BR112020003336A2 - gene que confere resistência a patógeno fúngico - Google Patents

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Milena Ouzunova
Thomas PRESTERL
Daniela SCHEUERMANN
Gerhard HERREN
Beat Keller
Simon Krattinger
Thomas Wicker
Ping Yang
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Abstract

A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídio que confere resistência a uma planta contra um patógeno fúngico, tal como Helminthosporium turcicum. A presente invenção também se refere a uma planta (ou parte da mesma) que compreende a molécula de ácido nucleico, e aos métodos que envolvem a molécula de ácido nucleico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENE QUE CONFERE RESISTÊNCIA A PATÓGENO FÚNGICO".
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico para codificação de um polipeptídio, o qual confere resistência a uma planta contra um patógeno fúngico, tal como o Helminthosporium turcicum. A presente invenção também se refere a uma planta (ou a uma parte da mesma) que compreende a molécula de ácido nucleico e aos métodos que envolvem a molécula de ácido nucleico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] No milho (Zea mays L.), há muitos patógenos fúngicos que causam doenças nas folhas. O fungo que, indubitavelmente, pode causar a maioria dos danos sob condições climáticas tropicais e também temperadas, tais como em grande parte da Europa e da América do Norte, bem como na África e na Índia, é conhecido como Helminthosporium turcicum ou, como sinônimo, o Exserohilum turcicum (teleomorfo: Setosphaeria turcica). O H. turcicum é a causa da doença da mancha nas folhas, conhecida como "Ferrugem do norte da folha do milho" (NCLB), que pode ocorrer em proporções epidêmicas durante os anos úmidos, atacando variedades de milho vulneráveis e causando muitos danos e perdas consideráveis de produção de 30% e mais em vastas áreas. Desde os anos de 1970, tem sido procurada a resistência natural no material genético. Atualmente, são conhecidas as resis- tências quantitativas e qualitativas, mesmo que incompletas. Embora a resistência quantitativa oligo ou poligenicamente herdada apareça incompleta e não específica em relação à raça no fenótipo e seja influenciada por genes adicionais e parcialmente dominantes, a resis- tência qualitativa parece ser tipicamente específica da raça e pode ser herdada através de genes individuais, na maior parte dominantes, em loci tais como HT1, HT2, HT3, Htm1 ou HTN1 (Lipps et al., 1997,
"Interaction of Ht and partial resistance to Exserohilum turcicum in maize." Plant Disease 81:277-282; Welz & Geiger, 2000, "Genes for resistance to northern corn leaf blight in diverse maize populations." Plant Breeding 119:1-14). Os retrocruzamentos em muitas linhas puras de milho frequentemente utilizadas tais como W22, A619, B37 ou B73 causaram a introgressão dos loci HT, onde eles exibem uma dominância e uma expressão parciais como função da respectiva informação genética (Welz, 1998, "Genetics and epidemiology of the pathosystem Zea mays/Setosphaeria turcica" Habilitationsschrift, Institut für Pflanzenzüchtunq, Saatgutforschung und Populations-genetik, Universität Hohenheim).
[0003] Apesar dessa arquitetura genética complexa da resistência a NCLB no milho, até agora, principalmente, o uso do gene HT1 situado no braço longo do cromossomo 2 junto com uma resistência quantitativa parcial tem sido suficiente para controlar a helmintoporiose no milho (Welz, 1998). A base para isso é que, globalmente, as raças 0 e 1 do H. turcicum são mais prevalentes (cerca de 55%) (Lipps et al., 1997), enquanto outras raças, tais como 2N e 23N, são apenas raras e estão mesmo em áreas geograficamente restritas (Welz, 1998). Esta raça 0 é avirulenta no que diz respeito a uma planta de milho com HT1 (vide também a Tabela 1), de modo que, quando provido com uma resistência quantitativa apropriada, exibe uma resistência geral suficiente à NCLB. No entanto, muitos estudos relataram uma disseminação crescente das raças menos comuns (Jordan et al., 1983, "Ocurrence of race 2 of Exserohilum turcicum on corn in the central and eastern United States." Plant Disease 67:1163-1165; Welz, 1998). As razões para isso são ligadas à dinâmica da população de um patógeno, que permite mudanças na virulência do patógeno por novas mutações em genes com avirulência e por novas combinações de genes com virulência disponíveis. Isso pode levar à ocorrência de raças patogênicas novas,
às vezes mais agressivas. No Brasil, por exemplo, a população de H. turcicum já parece ser substancialmente mais diversa no que diz respeito à composição da raça do que, por exemplo, na América do Norte. Já nos 1990, foi relatado que as raças de H. turcicum tinham quebrado a resistência conferida pelo gene HT1. Além disso, há a instabilidade dos genes de resistência a determinados fatores ambien- tais, tais como temperatura e intensidade de luz em algumas zonas climáticas (Thakur et al., 1989, "Effects of temperature and light on virulence of Exserohilum turcicum on corn." Phytopathology 1989, 79: 631-635). Consequentemente, o uso de genes de resistência HT novos para a produção de culturas de milho comerciais a fim de obter uma resistência mais ampla e mais duradoura ao H. turcicum no milho é de importância crescente. Tabela 1: Visão geral da resistência (R) e da suscetibilidade (S) de loci de resistência em relação a raças diferentes de Helminthosporium turcicum: Patógeno Reação do hospedeiro (Ht) a cada raça Designação Locus HT1 Locus HT2 Locus HT3 Gene HTN1 da raça Ht 0 R R R R 1 S R R R 2 R S R R 3 R R S R
N R R R S 12 S S R R 23 R S S R 2N R S R S 12N S S R S 23N R S S S 123N S S S S
[0004] Uma fonte de resistência HTN1 monogênica é o milho landrace mexicano "Pepitilla" (Gevers, 1975, "A new major gene for resistance to Helminthosporium turcicum leaf blight of maize." Plant Dis Rep 59:296-300). As linhas de introgressão de HTN1 exibem um mapeamento de gene no braço longo do cromossomo 8. Ao contrário dos genes de resistência HT usuais, o HTN1 confere resistência ao retardar o início da esporulação, e desse modo combate o desenvolvi- mento das lesões. Em consequência, menos lesões, lesões menores, bem como zonas de esporulação reduzidas, são formadas (Simcox & Bennetzen, 1993, "The use of molecular markers to study Setospaeria turcica resistance in maize." Phytopathology 83: 1326-1330). As lesões clorótico-necróticas, tais como aquelas que ocorrem com a resistência conferida por HT1, HT2 ou HT3, não são formadas (Gevers, 1975).
[0005] O documento de patente W02015/032.494 descreve a iden- tificação do gene causativo, RLK1, que confere o fenótipo de resistência à "Pepitilla" em 8,06 bin no milho e descreve os marcadores moleculares que são apropriados para se beneficiar desse locus de resistência sem uma ligação próxima, gancho de ligação indesejado, levando a um impacto negativo no potencial de rendimento.
[0006] No documento de patente W02011/163.590, os genótipos PH99N e PH26N foram descritos como fontes alternativas de resistência a NCLB no cromossomo 8, 5 bin.
[0007] Com a intenção de identificar um gene de resistência a NCLB do híbrido de milho DK888, em 2010, Chung et al. publicaram um estudo para mapeamento fino do locus de resistência de 8,06 bin (Chung et al. 2010 "Characterization and fine-mapping of a resistance locus for northern leaf blight in maize bin 8.06" Theoretical and Applied Genetics 121 (2): 205-227). Investigações sobre a especificidade da raça do Helminthosporium inicialmente deixaram claro que, funcionalmente, o locus de resistência foi ligado próximo com os genes HT2 e HTN1. As anotações de genoma de um fragmento de cromossomo de 0,46 Mb de tamanho ao usar a referência B73 sugeriram vários supostos quadros de leitura abertos; no entanto, o gene causativo não foi identificado e uma verificação funcional não foi descrita.
[0008] Desse modo, um dos objetivos da presente invenção consis- te em identificar e/ou então caracterizar os genes de resistência da planta que codificam os polipeptídios que conferem ou que aumentam a resistência contra um patógeno fúngico, tal como o Helminthosporium turcicum.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] A presente invenção apresenta uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que tem a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2. Também é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3.
[0010] Também é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que tem a identidade de pelo menos 96% à sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 e uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácido que tem a identidade de pelo menos 92% à sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3.
[0011] Também é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com o cordão complementar da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 ou que hibridiza com o cordão complementar da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 sob condições de hibridização restritas.
[0012] Além disso, é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína, e a dita proteína é derivada da sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2 ou da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 por meio de substituição, deleção e/ou adição de um ou mais aminoácido(s).
[0013] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção codifica um polipeptídio que é uma quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1) ou que pertence funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede.
[0014] A molécula de ácido nucleico da invenção codifica um polipeptídio capaz de conferir (ou aumentar) resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, em particular pelo Helminthosporium turcicum, de preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum em uma planta, de preferência em uma planta da espécie Zea mays, em que o polipeptídio é expresso.
[0015] Em outro aspecto, é apresentado um vetor ou cassete de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico da presente invenção. De preferência, no vetor ou cassete de expressão, a sequên- cia de nucleotídeos da invenção é ligada de modo operável a um elemento regulador, permitindo a expressão da sequência de nucleotí- deos em uma célula da planta.
[0016] Também é apresentada uma célula hospedeira que compre- ende a molécula de ácido nucleico da invenção ou o vetor ou cassete de expressão da invenção.
[0017] Em outro aspecto, é apresentado um polipeptídio codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção. O polipeptídio é uma quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1) ou per- tence funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1. De preferência, o polipeptídio é capaz de conferir (ou aumentar) resistência a uma doença de planta causada pelo Helminthosporium turcicum, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, raças 0, 1 e/ou N em uma planta, de preferência em uma planta da espécie Zea mays, em que o polipeptídio é expresso.
[0018] Além disso, o polipeptídio pode não ser capaz de conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada pelas raças 2 e/ou 3 do Helminthosporium turcicum em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, em que o polipeptídio é expresso. A planta pode demonstrar uma resposta suscetível à infecção pelas raças 2 e/ou 3 do Helminthosporium turcicum.
[0019] Além disso, é apresentada uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, a qual compreende a molécula de ácido nucleico da invenção transgenicamente (como transgene) ou endoge- namente (como gene endógeno), o vetor da invenção, o cassete de expressão da invenção ou o polipeptídio da invenção. De preferência, a planta é resistente a uma doença de planta causada pelo Helminthosporium turcicum, em particular pelo Helminthosporium turcicum raças 0, 1 e/ou N. A planta pode demonstrar uma resposta suscetível à infecção pelas raças 2 e/ou 3 do Helminthosporium turcicum. A planta pode ser uma planta transgênica ou uma planta geneticamente modificada. A planta pode ser uma planta que compre- ende a molécula de ácido nucleico da invenção endogenamente, em que as regiões de flanqueio genômicas não contêm um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador SYN 14136 e do marcador MA0021 ou um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador MA0022 e do marcador SYN4196. Uma parte da planta da invenção, a célula de planta da planta da invenção e a semente da planta da inven- ção também são apresentadas, em que a semente compreende a molécula de ácido nucleico da invenção transgenicamente (como trans- gene) ou endogenamente (como gene endógeno), o vetor da invenção, o cassete de expressão da invenção ou o polipeptídio da invenção.
[0020] De acordo com um outro aspecto, é apresentado um método ou um processo de identificar ou de selecionar uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, que apresente resistência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, ou uma parte, uma célula ou uma semente da mesma, o qual compreende as seguintes etapas: (a) detectar na planta, ou parte, célula ou semente da mesma (ou em uma amostra da planta, ou parte, célula ou semente da mesma), a presença da molécula de ácido nucleico da presente invenção tal como descrito acima ou uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (i) uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 60% de identidade à sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60% de identidade à sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3; (iii) uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 85% de identidade às posições de nucleotídeos 1-920 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 (Éxon 1; SEQ ID NO: 6) e/ou que tem pelo menos 60% de identidade às posições de nucleotídeos 23.252-23.288 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 (Éxon 2; SEQ ID NO: 7) ou às posições de nucleotídeos 921-957 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 2 (Éxon 2; SEQ ID NO: 7) e/ou que tem pelo menos 98% de identidade às posições de nucleotídeos 23.586-24.632 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 (Éxon 3; SEQ ID NO: 8) ou às posições de nucleotídeos 958-2004 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 2 (Éxon 3; SEQ ID NO: 8); (iv) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 75% de identidade às posições 1-306 da sequência de aminoácido indicadas na SEQ ID NO: 3 e/ou que tem pelo menos 60% de identidade às posições 307-319 da sequência de aminoácido indicadas na SEQ ID NO: 3 e/ou que tem pelo menos 98% de identidade às posições 320-668 da sequência de aminoácido indicadas na SEQ ID NO: 3; em que a molécula de ácido nucleico de qualquer um dentre (i) a (iv) codifica um polipeptídio capaz de conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada pelo patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, em que o polipeptídio é expresso, e em que de preferência a molécula de ácido nucleico de qualquer um dentre (i) a (iv) codifica um polipeptídio que é ou pertença funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1); e (b) identificar ou selecionar uma planta em que ou de cuja parte, célula ou semente a molécula de ácido nucleico, tal como definido em (a), esteja presente, a qual tenha resistência ou resistência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum.
[0021] Também é apresentado um método ou um processo de identificar uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, que seja resistente a uma doença de planta causada pelo Helminthosporium turcicum, em particular pelas raças 0, 1 e/ou N do
Helminthosporium turcicum, e que compreenda a molécula de ácido nucleico da invenção endogenamente, e o método ou o processo com- preendem a detecção nos alelos da planta de pelo menos dois marca- dores, em que pelo menos um dos ditos marcadores esteja em ou dentro do intervalo cromossômico entre SYN14136 e a molécula de ácido nucleico da invenção, e pelo menos um dos ditos marcadores esteja em ou dentro do intervalo cromossômico entre a molécula de ácido nucleico da invenção e SYN4196.
[0022] Em outro aspecto, é apresentada uma planta identificada ou selecionada pelo método ou processo de identificação ou de seleção de acordo com a presente invenção, ou uma progênie da mesma.
[0023] Em outro aspecto, é apresentado um método de identificação de um alelo de um gene de resistência que confere ou aumenta resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, na Zea mays, e que de preferência codifica um polipeptídio que é ou que pertence funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1), em que método compreende as etapas a seguir: (a) realização das compara- ções de sequências ao usar (i) pelo menos uma sequência de nucleotí- deo de codificação que se origina ou é derivada de um genótipo de Zea mays, em que a sequência de nucleotídeos mapeia de preferência ao locus de resistência de 8,5 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin, e (ii) como sequência de referência, uma sequência de nucleotídeos da invenção, de preferência a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 ou uma parte da mesma, ou uma sequência de consenso derivada de um conjunto de pelo menos duas sequências de nucleotídeos, em que uma sequência de nucleotídeos é a sequência de nucleotídeos da invenção, de preferência a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 ou uma parte da mesma, e em que cada sequência de nucleotídeos do conjunto de pelo menos duas sequências de nucleotídeos codifica um polipeptídio capaz de conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, na Zea mays em que o polipeptídio é expresso, e mapeia de preferência ao locus de resistência de 8,5 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin e de preferência codifica um polipeptí- dio que é ou pertença funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1); e (b) identificação do alelo, se a comparação das sequências revelar (i) uma identidade da sequência no nível do nucleotídeo de pelo menos 85% de identidade às posições de nucleotídeos 1-920 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 e/ou pelo menos 60% de identidade às posições de nucleotídeos 23.252-23.288 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou às posições de nucleotídeos 921-957 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 2 e/ou pelo menos 98% de identidade às posições de nucleotídeos 23.586-
24.632 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou às posições de nucleotídeos 958-2004 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 2, e/ou (ii) uma identidade da sequência do nível de aminoácido codificado de pelo menos 75% de identidade às posições 1 a 306 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 e/ou de pelo menos 60% de identidade às posições 307 a 319 da sequência de aminoácido indicadas na SEQ ID NO: 3 e/ou de pelo menos 98% de identidade às posições 320 a 668 da sequência de aminoácido indicadas na SEQ ID NO: 3.
[0024] Também é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo de um gene de resistência identificado pelo método de identifica- ção de alelo de um gene da resistência.
[0025] Em um outro aspecto, é apresentado um método para conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, o qual compreende as seguintes etapas: (a) introdução, em pelo menos uma célula da planta, da molé- cula de ácido nucleico da presente invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, no cassete de expressão da invenção ou no vetor da invenção, (b) regeneração da planta a partir de pelo menos uma célula, e (c) geração da expressão da molécula de ácido nucleico na planta.
[0026] Também é apresentado um método para aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum em uma planta da invenção, o qual compreende a etapa de reduzir o nível de expressão da molécula de ácido nucleico da presente invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, no cassete de expres- são da invenção ou no vetor da invenção, na planta ou pelo menos em uma célula da planta, de preferência comparada com o nível de expres- são do gene endógeno em uma planta do tipo selvagem e resistente.
[0027] Em um aspecto adicional, é apresentado um método para produzir uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, a qual tem resistência (aumentada) a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, ou uma parte, uma célula ou uma semente da mesma, o qual compreende as seguintes etapas: (a) introdução, na planta ou pelo menos em uma célula da planta, da molécula de ácido nucleico da presente invenção, incluindo, por exem- plo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, no cassete de expressão da invenção ou no vetor da invenção, (b) opcionalmente, regeneração da planta a partir de pelo menos uma célula, e (c) geração da expressão da molécula de ácido nucleico na planta.
[0028] Em um outro aspecto, é apresentada uma planta produzida pelos métodos de produção de uma planta de acordo com a presente invenção, ou uma progênie da mesma.
[0029] Também é apresentado um método para controlar a infes- tação de um patógeno fúngico, de preferência do Helminthosporium turcicum, com mais preferência das raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, em uma população de plantas, de preferência plantas da espécie Zea mays, o qual compre- ende as seguintes etapas: (a) crescimento das plantas da presente invenção em campos agrícolas e hortículas, e (b) geração da expressão da molécula de ácido nucleico da presente invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, no cassete de expressão da invenção ou no vetor da invenção, nas plantas.
[0030] Outro aspecto da invenção consiste em um oligonucleotídeo que tem um comprimento de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, de preferência pelo menos 21, 22, 23, 24 ou 25, com mais preferência pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 300 ou 500 nucleotídeos, em que o oligonucleotídeo pode hibridizar ou parear (i) à molécula de ácido nucleico da invenção, (ii) à molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4 ou da SEQ ID NO: 5 ou (iii) à molécula de ácido nucleico complementar de (i) ou (ii).
[0031] Também é apresentado um par de oligonucleotídeos ou um kit que compreende os ditos oligonucleotídeos, em que os oligonu- cleotídeos são apropriados para parear como iniciador de avanço e iniciador reverso a uma região no genoma da planta, de preferência o genoma da Zea mays, que mostra uma cossegregação, de preferência uma cossegregação perfeita, com a molécula de ácido nucleico da invenção.
[0032] Em um aspecto adicional, é apresentado o uso de pelo me- nos um oligonucleotídeo como um marcador molecular ou parte do mesmo no método de identificação ou de seleção de uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, a qual apresenta resistên- cia aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, ou uma parte, uma célula ou uma semente da mesma, ou no método de identificação de um alelo de um gene de resistência que confere ou aumenta a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, na Zea mays, em que o marcador molecular pode detectar pelo menos um único diagnóstico de polimorfismo, deleção ou inserção de nucleotí- deo para a molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou que compreende o oligonucleotídeo, tal como descrito acima, e/ou é o par ou o kit de oligonucleotídeos, tal como descrito acima.
[0033] Em um aspecto, é apresentado o uso de pelo menos um ou pelo menos dois oligonucleotídeo(s) como marcador molecular ou parte do mesmo no método ou no processo de identificação de uma planta, tal como descrito acima, ou no método ou processo para a eliminação do gancho de ligação ligado próximo à molécula de ácido nucleico da invenção para detecção da presença ou da ausência de um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do mar- cador SYN14136 e do marcador MA0021 ou um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador MA0022 e do marcador SYN4196.
[0034] Em um outro aspecto, é apresentado um método para detectar a presença ou a ausência da molécula de ácido nucleico da invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, o qual compreende as seguintes etapas: (a) isolamento do DNA de pelo menos uma célula da planta, e (b) uso de um marcador molecular para detectar a presença ou a ausência da molécula de ácido nucleico da invenção, em que o marcador molecular pode detectar pelo menos um diagnóstico de polimorfismo, deleção ou inserção de nucleotídeo para a molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou compreende o oligonucleotídeo, tal como descrito acima, e/ou é o par ou o kit de oligonucleotídeos, tal como descrito acima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0035] A FIGURA 1 mostra o vetor p7U-nativoHT2_CDS_2 que pode ser usado para transformar as plantas de Zea mays. O cassete de expressão que contém o cDNA do gene HT2 (SEQ ID NO: 2) sob controle do promotor nativo (SEQ ID NO: 4) e do terminador (SEQ ID NO: 5) foi transformado em um vetor binário que contém, por exemplo, um gene de herbicida (por exemplo: resistência a BASTA, resistência a glifosato ou resistência a inibidor de ALS) para a subsequente transfor- mação em Agrobacterium tumefaciens para transformação da planta mediada por Agrobacterium no genótipo A188 do milho (Zea mays).
[0036] As FIGURAS 2A a 2D mostram um alinhamento de sequên- cia múltipla de CLUSTAL O (1.2.4) dos alelos RLK1 HT2 (SEQ ID NO: 2), HTN1 (SEQ ID NO: 9), PH99N (SEQ ID NO: 11) e PH26N (SEQ ID NO: 13). A posição com as diferenças de sequência é indicada por um asterisco faltante na linha inferior de cada bloco.
[0037] As FIGURAS 3A e 3B mostram um alinhamento de sequên- cia múltipla de ClustalV (PAM250) dos polipeptídios RLK1: RLK1_A619HT2_CDS.seq (SEQ ID NO: 3), RLK1_A619HT3_CDS.seq (idêntico a SEQ ID NO: 3), RLK1_B37HTN_CDS.seq (SEQ ID NO: 10), RLK1_A619HT2_éxon1.seq (SEQ ID NO: 6), RLK1_A619HT2_éxon2.seq (SEQ ID NO: 7) e RLK1_A619HT2_Éxon3.seq (SEQ ID NO: 8).
[0038] As FIGURAS 4A a 4C mostram o alinhamento de sequência do DNA de HT2 (SEQ ID NO: 2) e do cDNA do alelo RLK1 derivado do genótipo A188. Na posição 1458 a 1459 do alelo A188 uma inserção "AC" de 2 bp (letras brancas em um fundo preto), que causa um códon de terminação inicial (negrito e sublinhado), foi identificada.
[0039] A FIGURA 5 mostra o alinhamento de sequência dos aminoácidos de A619HT2 e do modificado A188 RLK1. O modificado A188 RLK é 99,1% idêntico a A619HT2.
[0040] A FIGURA 6 mostra um mapa de posições do marcador em referência às posições do marcador de AGPv02.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0041] A presente invenção é baseada na identificação do gene HT2 que codifica um polipeptídio que confere (ou aumenta) a resistência de uma planta contra um patógeno fúngico, tal como o Helminthosporium turcicum.
[0042] Por conseguinte, em um aspecto da presente invenção, é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica o dito gene HT2. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico da invenção compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que tem a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 (DNA genômico de HT2) ou na SEQ ID NO: 2 (cDNA de HT2). Também é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 (proteína HT2).
[0043] Também é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 96% de identidade à sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2, de preferência em relação ao comprimento total. De preferência, a sequência de nucleotí- deos tem pelo menos 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade à sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2, de preferência em relação ao comprimento total. Também é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequên- cia de aminoácido que tem pelo menos 92% de identidade à sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 2, de preferência em relação ao comprimento total. De preferência, a molécula de ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade à sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3, de preferência em relação ao comprimento total.
[0044] Em outra realização, é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com o cordão complementar da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 ou em uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 sob condições de hibridização restritas.
[0045] Além disso, é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína derivada da proteína codificada pela sequên- cia de nucleotídeos na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 ou derivada da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 por meio de substituição, deleção e/ou adição de um ou mais aminoácido(s).
[0046] A deleção, a substituição ou a adição de aminoácido(s) podem ser realizadas por uma técnica conhecida no estado da técnica. A mutagênese em uma sequência de nucleotídeos pode ser causada por um método conhecido, tal como o método de Kunkel, o método duplex com lacunas ou um método similar a tal método conhecido. Por exemplo, a mutagênese pode ser causada com o uso de um kit de mutagênese (por exemplo, Mutant-K ou Mutant-G (nome do produto, TAKARA Bio)) com base em um método de mutagênese sítio-dirigida, um kit de série de Mutagênese in vitro LA PCR (nome do produto, TAKARA Bio) ou similar. Alternativamente, um método de mutagênese pode ser um método que usa um mutagênico químico representado por EMS (metanossulfonato de etila), 5-bromouracila, 2-aminopurina, hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina ou um composto carcinogênico diferente, um método que compreende o tratamento com radiação ao usar raios radioativos, tais como raios X, raios alfa, raios beta, raios gama ou um feixe de íon, ou um método que compreende o tratamento com radiação ultravioleta.
[0047] Quando um resíduo de aminoácido é alterado, o aminoácido é de preferência mutado para um aminoácido(s) diferente(s) que conserve(m) as propriedades do aminoácido. Exemplos de propriedades do aminoácido são: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S e T), aminoácidos que contêm as cadeia laterais alifáticas (G, A, V, L, I e P), aminoácidos que contêm cadeias laterais contendo o grupo hidroxila (S, T e V), aminoácidos que contêm cadeias laterais contendo enxofre (C e M), aminoácidos que contêm o ácido carboxílico e que contêm as cadeias laterais contendo amidas (D, N, E e Q), aminoácidos que contêm as cadeia laterais básicas (R, K e H) e aminoácidos que contêm as cadeias laterais aromáticas (H, F, Y e W) (os aminoácidos são representados por códigos de uma letra entre parênteses). As substi- tuições de aminoácido dentro de cada grupo são chamadas substitui- ções conservadoras. As substituições conservadoras são as preferidas.
[0048] De preferência, a molécula de ácido nucleico da invenção codifica um polipeptídio capaz de conferir (ou aumentar) a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico em uma planta em que o polipeptídio é expresso.
[0049] Além disso, a molécula de ácido nucleico da invenção codi- fica um polipeptídio que pode não conferir resistência a uma doença de planta causada pelas raças 2 e/ou 3 de Helminthosporium turcicum em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, em que o polipeptídio é expresso. A planta pode demonstrar uma resposta susce- tível à infecção com as raças 2 e/ou 3 do Helminthosporium turcicum.
[0050] Um exemplo adicional da molécula de ácido nucleico da invenção pode ser uma molécula de ácido nucleico que compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 23 ou uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 24.
[0051] Em uma modalidade, o patógeno de fúngico pertence à divisão Ascomycota ou Basidiomycota. O patógeno fúngico pode pertencer à família Pleosporaceae, Pucciniaceae ou Botryosphaeriaceae. De preferência, o patógeno fúngico pertence ao gênero Setosphaeria, Bipolaris, Puccinia ou Diplodia, com mais preferência é a espécie Helminthosporium turcicum, Setosphaeria rostrata, Setosphaeria glycinea, Setosphaeria holmii, Setosphaeria khartoumensis, Setosphaeria minor, Setosphaeria monoceras, Setosphaeria pedicellata, Setosphaeria prolata, Bipolaris australis, Bipolaris brizae, Bipolaris buchioës, Bipolaris cactivora, Bipolaris clavata, Bipolaris coicis, Bipolaris colocasiae, Bipolaris crotonis, Bipolaris crustacean, Bipolaris cilíndrico, Bipolaris euchlaenae, Bipolaris halepensis, Bipolaris heveae, Bipolaris incurvata, Bipolaris indica, Bipolaris iridis, Bipolaris lersiae, Bipolaris micropus, Bipolaris miyakei, Bipolaris multiformis, Bipolaris nicotiae, Bipolaris novae-zelandiae, Bipolaris ovariicola, Bipolaris panici-miliacei, Bipolaris papendorfii, Bipolaris sacchari, Bipolaris salkadehensis, Bipolaris sorghicola, Bipolaris subpapendorfii, Bipolaris tropicalis, Bipolaris urochloae, Bipolaris zeae, Puccinia asparagi, Puccinia graminis, Puccinia horiana, Puccinia mariae-wilsoniae, Puccinia poarum, Puccinia psidii, Puccinia recondite, Puccinia sessilis, Puccinia sorghi, Puccinia striiformis, Puccinia ttiticina, Diplodia maydis, Diplodia seriata ou Stenocarpella (Diplodia) macrospora, com mais preferência o Helminthosporium turcicum, Puccinia sorghi, Diplodia macrospora ou Bipolaris maydis.
[0052] Em uma modalidade, a doença da planta é uma doença fúngica. Em uma modalidade preferida, a doença da planta é selecionada do grupo que consiste na ferrugem do norte da folha do milho (causada pelo Helminthosporium turcicum), na ferrugem do sul da folha do milho (causada pelo Bipolaris maydis), na ferrugem comum (causada pelo Puccinia sorghi) e na mancha das folhas por Diplodia (causada pelo Diplodia macrospora, também chamado Stenocarpella macrospora). Com mais preferência, a doença da planta é a ferrugem do norte da folha do milho (NCLB).
[0053] Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico da invenção codifica um polipeptídio capaz de conferir a uma planta (ou aumentar em uma planta) a resistência à ferrugem do norte da folha do milho (NCLB), isto é, resistência ao Helminthosporium turcicum, em particular resistência às raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, ou resistência às raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum.
[0054] Em uma modalidade, a planta de acordo com a invenção é a Hordeum vulgare, Hordeum bulbusom, Sorghum bicolor, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italica, Oryza minuta, Oriza sativa, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Triticum durum, Secale cereale, Triticale, Malus domestica, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Daucus glochidiatus, Beta vulgaris, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, Solanum Iycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vilis vinifera, Erythrante guttata, Genlisea aurea, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis arenosa, Arabidopsis Iyrata, Arabidopsis thaliana, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsute, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Raphanus sativus, Brassica juncacea, Brassica nigra, Eruca vesicaria subsp. sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Populus trichocarpa, Medicago truncatula, Cicer yamashitae, Cicer bijugum, Cicer arietinum, Cicer reticulatum, Cicer judaicum, Cajanus cajanifolius, Cajanus scarabaeoides, Phaseolus vulgaris, Glycine max, Gossypium sp., Astragalus sinicus, Lotus japonicas, Torenia fournieri, allium cepa, Allium fistulosum, Alium sativum, Helianthus annuus, Helianthus tuberosus e Allium tuberosum,
ou qualquer variedade ou subespécies que pertençam a uma das plantas acima mencionadas, com mais preferência a Hordeum vulgare, Hordeum bulbusom, Sorghum bicolor, Zea mays, Setaria italica, Oryza minuta, Oriza sativa, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Triticum durum, Secale cereale, Triticale, Hordeum marinum, Aegilops tauschii ou qualquer variedade ou subespécies que pertençam a uma das plantas acima mencionadas, ou com mais preferência a Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Zea mays, Triticum aestivum, Secale cereale ou qualquer variedade ou subespécies que pertençam a uma das plantas acima mencionadas.
[0055] Em uma modalidade preferida, a planta de acordo com a invenção é a Zea mays.
[0056] De preferência, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção codifica um polipeptídio que é uma quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1) ou que pertence funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1.
[0057] Em outro aspecto, é apresentado um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico da presente invenção. O vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um fago ou um vetor de expressão, um vetor de transformação, um vetor de transporte ou um vetor de clona- gem, ele pode ser de cordão duplo ou único, linear ou circular, ou ele pode ser um hospedeiro procariótico ou eucariótico, por integração em seu genoma ou transformação extracromossômica.
[0058] Também é apresentado um cassete de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção.
[0059] Em uma modalidade, no vetor ou cassete de expressão, a sequência de nucleotídeos da invenção é ligada de modo operável ao elemento regulador que permite a expressão da sequência de nucleotí- deos em uma célula da planta. A célula da planta pode ser infectável por um patógeno fúngico ou infectada por um patógeno fúngico. Em uma modalidade preferida, a célula da planta fica localizada na folha ou em um tecido da folha. O elemento regulador pode ser um promotor (nativo, sintético um promotor nuclear ou um promotor quimérico), um terminador, um intensificador ou um elemento com atuação em cis. Além disso, o elemento regulador pode ser heterólogo à sequência de nucleotídeos ligado de modo operável ao elemento regulador.
[0060] De preferência, a sequência de nucleotídeos da invenção é ligada de modo operável em um vetor de expressão a uma ou mais sequências reguladoras, o que permite a transcrição e opcionalmente a expressão em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. Como um exemplo, a sequência de nucleotídeos pode estar sob o controle de um promotor ou de um terminador apropriados. Os promotores apro- priados podem ser os promotores que são induzidos constitutivamente (ver, por exemplo, o promotor 35S do "vírus do mosaico da couve-flor" (Odell JT, Nagy F, Chua N-H (1985) "Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter." Nature 313, 810-812 1985); outros exemplos são o promotor Actina da Oryza sativa (SEQ ID NO: 43) ou o promotor EF1 da Brachypodium distachyon (SEQ ID NO: 44). Particularmente, os promotores apropriados são aqueles promotores que são induzíveis pelo patógeno (ver, por exemplo, o promotor PR1 da salsa (Rushton PJ, Torres JT, Parniske M, Wernert P, Hahlbrock K e Somssich IE (1996) Interaction of elicitor- induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes. EMBO J. 15(20): 5690-5700). Particularmente, os promotores induzíveis pelo patógeno apropriados são os promotores sintéticos ou quiméricos que não ocorrem na natureza, que são compostos de diversos elementos e que contêm um promotor mínimo, bem como, a montante do promotor mínimo, pelo menos um elemento regulador de cis que age como o sítio de ligação para os fatores de transcrição especiais. Os promotores quiméricos são projetados de acordo com a necessidade e são induzidos por vários fatores ou novamente preparados. Os exemplos de tais promotores podem em ser encontrados nos documentos W02000/29.592 e W02007/147.395. O exemplo de um terminal apropriado é o nos- terminador (Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM (1982) Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6): 561-73).
[0061] Também é apresentada uma célula hospedeira que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção ou o vetor da invenção ou o cassete de expressão da invenção.
[0062] O vetor ou o cassete de expressão podem, por exemplo, ser introduzidos na célula hospedeira por conjugação, mobilização, trans- formação biolística, transformação conferida por agrobacterium, trans- fecção, transdução, infiltração a vácuo ou eletroporação. Os métodos desse tipo, bem como os métodos para a preparação dos vetores descritos, são familiares ao elemento versado no estado da técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 3ª. Ed., 2001).
[0063] Em uma modalidade, a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica (por exemplo, uma célula bacteriana). Em outra modalidade, a célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica (por exemplo, uma célula de planta ou uma célula de levedura). Particular- mente, as células hospedeiras bacterianas preferidas são de Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes e E. coli.
[0064] Em um outro aspecto, é apresentada uma proteína codifi- cada pela molécula de ácido nucleico da invenção.
[0065] Em outro aspecto adicional, é apresentada uma planta que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção, o vetor da inven- ção, o cassete de expressão da invenção ou a proteína da invenção. A planta pode ser uma planta transgênica ou uma planta geneticamente modificada. Uma parte da planta da invenção, uma célula de planta da planta da invenção e uma semente da planta da invenção também são apresentadas, em que a semente compreende a molécula de ácido nucleico da invenção transgênica ou endogenamente, o vetor da inven- ção, o cassete de expressão da invenção ou o polipeptídio da invenção.
[0066] O documento W02015/032.494, que investigou e usou linhas de introgressão com o Htn1 da Pepitilla, apresentou o fato de que o locus de resistência é ligado próximo das regiões genômicas que carregam o gancho de ligação, tendo por resultado efeitos negativos em uma ou mais características agronômicas. A primeira investigação da região de flanqueio do HT2 indicou que este gancho de ligação ou similar não só está presente no doador da Pepitilla para a introgressão de HtN1, mas também em outros doadores para este locus de resistência de Helminthosporium, tal como A619. Inter alia, o gancho de ligação como parte da introgressão de HT2 pode fazer a diferença no tempo de floração, que é uma importante característica agronômica. Ele pode influenciar de modo direto e substancial o potencial de rendimento de uma planta Zea mays. Um tempo de floração atrasado geralmente resulta em um rendimento menor. Um gancho de ligação adicional que afeta o potencial de rendimento, em particular o potencial de rendimento da silagem, pode ser encontrado distal e/ou proximal ao locus de resistência do Helminthosporium no 8.06 bin na Zea mays. As regiões de flanqueio, ligadas próximas a este locus de resistência, podem ser portadoras do gancho de ligação conhecido, no entanto, essas regiões podem ser limitadas a um intervalo localizado entre os alelos do marcador SYN14136 e do marcador MA0021 e/ou a um intervalo locali- zado entre os alelos do marcador MA0022 e do marcador SYN4196 (FIGURA 6). Desse modo, a planta da invenção pode ser uma planta da espécie Zea mays que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção endogenamente, em que as regiões de flanqueio no genoma não contêm um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador SYN14136 e do marcador MA0021 ou um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador MA0022 e do marcador SYN4196. Em uma modalidade preferida, a planta é uma planta da espécie Zea mays que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção endogenamente, em que as regiões de flanqueio no genoma não contêm um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador SYN14136 e do marcador PZE108077560, um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador PZE 108093423 e do marcador MA0021, ou um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador MA0022 e do marcador SYN4196. Tabela 2: Sequências de iniciador do marcador KASP e atribuição aos alelos doadores (alelo X e alelo Y: descrevem os valores bialélicos dos SNPs) Marcador SNP Posição do Alelos de Alelos de Iniciador Alelos doadores marcador iniciador X(5’-3’) iniciador Y(5’-3’) comum (5’-3’) A619HT2 AGPv02[bp] [SEQ ID NO] [SEQ ID NO] [SEQ ID NO] (SNP) SYN 14136 131681497 25 26 27 A PZE-108077560 133189880 28 29 30 A PZE-108093423 150279048 31 32 33 A MA0021 151907173 34 35 36 G MA0022 152046529 37 38 39 A SYN4196 161766769 40 41 42 c
[0067] Como um exemplo, a remoção do gancho de ligação pode ser realizada por recombinação genética durante um processo de cruzamento entre duas plantas de milho, em que uma planta de milho carrega o locus de resistência HT2. Além do uso de técnicas de repro- dução convencionais para produzir uma recombinação genética que tenha o resultado de substituir pelo menos um dos intervalos doadores com o gancho de ligação identificado acima com as sequências genômicas pai recorrentes que de preferência estão livres de genes indesejados, a biotecnologia moderna oferece a um elemento versado no estado da técnica muitas ferramentas que podem permitir que uma engenharia genética precisa seja realizada. Os exemplos de ferramen- tas conhecidas incluem as meganucleases (Silva et al., 2011), endonu- cleases residentes (Chevalier 2002), nucleases de dedo do zinco, nucleases TALE (WO 2010/079.430; WO 2011/072.246) ou Sistemas CRISPR (Gaj et al., 2013). Estas são as proteínas de fusão de nuclease artificiais que são capazes de fazer a clivagem das moléculas de ácido nucleico de cordão duplo, tais como o DNA de uma planta, e, desse modo, produzir quebras do cordão duplo em posições desejadas no genoma. Ao explorar os mecanismos das próprias células para reparar as quebras do cordão duplo induzidas, uma recombinação homóloga ou uma "junção de extremidade não homóloga" pode ser realizada, o que pode levar a uma remoção dos intervalos do gancho de ligação conten- do doadores. As sequências-alvo apropriadas no genoma para o reco- nhecimento das nucleases de domínio do podem ser realizadas, por exemplo, a partir da informação de sequência dos marcadores SNP (Tabela 2). No entanto, um elemento versado no estado da técnica também pode identificar outras sequências, de preferência dentro das regiões de flanqueio definidas descritas acima, que são apropriadas co- mo sequências-alvo para os domínios de reconhecimento das nucleases.
[0068] Em um outro aspecto, é apresentada uma planta transgênica ou geneticamente modificada que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção, o vetor da invenção ou o cassete de expressão da invenção. A molécula de ácido nucleico pode ser um transgene ou um gene endógeno modificado/editado. Um promotor pode ser ligado de modo operável à molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídeo para a expressão.
[0069] Também é apresentada uma parte ou uma semente da planta da invenção, que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção, o vetor da invenção ou o cassete de expressão da invenção, em que a semente compreende a molécula de ácido nucleico da inven- ção, o vetor da invenção, o cassete de expressão da invenção. A molé- cula de ácido nucleico pode ser um transgene ou um gene endógeno modificado/editado.
[0070] De acordo com um outro aspecto, é apresentado um método de identificação ou de seleção de uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, que apresenta resistência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, ou uma parte, célula ou semente da mesma, o qual compreende as seguintes etapas: (a) detecção, na planta, ou parte, célula ou semente da mesma (ou em uma amostra da planta, ou parte, célula ou semente da mesma), da presença da molécula de ácido nucleico da presente invenção, tal como descrito acima, ou de uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (i) uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade à sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2, de preferência em relação ao comprimento total, (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade à sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3, de preferência em relação ao comprimento total, (iii) uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade às posições de nucleotídeos 1-920 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 (Éxon 1; SEQ ID NO:
6), de preferência em relação ao comprimento total, e/ou que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade às posições de nucleotídeos 23252-23288 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 (Éxon 2; SEQ ID NO: 7) ou às posições de nucleotídeos 921-957 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 2 (Éxon 2; SEQ ID NO: 7), de preferência em relação ao comprimento total, e/ou que tem pelo menos 98%, 98,5%, 99% ou 99,5% de identidade às posições de nucleotídeos 23586-24632 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 (Éxon 3; SEQ ID NO: 8) ou às posições de nucleotídeos 958-2004 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 2 (Éxon 3; SEQ ID NO: 8), de preferência em relação ao comprimento total, (iv) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade às posições 1-306 da sequência de aminoácido indicadas na SEQ ID NO: 3, de preferência em relação ao comprimento total, e/ou que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade às posições 307- 319 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3, de preferência em relação ao comprimento total, e/ou que tem pelo menos 98%, 98,5%, 99% ou 99,5% de identidade às posições 320-668 da sequência de aminoácido indicadas na SEQ ID NO: 3, de preferência em relação ao comprimento total, em que a molécula de ácido nucleico de qualquer um dentre (i) a (iv) codifica um polipeptídio capaz de conferir ou de aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, em que o polipeptídio é expresso, e em que de preferência a molécula de ácido nucleico de qualquer um dentre (i) a (iv) codifica um polipeptídio que é ou que pertença funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1); ou detecção, em uma planta, ou parte, célula ou semente da mesma (ou um amostra de plan- ta, ou parte, célula ou semente da mesma), da presença do polipeptídio codificado pela molécula de nucleico ácido da presente invenção, tal como descrito acima, ou de uma sequência de nucleotídeo de qualquer um dentre (i) a (iv), e (b) identificação ou seleção da planta em que ou em cuja parte, célula ou semente a molécula de ácido nucleico, tal como definida em (a), esteja presente, como tendo resistência ou uma resistência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum.
[0071] O método pode compreender a etapa adicional de obter uma amostra de ácido nucleico da planta ou da parte, célula ou semente e de detectar a sequência na amostra. Por exemplo, a etapa de obter a amostra de ácido nucleico da planta ou parte ou semente da mesma pode ser realizada antes da etapa de detecção (a).
[0072] A detecção de uma sequência de nucleotídeos pode ser realizada por um método de hibridização, ao usar uma sonda de oligonucleotídeos. As condições de hibridização podem ser seleciona- das apropriadamente, dependendo de fatores tais como valor de Tm da sonda usada e teor de CG do DNA alvo. Os métodos de hibridização conhecidos são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., 2001.
[0073] Alternativamente, a detecção de um gene pode ser realizada por meio de um método de amplificação do DNA, tal como PCR, ao usar os respectivos iniciadores. Quando a detecção é realizada pelo método PCR, as condições do PCR podem ser selecionadas apropriadamente, dependendo de fatores tais como o valor de Tm do iniciador usado e o comprimento da região amplificada a ser detectada. A detecção pode ser realizada pela amplificação do alvo por PCR e confirmação da presença ou da ausência de um produto amplificado com PCR. O método para confirmar a presença ou a ausência de um produto de amplificação não é particularmente limitado. Por exemplo, o produto de amplificação pode ser confirmado ao submeter uma mistura da reação de amplificação do ácido nucleico a eletroforese em gel de agarose; depois disso, manchando o gel com um ácido nucleico apropriado que mancha o reagente, tal como o brometo de etídio, o GREEN I SYBER ou similar; e detectando a presença ou a ausência de faixas que resul- tam da irradiação com raios ultravioleta. As faixas podem ser detectadas pela observação visual ou podem ser detectadas ao usar, por exemplo, um analisador de imagem fluorescente ou similar.
[0074] Também é apresentado um método ou um processo de identificação de uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, que apresenta resistência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, o Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, ou uma parte, que apresenta resistência aumentada a uma doença de planta causada pelo Helminthosporium turcicum, de preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, e que compreendem a molécula de ácido nucleico da invenção endogenamente, uma célula ou uma semente da mesma, e o método ou o processo compreendem a detecção, nos alelos da planta, de pelo menos dois marcadores, em que pelo menos um dos ditos marcadores está no ou dentro do intervalo cromossômico entre SYN14136 e a molécula de ácido nucleico da invenção, e pelo menos um dos ditos marcadores está no ou dentro do intervalo cromossômico entre a molécula de ácido nucleico da invenção e SYN4196. Em uma modalidade preferida, o método ou o processo compreendem a detecção, nos alelos da planta, de pelo menos dois marcadores, em que pelo menos um dos ditos marcadores está no ou dentro do intervalo cromossômico entre PZE108093423 e a molécula de ácido nucleico da invenção, e pelo menos um dos ditos marcadores está no ou dentro do intervalo cromossômico entre a molécula de ácido nucleico da invenção e SYN4196.
[0075] Em outro aspecto, é apresentado um método de identifica- ção de um alelo de um gene de resistência que confere ou aumenta a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, na Zea mays, e que de preferência codifica um polipeptídio que é ou que pertence funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 1 (WAK RLK1), em que o método compreende as etapas a seguir: (a) realização das compa- rações de sequências ao usar (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo de codificação isolada de um genótipo de Zea mays, em que a sequência de nucleotídeos mapeia de preferência ao locus de resistência de 8,5 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin, e (ii) como a sequência de referência, a sequência de nucleotídeos da invenção, de preferência a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 ou uma parte da mesma, ou uma sequência de consenso derivada de um conjunto de pelo menos duas sequências de nucleotídeos em que uma sequência de nucleotídeos é a sequência da invenção, de preferência a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 ou uma parte da mesma, e em que cada sequência de nucleotídeos do conjunto de pelo menos duas sequências de nucleotídeos codifica um polipeptídio capaz de conferir ou de aumen- tar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, na Zea mays em que o polipeptídio é expresso, e mapeia de preferência ao locus de resistência de 8,5 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin e de preferência codifica um polipeptídio que é ou que pertença funcio- nalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1); e (b) identificação do alelo, se a comparação das sequên- cias revelar (i) uma identidade da sequência no nível do nucleotídeo de pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identi- dade às posições de nucleotídeo 1-920 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO:1 ou na SEQ ID NO: 2, de preferência em relação ao comprimento total, e/ou de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade às posições de nucleotídeos 23252-23288 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou às posições de nucleotídeos 921-957 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 2, de preferência em relação ao comprimento total, e/ou de pelo menos 98%, 98,5%, 99% ou 99,5% de identidade às posições de nucleotídeo 23586- 24632 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou às posições de nucleotídeos 958-2004 da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 2, de preferência em relação ao comprimento total e/ou (ii) uma identidade da sequência do nível do aminoácido codificado de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade às posições 1-306 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3, de preferência em relação ao comprimento total, e/ou de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade às posições 307-319 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3, de preferência em relação ao comprimento total, e/ou de pelo menos 98%, 98,5%, 99% ou 99,5% de identidade às posições 320-668 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3, de preferência em relação ao comprimento total.
[0076] De preferência, a sequência de consenso é derivada de um conjunto de pelo menos duas sequências de nucleotídeos, em que uma sequência de nucleotídeos é a sequência de nucleotídeos da invenção, de preferência a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 3 ou uma parte da mesma, e em que uma sequência de nucleotídeos adicional é selecio- nada do grupo que consiste na sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 9 ou uma parte da mesma, a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 11 ou uma parte da mesma, a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 13 ou uma parte da mesma, a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 23 ou uma parte da mesma, uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 10 ou uma parte da mesma, uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 12 ou uma parte da mesma, uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 14 ou uma parte da mesma ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 24 ou uma parte da mesma.
[0077] Pelo menos uma sequência de nucleotídeo de codificação isolada de um genótipo de Zea mays da etapa (a) (i) pode ser derivada de um banco de dados de sequência da planta ou de um banco de genes onde as amostras da semente de vários genótipos de Zea mays estejam depositadas. Os bancos de dados de sequência da planta ou os bancos de genes são conhecidos no estado da técnica.
[0078] O método de identificação de um (novo) alelo de um gene de resistência (ou de um potencial novo alelo de um gene de resistência) que confere resistência ou resistência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico também pode compreender, por exemplo, tal como na etapa (c), a etapa de determinação do nível de resistência da planta contra o patógeno fúngico causado pelo alelo identificado.
[0079] Também é apresentada uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica um alelo de um gene de resistência (ou potencial novo alelo) identificado pelo método de identificação descrito acima. O dito alelo pode ser usado em um método de produção de uma planta, de prefe- rência uma planta da espécie Zea mays, ou em um método que confe- re/aumenta a resistência a uma doença de planta que é causada por um patógeno fúngico tal como o Helminthosporium turcicum, de preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum. Em uma realização, o método de acordo com a invenção para produzir uma planta ou o método de acordo com a invenção para conferir/aumentar a resistência a uma doença de planta compreendem ainda na etapa (a) a introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica o novo gene de resistência em pelo menos uma célula da planta.
[0080] Em outro aspecto, é apresentado um método para conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, o qual compreende as seguintes etapas: (a) introdução em pelo menos uma célula da planta da molécula de ácido nucleico da presente invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, no cassete de expressão da invenção ou no vetor da invenção, (b) regeneração da planta a partir de pelo menos uma célula, e (c) geração da expressão da molécula de ácido nucleico na planta.
[0081] Em uma modalidade preferida do método para conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, a etapa (a) resulta na modificação de uma molécula de ácido nucleico endógena que confere suscetibilidade a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, mapeando de preferência ao locus de resistência de 8,5 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin no cromossomo 8 da Zea mays e codificando de preferência um polipeptídio que é ou que pertence funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1), em que a modificação converte a molécula do ácido nucleico endógena na molécula de ácido nucleico da presente invenção, que confere resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, se expressas.
[0082] Em outra modalidade preferida do método para conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, a etapa (a) resulta na modificação de uma molécula de ácido nucleico endógena que confere resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, mapeando de preferência ao locus de resistência de 8,5 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin no cromossomo 8 da Zea mays e codificando de preferência um polipeptídio que é ou que pertence funcionalmente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1), em que a modificação converte a molécula de ácido nucleico endógena na molécula de ácido nucleico da presente invenção, que confere resis- tência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, se expressas.
[0083] Também é apresentado um método para aumentar a resis- tência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, em uma planta da invenção, o qual compreende as etapas de reduzir o nível de expressão da molécula de ácido nucleico da presente invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, no cassete de expres- são da invenção ou no vetor da invenção, na planta ou pelo menos em uma célula da planta, de preferência comparado com o nível de expressão do gene endógeno em uma planta do tipo selvagem e resis- tente. Tal tipo de planta selvagem e resistente é, por exemplo, sele- cionada das linhas A619HT2, B37HT2 ou B73HT2. A redução pode ser realizada de modo transitório ou durável, de preferência como uma medida preventiva, se a infestação pelo patógeno fúngico for esperada, por exemplo, devido a certas condições ambientais que levam à distri- buição do patógeno fúngico. Um elemento versado no estado da técnica conhece bem as várias metodologias para reduzir a expressão do gene na planta. Uma redução durável do nível de expressão pode ser conseguida, por exemplo, pela modulação do promotor ou de outros elementos reguladores por meio de uma mutagênese aleatória ou específica ou pela integração estável de um cassete de expressão,
permitindo a expressão do RNA de cordão duplo, do RNA de antis- sentido de um só cordão ou de um DNA de grampo, que podem silenciar à medida que o RNA interfere no mRNA codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção. Tal molécula inibitória do RNA, de preferência na forma de moléculas siRNA, também pode ser usada para uma redução transitória do nível de expressão se aplicada às plantas como spray e absorvida ativa ou passivamente pelas células da planta, de preferência pelas células das folhas.
[0084] Em outro aspecto, é apresentado um método para produzir uma planta (ou uma parte, célula ou semente da mesma), de preferência uma planta da espécie Zea mays, que apresenta resistência (aumen- tada) a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, ou uma parte, uma célula ou uma semente da mesma, o qual compreende as seguintes etapas: (a) introdução na planta ou pelo menos em uma célula da planta da molécula de ácido nucleico da presente invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, no cassete de expressão da invenção ou no vetor da invenção, (b) opcionalmente, regeneração da planta a partir de pelo menos uma célula, e (c) geração da expressão da molécula de ácido nucleico na planta ou em parte da mesma.
[0085] Em uma modalidade preferida do método para produzir uma planta (ou uma parte, célula ou semente da mesma) da espécie Zea mays, a etapa (a) resulta na modificação de uma molécula de ácido nucleico endógena que confere suscetibilidade a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum,
de preferência mapeando ao locus de resistência de 8,5 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin no cromossomo 8 da Zea mays, e de prefe- rência codificando um polipeptídio que é ou que pertence funcional- mente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1), em que a modificação converte a molécula de ácido nucleico endógena na molécula de ácido nucleico da presente invenção, conferindo resistência a uma doença de planta causada por um pató- geno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, se expressas.
[0086] Em outra modalidade preferida do método para produzir uma planta (ou uma parte, célula ou semente da mesma) da espécie Zea mays, a etapa (a) resulta na modificação de uma molécula do ácido nucleico endógena que confere resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, de preferência mapeando ao locus de resistência de 8,5 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin no cromossomo 8 da Zea mays, e de prefe- rência codificando um polipeptídio que é ou que pertence funcional- mente à família da quinase similar a receptor associada à parede 1 (WAK RLK1), em que a modificação converte a molécula de ácido nucleico endógena na molécula de ácido nucleico da presente invenção, conferindo uma resistência aumentada a uma doença de planta causa- da por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, se expressas.
[0087] De preferência, o método destina-se à produção de uma planta (ou uma parte, célula ou semente da mesma) que apresenta resistência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, tal como o Helminthosporium turcicum, de preferên- cia pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum. Por conseguinte, o método pode compreender a etapa adicional (d) de seleção de uma planta que apre- senta resistência aumentada se comparada a uma planta da referência. De preferência, a planta de referência é uma planta da mesma espécie, com mais preferência a planta de referência é uma planta do tipo selvagem da mesma espécie ou uma planta isogênica à planta selecionada na etapa (d), exceto quanto à molécula de ácido nucleico da presente invenção, que foi inserida na etapa (a) ou modificada durante a etapa (a), tal como descrito acima.
[0088] De preferência, nos métodos da invenção, a molécula de ácido nucleico da invenção é expressa na planta ou em parte da mesma em uma quantidade e/ou período suficiente para aumentar ou conferir resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico na planta.
[0089] Em outro aspecto, é apresentada uma planta produzida pelos métodos da invenção, ou uma progênie, fruta ou semente da mesma. De preferência, a planta ou a progênie, a fruta ou a semente da mesma compreendem a molécula de ácido nucleico da invenção, ou o vetor da invenção, ou a proteína da invenção, e/ou a célula da invenção.
[0090] Em outro aspecto, é apresentado o uso de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do novo alelo identificado de um gene de resistência, na produção de uma planta que apresenta resistência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum. A planta produzida pode ser uma planta geneticamente modificada ou transgênica.
[0091] Também é apresentado um método para controlar a infes- tação de um patógeno fúngico, de preferência do Helminthosporium turcicum, com mais preferência das raças 0, 1, 2, 3, N, 12, 23, 2N, 12N, 23N e/ou 123N do Helminthosporium turcicum, o qual compreende as seguintes etapas: (a) crescimento das plantas da presente invenção em campos agrícolas e de horticultura, e (b) geração da expressão da molécula de ácido nucleico da presente invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, no cassete de expressão da invenção ou no vetor da invenção, nas plantas.
[0092] Um outro aspecto da invenção consiste em um oligonucleotí- deo que tem um comprimento de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, de preferência pelo menos 21, 22, 23, 24 ou 25, com mais preferência pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 300 ou 500 nucleotídeos, em que o oligonucleotídeo pode hibridizar ou parear (i) à molécula de ácido nucleico da invenção, (ii) à molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4 ou da SEQ ID NO: 5, ou (iii) à molécula de ácido nucleico complementar a (i) ou (ii). De prefe- rência, o oligonucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que tem uma identidade de pelo menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% ou 100% à sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) à qual o oligonucleotídeo pode hibridizar ou parear.
[0093] Também é apresentado um par de oligonucleotídeos ou um kit que compreende os ditos oligonucleotídeos, em que os oligonucleotí- deos são apropriados para parear como iniciador de avanço e como iniciador reverso a uma região no genoma da planta, de preferência o genoma da Zea mays, que mostram uma cossegregação, de prefe- rência uma cossegregação perfeita, com a molécula de ácido nucleico da invenção. De preferência, o par compreende um ou dois oligonucleo- tídeos da invenção. De preferência, o kit compreende um, dois ou mais oligonucleotídeos da invenção
[0094] Em um aspecto adicional, é apresentado o uso de pelo me- nos um oligonucleotídeo como um marcador molecular ou parte do mesmo no método de identificação ou de seleção de uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, a qual apresenta resis- tência aumentada a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, ou uma parte, uma célula ou uma semente da mesma, ou no método de identificar um alelo de um gene de resistência que confere ou aumenta a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico, de preferência pelo Helminthosporium turcicum, com mais preferência pelas raças 0, 1 e/ou N do Helminthosporium turcicum, na Zea mays, em que o marcador molecular pode detectar pelo menos um único diagnóstico de polimorfismo, deleção ou inserção de nucleotídeo para a molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou compreende o oligonucleotídeo, tal como descrito acima, e/ou é o par ou o kit de oligonucleotídeos, tal como descrito acima. Tal único polimorfismo, deleção ou inserção de nucleotídeo pode ser derivado diretamente do alinhamento da sequência mostrado na FIGURA 2. De preferência, pelo menos um único polimorfismo, deleção ou inserção de nucleotídeo resulta em troca, deleção ou inserção de pelo menos um aminoácido. As trocas, deleções ou inserções características de uma comparação entre o polipeptídio que tem a sequência de aminoácido indicada na. SEQ ID: NO 3 e o polipeptídio RLK1 (SEQ ID NO: 10) que conferem o fenótipo de resistência a "Pepitilla", tal como descrito em W02015/1032.494, são mostrados na Tabela 2.
[0095] Em um outro aspecto, é apresentado um método para detectar a presença ou a ausência da molécula de ácido nucleico da invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, o qual compreende as seguintes etapas: (a) isolamento do DNA de pelo menos uma célula da planta, e (b) uso de um marcador molecular para detectar a presença ou a ausência da molécula de ácido nucleico da invenção, em que o marcador molecular pode detectar pelo menos um único diagnóstico de polimorfismo, deleção ou inserção de nucleotídeo para a molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou que compreende o oligonucleotídeo, tal como descrito acima, e/ou é o par ou o kit de oligonucleotídeos, tal como descrito acima.
[0096] Em um aspecto, é apresentado o uso de pelo menos um ou pelo menos dois oligonucleotídeo(s) como um marcador molecular ou parte do mesmo no método ou no processo de identificar uma planta, tal como descrito acima, em um método ou um processo para a eliminação do gancho de ligação ligado próximo à molécula de ácido nucleico da invenção para detectar a presença ou a ausência de um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador SYN 14136 e do marcador MA0021 ou um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do mar- cador MA0022 e do marcador SYN4196. Em uma modalidade preferida, pelo menos um oligonucleotídeo é usado como marcador molecular ou parte do mesmo em um método ou processo para a eliminação do gancho de ligação ligado próximo à molécula de ácido nucleico da invenção para detectar a presença ou a ausência de um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador SYN14136 e do marcador PZE108077560, um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador PZE108093423 e do marcador MA0021 e/ou um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marca- dor ou MA0022 e do marcador SYN4196.
[0097] Em outro aspecto, é apresentado um método para detectar a presença da molécula de ácido nucleico da invenção, incluindo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos do alelo identificado, em uma planta, de preferência uma planta da espécie Zea mays, compre- endendo as seguintes etapas: (a) isolamento do DNA de pelo menos uma célula da planta, e (b) uso de um marcador molecular para detectar a presença ou a ausência da molécula de ácido nucleico da invenção, em que o marcador molecular pode detectar pelo menos um único diagnóstico de polimorfismo, deleção ou inserção de nucleotídeo para a molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou compreende o oligonucleotídeo, como descrito acima, e/ou é o par ou o kit de oligonu- cleotídeos, tal como descrito acima. Tal único polimorfismo, deleção ou inserção do nucleotídeo pode ser derivado diretamente do alinhamento da sequência mostrado na FIGURA 2. De preferência, pelo menos um único polimorfismo, deleção ou inserção do nucleotídeo resulta na troca, na deleção ou na inserção de pelo menos um aminoácido. As trocas, deleções ou inserções características de uma comparação entre o polipeptídio que tem a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 e o polipeptídio RLK1 conferem o fenótipo de resistência a "Pepitilla" (SEQ ID NO: 10), tal como descrito no documento W02015/032.494, são mostrados na Tabela 3. Tabela 3: Trocas, deleções ou inserções características de uma com- paração entre o polipeptídio que tem a sequência de aminoácido indica- da na SEQ ID NO: 3 e o polipeptídio RLK1 (SEQ ID NO: 10) conferem o fenótipo de resistência a "Pepitilla", tal como descrito no documento W02015/032.494 (vide também a FIGURA 3).
Posição HTN HT2 EFEITO ÉXON 5 Q L Forte Éxon 1 7 H R Fraco Éxon 1 9 S P Fraco Éxon 1 27 G A Fraco Éxon 1 36 N S Fraco Éxon 1 51 A V Forte Éxon 1 56 E Éxon 1 75 I T Forte Éxon 1 95 E K Fraco Éxon 1 101 S P Fraco Éxon 1 102 P T Fraco Éxon 1 114 G D Forte Éxon 1 115 D N Fraco Éxon 1 122 S Éxon 1 123 Y Éxon 1 127 Q Y Fraco Éxon 1 128 Q H Moderado Éxon 1 135 R S Moderado Éxon 1 142 G E Forte Éxon 1 147 R H Moderado Éxon 1 157 L Éxon 1 158 H Éxon 1 162 A P Moderado Éxon 1 180 N D Fraco Éxon 1 182 P L Forte Éxon 1 187 D G Forte Éxon 1 188 Y N Fraco Éxon 1 196 N S Fraco Éxon 1
199 T A Moderado Éxon 1 204 R G Forte Éxon 1 210 T P Fraco Éxon 1 211 G E Moderado Éxon 1 216 Q H Fraco Éxon 1 217 E A Forte Éxon 1 223 L S Forte Éxon 1 235 R S Fraco Éxon 1 236 D E Fraco Éxon 1 239 Q Éxon 1 246 F L Fraco Éxon 1 249 T G Moderado Éxon 1 250 R Éxon 1 256 V L Moderado Éxon 1 261 F I Forte Éxon 1 266 N K Fraco Éxon 1 275 R Q Fraco Éxon 1 278 G E Moderado Éxon 1 284 W R Forte Éxon 1 297 L F Fraco Éxon 1 303 V A Forte Éxon 1 305 S N Fraco Éxon 1 314 T Éxon 2 315 K Éxon 2 316 K R Fraco Éxon 2 318 K E Fraco Éxon 2 319 E A Forte Éxon 2 320 G A Fraco Éxon 2 321 P S Fraco Éxon 2
345 G C Forte Éxon 3 352 E K Fraco Éxon 3 368 S Éxon 3 566 I T Forte Éxon 3
DEFINIÇÕES
[0098] Os termos "resistência" ou "resistente", ao se referirem a um patógeno, devem ser compreendidos como significando a capacidade de uma planta, tecido de planta ou célula de planta de resistir aos efeitos prejudiciais de um patógeno e se estende do intervalo entre o desenvol- vimento de uma doença à completa supressão do desenvolvimento da doença. A resistência pode ser completa ou parcial e pode ser espe- cífica ou não específica à raça do patógeno. Uma resistência conferida pode ser uma resistência herdada recentemente ou um aumento na resistência parcial já existente.
[0099] A resistência pode ser quantificada pelos métodos conheci- dos no estado da técnica. Por exemplo, a resistência ao Helminthosporium turcicum pode ser quantificada pela determinação de notas de classificação ao usar experiências de fenotipagem de acordo com o esquema mostrado na Tabela 4 abaixo. Por exemplo, uma planta de milho resistente ao Helminthosporium turcicum, no significado da invenção, exibe uma "resistência aumentada" ao H. turcicum por pelo menos 1 nota de classificação, de preferência por pelo menos 2 notas de classificação ou pelo menos 3 notas de classificação, e com mais preferência por pelo menos 4 notas de classificação. De preferência, uma planta de milho de acordo com a invenção exibe resistência a pelo menos uma raça do Helminthosporium turcicum que não corresponde à especificidade da raça conhecida na técnica anterior. Em uma modali- dade particularmente preferida, uma planta de milho de acordo com a invenção é resistente a todas as raças conhecidas do Helminthosporium turcicum, isto é, a resistência conferida não é específica da raça e pode ser particularmente vantajosa na formação de uma ampla resistência ao Helminthosporium turcicum. Tabela 4: Esquema de notas de classificação para experimentos de fenotipagem em testes de campo em várias localizações com a inocu- lação natural e artificial do H. turcicum (Deutsche Maiskomitee (DMK, German maize committee); AG Variety 27.02.02; (DMK J. Rath; RP Freiburg H.J. Imgraben) Nota de classificação Fenótipo 1 As plantas não exibem nenhum sintoma da doença, 0% 2 Começo da infestação, primeiros pontos pequenos (menos de 2 cm) visíveis. Menos de 5% da superfície da folha afetada. 3 Alguns pontos se desenvolvem em um estágio da folha. Entre 5 a 10% da superfície da folha afetada. 4 10 a 20% da superfície da folha afetada. Pontos claramente visíveis em diversos estágios da folha. 5 20 a 40% da superfície da folha afetada. Os pontos começam a se unir. 6 40 a 60% da superfície da folha afetada. Infestação sistemática visível nas folhas. 7 60 a 80% da superfície da folha afetada. Cerca de metade das folhas são destruídas ou secam por causa da infestação fúngica. 8 80 a 90% da superfície da folha afetada. Mais da metade das folhas destruídas ou secas por causa da infestação fúngica. 9 90 a 100% da superfície da folha afetada. As plantas ficam quase completamente secas.
[0100] O termo "hibridizar" ou "hibridização" deve ser compreendido como significando um procedimento em que uma molécula de ácido nucleico de um só cordão se aglomera com um cordão de ácido nucleico que é tão complementar quanto possível, isto é, forma pares de base com a mesma. Exemplos de métodos padrão para a hibridização foram descritos em 2001 por Sambrook et al.
De preferência, isso deve ser compreendido como significando que pelo menos 60%, com mais preferência pelo menos 65%, 70%, 75%, 80% ou 85%, particularmente de preferência 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases da molécula de ácido nucleico se submetem a uma pareação de base com o cordão de ácido nucleico que é tão comple- mentar quanto possível.
A possibilidade de tal aglomeração depende da restrição das condições de hibridização.
O termo "restrição" refere-se às condições de hibridização.
Uma maior restrição ocorre quando a pareação de base é mais difícil, uma menor restrição ocorre quando a pareação de base é mais fácil.
A restrição das condições de hibridização depende, por exemplo, da concentração de sal ou da resistência iônica e da temperatura.
Em geral, a restrição pode ser aumentada com a elevação da temperatura e/ou a redução do teor de sal.
O termo "condi- ções restritas de hibridização" deve ser compreendido como signifi- cando aquelas condições sob as quais uma hibridização ocorre princi- palmente só entre as moléculas do ácido nucleico homólogas.
O termo "condições de hibridização", com respeito a isso, refere-se não somente às condições reais que prevalecem durante a aglomeração real dos ácidos nucleicos, mas também às condições que prevalecem durante as etapas de lavagem subsequentes.
Exemplos de condições de hibridização mais restritas são as condições sob as quais principalmente só aquelas moléculas de ácido nucleico que apresentam pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência são submetidos à hibridização.
Tais condições de hibridização mais restritas são, por exemplo: 4 x SSC a 65°C e lavagens múltiplas subsequentes a 0,1 x SSC a 65°C por cerca de 1 hora.
O termo "condições de hibridização mais restritas", tal como aqui utilizado, também pode significar: hibridi- zação a 68°C em 0,25 M de fosfato de sódio, pH 7,2, 7% de SDS, 1 mM de EDTA e 1% de BSA por 16 horas e subsequente lavagem por duas vezes com 2 x SSC e 0,1% de SDS a 68°C. De preferência, a hibri- dização ocorre sob condições restritas. Condições de hibridização me- nos restritas são, por exemplo: hibridização a 4 x SSC a 37°C e subse- quente lavagem múltipla a 1 x SSC a temperatura ambiente.
[0101] A presente invenção abrange as moléculas de ácido nucleico que compreendem ou que consistem em uma sequência de nucleotí- deos que codifica uma proteína, e a dita proteína é derivada da sequên- cia de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2 ou da sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 3 por meio de substituição, deleção e/ou adição de um ou mais aminoácido(s). Na presente invenção, o termo "um ou mais aminoácido(s)" refere-se, por exemplo, a 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30 ou 1 a 20, de preferência 1 a 10, com mais preferência 1 a 7, ainda com mais preferência 1 a 5, e com particular preferência 1, 2, ou 3 aminoácidos.
[0102] O termo "ligado de modo operável" significa ligado em uma molécula de ácido nucleico comum de uma maneira tal que os elemen- tos ligados são posicionados e orientados com respeito uns aos outros de tal modo que a transcrição da molécula de ácido nucleico pode ocorrer. Um DNA que é ligado de modo operável a um promotor está sob o controle transcricional desse promotor.
[0103] "Introdução", no significado da presente invenção, inclui a integração estável por meio de uma transformação que inclui a trans- formação mediada por Agrobacterium, a transfecção, a microinjeção, o bombardeio biolístico, a inserção ao usar uma tecnologia de edição de gene, como CRISPR Systems (por exemplo, CRISPR/Cas, em particu- lar CRISPR/Cas9 ou CRISPR/Cpf1), CRISPR/CasX ou CRISPR/CasY), TALENs, nucleases de dedo do zinco ou meganucleases, opcional- mente a recombinação homóloga por meio de uma das tecnologias de edição de gene acima mencionadas que inclui de preferência um molde de reparo, a modificação do gene endógeno ao usar uma mutagênese aleatória ou específica como TILLING ou a tecnologia de edição de gene acima mencionada, etc. O termo "introdução" pode ou mão abranger a introgressão ao usar a reprodução convencional.
[0104] Os termos "transgênico", "transgênica" ou "transgene" devem ser compreendidos como significando que o respectivo gene é um gene exógeno que foi introduzido na planta. O gene exógeno pode ser derivado de uma espécie, com exceção da espécie de planta na qual é introduzido. Alternativamente, o respectivo gene pode ser um gene já presente na espécie de planta na qual é introduzido, de modo que uma ou mais cópias adicionais do dito gene estejam presentes como resul- tado da introdução do transgene. Uma "planta transgênica" é uma planta dentro de cujo genoma foi integrado pelo menos um polinucleotídeo, de preferência um polinucleotídeo heterólogo. De preferência, o polinucleotídeo foi integrado de uma maneira estável, o que significa que o polinucleotídeo integrado permanece estável na planta, é expres- so e também pode ser herdado de modo estável pela progênie. O termo "heterólogo" significa que o polinucleotídeo introduzido se origina, por exemplo, de uma célula ou de um organismo com outra informação genética da mesma espécie ou de outra espécie, ou é homólogo com a célula hospedeira procariótica ou eucariótica, mas então fica localizado em um ambiente genético diferente e desse modo é diferente de qual- quer polinucleotídeo que ocorre naturalmente correspondente possível. Um polinucleotídeo heterólogo pode estar presente além de um gene endógeno correspondente.
[0105] Os "órgãos" da planta são as folhas, as hastes da planta, os troncos, as raízes, os botões vegetativos, os meristemas, os embriões, as anteras, os ovários ou a fruta. As "partes" da planta podem significar uma fusão de vários órgãos, por exemplo, uma flor ou uma semente ou parte de um órgão, por exemplo, um segmento transversal da haste. Os exemplos dos "tecidos" da planta são o tecido do caule, o tecido de armazenamento, o tecido meristemático, o tecido embriogênico, o teci- do da folha, o tecido do botão, o tecido da raiz, o tecido tumoral da planta ou o tecido reprodutivo. O termo "células" deve ser compreendido como significando as células da planta isoladas com uma parede de célula ou agregados da mesma ou protoplastos, por exemplo.
[0106] O termo "editado geneticamente" significa que um gene endógeno é modificado, por exemplo, por meio de uma mutagênese aleatória, TILLING ou tecnologia de edição de gene. Por exemplo, de acordo com a invenção, o gene endógeno de uma planta pode ser modificado para conferir resistência (ou resistência aumentada) a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico. A modificação genética pode ser obtida, por exemplo, com o uso de métodos de mutagênese aleatória ou específica (tais como edição de gene) ou recombinação homóloga (opcionalmente, suportada pelas ferramentas de edição de gene) ou suas combinações.
[0107] Tal como aqui utilizado, o termo "modificação" significa que a sequência genética mudou em pelo menos um nucleotídeo. Isto pode ocorrer pela substituição de menos um nucleotídeo e/ou pela deleção de pelo menos um nucleotídeo e/ou pela inserção de pelo menos um nucleotídeo, contanto que resulte em uma mudança total de pelo menos um nucleotídeo se comparada à sequência de nucleotídeos antes da modificação, permitindo desse modo a identificação da modificação, por exemplo, por meio de técnicas tais como sequenciamento ou análise de PCR e similares, bem conhecidas de um elemento versado no estado da técnica.
[0108] O termo "alelo" refere-se a uma ou duas ou mais sequências de nucleotídeos em um locus específico no genoma. Um primeiro alelo está em um cromossomo, um segundo alelo no cromossomo irmão na mesma posição. Se os dois alelos forem diferentes, eles são heterozi- gotos, e se forem os mesmos, são homozigotos. Os vários alelos de um gene (alelos do gene) diferem em pelo menos um SNP. Vários alelos de um gene de resistência podem conferir resistência, possivelmente um nível diferente de resistência a uma planta, contra um patógeno fúngico, isto é, causam diferentes tipos de fenótipos da planta em resposta à infestação com um patógeno fúngico, ou constituem uma variante do gene que não pode conferir resistência, isto é, o fenótipo da planta resul- tante é suscetível a um patógeno fúngico.
[0109] De acordo com a presente invenção, o termo "sequência reguladora" significa uma sequência de nucleotídeos que influencia a especificidade e/ou a resistência da expressão, por exemplo, na medida em que a sequência reguladora confere uma especificidade de tecido específica. Uma sequência reguladora desse tipo pode estar localizada a montante do ponto de iniciação da transcrição de um promotor míni- mo, mas também a jusante do mesmo, por exemplo, em uma sequência líder transcrita, mas não traduzida, ou dentro de um íntron.
[0110] O termo "marcador molecular" ou "marcador" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é usada como referência ou ponto de orientação. Um marcador para reconhecimento de um evento de recombinação deve ser apropriado para monitorar as diferenças ou os polimorfismos em uma população de plantas. Para os marcadores, essas diferenças estão no nível do DNA e, por exemplo, são diferenças da sequência de polinucleotídeo como, por exemplo, SSRs (repetições de sequência simples), RFLPs (restrições de polimorfismos de compri- mento de fragmento), FLPs (polimorfismos de comprimento de fragmen- to) ou SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único). Os marcadores podem ser derivados de ácidos nucleicos genômicos ou expressos, tais como RNA, cDNA ou ESTs encaixados e podem ser baseados em ácidos nucleicos que são usados como sondas ou pares de iniciador e, dessa maneira, são apropriados para amplificar um fragmento de sequência ao usar os métodos à base de PCR. Os marcadores que dizem respeito aos polimorfismos genéticos entre partes de uma população podem ser detectados com o uso de métodos estabelecidos pela técnica anterior (An Introduction to Genetic Analysis. 7ª. Edição, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Esses incluem, por exemplo: sequenciamento de DNA, amplificação à base de PCR, de sequência específica, ensaios de RFLPs, ensaios de KASP, ensaios de polimorfismos de polinucleotídeo ao usar a hibridização específica de alelo (ASH), detecção de SSRs, SNPs ou AFLPs. Os métodos para detecção de ESTs (etiquetas de sequência expressas) e RAPD (DNA polimórfico amplificado aleatoriamente) também são conhecidos. Dependendo do contexto, o termo "marcador", na descrição, também pode significar uma posição de cromossomo específica no genoma de uma espécie onde um marcador específico (por exemplo, SNP) pode ser encontrado.
[0111] Os termos "distal" e "proximal" descrevem a posição de um intervalo cromossômico ou de um segmento genético em relação a um ponto de referência específico (por exemplo, um polinucleotídeo espe- cífico, um outro intervalo cromossômico ou um gene) em um cromos- somo inteiro; "distal" significa que o intervalo ou o segmento estão locali- zados ao lado do ponto de referência, distantes do centromero do cromossomo, e "proximal" significa que o intervalo ou o segmento estão localizados ao lado do ponto de referência, perto do centrômero do cromossomo.
[0112] O termo "ligado próximo" significa dois loci, dois intervalos, dois segmentos genéticos (por exemplo, gene de resistência e regiões de flanqueio) ou dois marcadores (loci de marcador) que apresentam menos do que 15 cM, menos do que 12 cM, menos do que 10 cM, menos do que 8 cM, menos do que 7 cM, menos do que 6 cM, menos do que 5 cM, menos do que 4 cM, menos do que 3 cM, menos do que 2 cM, menos do que 1 cM, menos do que 0,5 cM, menos do que 0,2 cM,
menos do que 0,1 cM de distância entre si, estabelecida ao usar o mapa genético 4 vizinhos IBM2 que está disponível publicamente no website MAIZE GDB, ou que apresentem menos do que 50 Mbp (pares de mega base), menos do que 40 Mbp, menos do que 30 Mbp, menos do que 25 Mbp, menos do que 20 Mbp, menos do que 15 Mbp ou menos do que 10 Mbp de distância uns dos outros.
[0113] O termo "intervalo" ou "intervalo cromossômico" significa um segmento linear contínuo em um DNA genômico que está presente em um cromossomo individual em uma planta ou em um fragmento de cromossomo e que geralmente é definido através de dois marcadores que representam os pontos de extremidade do intervalo no lado distal e proximal. A esse respeito, os marcadores que definem as extremidades do intervalo podem, eles mesmos, ser também uma parte do intervalo. Além disso, dois intervalos diferentes podem se sobrepor. Na descrição, um intervalo é especificado pela indicação "entre o marcador A e o marcador B". Um marcador de extremidade de um intervalo também pode ficar localizado em uma região de marcador definida para um lado do intervalo. Uma região de marcador então é definida pela provisão de dois marcadores de flanqueio e constitui um segmento cromossômico em que mais marcadores podem ficar situados, além dos marcadores de flanqueio. Os marcadores de flanqueio determinam os pontos de extremidade de uma região de marcador e eles mesmos ainda são parte da região de marcador. Se ambos os marcadores de extremidade de um intervalo forem marcadores em regiões de marcador diferentes em ambos os lados de um intervalo, a descrição especifica um intervalo indicando "entre um marcador em uma região de marcador X que é flanqueada pelos marcadores C e D e um marcador em uma região de marcador Y que é flanqueada pelos marcadores E e F". Uma região de marcador pode apresentar uma extensão de até 500.000 pares de base (bp), e de preferência pode estar entre 100.000 e 400.000 bp de tamanho, ou, particularmente, pode, de preferência, ter um tamanho entre 140.000 e 315.000 bp.
[0114] O termo "introgressão", tal como utilizado em relação à presente invenção, significa a transferência de pelo menos um alelo de gene desejado em um locus genético de uma informação genética em outra. Como exemplo, a introgressão de um alelo de gene desejado em um locus específico pode ser transferida a uma progênie por um cruzamento sexual entre dois pais da mesma espécie. Alternativa- mente, por exemplo, a transferência de um alelo de gene também pode ocorrer por uma recombinação entre dois genomas doadores em um protoplasto fundido, em que pelo menos um protoplasto doador carrega o alelo de gene desejado em seu genoma. Em cada caso a progênie, que então compreende o alelo de gene desejado, podem então ser retrocruzada outra vez com uma linha que compreende uma informação genética preferida e pode ser selecionada para o alelo de gene dese- jado. O resultado é a fixação do alelo de gene desejado em uma informação genética selecionada.
[0115] O "locus" é uma posição em um cromossomo onde um ou mais genes são encontrados e que causa uma característica agronômi- ca ou influencia uma. Em particular, o termo "locus", tal como aqui utilizado, significa o locus de resistência HT2 que confere resistência contra o patógeno Helminthosporium turcicum ou pelo menos contra uma raça do Helminthosporium turcicum.
[0116] O termo "alelo" refere-se a uma ou duas ou mais sequências de nucleotídeos em um locus específico no genoma. Um primeiro alelo está em um cromossomo, um segundo em um segundo cromossomo na mesma posição. Se os dois alelos forem diferentes, eles são hetero- zigotos, e se forem os mesmos, eles são homozigotos. Os vários alelos de um gene (alelos de gene) diferem em pelo menos um SNP. Depen- dendo do contexto da descrição, um alelo significa também um único
SNP que, por exemplo, permite a distinção entre o doador de resistência e o pai recorrente.
EXEMPLOS
[0117] Os exemplos a seguir, incluindo as experiências realizadas e os resultados obtidos, são apresentados apenas para finalidades ilustrativas e não devem ser interpretados como limitadores da presente invenção.
1. Clonagem e validação funcional do gene de resistência HT2 e HT3 a. Mapeamento QTL e desenvolvimento de recombinantes
[0118] A linha doadora A619HT2 foi cruzada e retrocruzada com a linha RP1 para criar uma linha isogênica próxima (NIL, RP1HT2A) com o fragmento principal do doador original A619HT2 no cromossomo 8 e muito poucas outras regiões doadoras pequenas. Este NIL RP1HT2A foi cruzado com seu pai recorrente RP1 para construir uma população F2. O mesmo foi feito para RP2 x RP2HT3A (o doador original era aqui A619HT3). Os pais recorrentes RP1 e RP2 eram suscetíveis a NCLB (Notas 7 a 9; conforme Tabela 4), enquanto as linhas doadoras A619HT2 e A619HT3 eram resistentes (notas 1 a 3). As notas dos NILs RP1HT2A e RP2HT3A foram 2 e 3 e 1 e 2, respectivamente.
[0119] As populações F2 foram plantadas no campo com 720 indi- víduos na localização Pocking, Alemanha. O mapeamento QTL resultou em um pico (valor LOD para a população com RP2HT3A = 168,77; valor LOD para a população com RP1HT2A = 44,02) para ambas as populações no cromossomo 8 (1,1 cM e quadro de 3,5 Mbp). Nenhum outro pico significativo foi detectado. As plantas recombinantes (NO total ~ 2.000) foram desenvolvidas em várias gerações até o estado F11. O mapeamento QTL em F2 e o mapeamento fino adicional com as recom- binantes restringiu a região cromossômica para baixo a um intervalo físico de 490 kbp (intervalo genético = 0,2 cM). Este intervalo inclui o gene RLK1.
b. Análise molecular da região alvo
[0120] Das linhas RP1HT2A e RP2HT3A, bibliotecas BAC sem gra- des foram desenvolvidas e selecionadas com 7 sondas do locus alvo. Para a região do gene candidato RLK1, um contig de BAC contígua pôde ser desenvolvida para ambas as linhas doadoras. A análise de sequência revelou que as linhas doadoras A619HT2 e A619HT3 são idênticas para a região alvo (em 1 Mbp). A sequência de cDNA RLK1 do gene candidato mostra 97 polimorfismos (nível de DNA; incl. SNPs e Indels/Deleções) e 61 mudanças de aminoácido (nível de proteína) entre as linhas que abrigam o HTN1 do documento WO 2015/032.494 A2 e o alelo HT2. Dos 97 polimorfismos, somente os 14 únicos polimorfismos de nucleotídeo (SNPs) resultam em trocas de aminoácido silenciosas que provavelmente não influenciam a atividade do gene de resistência. Todos os outros polimorfismos restantes mudam a estrutura da proteína significativamente por substituição, por adição ou por deleção. A Tabela 3 mostra 15 trocas de aminoácidos para as quais é previsto um efeito forte na estrutura da proteína. Entre essas, foi identifi- cado o aminoácido adicional específico do genótipo múltiplo. Compa- rado às sequências de cDNA RLK1 indicadas na SEQ ID NO: 11 e 13 da linha doadora descrita no documento WO 2011/163.590 A1, A619HT2 e A619HT3 diferem em 31 nucleotídeos e 12 aminoácidos. c. Validação funcional do alelo HT2 de RLK1 (i) Validação funcional ao usar a mutagênese EMS:
[0121] Uma população EMS mutagenizada de RP2HT3A foi desenvolvida. As regiões exônicas 1 e 3 de RLK1 foram selecionadas e 3 mutantes positivos que abrigam uma mudança de aminoácido foram detectados (SEQ ID NºS: 16, 18, 20, 46, 48, 50, 52, 54, 56 e 58). No cDNA RLK do mutante WVE16-92.125-001 G na posição 1625 substi- tuída por A (vide também a SEQ ID NO: 15), que leva a uma troca de aminoácido de Gly para Asp na posição 542 (vide também a SEQ ID
NO: 16); no cDNA RLK do mutante WVE16-92149-012 C na posição 95 substituída por T (vide também a SEQ ID NO: 17), que leva a uma troca de aminoácido de Pro para Leu na posição 32 (vide também a SEQ ID NO: 18); no cDNA RLK do mutante WVE16-92168-005 G na posição 115 substituída por A (vide também a SEQ ID NO: 19), que leva a uma troca de aminoácido de Ala para Thr na posição 39 (vide também a SEQ ID NO: 20); no cDNA RLK do mutante WVE16-92168-024_WVE17- 68687-013 G na posição 73 substituída por A (vide também a SEQ ID NO: 45), que leva a uma troca de aminoácido de Ala para Thr na posição 25 (vide também a SEQ ID NO: 46); no cDNA RLK do mutante WVE17- 68655-008 C na posição 301 substituída por T (vide também a SEQ ID NO: 47), que leva a uma troca de aminoácido de Pro para Ser na posição 101 (vide também a SEQ ID NO: 48); no cDNA RLK do mutante WVE17-68625-014 G na posição 715 substituída por A (vide também a SEQ ID NO: 49), que leva a uma troca de aminoácido de Val para Ile na posição 239 (vide também a SEQ ID NO: 50); no cDNA RLK do mutante WVE17-68611-006 T na posição 862 substituída por A (vide também a SEQ ID NO: 51), que leva a uma troca de aminoácido de Phe para Ile na posição 288 (vide também a SEQ ID NO: 52); no cDNA RLK do mutante WVE17-68696-002 A na posição 929 substituída por G (vide também a SEQ ID NO: 53), que leva a uma troca de aminoácido de Lys para Arg na posição 310 (vide também a SEQ ID NO: 54); no cDNA RLK do mutante WVE17-68656-011 C na posição 1289 substituída por T (vide também a SEQ ID NO: 55), que leva a uma troca de aminoácido de Thr para Ile na posição 430 (vide também a SEQ ID NO: 56); no cDNA RLK do mutante WVE17-68630-001 G na posição 1826 substi- tuída por A (vide também a SEQ ID NO: 57), que leva a uma troca de aminoácido de Cys para Tyr na posição 609 (vide também a SEQ ID NO: 58). Após a apresentação desses mutantes, eles foram avaliados no campo e na estufa.
d. Análise da expressão:
[0122] A análise da expressão de RLK1 em RP1, RP1HT2A, RP2 e RP2HT3A em um material de folha não infectado e infectado mostrou uma expressão similar nos NILs RP1HT2A e RP2HT3A. A expressão é infrarregulada no material de folha infectado. Esta resposta à infecção também pode ser mostrada para o alelo HTN1 de RLK1.
2. Série alélica RLK1 e identificação da região relevante para a reação de resistência
[0123] A fim de identificar uma região relevante para a reação de resistência ao patógeno Helminthosporium turcicum, a análise a seguir foi realizada: A análise de Bioinformática de re-sequenciamento do gene RLK1 em diferentes linhas doadoras e pais recorrentes revela a região do aminoácido relevante para a reação de resistência. Portanto, os pares de iniciador da sequência genômica para RLK1 foram desenvol- vidos a fim de cobrir as regiões exônicas. Éxon 1 só pôde ser coberto parcialmente, e Éxon 2 e 3 completamente. Os amplicons desenvolvidos foram amplificados e sequenciados em 96 genótipos com a técnica de sequenciamento PACBio. As sequências foram montadas para as sequências de consenso por genótipo. Para alguns genótipos, foram obtidas múltiplas sequências de consenso. A sequência de consenso com a quantidade mais alta de leituras de sequenciamento foi escolhida para uma montagem de todos os 96 genótipos. Os haplótipos foram determinados de acordo com a região/partes exônicas. Para o Éxon 1, 12 haplótipos diferentes; para o Éxon 2, 7 haplótipos diferentes; e para o Éxon 3, 9 haplótipos diferentes foram detectados. A distância genética foi calculada dentro do software Lasergene MegAlign (DNASTAR, Inc.). Os haplótipos diferentes foram montados no nível da sequência do DNA e da proteína (vide Tabela 5). Em consequência disso, as regiões de Éxon 1 e 2 parecem ser altamente variáveis para o gene e abrigam os domínios associados a WAK. Esta parte da proteína fica localizada no espaço intercelular e pode interagir com as proteínas fúngicas. As variações nesses dois éxons são pares de base candidatos interes- santes para esta interação. Nesta base, é possível identificar os haplótipos de Éxon 1 e 2 em novos alelos de RLK1 que podem conferir ou aumentar a resistência pelo menos ao patógeno Helminthosporium turcicum.
[0124] Além disso, a fenotipagem de diferentes linhas doadoras, as linhas isogênicas próximas e os pais recorrentes e a análise do haplótipo do locus RLK1, assim como a análise de expressão de RLK1 em linhas doadoras diferentes, linhas isogênicas próximas e pais recorrentes combinados com a análise fenotípica são realizadas para a identificação da região relevante para a reação de resistência e final- mente para a identificação de novas variantes alélicas do gene de resis- tência. A avaliação de todas as séries de dados descritas deve restringir a região relevante para a reação de resistência. Tabela 5: Distâncias genéticas [%] entre diferentes haplótipos baseados em éxon Homologia no nível do DNA Homologia no nível da proteína Sequência total: > 60% Sequência total: > 60% Éxon 1: > 85% Éxon 1: > 75% Éxon 2: > 60% Éxon 2: > 60% Éxon 3: > 98% Éxon 3: > 98%
3. Reação de resistência a outros patógenos
[0125] Um conjunto de genótipos que abrigam os diferentes alelos RLK1 foi inoculado com outros patógenos de planta, como a ferrugem do sul da folha do milho (Bipolaris maydis), a ferrugem comum (Puccinia sorghi) e Diplodia macrospora (Stenocarpella macrospora). Uma carac- terística comum desses patógenos é que a infecção se apoia em uma biologia muito similar dos fungos e no fato de que eles penetram no hospedeiro através do tecido da folha. Uma primeira experiência com a ferrugem do sul da folha do milho (Bipolaris maydis) também indica uma reação de resistência do HT2- e do alelo HTN do RLK1.
4. Introdução de resistência a NCLB causada pelo Helminthosporium turcicum em um genótipo suscetível através da transformação mediada por Agrobacterium
[0126] Três construções diferentes com a sequência cDNA HT2 (SEQ ID NO: 2) sob promotores com atividade diferente foram trans- formadas em um genótipo de milho suscetível A188: construção A com a sequência cDNA HT2 (SEQ ID NO: 2), a região nativa do promotor de -1980 bp (SEQ ID NO: 4) e a região do terminador (SEQ ID NO: 5) (vetor p7U, ver Figura 1), construção B com a sequência cDNA HT2 (SEQ ID NO: 2), o promotor de actina de Oryza sativa (SEQ ID NO: 43) e a região do terminador (SEQ ID NO: 5), e a construção C com a sequência cDNA HT2 (SEQ ID NO: 2), o promotor EF1 de Brachypodium distachyon (SEQ ID NO: 44) e a região do terminador (SEQ ID NO: 5). Para produzir, por exemplo, o vetor p7U-nativeHT2_CDS_2, o cassete de expressão que contém o gene HT2 sob o controle do promotor nativo e do terminador foi transformado em um vetor binário que contém um gene de herbicida (por exemplo: resistência a BASTA, resistência a glifosato ou resistência a inibidor de ALS) para a subsequente trans- formação em Agrobacterium tumefaciens para transformação da planta mediada por Agrobacterium no genótipo A188 do milho (Zea mays). As plantas T0 transformadas de modo estável com as diferentes constru- ções foram multiplicadas e a progênie que cresceu em uma estufa foram testadas para a resistência a NCLB. As plantas transgênicas com todas as construções diferentes mostraram um aumento na resistência a NCLB, no entanto, em graus diferentes, dependendo da localização da integração e da resistência do promotor.
5. Introdução de resistência a NCLB causada pelo Helminthosporium turcicum em um genótipo suscetível através de edição de gene
[0127] O alelo de RLK1 no genótipo de milho suscetível A188 foi identificado, sequenciado e um cDNA foi previsto (SEQ ID NO: 21). Uma comparação entre o cDNA deste alelo A188 e o cDNA de HT2 mostra que as sequências apresentam uma identidade de sequência de 99% (FIGURA 4). No entanto, há, em uma posição de 1458 a 1459 do alelo A188, uma inserção de 2 bp "AC" que causa um códon de terminação inicial depois de uma Cisteína na posição 513 (SEQ ID NO: 22). Pela eliminação desta inserção de 2 bp ao usar a edição de gene baseada nos sistemas TALENS ou CRISPR, a resistência de HT2 pôde ser restaurada no genótipo A188. A FIGURA 5 mostra no alinhamento entre a proteína RLK1 derivada do alelo RLK1 modificado de A188 (SEQ ID NO: 24) e o alelo HT2 o alto nível de identidade na sequência de aminoácido.
O cDNA do alelo RLK1 modificado de A188 é mostrado na SEQ ID NO: 23.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2; (b) uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequên- cia de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3; (c) uma sequência de nucleotídeo que tem uma identidade de pelo menos 96% com a sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2; (d) uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequên- cia de aminoácido que tem pelo menos 92% de identidade à sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3; (e) uma sequência de nucleotídeo que hibridiza com o cor- dão complementar de uma sequência de nucleotídeo tal como definido em (a) ou (b) sob condições de hibridização restritas; e (f) uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína derivada da sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeo (a) ou (b) por meio da substituição, deleção e/ou adição de um ou mais aminoácido(s) da sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeo (a) ou (b); em que a molécula de ácido nucleico está codificando um polipeptídio capaz de conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada pelo patógeno fúngico em uma planta em que o polipeptídio é expresso.
2. Método de identificação de um alelo de um gene da resis- tência, em que o alelo confere maior resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico em Zea mays, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir:
(a) a realização de comparações de sequências ao usar (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo de codificação que se origina de um genótipo de Zea mays, em que a sequência de nucleotídeo mapeia de preferência ao locus de resistência de 8,05 bin ou ao locus de resistência de 8,06 bin, e (ii) como sequência de referência, uma sequência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou uma parte da mesma, ou uma sequência de consenso derivada de um conjunto de pelo menos duas sequências de nucleotídeos em que uma sequência de nucleotídeo é a sequência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindi- cação 1 ou uma parte da mesma, e em que cada sequência de nucleotí- deo do conjunto de pelo menos duas sequências de nucleotídeos codifica um polipeptídio capaz de conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico em Zea mays em que o polipeptídio é expresso, e mapeia de preferência ao locus de resistência de 8,05 bin ou ao locus de resistência de 8,6 bin; e (b) a identificação do alelo, se a comparação das sequências revelar: i. uma identidade de sequência no nível do nucleotídeo de pelo menos 85% de identidade às posições de nucleotídeos 1 a 920 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 e/ou da pelo menos 60% de identidade às posições de nucleotídeos 23252-23288 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 ou ao nucleotídeo posiciona 921-957 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 2 e/ou de pelo menos 98% de identidade às posições de nucleotídeos 23.586 a 24.632 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 ou às posições de nucleotídeos 958 a 2.004 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 2. e/ou ii. uma identidade de sequência no nível do aminoácido de pelo menos 75% de identidade às posições 1 a 306 da sequência de aminoácido indicadas na SEQ ID NO: 3 e/ou da pelo menos 60% de identidade às posições 307-319 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 e/ou de pelo menos 98% de identidade às posições 320 a 668 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3.
3. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeo do alelo identificado pelo método como definido na reivindicação 2.
4. Vetor ou cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivin- dicação 1 ou 3, de preferência ligado operavelmente a um promotor, permitindo a expressão da sequência de nucleotídeo em uma célula da planta.
5. Polipeptídio, caracterizado pelo fato de que é codificado pela molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 3.
6. Planta ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindi- cação 1 ou 3, o vetor ou cassete de expressão como definido na reivin- dicação 4, ou o polipeptídio como definido na reivindicação 5.
7. Planta de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta geneticamente modificada ou uma planta transgênica.
8. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a planta ou parte da mesma compre- ende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 endogenamente, e as regiões de flanqueio genômicas ligadas próximas à molécula de ácido nucleico não contêm um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre alelos do marcador SYN14136 e do marcador MA0021 ou um intervalo derivado de A619HT2 ou A619HT3 localizado entre os alelos do marcador MA0022 e do marcador SYN4196.
9. Semente da planta como definida na reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nuclei- co como definida na reivindicação 1 ou 3, o vetor ou cassete de expres- são como definido na reivindicação 4, ou a proteína como definida na reivindicação 6.
10. Método de identificação ou seleção de uma planta que tem maior resistência a uma doença de planta causada por um patóge- no fúngico, ou uma parte, uma célula ou semente da mesma, caracte- rizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir: (a) a detecção na planta, ou uma parte, célula ou semente da mesma, da presença da molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, ou de uma molécula de ácido nucleico que compre- ende ou consiste em uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: i. uma sequência de nucleotídeo que tem a pelo menos 60% de identidade à sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2; ii. uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequên- cia de aminoácido que tem pelo menos 60% de identidade à sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3, em que a molécula de ácido nucleico está codificando um polipeptídio capaz de aumentar a resistência a uma doença de planta causada pelo patógeno fúngico em uma planta em que o polipeptídio é expresso; iii. às posições de nucleotídeos 1 a 920 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2 (Éxon 1; SEQ ID NO: 6) e/ou tem pelo menos 60% de identidade às posições de nucleotídeos 23.252 a 23.288 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 (Éxon 2; SEQ ID NO: 7) ou às posições de nucleotídeos 921 a 957 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 2 (Éxon 2; SEQ ID NO: 7) e/ou tem a pelo menos 98% de identidade às posições de nucleotídeos 23.586 a 24.632 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 1 (Éxon 3; SEQ ID NO: 8) ou às posições de nucleotí- deos 958 a 2.004 da sequência de nucleotídeo indicada na SEQ ID NO: 2; iv. uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequên- cia de aminoácido que tem pelo menos 75% de identidade às posições 1 a 306 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 e/ou tem pelo menos 60% de identidade às posições 307 a 319 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3 e/ou tem pelo menos 98% de identidade às posições 320 a 668 da sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO: 3; em que a molécula de ácido nucleico de qualquer um de (i) a (iv) está codificando um polipeptídio capaz de conferir ou aumentar a resistência a uma doença de planta causada pelo patógeno fúngico em uma planta em que o polipeptídio é expresso; (b) a identificação ou seleção da planta em que ou em cuja parte, célula ou semente a molécula de ácido nucleico tal como definido em (a) está presente, como dotada de uma resistência ou uma maior resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico.
11. Método para aumentar a resistência a uma doença de planta causada por um patógeno fúngico em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir: (a) a introdução, em pelo menos uma célula da planta, da molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 3, ou do vetor ou cassete de expressão como definido na reivindicação 4, (b) a regeneração da planta a partir de pelo menos uma célula, e (c) a geração da expressão da molécula de ácido nucleico na planta.
12. Oligonucleotídeo que tem um comprimento de pelo menos 15 nucleotídeos, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotí- deo pode hibridizar ou parear (i) à molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 3, (ii) à molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 4 ou da SEQ ID NO: 5, ou (iii) à molécula de ácido nucleico complementar de (i) ou (ii).
13. Par de oligonucleotídeos ou kit que compreende os ditos oligonucleotídeos, caracterizado pelo fato de que os oligonucleotídeos são apropriados para parear como iniciador de avanço e iniciador reverso a uma região no genoma da planta, de preferência o genoma de Zea mays, que mostra um cossegregação com a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 3.
14. Método para detectar a presença ou ausência da molécu- la de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 3 em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir: (a) o isolamento do DNA de pelo menos uma célula da planta, e (b) o uso de um marcador molecular para detectar a presen- ça ou ausência da molécula de ácido nucleico como definida na reivindi- cação 1 ou 3, em que o marcador molecular pode detectar pelo menos um único diagnóstico de polimorfismo, deleção ou inserção de nucleotí- deo para a molécula de ácido nucleico e/ou compreende o oligonucleotí- deo como definido na reivindicação 12 e/ou é o par de oligonucleotídeos ou kit como definido na reivindicação 13.
15. Método para identificar uma planta que tem uma maior resistência a uma doença de planta causada por Helminthosporium turcicum, caracterizado pelo fato de compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 endogenamente, e o método ou processo compreende a detecção, nos alelos da planta, de pelo menos dois marcadores, em que pelo menos um dos ditos marcadores está em ou dentro do intervalo cromossômico entre SYN 14136 e a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, e pelo menos um dos ditos marcadores está em ou dentro do intervalo cromos- sômico entre a molécula de ácido nucleico como definida na reivindi- cação 1 e SYN4196.
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