 540 ATCATCTOCA GGATCGACCG GAATTAGGGA ATAAATAAAC TATTTTTTCT CTCAATCTCA 600 AAGACAATTT AAGTITCCAA ACTAGCGATT AATCITAACC AATGACTAGA CITTGrrGTTG 660 GrITnTTCrC TTACTGCTGG AGATGCTAAG GATTCTICTr CCAAGAACGA CTAGAAACCG 720 AATCGCITIT TCCCTCGGCT AGITTCGCAT GGCATCGTCC TTCCTGCXXA TGCX3CGCACA 780 ACCATCCATC CACTGACGAT GCGATGCCTA CTCACCACCT CGCGCAGCXír GATGCTAACG 840 CCACCACATG CAOCACCAGT GGGGCAGCTG GGGACXXXX3G GAGCAACCGG CAGCGCCCTA 900 TAAATCTGOC GGOCOGGOGG TTGCATTGTC TGCGTCAGGG CCTCTTGATC ATCAGTCXjCC 960 AGAGGAGC1G TTCATCGAGG TGAGTGAGGT TCAAAAGCAG GCGGGGAACA AAGGCACCAT 1020 CGCCATGGAC GGC 1033 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases 37 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “oligonucleótido: 37

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:6: CCGGTTAACT CTAGAGGGTA GCAGAGCATA GTCAGTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “oligonucleótido” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

GfXGTCCATG GCGATGGTGC C 21

Lisboa, 19 de Novembro de 2001 O Agante Oficia! da Piopt ;icde indusíuai

JOSÉ DE SAMPAIO

Claims (17)

1. fb L

   Reivindicações 1. Sequência isolada de ADN capaz de actuar como um promotor de plantas preferível em tecidos e que compreende a sequência de 1012 pares de bases que se encontra adjacente e a montante do codão deduzido ATG de início da tradução do gene MS8-15, estando essa sequência de 1012 pares de bases identificada na SEQ DD NO:3; ou um seu fragmento capaz de actuar como um promotor de plantas, preferível em tecidos verdes.
2. 2. Promotor ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, o qual é capaz de comandar a transcrição de uma forma preferível nas folhas ou preferível nos caules.
3. 3. Vector que compreende a molécula de ADN da reivindicação 1 ou 2.
4. 4. Vector de expressão que compreende um gene funcionalmente ligado ao promotor da reivindicação 1 ou 2.
5. 5. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 4, em que o gene é um gene de β-gluco-ronidase, luciferase, β-galactosidase, proteína fluorescente verde ou de cloranfenicol--acetil-transferase.
6. 6. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 4, em que o gene é seleccionado entre um gene capaz de conferir resistência contra um insecto, um gene capaz de conferir resistência contra um herbicida, um gene capaz de alterar o crescimento de uma planta, um gene capaz de conferir resistência contra a deterioração de frutos ou vegetais ou um gene capaz de conferir resistência contra condições climatéricas adversas.
7. 7. Célula vegetal transformada com um vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 6.
8. 8. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 7, a qual é uma célula de milho.
9. 9. Método para a produção de uma planta transgénica, o qual consiste em transformar uma célula vegetal com um vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 6 e a partir dai regenerar uma planta.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a planta é uma planta de milho.
11. 11. Método para exprimir de forma selectiva um gene no tecido verde de uma planta, consistindo esse método em transformar uma planta ou uma célula da planta com um vector de expressão tal como definido numa qualquer das reivindicações 4 a 6, em que o promotor é tal como definido na reivindicação 2.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a planta ou célula da planta é uma planta ou uma célula de milho.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o gene é seleccionado entre um gene capaz de conferir resistência contra um insecto, um gene capaz de conferir resistência contra '4 um herbicida, um gene capaz de alterar o crescimento de uma planta, um gene capaz de conferir resistência contra a deterioração de frutos ou vegetais ou um gene capaz de conferir resistência contra condições climatéricas adversas.
14. 14. Oligonucleótido tal como identificado na SEQID NO:6.
15. 15. Oligonucleótido tal como identificado na SEQ ID NO:7.
16. 16. Planta transgénica que compreende uma célula de acordo com a reivindicação 7.
17. 17. Planta de milho transgénica que compreende uma célula de milho de acordo com a reivindicação 8 Lisboa, 19 de Novembro de 2001 . O Agente Oficia! da Frop·,,; acide industriai

    JOSÉ DE SAMPAIO A.O.IM Rua do Salitre, !·λ'. :·.··: 1269-063 LI.:ní>A