CN111247243A - 在作物植物中增加的真菌抗性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于产生具有增强的抗真菌性，优选针对玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)的幼苗抗性的植物的方法。进一步提供了用于在植物细胞、组织、器官或整株植物中引入、修饰或调节至少一种壁相关的激酶(WAK)，并从而引起苯并恶唑嗪酮类(benzoxazinoid)的合成减少并进而提高真菌抗性的方法。进一步提供了鉴定和/或修饰WAK信号级联反应中下游效应分子的方法。最后，提供了具有增强的真菌抗性的植物细胞、组织、器官或整株植物，以及提供了使用物质以靶向方式激活信号传导途径的方法。因此，本发明涉及WAK作为针对真菌病害的植物防御中的主要调节剂和关键信号传导介体以及WAK信号级联反应中的调节和串扰机制，并且进一步给出了建立与一系列作物植物有关的新型抗真菌策略的实例。

Description

在作物植物中增加的真菌抗性
技术领域
本发明涉及用于产生具有增强的抗真菌性，优选针对玉米大斑病(Northern CornLeaf Blight)的幼苗抗性的植物的方法。进一步提供了用于在植物细胞、组织、器官或整株植物中引入、修饰或调节至少一种壁相关激酶(WAK)，并从而引起苯并恶唑嗪酮类(benzoxazinoid)的合成减少并进而提高真菌抗性的方法。进一步提供了鉴定和/或修饰WAK信号级联反应中下游效应分子的方法。最后，提供了具有增强的真菌抗性的植物细胞、组织、器官或整株植物，以及提供了使用物质以靶向方式激活信号传导途径的方法。因此，本发明涉及WAK作为针对真菌病害的植物防御中的主要调节剂和关键信号传导介体以及WAK信号级联反应中的调节和串扰机制，并且进一步给出了建立与一系列作物植物有关的新型抗真菌策略的实例。
发明背景
由涵盖病毒、细菌、真菌、线虫和昆虫在内的病原体对作物植物的感染和侵染，并且所造成的损害引起栽培植物的产量大幅下降。在玉米(Zea mays)中，有许多引起叶疾病的真菌病原体。目前能够在热带和温带气候条件下(如欧洲和北美的大部分以及非洲和印度)引起最多破坏的真菌，已知为大斑病长蠕孢或者也称作玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum(有性型:Setosphaeria turcica))。大斑病长蠕孢(H.turcicum)/玉米大斑病菌(E.turcicum)是引起已知为“玉米大斑病”(NCLB)的叶斑病的起因，其在潮湿年份可以流行病的比例发生，攻击易受感染的玉米玉米品种并引起大量的破坏和30％的产量的可观损失以及同时影响更大的区域(Perkins,J.M.,and W.L.Pedersen."Disease development andyield losses associated with northern leaf blight on corn."Plant disease71.10(1987):940-943；Raymundo,A.D.,A.L.Hooker,and J.M.Perkins."Effect of gene HtNon the development of northern corn leaf blight epidemics."Plant disease(1981)；Ullstrup,AJ,and Miles,SR 1957.The effects of some leaf blights of cornon grain yield.Phytopathology 47:331-336)。继而从1970年代起，就已经在遗传材料中寻找天然的抗性。
由于病原体的抗性突破性地性质不断增强，为主要作物植物定义和建立新的对病原体抗性策略的竞赛越来越加速，即病原体适应和抵抗植物保护剂的压力和/或颠覆内源性植物防御机制的进化策略。
目前，已知有数量(quantitative)和质量(qualitative)抗性。寡基因或多基因数量抗性在表现型方面显得不完全并且对于小种没有特异性以及会受到额外的和部分显性的基因影响，而质量抗性似乎通常是小种特异性的并且可以在以下基因座通过个体来遗传的：例如，大多关于NCLB的显性抗性基因为HT1、HT2、HT3、Htm、Htn1或Htp(Lipps,P.E.,R.C.Pratt,and J.J.Hakiza."Interaction of Ht and partial resistance toExserohilum turcicum in maize."Plant disease 81.3(1997):277-282；Wang,H.,etal."Expression of Ht2-related genes in response to the HT-Toxin ofExserohilum turcicum in Maize."Annals of applied biology 156.1(2010):111-120)。在许多频繁使用的近交玉米品系如W22、A619、B37或B73中的回交(backcross)已经成功地实现了HT基因座的渐渗(introgression)，其中它们呈现出部分显性和作为各自遗传背景的功能的表达(Welz,HG(1998)."Genetics and epidemiology of the pathosystemZea mays/Setosphaeria turcica."Habilitationsschrift Institut für PfIanzenzüchtung,Saatgutforschung und Populationsgenetik,
Figure BDA0002459653610000021
Hohenheim)。WO 2011/163590 A1还将抗性来源PH99N中假定的Htn1基因标注为串联蛋白激酶样基因并公开了其基因序列，但是也并未确定其功能(例如在转基因玉米植物中)。WO 2015/032494 A2公开了鉴定衍生自供体Peptilla的HTN1基因的另一个等位基因变体以及其基因组中已整合了来自供体Pepitilla的染色体片段的抗性玉米植物，该染色体片段包含抗性基因座HTN1。
在种植玉米的潮湿气候中发现引起NCLB的半营养型真菌病原体玉米大斑病菌(真菌的无定形形式)。玉米大斑病菌在玉米残渣中生存，并随着时间在高残留和连续玉米种植系统中积累。较高的湿度和适中的温度有利于玉米大斑病菌真菌的持久性而造成巨大的产量损失，例如由于光合作用降低导致穗量有限，或者如果继发的茎杆腐烂感染和茎秆倒伏伴随叶面积的损失而导致收获损失。
作为针对各种病原体的天然防御机制，植物已进化出多层防御层来针对由病原微生物的感染(Jones,Jonathan DG,and Jeffery L.Dangl."The plant immune system."Nature444.7117(2006):323)。主要防御是基于胞外膜锚定模式识别受体(PRR)对病原体相关或宿主损害相关分子模式或特征(PAMP/DAMP)的细胞外感知。这些受体蛋白监测细胞外空间中是否存在微生物或宿主衍生的激发物，即分别为PAMP或DAMP。这些特征可以是在整个病原体类别中高度保守的并具有特征性，例如富含亮氨酸的重复受体激酶(LRR-RK)FLS2可以识别细菌鞭毛蛋白，这导致对大多数细菌的基础和广谱耐药性(Macho,Alberto P.,and Cyril Zipfel."Plant PRRs and the activation of innate immune signaling."Molecular cell 54.2(2014):263-272)。其他受体激酶仅赋予对特定病原体的某些小种的抗性(Hu,Keming,et al."Improvement of multiple agronomic traits by a diseaseresistance gene via cell wall reinforcement."Nature plants 3(2017):17009)。受体激酶具有不同类型的细胞外结构域，包括富含亮氨酸的重复序列(LRR)、赖氨酸基序(LysM)、凝集素基序或表皮生长因子(EGF)样细胞外结构域(Dardick,Chris,BenjaminSchwessinger,and Pamela Ronald."Non-arginine-aspartate(non-RD)kinases areassociated with innate immune receptors that recognize conserved microbialsignatures."Current opinion in plant biology 15.4(2012):358-366)。
在草类中，越来越多的证据表明WAK可能是真菌和细菌疾病抗性中的重要因素。WAK基因qHSR1、Htn1和OsWAK(Xa4)具有疾病抗性(Hurni,Severine,et al."The maizedisease resistance gene Htn1 against northern corn leaf blight encodes awall-associated receptor-like kinase."Proceedings of the National Academy ofSciences 112.28(2015):8780-8785.,Hu et al.2017)，但对导致观察到的表型的潜在机制和信号传导级联知之甚少。
OsWAK潜在的抗性涉及通过增强纤维素的生物合成来增强细胞强度(Hu等人，2017)。有趣的是，还描述了一种情况，其中由Snn1基因编码的小麦WAK充当敏感性因子。已经表明Snn1感知由真菌病原体颖枯壳多孢(Stagonospora nodorum)编码的SnTox1毒素，它会触发细胞死亡并允许坏死性颖枯壳多孢病原体在小麦上繁殖(Shi,Gongjun,et al."Marker development,saturation mapping,and high-resolution mapping of theSeptoria nodorum blotch susceptibility gene Snn3-B1 in wheat."Moleculargenetics and genomics 291.1(2016):107-119)。在双子叶植物中，发现拟南芥AtWAK1与多糖降解导致的细胞壁来源的寡半乳糖苷(OG)的物理结合并被识别(Kohorn,Bruce D.,etal."Pectin activation of MAP kinase and gene expression is WAK2 dependent."The Plant Journal 60.6(2009):974-982)。与仅由五个成员组成的拟南芥WAK基因家族相反，单子叶植物中的WAK基因属于一个大家族。例如，在水稻中发现>100个成员(Kanneganti,Vydehi,and Aditya K.Gupta."Wall associated kinases from plants—an overview."Physiology and Molecular Biology of Plants 14.1-2(2008):109-118)。单子叶植物中WAK的出现可能与几个功能方面有关，例如生物病(Li,Hui,et al."Anovel wall-associated receptor-like protein kinase gene,OsWAK1,playsimportant roles in rice blast disease resistance."Plant molecular biology69.3(2009):337-346；Hurni et al.2015；Zuo,Weiliang,et al."A maize wall-associated kinase confers quantitative resistance to head smut."Naturegenetics 47.2(2015):151-157；Shi,Gongjun,et al."The hijacking of a receptorkinase–driven pathway by a wheat fungal pathogen leads to disease."Scienceadvances 2.10(2016):e1600822；Hu et al.2017)、对磷缺乏的耐受性(Hufnagel,Barbara,et al."Duplicate and conquer:Multiple homologs of PHOSPHORUS-STARVATION TOLERANCE1 enhance phosphorus acquisition and sorghum performanceon low-phosphorus soils."Plant physiology 166.2(2014):659-677)、根系生长(Kaur,Ravneet,Kashmir Singh,and Jaswinder Singh."A root-specific wall-associatedkinase gene,HvWAK1,regulates root growth and is highly divergent in barleyand other cereals."Functional&integrative genomics 13.2(2013):167-177)以及配子体发育(Wang,Na,et al."The rice wall-associated receptor-like kinase geneOsDEES1 plays a role in female gametophyte development."Plant physiology160.2(2012):696-707；Hu et al.2017)。因此，越来越多的证据表明，壁相关激酶(WAK)可能特异性地在谷类作物的植物免疫中起关键作用。
仍然，对于基于WAK的植物免疫潜在的具体分子机制知之甚少，所述免疫机制对于每种病原体是高度特异性的，并因此对待识别的PAMP/DAMP是高度特异性的，并且还取决于下游信号传导级联和随后启动的效应物机制。到目前为止，确切地说，包含或不包含对病原体抗性的受体样激酶的植物的表型结果已经与植物的基因型匹配。负责WAK作用的分子机制，精确的信号传导途径以及还有不同途径之间的串扰仍然难以捉摸。
化学杀真菌剂长期以来用于控制真菌疾病。通过研究现有植物品种抑制或至少限制任何病原体侵染的抗性能力以提供与植物病原体作斗争的新的策略并提供携带感兴趣的抗性特征的新植物，一种不同的方法依赖于参与病原体抗性的复杂生物合成途径的检查和阐明，所述参与病原体抗性的复杂生物合成途径引起植物的自然病原体防御。
苯并恶唑嗪酮类(BXD)在1960年代被确认为植物的次级代谢物，其作为天然杀虫剂使用。BXD是在玉米和其他谷物物种以及某些双子叶植物中发现的一类次级代谢物，并含有2-羟基-2H-1,4-苯并恶嗪-3(4H)-一个骨架(Niemeyer,Hermann M."Hydroxamic acidsderived from 2-hydroxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one:key defense chemicals ofcereals."Journal of Agricultural and Food Chemistry 57.5(2009):1677-1696)。BXD在幼苗中合成，并以糖苷储存。主要的苷配基是2,4-二羟基-2H-1,4-苯并恶嗪-3(4H)-一(DIBOA)和2,4-二羟基-7-甲氧基-2H-1,4-苯并恶嗪-3(4H)-一(DIMBOA)。BXD是在禾本科(Poaceae)的两个亚科中合成的，并偶尔在双子叶植物的单个物种中发现。BXD主要以无活性的糖苷存储，而在受到生物压力时，它们会水解为相应的有毒异羟肟酸(例如DIMBOA)。BXD生物合成的第一步是将吲哚-3-甘油磷酸酯转化为吲哚。在玉米(Zea mays)中，该反应由Benzoxazineless1(BX1)或吲哚甘油磷酸裂解酶(本文为IGL或Igl)催化。bx1基因处于发育控制之下，并且主要负责BX的产生，而Igl基因则可通过应激信号(如伤口、草食或茉莉酸类)诱导。IGL的酶学性质类似于BX1，但是它们相应基因的转录调控是不同的。像其他Bx基因一样，bx1在植物的早期发育阶段组成性表达，这与内源性BX水平相关。四个氧原子被引入到产生DIBOA的吲哚部分中，这被称为BX2至BX5的四种细胞色素P450单加氧酶催化。另一种Bx酶BX6负责玉米中苯并恶唑嗪酮类C-7位的羟基化(Frey,Monika,et al."A 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase is integrated in DIMBOA-biosynthesis."Phytochemistry 62.3(2003):371-376)。作为进一步的实例，Bx7是催化由TRIBOA-glc形成DIMBOA-glc的O-甲基转移酶(OMT)。
这些化合物在真菌病抗性中的作用知之甚少。几十年前，很少有田间研究提出苯并恶唑嗪酮类异羟肟酸浓度与玉米秸秆腐烂、玉米大斑病和小麦茎锈病的疾病抗性之间的相关性(Long,B.J.,G.M.Dunn,and D.G.Routley."Relationship of hydroxamateconcentration in maize and field reaction to Helminthosporium turcicum."CropScience 18.4(1978):573-575)，而没有为这种现象提供任何分子基础。其他研究甚至发现BXD对真菌病抗性(包括玉米秸秆腐烂、南部玉米叶枯病、玉米炭疽病、玉米黑穗病和赤霉病)没有影响(Niemeyer，2009)。
因此，本发明的一个突出目的是提供新的工具和方法，以允许对主要作物植物进行针对真菌植物病原体控制方面的严格抗性管理。
此外，本发明的目的是基于开发由次级代谢物介导的植物内源性防御机制，提供对抗真菌叶病的新策略和方法，并进一步提供具有特定基因型的植物作为增加的针对引起严重植物病害的真菌病原体的抗性或耐受性来源。基本上，本发明的目的是阐明由WAK基因ZmWAK-RLK1引起的玉米Htn1玉米大斑病(NCLB)抗性的分子基础，以建立分子靶标和相关生物合成途径之间的串扰机制，来通过表征植物中疾病抗性涉及的分子机制，为各种重要作物植物提供新的急需抗性策略。
发明内容
通过鉴定由WAK基因ZmWAK-RLK1引起的玉米Htn1玉米大斑病(NCLB)抗性的分子基础来实现上述目的。已经证明ZmWAK-RLK1调节苯并恶唑嗪酮类(BXD)生物合成途径的上游，即它在苯并恶唑嗪酮类(BXD)生物合成途径的上游起作用，这导致降低的BXD浓度。此外，证实在调节BXD的生物合成和真菌病中WAK与下游效应物，即BX酶和Igl的相互作用。此外，本发明基于与茉莉酸(JA)的植物WAK信号传导途径的串扰和交叉调控的相关信息以及进一步的相关植物生物合成途径，以阐明对于调节和诱导针对主要病原体的植物防御重要的调控网络。
有趣的是，BXD生物合成受损的玉米植株对NCLB的抗性增强。因此，这些对WAK介导的定量疾病抗性的新见解首次提供了WAK与次级代谢物BXD之间的功能联系，所述联系被用来定义新的真菌防御策略，而不仅仅是使用杀真菌剂控制疾病，这可用于几种相关的真菌病原体，在几种重要的作物植物中通过病原体相关的PAMP/DAMP诱导相当的植物免疫反应。
因此，本发明转化有关分子机制、激酶结构域中的特定突变对WAK的信号传导功能的影响、以及进一步对信号传导级联的串扰和相互作用的信息，来提供具有确定遗传背景的植物，并从而为植物提供针对真菌病原体的增强的抗性。此外，本发明提供调节(增加/减少)或中和植物次级代谢物和负责所述次级代谢物的合成途径的相关基因的作用的方法，来以靶向方式增强真菌病原体抗性。
因此，一方面，提供了一种用于产生与相应的对照植物相比具有增加的真菌抗性的植物的方法，其中所述真菌抗性由至少一种壁相关激酶调节，所述方法包括：(i)(a)提供至少一个具有特定基因型的植物细胞、组织、器官或整株植物，所述特定基因型关于在所述植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中存在至少一个编码壁相关激酶的基因；或(i)(b)将至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因导入植物细胞、组织、器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞的基因组中；和(ii)(a)在所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中修饰至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因；和/或(ii)(b)在所述至少一种植物细胞、组织、器官或整株植物中调节至少一种壁相关激酶的表达水平和/或从所述至少一种壁相关激酶到至少一种苯并恶唑嗪酮类合成的所述信号传导途径内或至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径内至少一种分子的转录水平、表达水平或功能；(iii)从所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中产生植物群体，以及(iv)基于对至少一种苯并恶唑嗪酮类化合物的合成减少(优选响应于真菌病原体感染)的确定，从该群体中选择/鉴定具有增强的真菌抗性的植物，其中所选择的植物基于苯并恶唑嗪酮类化合物的合成减少而具有增强的真菌抗性，和/或其中所述至少一种苯并恶唑嗪酮类化合物的合成受所述至少一种壁相关激酶的调节。
在本发明各个方面的一个实施方案中，所述至少一种壁相关激酶是WAK-RLK1基因，优选选自Htn1、Ht2或Ht3或其等位基因变体、其突变体或功能片段、或编码其的基因，优选其中所述至少一种壁相关激酶a)由包含SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列的核酸分子或其功能片段编码，b)由包含与SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的核苷酸序列的核酸分子编码，优选在序列的整个长度上，c)由在严格条件下与a)或b)的互补序列杂交的核酸分子编码，d)由包含编码SEQID NO：2或8的氨基酸序列或其功能片段的核苷酸序列的核酸分子编码，e)由包含编码与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子编码，优选在序列的整个长度上，f)包含SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列，或g)包含与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的氨基酸序列，优选在序列的整个长度上，条件是a)至g)中的任何序列(任选在表达后)仍编码至少一个功能性Htn1、Ht2或Ht3或其等位基因变体、突变体或功能片段。优选地，本发明的至少一种壁相关激酶在表达后引起至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成减少。更优选地，在玉米中，编码所述至少一种壁相关激酶的基因或核酸分子位于8号染色体的长臂上的bin 5或bin 6的基因座上或定位在8号染色体的长臂上的bin 5或bin 6的基因座上。
在本发明各个方面的另一个实施方案中，其生物合成受所述至少一种壁相关激酶调节的苯并恶唑嗪酮类选自以下至少一种：DIM2BOA、DIMBOA、HMBOA、HM2BOA、HDMBOA、HDM2BOA、HBOA、DHBOA、DIBOA或TRIBOA，葡糖苷或甙配基形式的前述苯并恶唑嗪酮类，或苯并恶唑啉酮，或前述苯并恶唑嗪酮类的任意组合，优选其中生物合成受至少一种壁相关激酶调节的苯并恶唑嗪酮类选自以下至少一种：DIM2BOA、DIMBOA、HMBOA或HDMBOA，葡萄糖苷或糖苷配基形式的前述苯并恶唑嗪酮类，或前述苯并恶唑嗪酮类的任意组合。
在另一个实施方案中，提供了一种方法，其中通过提供至少一种壁相关激酶、其等位基因变体、突变体或功能片段或编码其的基因，来实现至少一种苯并恶唑嗪酮类的减少的合成，其中所述至少一种壁相关激酶包含可直接或间接影响苯并恶唑嗪酮类(合成)途径和至少一种额外的植物代谢途径优选病抗性相关途径的序列，其中所述植物代谢途径选自由以下组成的组：茉莉酸途径、乙烯途径、木质素合成途径、防御途径、受体样激酶途径和/或细胞壁相关途径。
在本发明各个方面的又一个实施方案中，针对其抗性增加的真菌抗性，或由所述真菌引起的疾病选自格孢腔菌(Pleosporales)目的真菌，包括引起玉米大斑病(NCLB)(特别是影响玉米和小麦植物)的玉米大斑病菌(E.turcicum)/大斑病长蠕孢(H.turcicum)、南部玉米叶枯病(玉米小斑病菌(Bipolaris maydis))，引起锈病的Pucciniales目，包括常见锈病(高粱柄锈菌(Puccinia sorghi))、或Diploida叶条纹/枯萎(Diploida macrospora/Stenocarpella macrospora)或禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)或镰刀菌属(Fusarium spp.)，优选引起镰刀菌茎腐烂的Fusarium verticilioides，或赤霉菌属(Gibberella spp.)，例如引起赤霉茎腐病的玉米赤霉菌(Gapberella zeae)、锈病、茎腐病、玉米丝黑穗病(丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana))和Diploida叶条纹/枯萎。
在本发明各个方面的实施方案之一中，将所述至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因稳定地整合/引入至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中，或将所述至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因瞬时导入植物细胞、组织、器官或整株植物。
在本发明各个方面的另一个实施方案中，在从所述至少一种壁相关激酶到合成至少一种苯并恶唑嗪酮类的信号传导途径内或在至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径中的所述至少一种分子选自由以下组成的组：基因bx1(SEQ ID NO：10)、bx2(SEQ ID NO：12)、igl(SEQ ID NO：14)、bx6(SEQ ID NO：16)、bx11(SEQ ID NO：18)、bx14(SEQ ID NO：20)、opr2(SEQ ID NO：22)、lox3(SEQ ID NO：24)或aoc1(SEQ ID NO：26)或其同源基因，或蛋白BX1(SEQ ID NO：11)、BX2(SEQ ID NO：13)、IGL(SEQ ID NO：15)、BX6(SEQ ID NO：17)、BX11(SEQ ID NO：19)、BX14(SEQ ID NO：21)、OPR2(SEQ ID NO：23)、LOX3(SEQ ID NO：25)或AOC1基因(SEQ ID NO：27)或其同源物。
在本发明各个方面的另一个实施方案中，将所述至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因稳定地整合到所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中，并且引入所述至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因包括植物育种期间所述至少一个基因的渐渗。
在本发明各个方面的又一个实施方案中，在上述公开方面的方法的步骤(ii)(a)或(ii)(b)中对至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因的修饰是通过至少一种位点特异性核酸酶(SSN)或其催化活性片段或编码其的核苷酸序列、寡核苷酸定向诱变、化学诱变或TILLING来进行的。
在本发明各个方面的又一个实施方案中，所述至少一种位点特异性核酸酶(SSN)或编码其的核酸序列选自以下至少一种：CRISPR核酸酶(包括Cas或Cpf1核酸酶)、TALEN、ZFN、大范围核酸酶、碱基编辑复合体、限制性内切酶(包括FokI或其变体)、或两个位点特异性切口内切核酸酶、或其变体或催化活性片段。
根据本发明各个方面的一个实施方案，步骤(i)中提供的至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物选自由以下组成的组：大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeumbulbusom)、双色高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉蜀黍属(Zeaspp.)包括玉米(Zea mays)、小米(Setaria italic)、小粒稻(Oryza minuta)、水稻(Oryzasativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malus domestica)、紫短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucus glochidiatus、甜菜属(Betaspp.)包括甜菜(Beta vulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、Erythrante guttata、螺旋狸藻(Genlisea aurea)、黄瓜(Cucumis sativus)、川桑(Morus notabilis)、Arabidopsisarenosa、深山南芥(Arabidopsis lyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursapastoris)、Olmarabidopsis pumila、筷子芥(Arabis hirsute)、欧洲油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassica oeleracia)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassica nigra)、Eruca vesicaria subsp.sativa、甜橙(Citrus sinensis)、麻风树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、山下鹰嘴豆(Cicer yamashitae)、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、网状鹰嘴豆(Cicer reticulatum)、Cicer judaicum、木豆(Cajanuscajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉属(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotusjaponicas)、夏堇(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、蒜(Allium sativum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthus tuberosus)和韭菜(Allium tuberosum)，或属于上述植物之一的任何变种或亚种，优选其中步骤(i)中所述植物细胞、组织、器官或整株植物选自玉米或小麦属，或属于上述植物之一的任何变种或亚种
在另一方面，提供了植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料，或其衍生物或后代，其可通过根据本发明方法的任何一个实施方案的方法获得。
在本发明的另一个方面，提供了一种方法，所述方法用于鉴定与相应对照植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料相比，植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中参与增加的病原体抗性，优选参与增加的真菌抗性的至少一个基因，所述方法包括：(i)确定所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因型，所述基因型关于在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因组中编码壁相关激酶的至少一个基因的存在；(ii)任选地：确定步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的苯并恶唑嗪酮类特征；(iii)将步骤(i)或(ii)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料暴露于刺激下，任选地其中所述刺激与所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的苯并恶唑嗪酮类特征相关，优选其中所述刺激与真菌病原体感染相关；(iv)在暴露于刺激后，对从步骤(i)或(ii)的至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料获得的至少一种分析物进行分析；(v)确定在所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的至少一个细胞中在暴露于根据步骤(iii)的刺激后受到调控的至少一个基因，所述至少一个基因可从步骤(iv)中定义的至少一种分析物的分析推导出，(vi)对步骤(v)中所确定的至少一个基因进行功能表征；和(vii)提供在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中参与增加的病原体抗性，优选增加的真菌抗性的至少一个基因。
还提供了植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代，其可通过将至少一个基因引入植物细胞、组织、器官、或整株植物的至少一种的至少一个细胞中而获得，所述至少一个基因由用于鉴定参与增加的病原体抗性的至少一个基因的方法提供。
在本发明的另一个实施方案中，提供了可通过本发明的方法获得的植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代，其中至少一个基因的引入是稳定引入，优选由常规植物育种介导的稳定引入，或由分子生物学的手段介导的稳定引入(包括基因组编辑)，或其组合，所述至少一个基因由用于鉴定参与增加的病原体抗性的至少一个基因的方法提供。
在本发明的又一方面，提供了一种与相应的对照植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料相比，在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中增加病原体抗性，优选真菌抗性的方法，所述方法包括：(i)(a)提供至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料；(ii)(a)用中和至少一种苯并恶唑嗪酮类的作用的物质处理根据步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料，和/或(ii)(b)用活化至少一种壁相关激酶下游的信号传导途径的物质处理根据步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料；和/或(ii)(c)修饰步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的至少一个基因的至少一个启动子或至少一个调控序列，其中所述至少一个启动子或至少一个调控序列参与调节参与至少一种壁相关激酶的信号传导途径或下游的至少一个基因的转录；(iii)在至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中减少至少一种苯并恶唑嗪酮类的量，并从而增加病原体抗性，优选地为真菌抗性。
进一步提供了在增加病原体抗性的方法的方面所定义的物质用于在至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中增加病原体抗性，优选真菌抗性中的用途。
定义
如本文所用，术语“活性片段”或“功能片段”指的是氨基酸序列，其是指从给定模板氨基酸序列或编码其的核酸序列衍生的核心序列，包含模板序列的全部或部分活性位点，条件是所得到的催化活性片段仍具有天然酶或其变体的活性位点负责的表征模板序列的活性。所述修饰适于产生仍具有与模板序列相同活性的较小体积氨基酸序列，使得催化活性片段成为空间上不太苛刻的更通用或更稳定的工具。对于不代表酶的氨基酸序列，术语“功能片段”也可以暗示氨基酸序列的一部分或结构域参与与另一分子的相互作用，和/或参与细胞内的任何结构功能。
如本文所用，“等位基因”或“等位基因变体”是指给定基因的变体形式。由于大多数多细胞生物都有两套染色体；也就是说，它们是二倍体(或者，如果存在更多的染色体组，则它们是多倍体)，这些染色体称为同源染色体。如果同源染色体上一个基因(或基因座)的两个等位基因相同，则它们和生物体就该基因(或基因座)而言是纯合的。如果等位基因不同，则则它们和生物体相对于该基因是杂合的。等位基因可以导致相同或不同的可观察表型。因此，术语“等位基因”是指基因组中特定位点的一个或两个或多个核苷酸序列。第一个等位基因在染色体上，第二个在第二染色体的同一位置。如果两个等位基因不同，则它们是杂合的；且如果它们相同，则它们是纯合的。一个基因的各种等位基因(基因等位基因)在至少一个SNP(单核苷酸多态性)上有所不同。
如本文所用的“互补”或“互补性”描述了两种DNA、两种RNA之间的关系，或对于根据本发明的杂交序列，RNA和DNA核酸区域之间的关系。由DNA或RNA的核碱基定义，两个核酸区域可以根据锁钥模型彼此杂交。为此，Watson-Crick碱基配对的原理基于腺嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶以及鸟嘌呤和胞嘧啶分别作为互补碱基。此外，非沃森-克里克配对，如反向沃森-克里克、Hoogsteen、反向Hoogsteen和摆动配对包含在本文中使用的术语“互补”中，只要各个碱基对可以彼此形成氢键键合，即基于所述互补性，两条不同的核酸链可以彼此杂交。
本文所用的术语“构建体”尤其是“遗传构建体”或“重组构建体”(在本文中可互换使用)指包含以下的构建体：质粒或质粒载体、粘粒、人工酵母-或细菌人工染色体(YAC和BAC)、噬粒、基于细菌噬菌体的载体、表达盒、分离的单链或双链核酸序列，其含有DNA和RNA序列或氨基酸序列，包括修饰病毒在内的病毒载体，其组合或混合物，用于引入或转化、转染或转导入本公开所述的靶细胞或植物、植物细胞、组织、器官或材料。
如本文所用，术语“递送构建体”或“递送载体”是指用作用于运输感兴趣的核酸(包含RNA和DNA的杂交核酸)和/或氨基酸序列货物进入靶细胞，优选真核细胞的任何生物或化学手段。本文所用的术语“载体”指递送本公开所述遗传或重组构建体到靶细胞、组织、器官或植物的转运工具。载体因而包括核酸序列任选包括序列如调控序列或定位序列以用于直接或间接递送到感兴趣靶细胞或植物所需细胞区室中的植物靶结构。载体也能用于引入氨基酸序列到靶细胞或靶结构。通常，本文所用的载体可以是质粒载体。术语“直接引入”指含有本公开所述待修饰核酸序列的所需靶细胞或靶结构直接转化或转导或转染到感兴趣的特定靶细胞，其中用载体递送的材料会发挥其作用。术语“间接引入”指在某一结构中实现引入，例如叶的细胞或者植物器官或组织的细胞，其自身不代表待转化的实际感兴趣靶细胞或结构，但这些结构用作系统性传播和转移载体(优选包括本公开所述遗传构建体)到实际植物靶结构(例如分生细胞或组织)的基础。在术语“载体”用于转染氨基酸序列到靶细胞的上下文中，术语“载体”指用于肽或蛋白转染的合适试剂，例如离子脂质混合物、细胞穿透肽(CPP)或粒子轰击。在引入核酸材料的上下文中，术语“载体”不仅能指质粒载体，也指能用作引入核酸或氨基酸序列递送(例如通过粒子轰击方式)到感兴趣靶细胞的基础的合适载体材料。所述载体材料包括例如金或钨粒子。最后，术语“载体”也指使用病毒载体引入至少一种根据本公开所述遗传构建体，如修饰的病毒以及细菌载体，例如农杆菌，如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。最后，术语“载体”也指适当化学转运剂，用于引入线性核酸序列(单或双链)或氨基酸序列或其组合到靶细胞，与物理引入方法相组合，包括聚合物或基于脂质的递送构建体。
因此合适的“递送构建体”或“载体”包含用于将核苷酸序列和/或氨基酸序列递送到靶细胞的生物学手段，包括病毒载体、农杆菌属，或化学递送构建体，包括纳米颗粒，例如中孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)，阳离子聚合物包括基于PEI(聚乙烯亚胺)聚合物的方法或聚合物如DEAE-葡聚糖，或非共价表面附着PEI以产生阳离子表面，脂质或聚合物囊泡或其组合。脂质或聚合物囊泡可以选自例如脂质、脂质体、脂质包封系统、纳米颗粒、小核酸-脂质颗粒制剂、聚合物和聚合物囊泡。
本文在原核或真核细胞，优选根据本公开的植物或植物细胞或植物材料的上下文中使用的术语“衍生物”或“子代”或“后代”涉及由自然生殖性繁殖，包括有性繁殖和无性繁殖产生的这种细胞或材料的子代。本领域技术人员公知，所述繁殖可导致由自然现象产生的突变导入生物体基因组中，所述突变导致后代或子代与亲本生物体或细胞在基因组上不同，然而，它们仍然属于相同的属/种，并且具有与亲本重组宿主细胞大致相同的特征。这样的由生殖或再生过程中的自然现象产生的衍生物或子代或后代因此包含在本公开内容的术语中。因此，这些术语不是指任何任意的衍生物、后代或子代，而是指与亲代细胞或病毒或其分子系统发生相关即基于其亲代细胞的衍生物、后代或子代，衍生物、后代或子代以及“亲本”之间的关系明显可由本领域技术人员推断。“子代”包括植物、植物细胞、植物组织或植物器官的任何后续世代。
此外，术语“衍生物”可以指，在物质或分子而不是指细胞或生物体的情况下，直接地或通过修饰间接地从另一个获得。这可能意味着从细胞获得的核酸序列或来自细胞或植物的代谢物。
此外，本文在生物学序列(核酸或氨基酸)或分子或复合物的上下文中使用的术语“衍生”或“衍生自”暗示相应序列基于参考序列，例如来自序列表，或数据库登录号，或相应的支架结构，即源自所述序列，而参考序列可包含更多序列，例如病毒的全基因组或完整多蛋白编码序列，而“衍生自”天然序列的序列可以仅包含其一个分离的片段或其连续片段。在这种情况下，cDNA分子或RNA可以说是“源自”作为分子模板的DNA序列。因此，本领域技术人员可以容易地定义“衍生自”参考序列的序列，其将通过DNA或氨基酸水平上的序列比对与相应的参考序列具有高度同一性，并且将与相应的参考序列具有一致的DNA/氨基酸连续延伸(对于比对的分子给定长度，>75％的查询同一性，条件是衍生的序列是查询序列并且参考序列表示序列比对期间的对象)。技术人员因此可以基于本文提供的公开内容通过聚合酶链式反应等将相应序列克隆到合适的感兴趣的载体系统中，或使用序列作为载体支架。因此，术语“衍生自”不是任意序列，而是与其衍生的参考序列相对应的序列，而某些差异，例如在宿主细胞内复制重组构建物期间天然发生的某些突变，不能排除并且因此包含于术语“衍生自”。此外，来自亲本序列的几个序列段可以集中在从亲本衍生的序列中。不同的片段与亲本序列具有高甚至100％的同源性。
在核酸和/或氨基酸序列的上下文中，术语“内源的”是指在植物基因组中以其天然形式和天然遗传背景发现的核酸和/或氨基酸。如本领域技术人员所知，基因核酸序列的几种变体，例如等位基因变体可以存在于给定的植物物种中。
如本文所用，“真菌”或“真菌病原体”是指任何植物病原性真菌，包括处于任何发育阶段的卵菌，包括孢子，或此类真菌的任何部分，其可以与植物或植物部分或细胞相互作用以诱导在所述植物或植物部分或细胞中的应答。
如本文所用，“融合物”可以指包含一个或多个非天然序列(例如部分)的蛋白质和/或核酸。融合可以位于修饰蛋白的N-末端或C-末端，或两者，或在分子内作为单独的结构域。对于核酸分子，融合分子可以在5'或3'末端或其间任何合适的位置连接。融合可以是转录和/或翻译融合。融合物可以包含一个或多个相同的非天然序列。融合物可以包含一个或更多个不同的非天然序列。融合物可以是嵌合物。融合物可以包含核酸亲和标签。融合物可以包含条形码。融合物可以包含肽亲和标签。融合物可以提供位点特异性效应物或碱基编辑的亚细胞定位(例如，用于靶向细胞核的核定位信号(NLS)，用于靶向线粒体的线粒体定位信号，用于靶向至叶绿体的叶绿体定位信号，内质网(ER)滞留信号等)。融合物可提供可用于追踪或纯化的非天然序列(例如亲和标签)。融合可以是小分子如生物素或染料，如alexa荧光染料、Cyanine3染料、Cyanine5染料。融合可以提供增加的或降低的稳定性。在一些实施方案中，融合可包含可检测标记，包括可提供可检测信号的部分。可以提供可检测信号的合适的可检测标记和/或部分可以包括但不限于酶、放射性同位素、特异性结合对的成员；荧光团；荧光报道分子或荧光蛋白；量子点等等。融合物可以包含FRET对的成员或荧光团/量子点供体/受体对。融合物可以包含酶。合适的酶可以包括但不限于辣根过氧化物酶、萤光素酶、β-25半乳糖苷酶等。融合物可以包含荧光蛋白。合适的荧光蛋白可以包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)(例如来自维多利亚水母(Aequoria victoria)的GFP、来自Anguillajaponica的荧光蛋白或其突变体或衍生物)、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、黄绿色荧光蛋白(例如，来自头孢克洛毛状苔藓的四聚体荧光蛋白的mNeonGreen)、任何各种荧光和有色蛋白。融合物可以包含纳米颗粒。合适的纳米粒子可以包括荧光或发光纳米粒子，以及任选地连接至纳米粒子的磁性纳米粒子或纳米金刚石。可以检测纳米粒子的任何光学或磁性性质或特征。融合物可包含解旋酶、核酸酶(例如FokI)、内切核酸酶、外切核酸酶(例如5'外切核酸酶和/或3'外切核酸酶)、连接酶、切口酶、核酸酶-解旋酶(例如Cas3)、DNA甲基转移酶(例如Dam)或DNA脱甲基酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、乙酰化酶(包括例如但不限于组蛋白乙酰化酶)、脱乙酰酶(包括例如但不限于组蛋白脱乙酰酶)、磷酸酶、激酶、转录(共)激活剂、转录(共)因子、RNA聚合酶亚基、转录阻遏物、DNA结合蛋白、DNA结构化蛋白、长的非编码RNA、DNA修复蛋白(例如参与修复单链和/或双链断裂的蛋白质，例如涉及碱基切除修复、核苷酸切除修复、错配修复、NHEJ、HR、微同源性介导的末端连接(MMEJ)和/或任选的非同源末端连接(ANHEJ)的蛋白，例如但不限于HR调节剂和HR复合物组装信号)、标记蛋白、报道蛋白、荧光蛋白、配体结合蛋白(例如mCherry或重金属结合蛋白)、信号肽(例如Tat-信号序列)、靶向性蛋白或肽、亚细胞定位序列(例如，核定位序列、叶绿体定位序列)和/或抗体表位，或其任何组合。
术语“遗传修饰”或“遗传操作”或“经遗传操作的”在本文中以广义使用并指核酸序列或氨基酸序列、靶细胞、组织、器官或生物体的任何修饰，其伴随着直接或间接人为干预，以影响内源遗传材料或者靶细胞、组织、器官或生物体的转录组或蛋白质组，用于以目的性方式修饰其，从而其不同于在没有人为干预情况下发现的状态。人为干预能体外或体内/植物原位发生，或都可以。能包括进一步修饰，例如一或多个点突变，如用于靶向蛋白工程或密码子优化、缺失，至少一个核酸或氨基酸分子的一或多个插入或缺失(还包括同源重组)，修饰核酸或氨基酸序列，或其组合。所述术语还应包括核酸分子或氨基酸分子或宿主细胞或生物体，包含植物或其植物材料，其与天然出现的相当序列、生物体或材料类似，但通过至少一个目的性操作步骤构建。因此，本文所用的“靶向遗传操作”或“靶向(碱基)修饰”是“遗传操作”的结果，其以靶向方式实现，即在靶细胞中特定位置和在特定合适情况下以在至少一个待操作细胞优选植物细胞中达到所需效果，其中该术语意指待被靶向的序列和相应的修饰基于前面的序列考虑因素，从而可以提前计划产生的修饰，例如，基于细胞基因组中靶位点的可用序列信息和/或基于感兴趣的分子工具的靶特异性信息(核酸或氨基酸序列的识别或结合特性，互补碱基配对等)。
术语“基因组”是指存在于生物体的每个细胞或病毒或细胞器中的遗传物质(基因和非编码序列)的全部互补物，和/或从一个亲本作为一个单位(单倍体)遗传的完整染色体组。因此，基因组还定义了“基因型”，它是给定细胞的遗传组成的部分，并因此是生物体或个体的遗传组成的部分，它决定了该细胞/生物体/个体的特定特征(表型)。
术语“基因组编辑”、“基因组工程改造”和“基因编辑/工程改造”在本文中可互换使用，并且是指针对活体有机体的任何遗传信息或基因组的靶向特异性修饰的策略和技术。因此，术语包括基因编辑，但也包括除基因组的基因编码区之外的区域的编辑。它还包括编辑或改造核(如果存在)以及细胞的其他遗传信息。此外，术语“基因组编辑”和“基因组工程改造”还包括表观遗传编辑或工程改造，即例如甲基化、组蛋白修饰或可能引起基因表达可遗传改变的非编码RNA的靶向修饰。
如本文所用，“种质”是用于描述遗传资源的术语，或者更准确地说是生物体的DNA和该材料的集合。在育种技术中，术语种质用于指示从中可以创建新植物或植物品种的遗传物质的集合。
术语“向导RNA”、“gRNA”或“单向导RNA”或“sgRNA”在本文中可互换使用，并且是指CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的合成融合物，或术语是指仅由crRNA和/或tracrRNA组成的单个RNA分子，或者该术语是指单独包含crRNA或tracrRNA部分的gRNA。tracr和crRNA部分因此不一定必须存在于一个共价连接的RNA分子上，然而它们也可以由两个单独的RNA分子组成，所述两个单独的RNA分子可以缔合或可以通过非共价或共价相互作用缔合以提供根据本公开的gRNA。术语“gDNA”或“sgDNA”或“向导DNA”在本文中可互换使用，并且指的是与Argonaute核酸酶相互作用的核酸分子。由于它们与位点特异性核酸酶相互作用的能力并且有助于将所述位点特异性核酸酶靶向基因组靶位点，本文公开的gRNA和gDNA都被称为“向导核酸”或“向导核酸”。
如本文所用，术语“杂交”是指使用核酸链通过碱基配对与互补链结合以形成杂交复合物的任何过程来配对互补核酸，即DNA和/或RNA。杂交和杂交强度(即核酸之间缔合的强度)受以下因素影响：核酸之间的互补性程度和长度、所涉及条件的严格性、形成的杂交体的Tm以及核酸中的G：C比。术语杂交的复合物是指由于互补的G和C碱基之间以及互补的A和T/U碱基之间的氢键的形成而在两个核酸序列之间形成的复合物。可以在两个DNA核酸分子之间、两个RNA核酸分子之间或DNA和RNA核酸分子之间形成杂交的复合物或相应的杂交构建体。对于所有星座，核酸分子可以是在体外或体内产生的天然存在的核酸分子和/或人工或合成的核酸分子。如上所述的杂交，例如可以在DNA、RNA和DNA/RNA序列之间形成的Watson-Crick碱基对，由特定的氢键模式决定，所述氢键模式因此表示根据本发明的非共价连接形式。术语“严格的杂交条件”应理解为是指这样的条件，在该条件下杂交主要仅在同源核酸分子之间发生。术语“杂交条件”在此方面不仅仅是指核酸的实际附聚过程中占优势的实际条件，还是指随后的洗涤步骤中占优势的条件。严格杂交条件的实例为，在该条件下主要仅有那些具有至少80％、优选至少85％、至少90％或至少95％的序列相同性的核酸分子才进行杂交。严格杂交条件例如是:于65℃ 4x SSC以及随后在65℃ 0.1x SSC多次洗涤大约1小时。术语“严格杂交条件”如本文所用可以指:于68℃在0.25M磷酸钠、pH 7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时并随后用2x SSC和0.1％SDS于68℃洗涤两次。优选地，杂交在严格条件下进行。
术语“渐渗(introgression)”如本发明所用是指遗传背景的遗传基因座上至少一个期望的等位基因转移至另一个。例如，渐渗可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交来进行。或者，等位基因的转移也可以通过两个供体基因组之间的重组来发生，例如在融合的原生质中，其中至少一个供体原生质在其基因组中携带有所期望的等位基因。在任何情形中，然后可以将包含所期望的基因等位基因的任何后代或衍生物与带有所期望的遗传背景的植物品系进行重复的回交步骤，以在所得衍生物或后代中选择所期望的基因等位基因。结果是可以将期望的等位基因固定在选定的遗传背景中。渗入的整个过程可以例如通过分子生物学的育种策略和技术的混合来进行，以实现给定种质、植物、植物细胞或植物材料的期望的基因型/表型。
术语“基因座”通常是指染色体的遗传定义区域，其携带一个基因或可能为两个或多个基因紧密相连，以致在基因上它们表现为负责表型的单个基因座。
如本文所用，术语“突变”和“修饰”可互换使用以指在体内或体外核酸操纵的背景下的缺失、插入、添加、取代、编辑、链断裂和/或引入加合物。缺失定义为核酸序列中的变化，其中一个或多个核苷酸不存在。插入或添加是核酸序列中的变化，导致添加一个或多个核苷酸。“取代”或编辑指用不同于被替换的一或多个核苷酸的分子替换一个或多个核苷酸替换。例如，核酸可被不同的核酸置换，例如通过用胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或尿苷取代胸腺嘧啶。嘧啶至嘧啶(例如C转化成Tt至C的核苷酸取代)或嘌呤至嘌呤(例如G到A或A至G的核苷酸取代)被称为转换(transition)，而嘧啶至嘌呤或嘌呤至嘧啶(例如G到T或G到C或A到T或A到C)被称为颠换(transversion)。或者，可以用修饰的核酸代替核酸，例如胸腺嘧啶二醇取代胸腺嘧啶。突变可能会导致不匹配。术语“错配”是指两个核酸之间的非共价相互作用，每个核酸位于不同的核苷酸序列或核酸分子上，其不遵循碱基配对规则。例如，对于部分互补序列5'-AGT-3'和5'-AAT-3'，存在G-A错配(转换)。
本文所用的“近等基因系”或“NIL”可用于通过分析NIL将它们定位到遗传染色体上，来鉴定负责表型性状的基因。为了产生近等基因系，将具有感兴趣的表型的生物体(通常是植物)与相同植物的标准系杂交。F1代自交产生F2代。选择具有目标性状的F2个体与标准系(轮回亲本)杂交。这个过程重复几代。可以比较姐妹系的遗传组成。可以在所有姐妹系中找到的来自供体亲本的等位基因被认为与该性状相关。
关于序列或分子的术语“核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且指天然或合成来源的单链或双链DNA或RNA。术语核苷酸序列因此被用于与其长度无关的任何DNA或RNA序列，使得该术语包含任何包含至少一个核苷酸的核苷酸序列，但也包括任何种类的较大的寡核苷酸或多核苷酸。术语因此是指天然和/或合成的脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)序列，其可以任选地包含合成的核酸类似物。根据本公开内容的核酸可以任选地进行密码子优化。“密码子优化”意味着DNA或RNA的密码子使用适合于感兴趣的细胞或生物体的密码子使用，以改善所述目的细胞或生物体中所述重组核酸的转录速率。本领域技术人员很清楚，由于密码子简并性，靶核酸可以在一个位置被修饰，而这种修饰仍然会在翻译后在该位置产生相同的氨基酸序列，这是通过密码子优化实现的考虑靶细胞或生物体的物种特异性密码子使用。根据本申请的核酸序列可以对以下非限制性生物体列表进行特定的密码子优化：大麦、双色高粱、黑麦、甘蔗、玉米、小米、水稻、小粒稻、澳洲野生稻、高秆野生稻、普通小麦、硬粒小麦、黑小麦、球茎大麦、紫短柄草、海滨大麦、节节麦、苹果、甜、向日葵、Daucus glochidiatus、小胡萝卜、Daucus muricatus、胡萝卜、巨桉、Erythrante guttata、螺旋狸藻、美花烟草、普通烟草、绒毛状烟草、本氏烟草、番茄、马铃薯、中果咖啡、葡萄、黄瓜、川桑、拟南芥、深山南芥、Arabidopsis arenosa、喜马拉雅鼠耳芥、卵叶须弥芥、弯曲碎米荠、北美独行菜、荠菜、Olmarabidopsis pumila、筷子芥、欧洲油菜、甘蓝、芜菁、芥菜、黑芥、萝卜、Eruca vesicaria subsp.sativa、甜橙、麻风树、大豆、棉属、或毛果杨。
本文所用的术语“粒子轰击”，也称为“基因枪转染”或“微粒介导的基因转移”，是指用于将包含感兴趣的核酸或遗传构建体包被的微粒或纳米粒子转移到靶中的物理递送方法细胞或组织。微粒或纳米粒子起到抛射物的作用，并使用合适的装置(通常称为基因枪)在高压下向目标靶结构上发射。通过粒子轰击的转化使用覆盖有感兴趣基因的金属微粒，然后使用被称为“基因枪”Sanford,John C.,et al."Delivery of substances intocells and tissues using a particle bombardment process."Particulate Scienceand Technology5.1(1987):27-37)的设备以足够快的速度(约1500千米/h)将其喷射到靶细胞上以穿透目标组织的细胞壁，但不足以导致细胞死亡。对于原生质体，其细胞壁完全被去除，条件在逻辑上是不同的。在至少一个微粒上的沉淀的核酸或遗传构建体在轰击后释放到细胞中，并整合到基因组中。微粒的加速通过高压放电或压缩气体(氦气)完成。关于所使用的金属颗粒，它们必须是无毒的，无反应性的，并且它们具有比靶细胞更小的直径。最常用的是金或钨。基因枪和相关系统的制造商和供应商通常会提供大量有关其一般用途的信息。
如本文所用，“病原体”是指可以感染植物或可以在植物中引起疾病的生物体。可以感染植物或在植物中引起疾病的病原体包括真菌、卵菌、细菌、病毒、类病毒、病毒样生物、植原体、原生动物、线虫和寄生植物。植物寄生虫可以通过摄食植物而造成损害，并且可以选自诸如昆虫的外寄生虫，包括蚜虫和其他吸吮树液的昆虫、螨虫和脊椎动物。
本文所用的术语“植物”应被广义地解释并且指完整植物生物体、植物器官、分化和未分化的植物组织、植物细胞、种子和其衍生物及后代。“植物细胞”包括但不限于来自以下的细胞：来自种子，来自成熟胚和未成熟胚、分生组织、籽苗、不同分化状态的愈伤组织、叶、花、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子、原生质体、巨藻和微藻。不同植物细胞可以是单倍体、二倍体或多倍体。术语“植物器官”是指植物组织或一组组织，其构成植物的形态上和功能上不同的部分。通常，术语“谷粒”用于描述由植物生长者产生的用于除生长或繁殖物种以外的目的的成熟籽粒，并且“种子”是指用于生长或繁殖物种的成熟籽粒。为了本发明的目的，“谷粒”、“种子”和“核”将可互换使用。
本文所用的“植物材料”指能获自在任何发育阶段的植物的任何材料。植物材料能植物原位获得或者来自植物或其植物组织或器官的体外培养物。因此，该术语包括植物细胞、组织和器官以及发育的植物结构和亚细胞组分如核酸、多肽及所有化学植物物质或代谢物，其能在植物细胞或区室内发现和/或能由植物生成，或其能获自任何植物细胞、组织的提取物或者任意发育阶段的植物。所述术语还包括植物材料的衍生物，如原生质体，获自植物材料所含至少一个植物细胞。由此，该术语还包括植物的分生细胞或分生组织。
“对照”或“对照植物细胞”或“对照组织”或“对照器官”或“对照植物”为测量受试植物或植物部分的表型变化提供了参考点，所述受试植物或植物部分中(遗传)修饰、调节和/或改变(例如本发明的各个方面中所指示的)已经作用于感兴趣的基因、蛋白质或物质或分子。对照植物或对照植物部分(例如，对照植物细胞、对照组织或对照器官)可以包含，例如：(a)野生型植物或细胞，即与对象植物或植物部分中所造成的所述(遗传)修饰、调节和/或改变的起始材料的基因型相同；(b)与起始材料具有相同基因型的植物或植物部分，但已用无效构建体(即，对感兴趣的性状没有已知作用的构建体，例如包含标志物基因的构建体)转化；或(c)在对象植物或植物部分的子代中是未转化的分离子的植物或植物部分。特别地，对照植物或对照植物细胞可以包含相同基因型的植物或植物部分，但是缺少编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因的修饰或缺少对以下的调节：至少一种壁相关激酶的表达水平和/或在从至少一种壁相关激酶到合成至少一种苯并恶唑嗪酮类的信号传导途径中或在至少一种苯并恶唑嗪酮类的信号传导途径中的至少一种分子的转录水平、表达水平或功能。
“质粒”是指以双链核酸序列形式的环状自主复制染色体外元件。在基因工程领域中，这些质粒通常插入例如编码对抗生素或除草剂的抗性的基因，编码靶核酸序列的基因，定位序列，调控序列，标签序列，标记基因，包括抗生素标记或荧光标记等。保留原始质粒的结构组分，如复制起点。根据本发明的某些实施方案，定位序列可以包含核定位序列，质体定位序列，优选线粒体定位序列或叶绿体定位序列，或用于将感兴趣的激酶靶向于感兴趣的细胞的质膜的定位序列。所述定位序列对于植物生物技术领域的技术人员是可用的。用于不同目标细胞的各种质粒载体可商购获得，并且其修饰对于相应领域的技术人员是已知的。
术语“蛋白质”、“氨基酸”或“多肽”在本文中可互换使用，并且指具有催化酶功能或结构或功能作用的氨基酸序列。术语“氨基酸”或“氨基酸序列”或“氨基酸分子”包括任何天然或化学合成的蛋白质、肽、多肽和酶或修饰的蛋白质、肽、多肽和酶，其中术语“修饰的”化学或酶促修饰蛋白质、肽、多肽和酶，包括将野生型序列截短为更短但仍然有活性的部分。
根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(herein"Sambrook et al.,1989")；DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&SJ.Higgins eds.(1985)；Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984)等。
本文所用的术语“调控序列”或“调控区”是指可以指导和/或影响感兴趣的核酸序列的转录和/或翻译和/或修饰的核酸或氨基酸序列。调控序列可以是启动子序列、增强子、沉默子、转录因子等。
如本文所用，术语“抗性”或“耐受性”或“有抗性”或“有耐受性”是指植物抵抗因如本文所公开的病原体，特别是真菌病原体的侵染所引起的表型至一定程度的能力，即预防、减少或延迟由(真菌)病原体引起的感染。因此，“抗性”/“耐受性”并非专门指“黑或白”表型，即表示在抗性植物侵染后根本没有出现任何症状的表型。术语“抗性”或“耐受性”或“有抗性”或“有耐受性”是指对没有对给定病原体的抗性的植物观察到的侵袭症状的逐渐改善。在自然和人工接种的大斑病长蠕孢在多个位置进行的田间试验中表型试验的分类评分方案(来自Deutsche Maiskomitee(德国玉米委员会，DMK)；AG品种27.02.02；(DMK J.Rath；RP Freiburg H.J.Imgraben)显示出作为示例植物的玉米的抗性水平从9(低)至1(高)，其中每个得分代表以下表型：1：植物表现无病害症状，0％；2：侵染开始，可见第一个小斑点(小于2厘米)；不到5％的叶子表面受到影响；3：在叶子阶段已形成一些斑点；5-10％的叶片表面受到影响；4：10-20％的叶片表面受到影响。在几个叶片阶段清晰可见的斑点；5：20-40％的叶片表面受到影响；斑点开始聚结；6：40-60％的叶片表面受到影响；在叶片上可见系统性侵染；7：60-80％的叶片表面受到影响。大约一半的叶子由于真菌侵害而被破坏或干燥。8：80-90％的叶片表面受到影响。一半以上的叶子由于真菌侵害而被破坏或干燥。9：90-100％的叶片表面受到影响。植物几乎完全干了。
如本文所用，术语“TILLING”是“基因组中靶向的诱导的局部病变”的缩写，并且描述一种众所周知的反向遗传学技术，其被设计用于使用酶消化来检测感兴趣的基因中的未知SNP(单核苷酸多态性)，并且在植物基因组学中被广泛使用。所述技术可以对具有对特定基因一系列修饰功能的等位基因突变体系列进行高通量鉴定。TILLING将诱变(例如化学方法或通过紫外线)与识别单碱基突变的敏感的DNA筛选技术相结合。
如本文所用的术语“转基因”或“转基因的”是指至少一种取自一种生物体的基因组或合成产生的核酸序列，然后将其导入感兴趣的细胞或生物体或组织的宿主中，和随后通过“稳定”转化或转染方法将其整合到宿主的基因组中。相反，术语“瞬时”转化或转染或导入是指引入分子工具的方式，所述分子工具包括至少一种核酸(DNA，RNA，单链或双链的至少一种或其混合物)和/或至少一种氨基酸序列，任选地包含合适的化学或生物试剂，以实现向细胞的至少一个感兴趣区室的转移，包括但不限于细胞质，细胞器，包括细胞核，线粒体，液泡，叶绿体或膜中，导致所引入的至少一种分子的转录和/或翻译和/或缔合和/或活性，而不会实现稳定的整合或掺入以及所引入至少一个引入到细胞的基因组的分子的遗传。
因此本文所用的术语“瞬时引入”指有或没有借助递送载体地向靶结构如植物细胞瞬时引入本公开所述至少一个核酸序列，优选纳入递送载体或重组构建体，其中所述至少一个核酸序列在合适反应条件下引入，从而基因组作为整体而言，未出现所述至少一个核酸序列整合入靶结构的内源核酸物质，使得所述至少一个核酸序列未整合入靶细胞的内源DNA。因此，在瞬时引入的情况中，所引入的遗传构建体不遗传到靶结构(例如原核或植物细胞)的后代。至少一个核酸序列和/或氨基酸序列或由其转录、翻译、加工、翻译后修饰或其复合物构建产生的产物仅采用组成型或诱导型形式短暂存在，即以瞬时方式，并因而仅能在靶细胞中有活性以在有限时间内发挥其效果。由此，经瞬时引入而引入的至少一个核酸序列不会遗传到细胞后代。然而，以瞬时方式引入的至少一个序列或效应物介导的效果可能会潜在的遗传到靶细胞后代。
在核酸或氨基酸序列蛋白的上下文中，“变体”是指通过在天然核酸或氨基酸序列的5'/N-末端和/或3'/C-末端缺失(所谓的截短)或添加一个或多个序列；在天然核酸或氨基酸序列的一个或多个位点缺失或添加一个或多个核酸或氨基酸序列；在天然蛋白质中一个或多个位点取代一个或多个核酸或氨基酸序列而衍生自天然核酸或氨基酸序列或另一个起始序列的核酸或氨基酸序列。本发明涵盖的变体蛋白具有生物学活性，即它们继续具有如本文所述的本发明的天然蛋白的全部或部分活性。这样的变体可以源自例如遗传多态性或源自人为操纵。
如本文所用，“同源物”是指执行相同生物学功能的一组蛋白质中的蛋白质，例如属于同一Pfam蛋白家族的蛋白。同源物由同源基因表达。关于同源基因，同源物包括直系同源物，例如在不同物种中表达的通过物种形成从共同祖先基因进化的基因并编码保留相同的功能的蛋白质，但不包括旁系同源物，例如通过重复相关但进化为编码具有不同功能的蛋白质的基因。同源基因包括天然存在的等位基因和人工产生的变体。遗传密码的简并性提供了用不同的碱基替换基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基的可能性，而不会引起从该基因产生的多肽的氨基酸序列的改变。当进行最佳比对时，同源蛋白通常具有至少约60％的相同性，在某些情况下为至少约70％，例如约80％或85％，且甚至至少约90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同性，优选在蛋白质的全长上；同源基因通常具有至少约60％的相同性，在某些情况下为至少约70％，例如约80％或85％，且甚至至少约90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同性，优选地在基因的全长上，尤其是在基因的编码区域上。
通过比较氨基酸序列例如手动地或使用用已知的基于同源性的搜索算法(例如通常已知并称为BLAST、FASTA和Smith-Waterman的搜索算法)的基于计算机的工具来鉴定同源物。局部序列比对程序，例如BLAST可用于搜索序列数据库以查找相似序列，且汇总期望值(E-value)可用于测量序列碱基相似性。因为对特定生物体具有最佳E值的命中蛋白不一定是直系同源物，例如具有相同的功能，或不一定是唯一的直系同源物，所以使用相互查询来筛选具有明显的用于直系同源物识别的E值的命中序列。相互查询需要针对与查询蛋白质序列相似的来自基础生物体的氨基酸序列的数据库进行显著命中的搜索。当相互查询的最佳命中是查询蛋白本身或物种形成后由重复的基因编码的蛋白时，命中可被识别为直系同源物。在本发明的转基因植物中有用的由DNA编码的同源物的另一方面是由于天然序列中一个或多个氨基酸的缺失或插入而与公开的蛋白质不同的那些蛋白质。
其他功能同源蛋白的一个或多个氨基酸与本文公开的氨基酸不同，这是一种或多种众所周知的保守氨基酸取代的结果，例如，缬氨酸是丙氨酸的保守取代物，苏氨酸是丝氨酸的保守取代物。天然序列内氨基酸的保守取代可以选自天然存在的氨基酸所属的类别的其他成员。这些各种类别中的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电荷)的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷的)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非极性(疏水)氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。天然氨基酸序列中氨基酸的保守取代物可以选自天然存在的氨基酸所属的组的其他成员。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有酰胺基侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守的氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本发明的另一方面包括由于在天然序列中缺失或插入一个或多个氨基酸而在一个或多个氨基酸上与所描述的蛋白质序列不同的蛋白质。
每当本公开涉及核酸或氨基酸序列的同源性或相同性的百分比时，这些值限定了通过使用EMBOSS Water配对序列比对(核苷酸)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)核酸或用于氨基酸序列的EMBOSS Water配对序列比对(蛋白质)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/)，优选在序列的整个长度上，即，提供的任何百分比值是指与相同或变异的其他序列相比，在对象或起始序列的全长上测得的％同源性或％相同性。由欧洲分子生物学实验室(EMBL)欧洲生物信息学研究所(EBI)提供的用于局部序列比对的工具使用修改的Smith-Waterman算法(参见www.ebi.ac.uk/Tools/psa/和Smith,T.F.&Waterman,M.S."Identification of common molecular subsequences"Journal of Molecular Biology,1981 147(1):195-197)。进行对齐时，使用由EMBL-EBI定义的默认参数。这些参数是(i)对于氨基酸序列：矩阵＝BLOSUM62，空位开放罚分＝10和空位延伸罚分＝0.5或(ii)对于核酸序列：矩阵＝DNA满，空位开放罚分＝10和空位延伸罚分＝0.5。
附图简述
图1(图1A和B)显示(图1A)甙配基形式的苯并恶唑嗪酮(BXD)的结构。来自图1A的BXD基本结构的衍生物为：HBOA(R1＝H，R2＝H，R3＝H)，DHBOA(R1＝H，R2＝OH，R3＝H)，HMBOA(R1＝H，R2＝OMe，R3＝H)，HM2BOA(R1＝H，R2＝OMe，R3＝OMe)，DIBOA(R1＝OH，R2＝H，R3＝H)，TRIBOA(R1＝OH，R2＝OH，R3＝H)，DIMBOA(R1＝OH，R2＝OMe，R3＝H)，DIM2BOA(R1＝OH，R2＝OMe，R3＝OMe)，HDMBOA(R1＝OMe，R2＝OMe，R3＝H)或HDM2BOA(R1＝OMe，R2＝OMe，R3＝OMe)。图1B显示了苯并恶唑啉酮的基本结构，苯并恶唑啉酮是BXD的天然降解产物，且也包括在本文所用的术语BXD中。特定的苯并恶唑啉酮是BOA(R2＝H，R3＝H)，MBOA(R2＝OMe，R3＝H)或M2BOA(R2＝OMe，R3＝OMe)。
图2(图2A和B)示出如实施例9中所述的真菌侵入的成功侵入事件的比率。(图2A)在宿主组织内部检测到的菌丝。在上图和下图中，关注点分别在表皮和菌丝上。图A下部图像中的箭头指示宿主组织内部的菌丝。(图2B)RLK1b、RLK1d和RLK1f是RP3Htn1中产生的NCLB抗性受损的ZmWAK-RLK1突变体，而RLK1b-wt，RLK1d-wt和RLK1f-wt分别是相应的姊妹系。统计是根据三个独立的实验，使用学生t检验进行的。星号表示**p<0.01或*p<0.05的显著差异。误差线表示±标准误差。
图3(图3A至C)显示了Htn1-NIL和相应亲本的疾病表型，如以下实施例10中详述。(图3A)在16dpi的第二片叶子的病征(w22、w22Htn1、B37和B37Htn1系从左到右)。(图3B)受试植物B37、w22、w22Htn1和B37Htn1的感染率。(图3C)在x轴下方详述的等基因线的疾病进展曲线(AUDPC)下的面积。*此图中的AUDPC以如Hurni et al.2015所述的计算，基于计算受感染植物的比率(％)之和。
图4显示Htn1-NIL中转录组分析的结果，该结果揭示了一组DEG。图4示出两个Htn1NIL中的DEG与对应的易感线相比的数量，如以下实施例10中进一步描述的。
图5(图5A至F)显示w22和w22Htn1中BXD的含量。(图5A)显示拟议的次生代谢物BXD的生物合成途径。在箭头的旁边和下方显示编码催化酶促反应每个步骤的蛋白质的基因。BXD化合物DIMBOA-Glc(图5B)、DIMBOA(图5C)、HMBOA-Glc(图5D)、DIM2BOA-Glc(图5E)和HDMBOA-Glc(图5F)的含量是在接种前在3dpi和10dpi确定的。在八次生物学重复中使用Tukey的HSD(P＝0.05)进行统计。ns代表不显著。误差线为±SE。另请参见下面的实施例10。
图6(图6A至D)显示ZmWAK-RLK1的存在可能通过下调玉米RP3遗传背景中的Igl表达而导致DIM2BOA-Glc含量降低(也参见实施例11)。(A)DIM2BOA-Glc的含量(n＝8)。Bx1(B)，Igl(C)和ZmWAK-RLK1(D)在Htn1突变体和姐妹系在播种后21天(n＝5)感染前的表达分析。使用学生t检验进行统计。星号表示**p<0.01或*p<0.05的显著差异。误差线为±SE。
图7(图7A至E)显示了在10dpi的第二片叶子的BXD化合物DIMBOA-Glc(A)、DIMBOA(B)、HMBOA-Glc(C)和DIM2BOA-Glc(D)、HDMBOA-Glc(E)的含量。下面的实施例12中提供更多信息。在8个生物学重复中使用学生t检验(P＝0.05)进行统计。星号表示**p<0.01或*p<0.05的显著差异。ns代表不显著。误差线为±SE。
图8(图8A至D)(也参见实施例12)显示，损害BXD的生物合成降低幼苗阶段NCLB疾病的易感性。(图8A和B)：bx突变体中的视觉症状和定量的NCLB疾病严重性。(图8C)：ZmWAK-RLK1在10dpi的转录水平。(图8D)显示NCLB疾病抗性的潜在的ZmWAK-RLK1拟建模型。抗性等位基因抑制主要BXD化合物的生物合成，这可能是促进NCLB疾病的易感性成分。使用学生t检验进行统计检验。星号表示**p<0.01或*p<0.05的显著差异。ns代表不显著。误差线为±SE。
图9(图9A至D)显示播种后21天Htn1 NIL和突变体第二片叶子中BXD化合物DIMBOA-Glc(A)、DIMBOA(B)、HMBOA-Glc(C)和HDMBOA-Glc(D)的含量。下面的实施例12中提供了更多信息。在8个生物学重复中使用学生t检验(P＝0.05)进行统计。星号表示**p<0.01或*p<0.05的显著差异。ns代表不显著。误差线为±SE。
图10显示组织中相对RLK1的表达。这些样品是从21天大的幼苗中收获的，没有接种病原体。图中不同的小写字母表示差异，其在统计上是不同的。另请参见下面的实施例13。
图11(图11A和11P)显示Htn1-NIL中的基因和相应的亲本系的转录水平。定量基因(图11A)ZmWAK-RLK1、(图11B)Bx1、(图11C)Igl、(图11D)Bx2、(图11E)Bx3、(图11F)Bx4、(图11G)Bx5、(图11H)Bx6、(图11I)Bx7、(图11J)Bx8、(图11K)Bx9、(图11L)Bx10/11，(图11M)Bx12、(图11N)Bx13、(图11O)Glu1和(图11P)Glu2的表达。条形的不同颜色和样式指示感染前后的时间点，如图11A的图例所示，这也适用于图11B至P。在四次生物学重复中使用Tukey的HSD(P＝0.05)在w22和B37遗传背景下分别进行统计。误差线为±SE。图中不同的小写字母表示差异，其在统计上是不同的。另请参见下面的实施例10。
图12(图12A至C)显示ZmWAK-RLK1定位于质膜。(图12A-B)在ZmWAK-RKL1-eGFP(SEQID NO：9)和已知位于质膜上的阳性对照PIP2A-mCherry瞬时表达后的洋葱表皮细胞中的荧光信号(Kammerloher,Werner,et al."Water channels in the plant plasma membranecloned by immunoselection from a mammalian expression system."The PlantJournal 6.2(1994):187-199)。显示在使用0.8M甘露糖醇的质壁分离之前(图12A)和之后(图12B)的信号。(图12C)渗入后两天，本氏烟草(N.benthamiana)叶中的荧光信号。值得注意的是，在各个图中以白色显示的信号对应于原始的绿色(第1列RLK_eGFP)、红色(第2列PIP2A_mCherry)和黄色(合并，第4列)荧光信号。第3列(DIC)代表微分干涉对比，以可视化细胞结构作为对照。
图13是示出在至少一个时间点中在B37Htn1/B37和w22Htn1/w22中检测到的215个差异表达的基因(DEG)的logFC和注释的表。
发明详述
基于本发明的实验和数据，发现涉及苯并恶唑嗪酮类(BXD)及其衍生物，主要是基于水解的衍生物如异羟肟酸的生物合成的基因，不仅参与针对玉米大斑病菌的防御机制，而是还可以影响和介导植物防御，即一系列作物植物中针对各种其他真菌病原体的抗性机制。因此，本发明既执行壁相关激酶(WAK)、下游信号传导分子(例如Bx1、Bx2、Bx6、Bx14和Igl)或苯并恶唑嗪酮类合成途径中涉及的任何其他酶之间的联系，还执行BXD次级代谢物的减少并进一步在技术上执行BXD次级代谢物的减少与真菌抗性增加有关的发现。
因此，本发明在第一方面提供用于生产具有增强的真菌抗性的植物的方法，其中所述真菌抗性由至少一种壁相关激酶调节，所述方法包括：(i)(a)提供至少一个具有特定基因型的植物细胞、组织、器官或整株植物，所述特定基因型关于在所述植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中至少一个编码壁相关激酶的基因的存在；或(i)(b)将至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因导入植物细胞、组织、器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞的基因组中；和(ii)(a)在所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中修饰至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因；和/或(ii)(b)在所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中调节至少一种壁相关激酶的表达水平和/或从所述至少一种壁相关激酶到合成至少一种苯并恶唑嗪酮类的所述信号传导途径内或至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径内至少一种分子的转录水平、表达水平或功能；(iii)从所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中产生植物群体，以及(iv)基于对至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成减少(优选响应于真菌病原体感染)的确定，从该群体中选择/鉴定具有增强的真菌抗性的植物，其中所选择的植物基于苯并恶唑嗪酮类的合成减少而具有增强的真菌抗性，和/或其中所述至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成受所述至少一种壁相关激酶的调节。
壁相关激酶(WAK)最近已被鉴定为几种谷物作物植物中真菌和细菌疾病抗性的主要组分。然而，目前尚不清楚WAK介导的抗性的分子机制。根据本发明，研究了玉米基因ZmWAK-RLK1(Htn1)的功能，其赋予对由半生营养真菌病原体玉米大斑病菌引起的玉米大斑病(NCLB)的定量抗性。发现ZmWAK-RLK1(Htn1)定位于质膜，并且其存在导致通过特异性减少病原体侵入到宿主组织中来改变感染过程。此外，ZmWAK-RLK1的普遍表达以及ZmWAK-RLK1下游信号传导途径的发现证明这种和相关的壁相关激酶在针对真菌病害的植物防御中作为主要调控因子和重要信号传导介质的功能。
对ZmWAK-RLK1不同的近等基因系(NIL)进行的转录组分析显示，在ZmWAK-RLK1存在下，参与次级代谢物苯并恶唑嗪酮类(BXD)的生物合成的几个基因差异表达。特别是在有ZmWAK-RLK1的NIL中，BXD化合物DIMBOA-Glc、DIMBOA、HMBOA-Glc和DIM2BOA-Glc的含量明显较低。此外，DIM2BOA-Glc是BXD的非活性糖苷，其在NCLB抗性受到破坏的ZmWAK-RLK1突变株中显著升高。此外，在BXD生物合成中受到影响的玉米突变体在苗期表现出降低的对玉米大斑病菌感染的易感性。因此，我们得出结论，BXD的生物合成增加对玉米大斑病菌感染的易感性，并且ZmWAK-RLK1介导的NCLB抗性是由这些化合物的减少导致的。这些发现表明WAK潜在的定量疾病抗性与由次生代谢物BXD介导的防御机制之间的新的联系，所述次生代谢物BXD以参与谷物抗虫性而已知。本文所用的术语“WAK”可以包含与信号转导相关的植物受体样激酶，其直接或间接地影响参与BXD合成的基因的生物合成，或与参与BXD合成的信号传导机制和/或蛋白质-蛋白质相互作用相互作用。
因此，由WAK“引起”的植物免疫反应可以是直接或间接性质的。如本领域技术人员已知的，受体样激酶通常包含至少一个细胞外信号传导结构域(例如用于感测PAMP和/或DAMP)、跨膜结构域和细胞内激酶结构域。激酶结构域允许WAK将细胞外信号转换为通过下游信号转导中涉及的一系列蛋白质传递的细胞内反应。通常，受体激酶因此间接地启动调节靶基因转录的转录因子的激活并将其转移到核/细胞器中。此外，除MAP激酶介导的防御基因表达的激活外，植物WAK可以通过激活NADPH氧化酶、生成一氧化氮、胼胝质沉积来触发防御反应，例如活性氧(ROS)积累。因此，本文在WAK或另一种植物受体激酶的上下文中使用的术语“引起(causing)”或“引起(caused)”应广义地解释为包括WAK的活性可能对下游信号分子的任何直接或间接作用，其中所述分子可以选自至少一个氨基酸序列(优选在WAK下游的信号转导级联中的酶或能够刺激或抑制WAK下游的复合物形成或刺激或抑制WAK下游的信号转导的肽)、代谢物(例如任何由植物产生的次级代谢物)、ROS或调节另一种下游基因/蛋白质的转录和/或翻译的间接作用。WAK可能以信号传导复合体的形式发生物理相互作用，以引起作用。在另一个实施方案中，由WAK引起的作用由下游分子(例如，使另一分子磷酸化的下游激酶)以间接的方式介导。在WAK信号传导级联的末端部分，可以诱导转录激活物或阻遏物以调节WAK的靶基因(优选茉莉酸和/或BXD生物合成途径中的靶基因)的转录。除了蛋白质-DNA相互作用之外，WAK信号传导还可以代表影响BXD生物合成途径的蛋白质-蛋白质相互作用。
在另一方面，本发明的方法还可包括将至少一种额外的或其他基因引入、修饰和/或调节到至少一种植物细胞、组织、器官或整株植物中以通过减少至少一种与真菌抗性相关的BXD化合物的合成来提供增加真菌疾病的协同作用的步骤。在优选的实施方案中，所述至少一个额外的或其他基因选自bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因(分别为SEQ ID NO：10、12、14、16、16、18、20、22、24或26)，或其同源基因，或由所述基因编码的分别如SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25或27所示的相应蛋白质，或其同源物。如本文所公开的，参与茉莉酸途径、乙烯途径、木质素合成途径、植物防御途径、另外的受体样激酶途径或细胞壁途径的某些基因，并优选地参与茉莉酸途径的某些基因，有助于至少一种功能性WAK的信号传导途径，其中可能会有通过茉莉酸途径的特定功能性WAK和特定的非功能性或功能性较低的基因的存在而提供的协同作用，由于两者的存在都将有助于感兴趣的BXD化合物的量显著减少，并因而使真菌抗性的增加不止于此。
因此，本发明提供特异性靶基因，所述靶基因可对于所述至少一种感兴趣的WAK额外地或替代地被调节，以为感兴趣的植物提供显著改善的真菌防御策略。这些结果基于不同的功能研究，包括在真菌特异性刺激后在定义的特定WAK基因型(即两对近等基因系w22和W22Htn1以及B37和B37Htn1(参见下文的实施例10))中通过分析RNA测序数据集的对比转录组分析。此外，进行额外的RT-qPCR实验和系统的RNA测序以破译由WAK例如Htn1触发的植物免疫网络(实施例6和10以及表1和2)。这些数据证明WAK与苯并恶唑嗪酮类合成和茉莉酸途径之间的串扰，并因此提供新的候选物以提供新的优良植物品系，其中包括特定的WAK以及关于参与苯苯并恶唑嗪酮类合成和茉莉酸途径的酶的特定的基因型。
在根据本发明的一个实施方案中，用于产生具有增强的真菌抗性的植物的方法可以包括在至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中修饰编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因，以及任选地至少一个额外的或其他基因，例如bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因。可以通过任何植物育种方式进行修饰，包括经典和现代的植物育种方法和/或分子生物学技术。经典的植物育种方法可以包括紧密或远缘相关物种的故意混种(杂交)，以产生具有期望的特性的新作物。使植物杂交以将来自特定品种的性状/基因引入新的遗传背景中，以提供具有修饰的和/或增加的品质、产量、耐受性(针对非生物胁迫)、抗性(针对生物胁迫)等特征的植物。如今，育种还包括诸如标志物辅助选择、反向育种以及与本领域技术人员已知和可获得的分子生物学工具的靶向结合的方法。
在根据本发明的一个实施方案中，至少一种壁相关激酶和/或至少一个额外的或其他基因，例如bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因的调节(modulation)或调节(modulating)可以因此包含以下至少一种：调节至少一种壁相关激酶的表达水平，优选增加至少一种壁相关激酶的表达，和/或调节至少一种与壁相关的激酶的功能或活性和/或活性，例如，通过提供与至少一种WAK的细胞外信号传导结构域相互作用的至少一种分子(例如激活剂)，或通过提供与至少一种WAK的细胞内信号传导结构域相互作用的至少一种分子(例如诱导或抑制激酶活性的分子)。在一个实施方案中，至少一种壁相关激酶和/或至少一种额外的或其他基因，例如bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因的调节(modulation)或调节(modulating)可以包括将至少一个突变定向引入到WAK和/或感兴趣的额外的或其他基因中，以以靶向方式调节WAK和由至少一个额外的或其他基因编码的额外的或其他蛋白质的活性。因此，包含至少一种壁相关激酶的调节的实施方案旨在在不修饰感兴趣的WAK的核酸序列和因此可能为WAK的氨基酸序列的情况下影响其中的至少一种WAK的活性。在某些实施方案中，其中至少一个额外的或其他基因，例如bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因被调节，所述调节可以旨在降低bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因的至少一个等位基因的活性，以减少BXD化合物的合成的量。例如，BX1和IGL酶负责大部分的BX生物合成。因此，抑制功能性BX酶，优选BX1、BX2或BX6酶或Igl酶的存在可以有助于提供减少的BXD合成，并从而提高感兴趣的植物的真菌抗性。
根据本发明的调节可以包括两个分子之间的任何直接或间接相互作用，即受体-配体相互作用、转录因子-转录因子结合位点相互作用、酶例如激酶与其靶位点的相互作用、肽或核酸调节因子与靶位点的相互作用、抗体-抗原相互作用、与DNA或组蛋白结合蛋白及其同源配体(DNA或组蛋白)的相互作用、两个核酸序列/分子之间的杂交等。
在一个实施方案中，可以通过特异性地影响WAK基因的调控序列来修饰或调节植物细胞、组织、器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞内的至少一种WAK的转录水平。在另一个实施方案中，所述调节影响至少一个基因，例如bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因。所述调节或修饰可以包括引入至少一个特定突变，例如以激活感兴趣的启动子，或者可以通过提供调节至少一种WAK基因的转录的转录因子来进行反式调节或修饰，其中根据本发明所有实施方案的至少一种WAK基因可以包含内源性存在的WAK基因，或被引入植物细胞、组织、器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞中的WAK基因。
根据本发明的各个方面和实施方案，在至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中，从至少一种壁相关激酶到合成至少一种苯并恶唑嗪酮类的信号传导途径因此意味着整个WAK下游的分子作用链，作为传感分子触发涉及各种不同效应物的信号传导级联，直至合成BXD化合物。
在根据本发明各个方面的一个实施方案中，所述至少一种壁相关激酶是WAK-RLK1基因，优选选自Htn1、Ht2或Ht3或其等位基因变体、其突变体或功能片段、或编码其的基因，优选其中所述至少一种壁相关激酶a)由包含SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列的核酸分子或其功能片段编码，b)由包含与SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的核苷酸序列的核酸分子编码，优选在序列的整个长度上，c)由在严格条件下与a)或b)的互补序列杂交的核酸分子编码，d)由包含编码SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列或其功能片段的核苷酸序列的核酸分子编码，e)由包含编码与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子编码，优选在序列的整个长度上，f)包含SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列，或g)包含与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的氨基酸序列，优选在序列的整个长度上，条件是a)至g)中的任何序列(任选在表达后)仍编码至少一个功能性Htn1、Ht2或Ht3或其等位基因变体、突变体或功能片段。在一个优选的实施方案中，所述至少一种壁相关激酶选自Htn1(RLK1)或其等位基因变体、突变体或功能片段或编码其的基因。变体可以进一步包含WAK基因的任何功能性剪接变体。如本领域技术人员所知，包含内含子的真核mRNA在加工期间从前体mRNA剪接成成熟的mRNA，从而在翻译后产生蛋白质(蛋白质生物合成)。
根据本发明的与WAK或任何其他受体样激酶或任何至少一种额外的基因/蛋白质(例如bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因，或相应的蛋白质Bx1、Bx2、Igl、Bx6，Bx11、Bx14、Opr2、Lox3或Aoc1)结合使用的“功能性”或“功能性片段”或“变体”，是指这样的氨基酸或核酸序列的片段，其涉及到在感兴趣的植物基因组的天然环境中各自的(较长)序列，而功能片段仍包含–任选地在转录、加工和翻译后–各自亲本序列的至少一种功能。功能片段的空间需求可能较小，并因此对于某些方法更方便。此外，可以将功能片段与另一个结构域融合以产生用于功能测定的融合分子，例如，与编码具有荧光活性的蛋白质的基因的融合物。在另一个实施方案中，功能片段可以与标签等融合。因此，功能片段也可包含含有在核酸水平上密码子最优化或含有某些突变的序列，所述突变不影响WAK或其他感兴趣的受体样激酶的活性或功能。
优选地，任何功能变体至少包含WAK的细胞外信号传导结构域和活性细胞内激酶结构域的截短形式，其中所述细胞内激酶结构域能够启动下游信号传导。值得注意的是，根据本发明的WAK的细胞外结构域、跨膜结构域和/或细胞内激酶结构域可包含至少一个突变。在本发明的意义上，所述突变可导致增加的信号传导活性以代表功能性变异或功能性突变。
在根据本发明的某些方面，根据本发明的方法引入和/或修饰和/或调节至少一个额外的或其他基因，例如bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因，在至少一种变体或突变体导致BXD合成减少的情况下，代表“功能丧失”或具有降低的活性的变体或突变体可能是对于本发明的目的特别优选的。特别地，根据本发明发现，在WAK信号传导途径和BXD合成途径(主要是由Bx1、Bx2、Bx6、Bx11和BX14和/或Igl介导的BXD合成途径)之间存在串扰，其中在植物中至少一种WAK或编码其的基因，以及额外的效应物或编码其的基因(例如bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因)的定向插入、调控或修饰，有助于增强真菌抗性，特别是对NCLB的抗性，因为两种途径的调节均导致BXD特征减少。其中在该调节网络中，WAK途径起着一般“起搏器”的作用，由于其识别和激酶功能而感知并转发信号，而茉莉酸和BXD合成途径中涉及的其他效应物之间也存在反馈调节。WAK的主要调节功能是通过以下事实证明的：在具有ZmWAK-RLK1的基因型中Bx1和Igl的联合表达始终较低(图11B和C和实施例10)，这表明ZmWAK-RLK1和其他WAK具有诱导还调节苯并恶嗪类化合物途径和茉莉酸途径的协同作用的能力。
在根据本发明各个方面的一个实施方案中，用于产生具有增强的真菌抗性的植物的方法因此包括引入和/或修饰和/或调节至少一种WAK或编码其的基因，其中WAK至少包含功能性细胞内激酶结构域，例如选自SEQ ID NO：1、2、7或8的序列或其等位基因变体或突变体，并且其中所述方法进一步包括引入和/或修饰和/或调节至少一种BX或Igl蛋白或编码其基因，其中相应的bx基因或Igl基因包含至少一个突变，或者其中bx基因或Igl基因具有特定基因型被敲除，使得WAK活性和减少或缺失的BX蛋白或Igl蛋白活性导致BXD生物合成减少。
取决于激酶结构域的催化位点上精氨酸残基的存在与否，受体样激酶可进一步分为RD和非RD激酶。ZmWAK-RLK2包含RD激酶，且ZmWAK-RLK1具有非RD激酶结构域(例如，参见SEQ ID NO：2的第505和506位，分别为氨基酸F(苯丙氨酸)和D(天冬氨酸)。迄今为止，已鉴定的大多数参与植物免疫的受体样激酶属于非RD激酶，而RD激酶被认为在其他过程(例如发育)中起作用。已经构建SEQ ID NO：2的变体(参见SEQ ID NO：3至6和Hurni等人，2015)。发现在位置M455、G497和G548(参考SEQID NO：2)上的突变可能导致对NCLB的更高易感性。所有所述位置位于ZmWAK-RLK1的丝氨酸苏氨酸激酶结构域中。因此，根据本发明的功能变体将避免WAK的激酶结构域中的任何突变或突变的组合，所述突变或突变的组合会导致真菌抗性降低。SEQ ID NO：2的示例性突变体显示为SEQ ID NO：3和4(RLK1b，M455I)和SEQ IDNO：5和6(RLK1d，G497E)。与根据SEQ ID NO：2的野生型序列相比，本文分析的另一突变体RLK1f包含突变G548R。与本文所述的各个姐妹系相比，测试所有突变体。基于这些结构数据，可以推断出WAK的功能性细胞内激酶结构域的重要性。因此，与同源野生型序列相比，WAK的功能变体或功能突变体可包含至少一个突变，其中所述至少一个突变不干扰WAK的下游信号传导，在该意义上这将降低特定的BXD化合物的水平，进而增加包含这种WAK功能变体或编码其的序列的植物、植物细胞、组织或器官的真菌抗性。
根据本发明的某些实施方案，可以将超过一种编码WAK的基因或其功能片段或编码其的序列引入到至少一种植物细胞、组织、器官或整株植物或在至少一种植物细胞、组织、器官或整株植物中调节或修饰。几种WAK的渐渗可以在提供增强的真菌抗性中具有协同作用，特别是基于根据本发明的内容将超过一种WAK分别引入感兴趣的植物的基因组中可以建立优良品系的情况下。如本文所述，WAK代表启动在WAK的细胞内激酶结构域下游并由WAK的细胞内激酶结构域介导的免疫级联的关键信号传导分子。因此，超过一种WAK可能因此具有积极下调BXD合成的剂量效应，并因此增加了感兴趣的植物特别是作物植物中的真菌抗性。此外，可以如上所述额外地或替代地修饰至少一种额外的基因或蛋白质，其优选选自SEQ ID NO：10至27中的任一个或其同源基因或同源物，以提供植物细胞、组织、器官或整株植物，作为产生具有改善的真菌抗性，优选针对NCLB的抗性的植物的材料。在本文的表1和3中公开在WAK信号传导和BXD生物合成之间的串扰中具有影响的待修饰的其他靶序列。
在根据本发明的另一个实施方案中，提供一种方法，其中通过提供至少一种壁相关激酶、其等位基因变体、突变体或功能性片段或编码其的基因来实现至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成减少，其中所述至少一种壁相关激酶包含这样的序列，其可直接或间接影响苯并恶唑嗪酮类途径和至少一种额外的植物代谢途径，优选为疾病抗性相关途径，其中所述植物代谢途径选自茉莉酸途径、乙烯途径、木质素合成途径、防御途径、受体样激酶途径、细胞壁相关途径，优选地，其中所述至少一种额外的植物代谢途径为茉莉酸酸途径，并且其中至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成减少是通过降低或下调由至少一种感兴趣的WAK诱导的Igl和/或Bx1表达实现的。
由本发明的发明人鉴定的几种差异表达基因(DEG)属于几种不同的免疫网络和不同的与疾病抗性相关的途径，包括苯并恶唑嗪酮类(BXD)的生物合成、(植物激素)茉莉酸(JA)、乙烯、木质素、防御和受体样激酶以及细胞壁，是在Htn1 NIL中发现的(实施例10，图13)。令人惊讶地，BXD生物合成途径的六个基因在至少一个时间点显示差异表达，包括Bx1(SEQ ID NO：10和11)，Bx2(SEQ ID NO：12和13)，Igl样(SEQ ID NO：14和15)，Bx6(SEQ IDNO：16和17)，Bx11(SEQ ID NO：18和19)和Bx14(SEQ ID NO：20和21)(另请参见图13的表的第2栏以作为公众可得的有关基因ID和名称的数据库条目的进一步参考)，表明WAK与真菌防御中的其他途径之间的交叉调控网络。这尤其令人惊讶，因为迄今为止，作为次生代谢产物的BXD尚未与由WAK激酶介导的针对真菌的防御相关。更令人惊讶的是，转录组数据和功能性测定也首次揭示免疫网络的部分的DEG，所述DEG包括植物激素茉莉酸，它在调节针对半营养和坏死性疾病的抗性中起着重要作用。JA处理可以诱导BXD化合物的积累(Oikawa,Akira,Atsushi Ishihara,and Hajime Iwamura."Induction of HDMBOA-Glcaccumulation and DIMBOA-Glc 4-O-methyltransferase by jasmonic acid inpoaceous plants."Phytochemistry 61.3(2002):331-337；Oikawa,Akira,et al."Accumulation of HDMBOA-Glc is induced by biotic stresses prior to the releaseof MBOA in maize leaves."Phytochemistry 65.22(2004):2995-3001)。因此，本发明为以下提供证据：在WAK激酶信号传导途径和茉莉酸途径之间存在另外的联系，这为多种新疾病且尤其是本文所述的真菌抗性策略铺平了道路。IGL的酶学性质类似于BX1，但是它们相应基因的转录调控是不同的。像其他Bx基因一样，Bx1在植物的早期发育阶段进行组成型表达，这与内源性BX水平相关。携带Bx1基因的突变等位基因的植物仅产生Bx1野生型植物中发现的BX的一部分。因此，根据本发明的WAK可以充当主调节因子，其为抗真菌信号传导与茉莉酸途径和其他途径的效应物(优选选自由以下组成的组的效应物：SEQ ID NO：10至27或其同源基因或同源物)搭建桥梁。
在一个实施方案中，将编码至少一种壁相关激酶的至少一种额外的基因引入植物细胞、组织、器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞中可以包括通过育种技术的手段或通过分子生物学的手段引入核酸序列，包含单链和/或双链形式的DNA和/或RNA或氨基酸序列，以转移感兴趣的功能性WAK或额外的感兴趣的功能性WAK，或编码其的序列进入至少一个感兴趣的细胞。所述至少一种额外的基因也可以是任何基因，其中所得蛋白质/酶参与BXD生物合成途径或茉莉酸途径，例如Bx1、Bx2、Bx3、Bx4、Bx5、Bx7、Bx8、Bx9、Bx10、Bx11、Bx12、Bx13、Bx14、Igl、Glu1、Glu2、OPR2、LOX3或AOC1(参见图13和SEQ ID NO：10至27)，或其任何变体或前述基因/蛋白质的组合。优选地，所述至少一种额外的基因包含至少一个突变，其改变天然存在的相应额外的基因的功能，其中所述突变在编码区中或在调节区内导致相应的BXD化合物的合成减少，或其中调控区如启动子区或编码区中的突变导致来自位于信号传导级联上游的WAK激酶的信号转导减少，因此所述突变导致BXD化合物的合成减少。在另一个实施方案中，编码Bx1、Bx2、Bx3、Bx4、Bx5、Bx7、Bx8、Bx9、Bx10、Bx11、Bx12、Bx13、Bx14、Igl、Glu1、Glu2、OPR2、LOX3或AOC1中的至少一种的基因可以在感兴趣的植物细胞的基因组内被缺失或部分缺失，或者所述基因可以靶向方式被修饰。
可以根据本发明的方法调节、引入或修饰以在植物细胞、植物或植物材料途径中实现提高的真菌抗性的其他参与BXD合成的调节的酶选自由以下组成的组：茉莉酸合成途径酶，包括12-氧-植物二烯酸还原酶2(OPR2)、脂氧合酶3(LOX3)或氧化烯环化酶1(AOC1)，乙烯途径酶，例如S-腺苷甲硫氨酸合酶，木质素途径酶，例如咖啡酰-CoA O-甲基转移酶1(OMT1)或OMT2，参与植物防御机制的酶和蛋白质，例如SAF1-Safener诱导1；谷胱甘肽S-转移酶及其任何组合。
目前，WAK是唯一可以将细胞壁与质膜物理连接的已知蛋白质(Brutus,Alexandre,et al."A domain swap approach reveals a role of the plant wall-associated kinase 1(WAK1)as a receptor of oligogalacturonides."Proceedings ofthe National Academy of Sciences 107.20(2010):9452-9457)。因此，根据本发明，其他结构上和功能上相关的细胞壁跨越或缔合激酶也适合作为WAK，例如玉米qHSR1(Zuo,Weiliang,et al."A maize wall-associated kinase confers quantitativeresistance to head smut."Nature genetics 47.2(2015):151-157)或通过增强细胞壁赋予定量的水稻白叶枯病抗性的水稻OsWAK/Xa4基因(Hu et al.2017)。
在根据本发明的另一个实施方案中，将至少一种基因引入植物细胞，组织，器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞中的步骤可以包括引入基因，其中由所述基因编码的氨基酸序列或酶参与WAK激酶下游的催化途径，其中所述额外的基因被单独引入，或与编码WAK激酶或其变体的至少一种基因一起被引入。
“苯并恶唑嗪酮类”或“BXD”是一类由吲哚衍生的植物化学防御物，包括具有2-羟基-2H-1,4-苯并恶嗪-3(4H)-一个骨架的化合物及其衍生物。BXD被描述为单子叶植物中的植物化学物质，包括草，包括重要的谷物作物，如玉米、小麦和黑麦，以及某些双子叶物种。本文所用的术语“BXD”是指苯并恶唑嗪酮类(葡萄糖苷和相应的含有2-羟基-2H-1,4-苯并恶嗪-3(4H)-骨架的相应苷配基)及其在代谢途径中的下游衍生物苯并恶唑啉酮以及任何中间体。因此，术语BXD还可以包含在质体、细胞质和细胞壁中发现的水解葡糖苷酶的活性的结果的衍生物，或者是通过氧代-环/环链互变异构体降解为苯并恶唑啉酮的结果的衍生物和中间体。还包括直接衍生自任何苯并恶唑啉酮的下游代谢物。术语“BXD”应进一步包括任何开放形式，成氮翁离子形式或络合物，例如来自BXD的金属络合物。BXD的基本结构如图1所示。
术语“降低的/减少的苯并恶唑嗪酮类的合成”或“降低的至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成”或“降低至少一种苯并恶唑嗪酮类的量”或“降低BXD的含量”或“降低的BXD化合物的量”等是指根据本发明的植物细胞、组织、器官或整株植物表现出这样的苯并恶唑嗪酮类、至少一种苯并恶唑嗪酮类或感兴趣的苯并恶唑嗪酮类的量，其与相应的对照植物细胞、对照组织、对照器官或对照整株植物相比降低至少10％、15％、20％或25％，优选至少30％、35％、40％或45％，更优选至少50％、60％或70％，所述对照植物细胞、对照组织、对照器官或对照整株植物具有相同基因型，但是缺少编码至少一种壁相关激酶的至少一种基因的修饰或至少一种壁相关激酶的表达水平的调节和/或从至少一种壁相关激酶到合成至少一种苯并恶唑嗪酮类的信号传导途径中的至少一个分子或至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径中的至少一个分子的转录水平、表达水平或功能的调节。在根据本发明的各个方面的一个实施方案中，其合成受所述至少一种壁相关激酶的调节，并且任选地受茉莉酸和/或苯并恶唑嗪酮类途径的至少一种额外的酶调节的苯并恶唑嗪酮类，选自DIM2BOA、DIMBOA、HMBOA、HM2BOA、HDMBOA、HDM2BOA、HBOA、DHPOA、DIBOA或TRIBOA中的至少一种，前述的苯并恶唑嗪酮类为葡糖苷或苷配基形式，或为苯并恶唑啉酮，或前述的苯并恶唑嗪酮类的任意组合，优选其中其合成受所述至少一种壁相关激酶的调节的苯并恶唑嗪酮类选自DIM2BOA、DIMBOA、HMBOA或HDMBOA的至少一种，前述的苯并恶唑嗪酮类为葡萄糖苷或糖苷配基形式，或前述的苯并恶唑嗪酮类的任意组合。
在根据本发明各个方面的一个实施方案中，可以通过将编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因导入植物细胞、组织、器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞中来实现降低的BXD含量，其中所述至少一种壁相关激酶引起至少一种BXD的合成减少。可能已经在感兴趣的植物细胞的基因组中存在的WAK基因之外，可以将超过一种编码WAK的基因和WAK基因的不同等位基因变体引入感兴趣的细胞。因此，参与BXD合成的几种WAK或受体样激酶的存在可能是有利的，以便增加感兴趣的基因的拷贝数，并从而增加感兴趣的基因的剂量效应。
在一个实施方案中，数量NCLB疾病抗性基于至少一种次生代谢物BXD的生物合成的减少，所述次生代谢物BXD优选DIM2BOA-Glc、DIMBOA、HMBOA、DIMBOA-Glc或HMBOA-Glc，以及根据本发明的各个方面的方法包括添加与之相互作用的清除剂分子，并且所述清除剂分子中和至少一种次级代谢物BXD的活性，以减少至少一种次级代谢物BXD敏感性组分的量，以减少真菌感染至少一种植物细胞、组织、器官或整株植物。
因此，根据本发明，提供了用于产生具有增强的真菌抗性的植物的方法，其中所述真菌抗性由至少一种壁相关激酶调节。因此，“调控”在本文中意指由至少一种壁相关激酶介导的直接或间接调控。该调控可能意指由至少一种壁相关激酶引发并通过参与信号传导级联的其他分子进行的信号传导级联。所述调控可以在蛋白质，RNA或核酸水平上。此外，所述调控可能意指串扰或反馈调控(例如意指Bx1、Bx2、Bx3、Bx4、Bx5、Bx7、Bx8、Bx9、Bx10、Bx11、Bx12、Bx13、Bx14、Igl、Glu1、Glu2、OPR2、LOX3或AOC1酶，或编码其的基因)，或这样的进一步编码Bx1、Bx2、Bx3、Bx4、Bx5、Bx7、Bx8、Bx9、Bx10、Bx11、Bx12、Bx13、Bx14、Igl、Glu1、Glu2、OPR2、LOX3或AOC1的基因的转录调控，或编码Bx1、Bx2、Bx3、Bx4、Bx5、Bx7、Bx8、Bx9、Bx10、Bx11、Bx12、Bx13、Bx14、Igl、Glu1、Glu2、OPR2、LOX3或AOC1的基因的调节或修饰。
在一个实施方案中，根据本发明的病原体是一种侵染植物的真菌病原体。由真菌病原体和相应的真菌引起的疾病可以选自羽毛斑枯病颖枯壳针孢(Septoria(Stagonospora)nodorum)、叶疱病(小麦壳针孢(Septoria tritici))、Ear fusarioses(镰刀菌属(Fusarium spp.))、晚疫病(致病疫霉(Phytophthora infestans))、炭疽病叶枯病或炭疽柄腐病(禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)(有性型：Glomerellagraminicola Politis)Glomerella tucumanensis)、弯孢菌叶斑(棒状弯孢(Curvulariaclavata)，C.eragrostidis，＝C.maculans(有性型：Cochliobolus eragrostidis))、Curvularia inaequalis、C.intermedia(有性型：Cochliobolus intermedius)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)(有性型：新月旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus))、苍白弯孢霉(Curvularia pallescens)(有性型：苍白旋孢腔菌(Cochliobolus pallescens))、塞内加尔弯孢霉(Curvularia senegalensis)、C.tuberculata(有性型：Cochliobolustuberculatus)、亚隔孢壳属叶斑病(Didymella leaf spot)(Didymella exitalis)、二倍体叶斑病或条纹病(Stenocarpella macrospora＝Diplodialeaf macrospora)、褐色条纹霜霉病(大豆疫霉(Sclerophthora rayssiae var.zeae))、Crazy top downy mildew(大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)＝Sclerospora macrospora)、绿耳霜霉病(Greenear downy mildew)(禾生指梗霉(Sclerospora graminicola))、叶斑病(多种小叶斑病)(烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、玉蜀黍壳二孢(Ascochyta maydis)、小麦裾叶炫菌(A.tritici)、A.zeicola、维克多利亚离蠕孢(Bipolaris victoriae)＝维克多利亚长蠕孢(Helminthosporium victoriae)(有性型：维克多利亚旋孢腔菌(Cochliobolusvictoriae))、巨大旋孢腔菌(C.sativus)(无性型：根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)＝H.sorokinianum＝芫荽长蠕孢(H.sativum))、黑附球菌(Epicoccum nigrum)、Exserohilum prolatum＝Drechslera prolata(有性型：Setosphaeria prolata)Graphiumpenicillioides、玉蜀黍小球腔菌(Leptosphaeria maydis)、玉蜀黍细盾壳(Leptothyriumzeae)、格孢及盘蛇孢(Ophiosphaerella herpotricha)、(无性型：Scolecosporiellasp.)、Paraphaeosphaeria michotii、茎点霉属(Phoma sp.)、Septoria zeae、S.zeicola、S.zeina、玉米大斑病(Setosphaeria turcica(无性型：玉米大斑病菌＝大斑病长蠕孢))、玉米圆斑病(Northern corn leaf spot)(炭色孢腔菌(Cochliobolus carbonum)(无性型：玉米生平脐蠕孢(Bipolaris zeicola)＝玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)))、球腔菌叶斑病(Phaeosphaeria leaf spot)(玉蜀黍球腔菌(Phaeosphaeria maydis)＝玉蜀黍亚球壳(Sphaerulina maydis))、嘴突叶斑病(Rostratum leaf spot)(Setosphaeriarostrata、(无性型：嘴突长蠕孢(Helminthosporium rostratum))、爪哇霜霉病(Javadowny mildew)(玉蜀黍指霜霉(Peronosclerospora maydis)＝玉蜀黍指梗霉(Sclerospora maydis))、菲律宾霜霉病(Philippine downy mildew)(菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)＝菲律宾指梗霉(Sclerosporaphilippinensis))、高粱霜霉病(Sorghum downy mildew)(高粱指霜霉(Peronosclerospora sorghi)＝高粱指梗霉(Sclerospora sorghi))、野大麦霜霉病(Spontaneum downy mildew)(野大麦指霜霉(Peronosclerospora spontanea)＝野大麦指梗霉(Sclerospora spontanea))、甘蔗霜霉病(Sugarcane downy mildew)((甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)＝甘蔗指梗霉(Sclerospora sacchari))、菌核穗腐病(Sclerotium ear rot)(白绢病(southern blight))(甘蔗齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii Sacc.)(有性型：白绢病菌(Athelia rolfsii)))、种腐苗枯病(Seed rot-seedling blight)(根腐离蠕孢、玉米生平脐蠕孢＝玉米圆斑病菌、Diplodia maydis、Exserohilum pedicillatum、玉米大斑病菌＝大斑病长蠕孢、燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)、黄镰刀菌(F.culmorum)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、玉米赤霉菌(Gibberella zeae)(无性型：禾谷镰刀菌(F.graminearum))、菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)、青霉菌属(Penicillium spp.)、拟茎点霉属(Phomopsis sp.)、腐霉属(Pythium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、玉蜀黍丝核菌(R.zeae)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、穗霉属(Spicaria sp.)、壳月孢属叶斑病(Selenophoma leafspot)(壳月孢属(Selenophoma sp.))、黄叶枯病(Yellow leaf blight)(Ascochytaischaemi、玉米黄叶枯病菌(Phyllosticta maydis)(有性型：Mycosphaerella zeae-maydis)、轮纹斑(Zonate leaf spot)(高粱胶尾孢(Gloeocercospora sorghi))。
其他植物病原性真菌包括Plasmodiophoromycota，例如Plasmodiophorabracusicae(十字花科蔬菜根肿病(clubroot of crucifers))、粉痂病菌(Spongosporasubterranean)、禾谷多粘菌(Polymyxa graminis)、卵菌(Oomycota)，例如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)(莴苣霜霉病(downy mildew of lettuce))、以下中的霜霉(Peronospora)(霜霉病(downy mildew))：金鱼草(snapdragon)(P.antirrhini)、洋葱(P.destructor)、菠菜(P.effusa)、大豆(P.manchurica)、烟草("青霉病(blue mold)"；烟草霜霉(P.tabacina))紫花苜蓿和三叶草(三叶草霜霉(P.trifolium))、草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)(啤酒花的霜霉病(downy mildew of hops))、轴霜霉(Plasmopara)(以下中的霜霉病：葡萄藤(grapevines)(葡萄轴霜霉(P.viticola))和向日葵(P.halstedii))、大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)(谷类和草类的霜霉病)、腐霉菌(Pythium)(例如由P.debaryanum引起的甜菜的潮湿腐烂(damping-off))、致病疫霉(Phytophthora infestans)(马铃薯和番茄等中的晚疫病(late blight))、白锈属物种(Albugo spec.)、子囊菌(Ascomycota)例如(雪霉微座孢(Microdochium nivale)(黑麦和小麦的雪霉病(snow mold))、镰刀菌(Fusarium)、禾谷镰刀菌、黄镰刀菌(主要在小麦中部分穗不育)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(番茄萎凋病(Fusarium wilt oftomato))、禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis)(大麦(sp.hordei)和小麦(f.sp.tritici)的白粉病(powdery mildew))、豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)(豌豆的白粉病)、仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena)(果树的溃疡病(Nectria canker))、葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)(葡萄的白粉病)、Pseudopeziza tracheiphila(葡萄的赤火病(red fire disease))、麦角菌(Claviceps purpurea)(例如黑麦和草)、全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)(在小麦、黑麦和其他草上的全蚀病(take-all))、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)(大麦的叶条纹病(leafstripe))、大麦网斑病菌(Pyrenophora teres)(大麦的网状斑点病(net blotch))、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)(小麦的叶枯病(leaf blight))、苹果黑星菌(Venturia inaequalis)(苹果黑星病(apple scab))、向日葵菌核菌(Sclerotiniasclerotium)(茎断、茎烂)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)(苜蓿、白色和红色三叶草的叶斑病(leaf spot))、担子菌(Basidiomycetes)例如肉孢核瑚菌(Typhulaincarnate)(大麦、黑麦、小麦上的核瑚菌枯病(typhula blight))、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米上的水泡黑穗病(blister smut))、大麦散黑穗菌(Ustilagonuda)(大麦上的散黑穗病(loose smut))、小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)(小麦、斯佩耳特小麦上的散黑穗病)、燕麦散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麦上的散黑穗病)、立枯丝核菌(马铃薯的丝核根腐病(rhizoctonia root rot))、轴黑粉菌属(Sphacelotheca spp.)(高粱的黑穗病(head smut))、Melampsora lini(rust of flax)、禾柄锈菌(Pucciniagraminis)(小麦、大麦、黑麦、燕麦的茎锈病(stem rust))、隐匿柄锈菌(Pucciniarecondite)(小麦上的叶锈病(leaf rust))、黑麦叶锈菌(Puccinia dispersa)(黑麦的褐锈病(brown rust))、大麦柄锈菌(Puccinia hordei)(大麦的叶锈病)、禾冠柄锈菌(Puccinia coronate)(燕麦的冠状锈病(crown rust))、条形柄锈菌(Pucciniastriiformis)(小麦、大麦、黑麦和大量草的黄锈病(yellow rust))、菜豆锈病菌(Uromycesappendiculatus)(菜豆的褐锈病(brown rus))、齐整小核菌(许多植物的根和茎腐烂)、半知菌(Deuteromycetes)(半知菌类(Fungi imperfecti))例如颖枯壳针孢(Septorianodorum)(颖枯壳多孢(Stagonospora nodorum))小麦的(稃枯病(glume blotch))(小麦壳针孢(Septoria tritici))、眼斑病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)(小麦、大麦、黑麦的眼斑病(eyespot))、Rynchosporium secalis(黑麦和大麦的叶斑病(leafspot))、茄链格孢(Alternaria solani)(马铃薯、番茄的早疫病(early blight))、Phomabetae(甜菜的黑胫病(blackleg))、Cercospora beticola(甜菜上的叶斑病)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)(油菜、卷心菜和其他十字花科植物上的黑斑病(black spot))、黄萎病菌(Verticillium dahlia)(黄萎病(verticillium wilt))、炭疽菌(Colletotrichum)例如菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianum)(菜豆炭疽病(bean anthracnose))、黑胫茎点霉(Phoma lingam)(卷心菜和油菜的黑胫病)、葡萄孢菌(Botrytis cinerea)(葡萄、草莓、番茄、啤酒花等的灰霉病(grey mold))。
基于本发明的公开，在感兴趣的农作物中优选的要预防的真菌疾病和可以防治的相应的致病性病原体选自来自格孢腔菌(Pleosporales)目的真菌，包括引起玉米大斑病(NCLB)(特别是影响玉米和小麦植物)的玉米大斑病菌/大斑病长蠕孢、或包括引起南部玉米叶枯病的玉米小斑病菌，引起锈病的Pucciniales目，包括引起常见锈病的高粱柄锈菌、或引起Diploida叶条纹/枯萎的Diploida macrospora或引起炭疽病的禾生炭疽菌，或镰刀菌属，优选引起镰刀菌茎腐烂的Fusarium verticilioides，或赤霉菌属，例如引起赤霉茎腐病的玉米赤霉菌、或引起玉米丝黑穗病的丝黑穗病菌，因此是可以在植物中预防并通过本发明的方法可以在植物中预防的由致病真菌引起的植物病。
在根据本发明各个方面的一个实施方案中，可以将编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因稳定地整合到至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中，或可以将编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因瞬时导入植物细胞、组织、器官或整株植物中。
在根据本发明各个方面的另一个实施方案中，可以将壁相关激酶下游的信号传导级联内的至少一个其他编码至少一种酶的基因稳定地整合到至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中，或可以将壁相关激酶下游的信号传导级联内的至少一个其他编码至少一种酶的基因瞬时导入植物细胞、组织、器官或整株植物。
本文公开了通过分子生物学或常规和现代育种的手段以及相关的工具和方法将感兴趣的基因引入感兴趣的植物细胞的方法，并且所述方法是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，瞬时引入可以包括直接引入氨基酸效应物而不是引入感兴趣的基因。
在根据本发明各个方面的一个实施方案中，可以将编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因稳定地整合到至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中，其中编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因的引入包括植物育种期间至少一种基因的渐渗。
可以使用多种标准育种技术中的任何种类，取决于要杂交的物种。由于本发明的基因或核酸的表达可以导致表型改变，可以将包含本发明的重组核酸的植物与第二植物性杂交以获得最终产物。因此，本发明的种子可以源自本发明的两个转基因植物之间的杂交，或来自本发明的转基因或突变植物与另一个植物之间的杂交。当两个亲本植物都表达本发明的基因或突变等位基因，或者如果两个等位基因都被修饰甚至缺失时，可以增强期望的作用，例如表达本发明的至少一种WAK基因或突变等位基因，以产生具有修饰的BXD合成性质或具有修饰的Bx1、Bx2、Bx3、Bx4、Bx5、Bx7、Bx8、Bx9、Bx10、Bx11、Bx12、Bx13、Bx14、Igl、Glu1、Glu2、OPR2、LOX3或AOC1谱的植物，这取决于要根据本发明的公开内容修饰的靶标。期望的效果可以通过标准的繁殖方式传递给下一代植物。因此，如上文所详述，“渐渗”是指通过自然手段，即通过使包含本文所述的感兴趣的基因或等位基因的植物与不包含所述基因或等位基因的植物杂交，将基因或等位基因整合到植物的基因组中。后代可以选择包含感兴趣的基因或等位基因的后代。
此外，本发明的方法可导致植物材料(包括谷物或种子)的产生或提供，这涉及本领域已知的用于产生其他植物、植物部分或种子的任何手段，并且尤其包括营养繁殖方法，例如，空气或地面压条、分生、(芽)嫁接、微繁殖、匍匐茎或匍匐枝、贮藏器官(诸如鳞茎、球茎、块茎和根茎)、打击或切割(striking或cutting)、或双鳞(twin-scaling)，有性繁殖，包括与另一种植物杂交，和无性繁殖，例如无融合生殖、体细胞杂交等。
在根据本发明各个方面的一个实施方案中，在产生具有增强的真菌抗性的植物的方法的步骤(ii)(a)或(ii)(b)中编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因的修饰或编码Bx1、Bx2、Bx3、Bx4、Bx5、Bx7、Bx8、Bx9、Bx10、Bx11、Bx12、Bx13、Bx14、Igl、Glu1、Glu2、OPR2、LOX3或AOC1的基因的修饰可以通过以下来进行：位点特异性核酸酶(SSN)或其催化活性片段或编码其的核酸序列、寡核苷酸定向(ODM)诱变(ODM)、化学诱变或TILLING中的至少一种。
TILLING最初是模型植物中的一种功能性基因组学工具，现已扩展到许多植物物种，并对于作物物种中的反向遗传学至关重要。最近对TILLING的一项重大更改是将下一代测序(NGS)应用于该过程，这允许基因靶标和基因组的多重化。NGS最终将导致TILLING成为计算机程序。因为它容易适用于大多数植物，它仍然是在已知基因中获得突变的主要非转基因方法，并因此代表根据本发明的方法的容易获得的非转基因处理的方法。如本领域技术人员所知，TILLING通常包括化学诱变，例如，使用对感兴趣的基因组的甲磺酸乙酯(EMS)或紫外线诱导的修饰，和鉴定靶基因中单碱基突变的敏感DNA筛选技术一起，其中所述靶基因可以编码选自由以下组成的组的蛋白质：受体样激酶，例如WAK，参与苯并恶唑嗪酮类合成或代谢、防御、木质素途径、茉莉酸合成途径的酶，或涉及上述代谢和/或信号传导途径之一的转录因子。
SSN和ODM诱变均是用于植物细胞中精密基因组工程的合适技术。如本领域技术人员所知，ODM提供了快速、精确且非转基因的育种替代品，用于农业中的性状改良，以解决这一紧急需求。ODM是一种精确的基因组编辑技术，它使用寡核苷酸对植物系统的质粒、游离基因和染色体DNA进行靶向编辑。
在根据本发明的各个方面和实施方式的一个实施方式中，至少一种位点特异性核酸酶(SSN)或编码其的核酸序列可以选自以下至少一种：CRISPR核酸酶包括Cas或Cpf1核酸酶、TALEN、ZFN、大范围核酸酶、碱基编辑复合物、限制性内切核酸酶(包括FokI或其变体)或两个位点特异性切口内切核酸酶，或其变体或催化活性片段。所述靶向基因组工程SSN可以既适合于引入尚不存在于特定基因型中的感兴趣的基因，又适合于针对给定特定基因型的基因进行靶向诱变以调节(上调或下调)由以高度精确的方式进行修饰的感兴趣的基因编码的酶的活性。
同时，SSN成为定点基因组工程必不可少的先决条件。SSN是(可编程)核酸酶，其可用于在定义的位置断裂感兴趣的核酸，以诱导双链断裂(DSB)或一个或多个单链断裂。可选地，所述核酸酶可以是嵌合或突变的变体，不再包含核酸酶功能，而是与另一种酶组合作为识别分子起作用。因此，那些核酸酶或其变体是任何基因编辑或基因组工程方法的关键。近年来，已开发出许多合适的核酸酶，尤其是定制的核酸内切酶，包括大范围核酸酶、碱基编辑复合体、锌指核酸酶、TALE核酸酶和CRISPR核酸酶，包括例如Cas、Cpf1、CasX或CasY核酸酶作为成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)系统的一部分。因此，设想使用那些SSN和必要的辅助分子，例如crRNA、tracrRNA或gRNA，以及递送系统来进行根据本发明的方法。
如本文所用，“碱基编辑器”是指具有与其衍生自的蛋白质的催化活性相同的蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段单独地或当以分子复合物的形式提供时，本文称为碱基编辑或碱基编辑复合体，其具有介导靶向的碱基修饰的能力，即，如果碱基转化未引起沉默突变，而是由包含要用碱基编辑器转化的位置的密码子编码的氨基酸的转化，则感兴趣的核苷酸碱基的转化导致感兴趣的点突变。优选地，碱基编辑器临时或永久连接至至少一种位点特异性效应物，或任选地连接至至少一种位点特异性效应物复合物的组分。所述连接可以是共价和/或非共价的。多个出版物显示，使用与胞苷脱氨酶结构域、载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽(APOBEC1)(例如衍生自大鼠的APOBEC)连接的CRISPR/Cas9切口酶或非功能性核酸酶，有靶向的碱基转化，主要是将胞苷(C)转化为胸腺嘧啶(T)。由胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶(C)的脱氨基反应，并产生尿嘧啶(U)，其具有胸腺嘧啶(T)的碱基配对特性。大多数已知的胞苷脱氨酶在RNA上运行，并且已知接受DNA的少数实例需要单链(ss)DNA。
根据本发明的“CRISPR核酸酶”可以是基于CRISPR的核酸酶或编码其的核酸序列，其选自由以下组成的组：(a)Cas9，包括SpCas9，SaCas9，SaKKH-Cas9，VQR-Cas9，St1Cas9，(b)Cpf1，包括AsCpf1，LbCpf1，FnCpf1，(c)CasX或(d)CasY或前述基于CRISPR的核酸酶的任何变体或衍生物，或与相应野生型相比包含突变的基于CRISPR的核酸酶，从而使得到的基于CRISPR的核酸酶转变为单链特异性DNA切口酶，或转变为缺乏全部DNA切割能力的DNA结合效应物。如本文所用，“基于CRISPR的核酸酶”是已经在天然存在的CRISPR系统中鉴定的任何核酸酶，其随后从其天然背景中分离，并且其优选已被修饰或组合成感兴趣的重组构建体，适合作为靶向基因组工程的工具。只要最初的基于野生型CRISPR的核酸酶提供DNA识别，即结合特性，任何基于CRISPR的核酸酶都可以使用并任选重新编程或另外突变以适合本发明的各种实施方案。所述DNA识别可以是PAM依赖性的。具有优化和工程化PAM识别模式的CRISPR核酸酶可用于特定应用并可以为了特定应用而创造。PAM识别编码的扩展可以适合于将位点特异性效应复合物靶向感兴趣的靶位点，而与野生型CRISPR基核酸酶的原始PAM特异性无关。Cpf1变体可以包含S542R，K548V，N552R或K607R突变中的至少一种，优选来自酸性氨基酸球菌的AsCpf1中的突变S542R/K607R或S542R/K548V/N552R(参见SEQ ID NO：24)。此外，根据本发明的方法，可以使用修饰的Cas变体，例如Cas9变体作为碱基编辑复合物的一部分，例如，BE3，VQR-BE3，EQR-BE3，VRER-BE3，SaBE3，SaKKH-BE3(参见Kim等，Nat.Biotech.,2017,doi:10.1038/nbt.3803)。因此，根据本发明，设想人工修饰的CRISPR核酸酶，其实际上可能不是在双链切割酶意义上的任何“核酸酶”，而是切口酶或核酸酶死亡变体，其仍具有固有的DNA识别能力以及因此具有DNA结合能力。用于本发明方法中的其它合适的基于Cpf1的效应物来源于滑麻科细菌(LbCpf1，例如NCBI参考序列：WP_051666128.1)，或来自土拉弗朗西斯菌(FnCpf1，例如UniProtKB/Swiss-Prot：A0Q7Q20.1)。Cpf1的变体是已知的(参见Gao等人，BioRxiv，dx.doi.org/10.1101/091611)。因此，可分别切割具有TYCV/CCCC和TATVPAM的靶位点并具有增强的体外和体内活性的具有突变S542R/K607R和S542R/K548V/N552R的AsCpf1突变体设想为本发明的位点特异性效应物。脱靶活性的全基因组范围评估表明这些变体保留了高水平的DNA靶向特异性，这可以通过在非PAM相互作用域中引入突变而进一步改善。总之，这些变体增加AsCpf1的靶向范围并为CRISPR/Cas基因组工程工具箱提供有用的添加。
由于受体样激酶和BX酶(参见SEQ ID NO：10至13和16至21)、Igl(SEQ ID NO：14和15)、OPR2(SEQ ID NO：22和23)、LOX3(SEQ ID NOs：24和25)和AOC1(SEQ ID NOs：26和27)广泛在多种植物中发现的事实，尤其是在具有农艺学意义的单子叶的植物(单子叶植物)和双子叶的植物(双子叶植物)。可以将本发明的方法用于几种重要的单子叶和双子叶作物植物的靶向的优化。
在根据本发明各个方面的一个实施方案中，步骤(i)中提供的至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物可以选自由以下组成的组：大麦、球茎大麦、双色高粱、甘蔗、玉蜀黍属包括玉米、小米、小粒稻、水稻、澳洲野生稻、高秆野生稻、普通小麦、硬粒小麦、黑麦、黑小麦、苹果、紫短柄草、海滨大、节节麦、Daucus glochidiatus、甜菜属包括甜菜、小胡萝卜、Daucus muricatus、胡萝卜、巨桉、美花烟草、绒毛状烟草、普通烟草、本氏烟草、番茄、马铃薯、中果咖啡、葡萄、Erythrante guttata、螺旋狸藻、黄瓜、川桑、Arabidopsis arenosa、深山南芥、拟南芥、喜马拉雅鼠耳芥、卵叶须弥芥、弯曲碎米荠、北美独行菜、荠菜、Olmarabidopsis pumila、筷子芥、欧洲油菜、甘蓝、芜菁、萝卜、芥菜、黑芥、Erucavesicaria subsp.sativa、甜橙、麻风树、毛果杨、蒺藜状苜蓿、山下鹰嘴豆、Cicerbijugum、鹰嘴豆、网状鹰嘴豆、Cicer judaicum、木豆、蔓草虫豆、菜豆、大豆、棉属、紫云英、百脉根、夏堇、洋葱、葱、蒜、向日葵、菊芋和韭菜，或属于前述植物之一的任何变种或亚种，优选其中步骤(i)中所述植物细胞、组织、器官或整株植物选自玉蜀黍属或小麦属，或属于前述植物之一的任何变种或亚种
因此，在本发明的一个方面，公开了植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料，或其衍生物或后代，其可通过根据本文公开的各个方面的任何一种方法获得。根据本发明获得的植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代将具有至少一种优化的农艺性状，其中该性状是疾病抗性或耐受性，优选为真菌抗性或耐受性，更优选为针对由本文公开的任何一种相关真菌病原体引起的由玉米大斑病菌或相关真菌疾病引起的NCLB的抗性或耐受性。基于本文提供的公开内容，其显示WAK诱导的定量NCLB抗性的功能机制，所述抗性与BXD生物合成的减少相关联，这反过来抑制半生营养性真菌玉米大斑病菌和相关真菌，本文提供的教导可以是用于提供具有有利的BXD含量，优选降低的BXD含量的植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代，以使植物细胞、组织、器官、整株植物或植物该材料或其衍生物或后代对真菌感染，即真菌侵染和持久性的抗性增加。
在根据本发明的又一个实施方案中，除了引入、调节和/或修饰感兴趣的WAK或WAK基因之外，还可以修饰感兴趣的植物细胞或植物的一种以上的农艺特性。所述农艺特性选自种子出苗、营养活力、胁迫耐受性、对另一种真菌或对另一种病原体(包括病毒、细菌、线虫、昆虫等)的疾病抗性或耐受性、除草剂抗性、分枝趋势、开花时间、种子群、播种密度、稳定性和耐贮藏性、脱粒能力(统一的成熟)、抗倒伏性、增加的产量(种子大小、产量等)、或具有农学意义的分子的修饰的组成(例如淀粉、碳水化合物、蛋白质等)。
在根据本发明的另一个方面，提供了一种方法，所述方法用于鉴定植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中参与增加的病原体抗性，优选参与增加的真菌抗性的至少一种基因，所述方法包括：(i)确定所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因型，所述基因型关于在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因组中编码壁相关激酶的至少一种基因的存在；(ii)任选地：确定步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的苯并恶唑嗪酮类特征；(iii)将步骤(i)或(ii)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料暴露于刺激下，任选地其中所述刺激与所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的苯并恶唑嗪酮类特征相关，优选其中所述刺激与真菌病原体感染相关；(iv)在暴露于刺激后，对从步骤(i)或(ii)的至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料获得的至少一种分析物进行分析；(v)，确定在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的至少一种的至少一个细胞中在暴露于根据步骤(iii)的刺激后受到调控的至少一个基因，所述至少一个基因可从步骤(iv)中定义的至少一种分析物的分析推导出，(vi)对步骤(v)中所确定的至少一个基因进行功能表征；和(vii)提供在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中参与增加的病原体抗性，优选增加的真菌抗性的至少一个基因。
在一个实施方案中，关于编码壁相关激酶的至少一个基因的存在而确定至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因型可以通过在感兴趣的植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因组中确定感兴趣的WAK基因的存在和/或转录水平来进行，优选包含根据SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列的WAK基因，或包含与SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的核苷酸序列的WAK基因，优选在序列的整个长度上，或包含优选在严格条件下与与SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的WAK基因，或包含核苷酸编码SEDID NO：2或8的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的氨基酸序列的WAK基因。
在另一个实施方案中，确定苯并恶唑嗪酮类特征包括确定来自BXD生物合成途径和/或茉莉酸途径的至少一个基因的存在和/或转录水平的步骤。所述基因可以选自SEQ IDNO：10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任何一个，或其变体、同源基因、等位基因或突变体或其片段。用于确定和/或比对感兴趣的序列的生物信息学工具是本文公开或者本领域技术人员容易获得的。
在一个实施方案中，关于编码壁相关激酶的至少一个基因的存在而确定至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因型还可包括对与本文公开的基因序列之一具有一定的序列相同性的基因测序，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，该基因尚未在可公开获得的基因组数据库中进行注释，以通过分子生物学手段，例如PCR技术确定所述基因的精确序列。
在一个实施方案中，所述用于鉴定植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中参与增加的病原体抗性，优选参与增加的真菌抗性的至少一个基因的方法可以包括确定步骤(i)的至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的苯并恶唑嗪酮类(BXD)特征。苯并恶唑嗪酮类特征是指定性和/或定量确定至少一种本文公开的感兴趣的BXD次级代谢物。所述确定可以为任何后续分析提供参考。因此，可以在不同时间点并且有或没有添加刺激下进行的苯并恶唑嗪酮类特征确定，可以提供有关在添加刺激之前和之后存在的特定BXD背景水平的信息。此外，BXD特征可以提供有关在适当和定义的条件下在植物、植物细胞、组织、器官或整株植物中合成的混合BXD化合物总量的数据。因此，BXD特征可以用作参考值，以具有针对根据本发明的方法执行的任何后续修改和/或调制的基准。由于BXD合成取决于合成途径的末端分支中不同酶的作用，可以分析一种以上不同的BXD化合物以提供感兴趣的植物细胞、组织、器官或整株植物的BXD特征，这代表在定义的条件下(时间点、刺激、刺激量和环境因素，例如生物或非生物胁迫)由植物合成的不同BXD化合物的全貌。
在一个实施方案中，所述用于鉴定植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中参与增加的病原体抗性，优选参与增加的真菌抗性的至少一个基因的方法可以包括将步骤(i)或(ii)的至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料暴露于刺激，任选地其中所述刺激与所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中的苯并恶唑嗪酮类特征相关，优选其中所述刺激与真菌病原体感染相关。
在本文中，“刺激”是指刺激植物细胞、组织、器官、整株植物的任何天然存在的，内源性或外源性，或非天然存在物质的化学物质。优选地，所述刺激是源自病原体(优选真菌病原体)或与病原体(优选真菌病原体)相关的刺激。所述刺激可以是在植物细胞、组织、器官、整株植物中触发由受体样激酶介导的免疫应答的已知PAMP或DAMP。相关性可以是本质上直接或间接的。所述“刺激”也可以是内源性物质，例如BXD或茉莉酸，或其合成变体，而BXD化合物和茉莉酸可以诱导植物细胞中的反馈调控机制。所述“刺激”可以是本身在植物中引起期望的应答的病原体。
因此，所述刺激可以是将在植物中引起应答的任何环境刺激，其中所述应答通过信号级联或植物细胞、组织、器官、整株植物内的反应来实现，例如与未刺激的植物的转录组谱相比导致不同的转录组谱。优选地，所述刺激与至少一种植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中的苯并恶唑嗪酮类特征相关。在一个实施方案中，在刺激与BXD特征之间的相关性未知的情况下，感兴趣的刺激与BXD特征之间的相关性可以通过增加感兴趣的刺激后，测量BXD信号传导途径中基因的上调或下调而容易地确定，以确定直接或间接的相关性。
在优选的实施方案中，所述刺激与真菌病原体相关，但不限于此。如在植物病理生理学领域中已知的，植物进化了复杂的策略以响应由多种不同植物病原体提供的刺激来启动防御应答。某些应答可能对病原体或与所述病原体相关或由所述病原体产生的一个特定分子具有高度特异性，而其他防御策略则是由感兴趣的刺激相关的整体调控网络的一部分。因此，根据本发明的方法，有可能分析感兴趣的刺激对感兴趣的途径的作用，以用高度有针对性的方式鉴定如本文中公开的对植物真菌应答具有有利作用的BXD或茉莉酸生物合成途径中的任何暗示，来鉴定有助于感兴趣的植物细胞、组织、器官或整株植物中有利的真菌防御应答的新靶基因。
在一个实施方案中，根据本发明的在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中鉴定至少一个参与增加的病原体抗性，优选地参与增加的真菌抗性的基因的方法可以包括在计算机可读介质上电子传送和/或电子存储数据的额外的步骤。
从至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中获得的“分析物”可包含核酸，包括DNA和RNA，氨基酸序列或植物代谢物。
在一个实施方案中，进行转录组分析，即在暴露于刺激下后使用从步骤(ii)的至少一个植物细胞、组织、器官或整步植物获得的RNA，分析从生物体的基因表达的所有信使RNA分子的总和，以获得与未经相应刺激处理的植物细胞、组织、器官或整株植物相比，用感兴趣的刺激处理过的植物细胞、组织、器官、整株植物中某些基因的转录谱的任何变化的数据。本领域技术人员可以使用多种不同的工具来进行全基因组差异表达的RNA的转录组分析，以及来分析改变的基因表达/转录。在一个实施方案中，根据上述方法的步骤(iii)的确定暴露于刺激下受到调控的至少一种基因，用于鉴定植物细胞、组织、器官、整株植物的至少一种的至少一个细胞中参与病原体抗性的至少一个基因，因此包括基因的转录水平的确定。优选地，可以进一步分析差异调控或高度调控的基因，例如与未处理的植物或植物细胞相比显著上调或下调的基因。
在另一个实施方案中，进行蛋白质组学分析，即使用从暴露于刺激下的步骤(ii)的至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物中获得的氨基酸对由植物细胞、组织或生物体表达的或可以由植物细胞，组织或生物体表达的蛋白质的整个补体进行分析，以获得与未经相应刺激处理的植物细胞、组织、器官或整株植物相比，用感兴趣的刺激处理过的植物细胞、组织、器官、整株植物中转录谱的任何变化的数据。本领域技术人员可以获得整个蛋白质组或其部分的几种用于定量和定性蛋白质组分析的方法。
在又一个实施方案中，进行代谢物的分析，所述代谢物例如由至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物产生并代表其代谢的中间物或产物的物质，以鉴定刺激对于所述感兴趣的代谢物的总体组成和生产水平的作用。
在用于鉴定至少一个参与植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中增加的病原体抗性，优选地增加的真菌抗性的基因的方法的一个实施方案中，可以对确定的感兴趣的基因进行功能表征，所述基因在暴露于刺激后被调控，优选影响BXD特征的刺激。功能表征可包括计算机分析、体外分析、体内分析或前述分析的组合。计算机分析可以包括确定所述基因在不同植物中的任何已知功能，或有关在不同植物或不同种质中所述基因的可用等位基因变体的信息。此外，计算机分析可以包括确定在感兴趣的植物的基因组中这样确定的基因的基因座，或确定与感兴趣的基因相关的调控序列。体外分析或操作可以包括感兴趣的基因的克隆、测序和表征和/或表达构建体或载体，或融合构建体的创建，或感兴趣的基因突变体的创建。体外分析或操作可进一步包括通过合适的递送载体将由合适的构建体包含的感兴趣的基因引入感兴趣的目标植物、组织、器官或整株植物中。体内分析可包括分析来自不同物种、品种或变种的不同植物或植物细胞、组织或器官，其基因组中包含或不包含感兴趣的基因，以提供感兴趣的基因可能参与的表型的功能表征，任选地通过使来自不同物种、品种或变种的不同植物或植物细胞、组织或器官经受不同的刺激和受控条件，以能够比较各自的结果。
在一个实施方案中，根据本发明的方法鉴定的至少一个参与增加的病原体抗性的基因可以进一步进行定向诱变研究和随后的功能分析，以鉴定正面或负面影响感兴趣的表型的突变，其中所述表型为与相应的野生型相比，BXD特征中的变化或真菌抗性的变化。本领域技术人员可以获得将(多个)定点突变引入给定感兴趣的基因的方法。
在本发明的一个方面，提供了一种植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代，其可以通过引入至少一个基因来获得，所述基因是由所述用于鉴定参与植物细胞、组织、器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞的基因组中增加的病原体抗性，优选地增加的真菌抗性的至少一个基因的方法所提供的。
在本发明各个方面的一个实施方案中，所述植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代包含至少一种壁相关激酶(WAK)，其选自Htn1、Ht2或Ht3或其等位基因变体、突变体或功能片段、或编码其的基因，优选其中所述至少一种壁相关激酶a)由包含SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列或其功能片段的核酸分子编码，b)由包含与SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的核苷酸序列的核酸分子编码，优选在序列的整个长度上，c)由在严格条件下与a)或b)的互补序列杂交的核酸分子编码，d)由包含编码SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列或其功能片段的核苷酸序列的核酸分子编码，e)由包含编码与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子编码，优选在序列的整个长度上，f)包含SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列，或g)包含与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的氨基酸序列，优选在序列的整个长度上，条件是序列(任选在表达后)仍编码至少一个功能性Htn1、Ht2或Ht3或其等位基因变体、突变体或功能片段。在一个优选的实施方案中，所述植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代包含被引入或渐渗的至少一种壁相关激酶或其等位基因变体、突变体或功能片段，或编码其的基因，或包含增强所述至少一种WAK的激酶活性的至少一种突变的至少一种壁相关激酶或其等位基因变体、突变体或功能片段，或编码其的基因。
在另一个优选的实施方案中，所述植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代包含至少一种额外的引入或渐渗的酶或编码其的基因，其中所述至少一种额外的基因或酶选自bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因(分别为SEQ IDNO：10、12、14、16、16、18、20、22、24或26)，或其同源基因，或由所述基因编码的相应蛋白质(分别为SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25或27)，或其同源物或其等位基因变体或突变体，优选分别导致bx1、bx2、igl、bx6、bx11、bx14、opr2、lox3或aoc1基因或蛋白的转录和/或翻译减少的突变体。因此，所述至少一个突变可以位于这种基因的调控区域中导致转录降低，或者所述突变可以导致影响翻译的蛋白质的催化活性的至少一个点突变，使得所述蛋白质或酶具有降低的合成BXD化合物的能力。
在一个实施方案中，将至少一个基因到植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中的引入，可通过引入至少一个基因来获得，所述基因是由用于鉴定参与增加的病原体抗性，优选增加的真菌抗性的至少一个基因的方法提供的，所述引入是稳定的引入，优选地是由植物育种介导的稳定的引入，或者是通过分子生物学的手段介导的稳定的引入，包括农杆菌介导的转化、基因组编辑或其组合。
在一个实施方案中，所述引入可以通过将所鉴定的至少一个基因渐渗来实现，和/或所述引入可以通过任何分子生物学的手段来实现。在一个实施方案中，所确定的基因或等位基因的引入可以通过两个供体基因组之间的重组来进行，例如在融合的原生质体中，其中至少供体原生质体在其基因组中携带感兴趣的基因等位基因。在任何情况下，然后可以将包含感兴趣的基因等位基因的任何后代或衍生物与携带感兴趣的遗传背景的植物品系进行重复的回交步骤，以在所得衍生物或后代中选择感兴趣的基因等位基因。结果可能是将这样渐渗的感兴趣的基因等位基因固定在选择的遗传背景中。渐渗的整个过程可以例如通过育种策略和分子生物学的技术的混合来进行，以实现对于给定种质、植物、植物细胞或植物材料的感兴趣的基因型/表型。
因此，在一个实施方案中，提供了一种改良的种质的供体来源，其具有例如通过渐渗增强对感兴趣的真菌的抗性，优选其中抗性增强的真菌抗性，或由所述真菌引起的疾病选自选自格孢腔菌目的真菌，包括引起玉米大斑病(NCLB)(特别是影响玉米和小麦植物)的玉米大斑病菌/大斑病长蠕孢、南部玉米叶枯病(玉米小斑病菌)，引起锈病的Pucciniales目，包括常见锈病(高粱柄锈菌)、或Diploida叶条纹/枯萎(Diploida macrospora/Stenocarpella macrospora)或禾生炭疽菌或镰刀菌，优选引起镰刀菌茎腐烂的Fusariumverticilioides，或赤霉菌属，例如引起赤霉茎腐病的玉米赤霉菌(Gapberella zeae)、锈病、茎腐病、玉米丝黑穗病(丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana))和Diploida叶条纹/枯萎。然后该种质可以作为进一步育种步骤的基础。
在另一个实施方案中，将通过用于鉴定至少一个参与提高的病原体抗性的基因的方法所鉴定和提供的至少一个基因引入至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物中可以通过至少一种分子生物学的手段，包括使用递送载体或载体来实现。任选地，所述方法可以进一步包括使用以下来修饰或调节感兴趣的基因：位点特异性核酸酶(SSN)或其催化活性片段中的至少一种，或编码其的核酸序列，寡核苷酸定向诱变，化学诱变或TILLING，其中所述至少一种位点特异性核酸酶(SSN)或编码该序列的核酸序列选自以下至少一种：CRISPR核酸酶，包括Cas或Cpf1核酸酶，TALEN，ZFN，核酸酶，碱基编辑物复合物，限制性内切核酸酶，包括FokI或其变体，或两个位点特异性切口内切核酸酶，或其变体或催化活性片段。
在根据本发明的又一方面，提供了一种在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中增加病原体抗性，优选真菌抗性的方法，所述方法包括：(i)提供至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料；(ii)(a)用中和至少一种苯并恶唑嗪酮类的作用的物质处理根据步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料，和/或(ii)(b)用活化至少一种壁相关激酶下游的信号传导途径的物质处理根据步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料；和/或(ii)(c)修饰步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的至少一个基因的至少一个启动子或至少一个调控序列，其中所述至少一个启动子或至少一个调控序列参与调节参与至少一种壁相关激酶的信号传导途径或下游的至少一个基因的转录或参与至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径；(ii)(d)用抑制至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成的物质处理根据步骤(i)的至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料；(iii)在至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中减少至少一种苯并恶唑嗪酮类的量，并从而增加病原体抗性，优选地为真菌抗性。
本文所用的“中和至少一种苯并恶唑嗪酮类的作用的物质”应作广义解释，并包括任何天然存在的分子或合成分子，其可与BXD化合物相互作用以降低在植物或植物环境上所述BXD化合物将(内源地和/或外源地)发挥的BXD化合物的自然作用。优选地，可以将中和至少一种苯并恶唑嗪酮类的作用的物质添加到植物细胞、组织、器官或整株植物，任选地将其涂覆或与合适的递送载具一起，从而可以将所述物质转移至感兴趣的植物细胞中。可选地，可以将所述物质添加到植物细胞、组织、器官或整株植物，以中和由植物细胞、组织、器官或整株植物释放的挥发性化合物的作用。优选地，中和至少一种苯并恶唑嗪酮类的作用的物质对植物细胞、组织、器官或整株植物或环境无毒。众所周知，茉莉酸(JA)处理可引起BXD化合物的积累(Oikawa等，2002和2004)，根据本发明的物质也可以是清除或减少茉莉酸的量物质以减少BXD化合物的积累，进而导致感兴趣的植物细胞、组织、器官或整株植物的真菌抗性增加。所述物质还可能干扰至少一种Bx、Igl或参与BXD或茉莉酸生物合成途径的其他基因的转录。
在另一个实施方案中，单独或与中和物质结合使用，至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料可以用激活至少一种壁相关激酶的下游的信号传导途径的物质来处理。如在分子生物学的背景下使用的，术语“上游”和“下游”可以指细胞和分子事件的时间和机制顺序。例如，在信号转导级联中，第二信使或细胞内激酶在细胞膜受体(例如WAK)的活化的下游起作用，也就是说，在细胞膜受体(例如WAK)的活化的短暂之后。相反，细胞膜受体的激活发生在第二信使的产生或者在信号传导级联中随后和细胞内起作用的其他酶的激活或抑制的上游，也就是说，在第二信使的产生或者在信号传导级联中随后和细胞内起作用的其他酶的激活或抑制之前。这样的活化物质可以选自从植物或植物细胞的外部起作用的物质，例如，对于受体样激酶(例如WAK)是PAMP或DAMP的物质，从而接收到更强的信号并且受体介导的应答增强。此外，所述物质可以激活WAK或WAK下游的任何激酶的激酶功能。最后，所述物质可能在WAK与其他BXD或茉莉酸生物合成途径之间的界面上起作用。
对于小麦WAK基因TaWAK/Snn1，它被坏死性效应因子SnTox1强行控制，所述SnTox1触发程序性细胞死亡，这允许病原体在死亡组织上得到供给并生长(Shi等人2016)。此外，这些数据表明被WAK识别的激发因子可以是细胞壁衍生的降解的多糖(例如OG)，或者病原性短肽(SnTox1)(Brutus等人2010；Shi等人2016)。因此，越来越多的证据表明，WAK在对配体类型的感知以及它们以直接还有间接方式与生物疾病相互作用中所起的作用具有复杂的性质和功能差异。优选地，根据本发明的活化物质是直接活化感兴趣的WAK的物质，其继而直接或间接地导致至少一种BXD化合物的合成减少，其继而增加植物细胞、组织、器官或整株植物的真菌抗性。
本发明的发明人证明，WAK ZmWAK-RLK1在BXD生物合成途径的上游起作用，并降低次生代谢物BXD化合物例如DIM2BOA-Glc的含量。由于已经在许多谷物物种(例如玉米、小麦和水稻，它们是全世界最重要的粮食作物)中发现BXD类的次级代谢物，因此，根据本发明各个方面的方法可以用于实现内在与BXD合成相关的WAK信号传导级联，这继而被发现是提供植物中真菌防御中新策略的关键，优选用于在已经在播种期降低对玉米大斑病的易感性。例如，发现在易感的ZmWAK-RLK1突变体中，储存的糖苷DIM2BOA-Glc一直较低，这表明DIM2BOA-Glc作为促进玉米大斑病菌感染的候选易感性化合物。该化合物的敲除已显示能稍微提高玉米叶片蚜虫玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)的性能(Handrick,Vinzenz,et al."Biosynthesis of 8-O-methylated benzoxazinoid defense compounds inmaize."The Plant Cell 28.7(2016):1682-1700)，其为完全不同的植物病原体类别，没有感染，但仍以植物为食，而目前已知的DIM2BOA-Glc与食韧皮部昆虫相互作用的功能机制可能是不同的并且具有拮抗作用。根据本发明的方法和发现以及主要在WAK的缺口桥和次生防御代谢物BXD中的新见解也可用于为植物，优选作物植物针对蚜虫和其他食韧皮部昆虫提供新的防御机制。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括调节或修饰如本文所公开的来自BXD和/或茉莉酸生物合成途径的至少一个额外的基因，以进一步降低次级代谢物BXD化合物例如DIM2BOA-Glc的含量，并因此增强植物中的真菌抗性。
在根据本发明的增加植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中的病原体抗性，优选真菌抗性的方法的又一个实施方案中，所述方法包括用调节步骤(i)的至少一个植物细胞、组织、器官、整个植物或植物材料的至少一个基因的至少启动子或至少一个调控序列的活性的物质，来处理根据步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料，其中所述至少启动子或至少一个调控序列参与调控参与至少一种壁相关激酶的信号传导途径或下游的至少一个基因的转录，或参与调控参与至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径的至少一个基因的转录。通过调节或修饰启动子或调控序列的活性，可以以靶向方式在分子水平上影响感兴趣的基因的转录水平，并进而可以影响感兴趣的蛋白的表达水平，或通过将对于给定的启动子/基因的转录因子，优选合成转录因子(例如TAL效应物激活因子/阻遏因子或CRISPR-dCas9激活因子/阻遏因子)引入细胞。在实施方案中，以靶向方式修饰启动子的情况下，修饰是通过以下至少一种进行的：位点特异性核酸酶(SSN)或其催化活性片段或编码其的核酸序列、寡核苷酸定向诱变、化学诱变或TILLING。
在一个实施方案中，所述至少一种位点特异性核酸酶(SSN)或编码其的核酸序列可以选自以下至少一种：CRISPR核酸酶包括Cas或Cpf1核酸酶、TALEN、ZFN、大范围核酸酶、碱基编辑复合物、限制性内切核酸酶(包括FokI或其变体)、重组酶或两个位点特异性切口内切核酸酶，或其变体或催化活性片段。优选地，引入靶向的点突变以修饰启动子区域，其中所述修饰可以利用位点特异性核酸酶工具的瞬时引入来获得非转基因植物细胞、组织、器官或整株植物。
在根据本发明的增加植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中的病原体抗性，优选真菌抗性的方法的另一个或进一步的实施方案中，所述方法包括用抑制至少一种苯并恶唑嗪酮类合成的物质处理步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料。抑制至少一种苯并恶唑嗪酮类合成的物质可以是双链RNA(dsRNA)，其适合于降低参与至少一种壁相关激酶的信号传导途径或下游的至少一个基因的表达水平，或适合于降低参与至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径游的至少一个基因的表达水平，其中通过所述表达水平的降低，而降低至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成或量，从而增加病原体抗性，优选真菌抗性。基因表达的这种下调以RNAi方法或miRNA干扰方法是本领域技术人员众所周知的(Fire,A,Xu,S,Montgomery,M,Kostas,S,Driver,S,Mello,C.(1998).Potent and specific genetic interferenceby double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans,Nature 391(6669):806-811)。优选地，抑制至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成的物质是至少一种siRNA或siRNA文库，其针对至少一种参与至少一种壁相关激酶的信号传导途径或下游的基因或参与至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径的基因。siRNA或siRNA文库可以是一个或多个表达盒的部分。siRNA可包含具有5'端和3'端的长度为15至30个核苷酸的RNA的第一链，以及具有5'端和3'端的长度为15至30个核苷酸的RNA的第二链，其中所述第一链与参与至少一种壁相关激酶的信号传导途径或下游的至少一个基因或参与至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径的至少一种基因的至少15个核苷酸互补，并且其中第一链和第二链的至少12个核苷酸彼此互补，并在生理条件下形成小干扰RNA(siRNA)双链体，并且其中所述siRNA沉默所述参与至少一种壁相关激酶的信号传导途径或下游的至少一个基因或参与至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径的至少一个基因。
本发明的方面的各个实施方案涉及单独或组合地增加植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中的病原体抗性，优选真菌抗性的方法，其可以导致在至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中，靶向的减少至少一种苯并恶唑嗪酮类的量，并从而可导致增加的病原体抗性，优选真菌抗性。因此，根据本发明的另一个方面，提供了物质用于在至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中提高病原体抗性，优选真菌抗性的用途。所述物质可以充当植物保护剂，并且可以外源应用于植物，或者所述物质可以是任何植物分子或材料的清除剂，或者所述物质可以充当WAK的调节剂、下游信号传导级联的调节剂或本文公开的与WAK信号传导途径有关的细胞途径(优选BXD和/或茉莉酸生物合成途径)的调节剂，或所述物质可以对与WAK有关的任何基因或本文公开的相关途径的转录起作用，其中因此所述物质可以直接或间接影响，优选减少植物细胞中产生和储存的BXD化合物的量。因此，根据本发明的物质的使用将导致降低的BXD水平，并因此在感兴趣的植物细胞、组织、器官或整株植物中增加真菌抗性。
递送方法：
适合于根据本发明的方法的用于将遗传物质引入植物细胞的多种合适的递送技术是本领域技术人员已知的，例如通过选择直接递送技术，包括对原生质体的聚乙二醇(PEG)处理(Potrykus,Ingo,et al."Direct gene transfer to cells of agraminaceous monocot."Molecular and General Genetics MGG 199.2(1985):183-188)、诸如电穿孔的方法(D'Halluin,Kathleen,et al."Transgenic maize plants bytissue electroporation."The plant cell4.12(1992):1495-1505)、显微注射(Neuhaus,G.,et al."Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection ofDNAinto microspore-derived embryoids."Theoretical and Applied Genetics 75.1(1987):30-36)、碳化硅纤维晶须技术(Kaeppler,H.F.,et al."Silicon carbide fiber-mediated stable transformation of plant cells."Tag Theoretical and AppliedGenetics84.5(1992):560-566)、病毒载体介导的方法(Gelvin,Nature Biotechnology23,"Viral-mediated plant transformation gets a boost",684-685(2005))和粒子轰击(参见例如，Sood et al.,2011,Biologia Plantarum,55,1-15)。
尽管基于生物学方法的转化方法，如农杆菌转化或病毒载体介导的植物转化，以及基于物理递送方法(如粒子轰击或显微注射)的方法已经演化为用于将遗传物质引入感兴趣的植物细胞或组织的突出技术。Helenius等人("Gene delivery into intact plantsusing the HeliosTM Gene Gun",Plant Molecular Biology Reporter,2000,18(3):287-288)公开了作为将物质引入植物细胞的物理方法的粒子轰击。因此，目前存在多种将基因构建体形式的遗传物质引入感兴趣的植物细胞中的植物转化方法，包括植物生物技术领域的技术人员已知的生物和物理手段，并且可以应用以将编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因导入植物细胞、组织、器官或整株植物中至少一种的至少一个细胞中。值得注意的是，所述用于转化和转染的递送方法可以用于同时引入本发明的工具。常见的生物手段是用农杆菌转化，其几十年来已经用于各种不同的植物材料。病毒载体介导的植物转化代表将遗传物质引入感兴趣的细胞的进一步策略。在植物生物学中找到应用的物理手段是粒子轰击，也称为生物射弹转染或微粒介导的基因转移，其是指用于将包含感兴趣的核酸或遗传构建体的包被微粒或纳米粒子转移到靶细胞或组织中的物理输送方法。物理引入手段适合于引入核酸，即RNA和/或DNA和蛋白质。同样，存在用于将感兴趣的核酸或氨基酸构建体特异性引入植物细胞中的特定转化或转染方法，包括电穿孔、显微注射、纳米颗粒和细胞穿透肽(CPP)。此外，存在基于化学的转染方法以引入基因构建体和/或核酸和/或蛋白质，其中包括用磷酸钙转染，用脂质体例如阳离子脂质体转染或用阳离子聚合物转染，包括DEAD-葡聚糖或聚乙烯亚胺，或其组合。所述递送方法和递送载体或货物因此与用于其他真核细胞(包括动物和哺乳动物细胞)的递送工具本质上不同，并且每种递送方法都必须进行特定的微调和优化，使得用于在至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中引入和/或修饰编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因；可以以全功能和主动的方式引入感兴趣的目标细胞的特定隔室中。上述递送技术(单独或组合使用)可用于体内(植物体内)或体外方法。
在一个实施方案中，根据本发明的调控序列可以是启动子序列，其中所述启动子的编辑或突变或调节包括用不同的启动子(也称为替换启动子)或启动子片段(也称为替换启动子片段)替换启动子或启动子片段，其中所述启动子替换导致以下任何一项或以下各项的任意组合：增加的启动子活性、增加的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、可诱导的启动子活性、扩展的基因表达的窗口、同一细胞层或其他细胞层中基因表达的时间或发育进程的修饰，例如在花药的绒毡层中延长基因表达的时间、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的启动子(或启动子片段)可以是对于正在编辑的细胞是内源的、人工的、预先存在的或转基因的启动子(或启动子片段)。替代启动子或其片段可以是对于正在编辑的细胞是内源的、人工的、预先存在的或转基因的启动子或其片段。
现在将通过以下实施例说明本发明，这些实施例不构成对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：植物材料和生长条件
使用了17个玉米自交系，包括：(1)历史品种B37和w22，以及含有NCLB抗性基因Htn1的NIL B37Htn1和w22Htn1；(2)来自KWS的携带Htn1的选育品系RP3及其NIL品系RP3Htn1(参见US 2016/0201080A1)；(3)三对突变体RLK1b(S，损害Htn1抗性)、RLK1d和RLK1f以及相应的姐妹系RLK1b-wt(R，携带功能性Htn1)、RLK1d-wt和RLK1f-wt，在RP3Htn1中由EMS诱变产生(Hurni et al.2015)；(4)三个玉米突变体(bx1、bx2和bx6)和亲本系w22，由Georg Jander教授(美国伊萨卡州康奈尔大学)提供。在每个Jiffy盆
Figure BDA0002459653610000482
中播种2到3粒玉米种子，并将15盆放入一个托盘中。幼苗植物在温室条件下生长，白天在20℃下16小时，晚上在18℃下8小时，并且相对湿度约为60％。
实施例2：温室中的NCLB感染测试
如先前所描述的那样，使用玉米大斑病菌分离株Passau-1对NCLB抗性进行测试(Hurni等人2015)。在第二片叶子完全露出来之后，将新出现的叶子切开并除去，直到每个测试实验结束。描述了在PDA培养基板上的单孢子接种和培养、子代孢子的收获和定量(Hurni等人2015)。不是通过将80μl孢子悬浮液滴入第二片叶子的叶片鞘两次来进行感染，而是通过一次喷洒(喷洒器：
Figure BDA0002459653610000481
Semadeni，Ostermundigen，瑞士)来感染玉米幼苗。每4个托盘(约60-80个幼苗)喷洒4ml孢子悬浮液(4.5×104孢子/ml)。感染后，通过在每个托盘的顶部放置塑料罩来产生非常高的湿度微条件。在11至25天之间对每棵植物的疾病症状进行评分，并通过计算病情进展曲线下的面积(AUDPC)或通过量化接种的第二片叶子的患病叶面积(PrimDLA)来评估严重程度。在每个实验中，在每种基因型中对大约15株幼苗评分。
实施例3：载体构建和亚细胞定位
使用cDNA克隆作为模板扩增ZmWAK-RLK1的编码序列，其最初在NCLB抗性基因型RP1Htn1中扩增(Hurni et al.2015)。使用
Figure BDA0002459653610000491
BP
Figure BDA0002459653610000492
II酶混合物(ThermoFisher Scientific，Wilmington，美国)将PCR片段引入Gateway供体载体pDONR207。通过与目的载体pUBC-GFP-DEST重组插入携带目标ZmWAK-RLK1序列的生成的进入载体，以产生由拟南芥泛素10(UBQ10)基因启动子驱动的框内ZmWAK-RLK1+c'-eGFP融合蛋白构建体(Grefen,Christopher,et al."A ubiquitin-10promoter-based vector set forfluorescent protein tagging facilitates temporal stability and native proteindistribution in transient and stable expression studies."The Plant Journal64.2(2010):355-365)。与参考质粒PIP2A-mCherry一起的UBQ10::ZmWAK-RLK1-c'-eGFP构建体(SEQ ID NO：9)(Cutler et al.,Random GFP::cDNA fusions enable visualizationof subcellular structures in cells of Arabidopsis at a highfrequency.Proc.Natl Acad.Sci.USA 97,3718–3723,(2000)含有35S::PIP2A_c'_RFP构建体，其位于质膜上)与纳米级金颗粒混合并共轰击成洋葱表皮细胞，随后将其在20℃下在黑暗中孵育2-3天，直到准备使用共聚焦显微镜观察。通过添加0.8M甘露醇溶液诱导质壁分离。此外，将两种质粒都转化到农杆菌GV3101中，并共渐渗4周龄的本氏烟草叶片中，准备在渐渗后2天观察。下表1提供用于载体构建的引物。
表1：用于载体构建体的正向(F)和反向(R)引物
Figure BDA0002459653610000493
Figure BDA0002459653610000501
实施例4：菌丝体发育
收获21天幼苗植物的第二片叶子并将其切成2×2cm2的叶段，将其放置并在植物琼脂(phytoagar)平板上孵育。用拭子在叶片表面涂上孢子悬浮液(4.5×104孢子/ml)。使用PARAFILM密封携带样品的培养皿，并在室温下孵育24小时直至收获。如前所述进行台盼蓝染色(Chung,Chia-Lin,et al."Resistance loci affecting distinct stages offungal pathogenesis:use of introgression lines for QTL mapping andcharacterization in the maize-Setosphaeria turcica pathosystem."BMC plantbiology 10.1(2010):103)。以1dpi感染的片段在乙酸:乙醇(1:3，v/v)溶液中孵育过夜，并且然后在乙酸:乙醇:甘油(1:5:1，v/v/v)的混合的溶液中孵育4小时。将样品在0.01％(w/v)台盼蓝乳酚溶液中染色过夜，并且然后使用ddH2O洗涤一次，并保存在60％甘油中以备使用。将样本放在载玻片上，并在ZEISS Axio Imager 2显微镜系统(CARL ZEISS，Jena，德国)下检查。计算萌发的孢子、胚芽管、附着胞和成功侵入(细胞内部或细胞壁之间的菌丝)的数量。进行三个独立的实验。
实施例5：RNA提取、RNA测序和数据分析
分别以0、9-hpi、3-dpi和10-dpi收获四个生物学重复的幼苗植物的第二片叶子，分别对应于接种前、萌发/侵入、腐植营养生长和坏死性生长(Jennings,P.R.,andA.J.Ullstrup."A HISTOLOGICAL STUDY OF 3HELMINTHOSPORIUM LEAF BLIGHTS OFCORN."Phytopathology 47.12(1957):707-714；Hilu,H.M.,and A.L.Hooker."Host-pathogen relationship of Helminthosporium turcicum in resistant andsusceptible corn seedlings."(1964):570-5)。使用SV Total RNA Isolation Kits(Promega，Dübendorf，瑞士)对48个样品(4个基因型，4个时间点，3个生物学重复)进行总RNA提取。通过Nanodrop1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，美国)检查1μl总RNA，以估计RNA浓度。同时，评估每种基因型的15株植物的AUDPC值，以控制感染是否起作用。
RNA测序的数量和质量使用
Figure BDA0002459653610000511
1.0荧光计(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，美国)和Bioanalyzer 2100(Agilent，Waldbronn，德国)确定。TruSeqStranded mRNA Sample Prep Kit(Illumina，Inc.，Hayward，美国)用于文库制备。将每个样品中的1μg总RNA是耗尽核糖体的，并且然后进行双链cDNA的合成。将每个cDNA样品片段化、末端修复、多聚腺苷酸化，并然后与包含用于多路复用的索引的TruSeq适配物连接。通过PCR反应富集两端含有TruSeq适配物的cDNA片段。对富集的文库进行定量和鉴定，并然后标准化为10nM。TruSeq SR Cluster Kit v4 cBot(Illumina，Inc.，Hayward，美国)用于使用8pM的汇集的标准化文库进行群集生成。使用TruSeq SBS Kit v4(Illumina，Inc.，Hayward，USA)在单末端125bp处在Illumina HiSeq2500上进行测序。
玉米参考基因组Zea_mays.AGPv3.27和相应的注释已下载(http:// www.maizegdb.org/)。用STAR将RNA测序读取映射到参考基因组上(Dobin,Alexander,etal."STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner."Bioinformatics 29.1(2013):15-21)，这允许以下命令：STAR-outFilterMultiMapNmax 1-outFilterMismatchNoverLmax0.01-alignIntronMax10000的每100bp有一个错配并且没有多重映射。读取计数是从具有featureCounts 1.4.6的映射文件确定的(Liao,Yang,GordonK.Smyth,and Wei Shi."featureCounts:an efficient general purpose program forassigning sequence reads to genomic features."Bioinformatics 30.7(2013):923-930)。用R package edgeR进行统计学分析，并用成对比较和离散度的标记估计测试基因的差异表达。当在其上映射至少10个读取时，基因被认为是表达的，并且具有log2FC≥|2|和FDR<0.01时，基因被认为是差异表达的。首先，分别针对每种基因型和每个时间点在Htn1植物和无Htn1植物之间进行成对比较。然后在时间点之间以及然后在两种基因型之间比较结果。使用在线软件agriGO(Du,Zhou,et al."agriGO:a GO analysis toolkit for theagricultural community."Nucleic acids research38.suppl_2(2010):W64-W70)进行用于差异表达的基因(DEG)的Gene Ontology分析。如果调整为p≤0.05，则将显著项是上色的。
实施例6：RT-qPCR测定
使用iScript Advanced cDNA kit(172-5038，Rio-Rad)对1μg总RNA进行第一链cDNA合成。使用Real-Time System C1000TM Thermal cycler(96或384孔，Bio-Rad)将1:20稀释的cDNA用于定量表达。如所述(Hurni et al.2015)，通过参考基因FPGS和肌动蛋白使靶标的表达标准化。用于表达分析的引物示于上表1中。
实施例7：苯并恶唑嗪酮类(BXD)的提取和测量
收获60-100mg幼苗植物的叶子(无叶脉)，并立即在液氮中冷冻、研磨并添加提取缓冲液(1mg样品+10μl提取缓冲液)。将样品充分混合并在4℃下以13,000rpm离心。将上清液转移至新试管中，并在相同条件下再离心一次，以除去可能的叶片颗粒。收集上清液，准备进行BXD测量。
苯并恶唑嗪酮类的含量通过与紫外检测器相连并与质谱仪(Waters)相连的Acquity UPLC设备(Waters)进行分析(Meihls,Lisa N.,et al."Natural variation inmaize aphid resistance is associated with 2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one glucoside methyltransferase activity."The Plant Cell Online25.6(2013):2341-2355)。使用Acquity BEH C18柱(Waters)。自动进样器和柱的温度分别为15℃和40℃。流动相由99％的水、1％的乙腈和0.1％的甲酸(A)和乙腈和0.1％的甲酸(B)组成。用3％A和97％B然后进行柱修复将流速设置为0.4ml min-1。进样量为5μl。在275nm处提取的迹线用于苯并恶唑嗪酮类的定量。以下提取的离子色谱图用于质量窗口为±0.01D的定量：对于DIMBOA(保留时间[RT]5.62分钟)和DIMBOA-Glc(RT 5.64分钟)的质荷比(m/z)、对于HDMBOA-Glc的m/z(RT 8.19分钟)、对于HMBOA-Glc的m/z(RT 5.34分钟)和DIM2BOA-Glc的m/z(RT 5.825分钟)。通过从纯化的DIMBOA-Glc、DIMBOA和HDMBOA-Glc标样中获得的外部校准曲线确定苯并恶唑嗪酮类的绝对浓度。
实施例8：ZmWAK-RLK1编码质膜定位蛋白
为了确定ZmWAK-RLK1蛋白的亚细胞定位，生成融合构建体，所述融合构建体由与C末端的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的序列融合的全长编码序列组成(参见对于核酸质粒构建体的SEQ ID NO：9)。当在洋葱表皮细胞中瞬时表达时，ZmWAK-RLK1融合蛋白在质壁分离之前和之后定位于质膜。此外，渐渗本氏烟草的叶片中证实渐渗后两天ZmWAK-RLK1定位至质膜上(参见图12)。这些数据，尤其是在ZmWAK-RKL1-eGFP和已知定位于质膜的阳性对照PIP2A-mCherry瞬时表达后对洋葱表皮细胞的共聚焦分析，表明ZmWAK-RLK1是质膜蛋白。
实施例9：ZmWAK-RLK1减少真菌的侵入
半生营养真菌玉米大斑病菌的孢子大部分在6-18接种后小时(hpi)之间侵入玉米表皮(Jennings and Ullstrup,1957)。为了研究ZmWAK-RLK1是否改变真菌侵入尝试的结果，我们使用台盼蓝染色研究一个接种后天数(dpi)的感染过程(数据未显示)。在三个EMS诱导的ZmWAK-RLK1功能丧失突变系(RLK1b、RLK1d和RLK1f)及其在近等基因系(NIL)RP3Htn1中生成的相应姊妹株系中评估成功侵入事件的数量(Hurni et al.2015)。在有/没有ZmWAK-RLK1的基因型中，在萌发管和附着胞的生成上没有观察到显著差异(数据未显示)。相反，如图2A和B所示，与功能丧失突变体相比，如果ZmWAK-RLK1具有功能，则成功侵入事件的次数显著更低。这表明ZmWAK-RLK1导致病原体侵入到宿主组织减少。
实施例10：转录组和代谢分析鉴定在ZmWAK-RLK1的存在下BXD生物合成途径的改变
为了破译受ZmWAK-RLK1特异性影响的免疫网络，我们通过RNA测序在两对近等基因系w22和W22Htn1以及B37和B37Htn1中进行转录组分析。在两个NIL中均存在ZmWAK-RLK1下，NCLB的发展显著降低(图3A-C)。在0和9hpi(侵入阶段)以及3(生物营养生长)和10dpi(腐植营养生长)下收集叶片样品(Jennings和Ullstrup，1957年)。对48个样品进行测序，并获得了11.59亿个读取(表2)。以每个样本平均1,708万个读取独特地映射超过8.2亿个读取(70.7％)(表2)。在有或没有Htn1的基因型中，未观察到映射的读取的百分比的明显差异。共表达15345个基因，并将其用于进一步分析。通过使用由edgeR标准化的表达进行多维标度(MDS)分析，相同基因型-时间点组合的生物学重复大多归组到一起，表明重复的可重复性(数据未显示)。与w22Htn1/w22相比，在B37Htn1/B37中检测到更多的差异表达的基因(DEG)(图4)。这些基因至少在一个时间点在两个NIL中差异表达。为了鉴定与ZmWAK-RLK1相关的DEG并排除遗传背景影响，仅考虑在两个NIL对中差异表达的基因。
表2：测序的和映射的RNA-seq读取的统计
Figure BDA0002459653610000531
Figure BDA0002459653610000541
a用于映射的参数：小于1％的错配，映射的1个基因座，内含子大小小于10kb；
b NA＝未分析。
在所有时间点上鉴定215个常见的DEG(图13)。在含ZmWAK-RLK1的NIL中与相应的易感系相比诱导并抑制132和83个基因(未显示热图和维恩图)。仅在接种前的时间点0发现108个DEG，而仅在感染后才发现107个DEG。在所有时间点(包括时间点)，有29个DEG差异表达。进行使用agriGO的普通富集分析(Over-Representation Analysis)，以鉴定与ZmWAK-RLK1相关的富集的基因本体论(GO)术语。对于防御反应(例如GO：0009814)和代谢/生物合成过程(例如GO：0006725)而言，官能团被富集(数据未显示)。
为了进一步分析ZmWAK-RLK1的存在是否与BXD的生物合成有关(图5A)，定量感染前和感染后w22Htn1和w22的第二片叶子中主要BXD的含量(图5B至F)。在所有时间点与w22相比，w22Htn1中的四个BXD DIMBOA-Glc、DIMBOA、HMBOA-Glc和DIM2BOA-Glc的含量显著较低(数据未显示)，这表明存在ZmWAK-RLK1时BXD含量的组成性降低。此外，通过RT-qPCR确定ZmWAK-RLK1的转录水平，并且特别是病原体接种之前和之后BXD生物合成途径中的基因的转录水平。基因(A)ZmWAK-RLK1、(B)Bx1、(C)Igl、(D)Bx2、(E)Bx3、(F)Bx4、(G)Bx5、(H)Bx6、(I)Bx7、(J)Bx8、(K)Bx9、(L)Bx10/11、(M)Bx12、(N)Bx13、(O)Glu1和(P)Glu2的表达，在感染前和感染后在不同时间点测量，并使用Tukey's HSD(P＝0.05)在四个生物学重复中分开在w22和B37遗传背景中进行统计。
NIL中的ZmWAK-RLK1表达显示无明显差异(图11A)。总体而言，BXD生物合成基因的转录水平是基因型特异性的(图11A至P)。例如，BX1及其蛋白同源物IGL可以将吲哚-3-甘油磷酸盐/酯转化为吲哚，这是BXD代谢的第一步(Frey等，2000)。他们的编码基因Bx1和Igl在B37和w22中显示出相反的基因表达贡献，但是在具有ZmWAK-RLK1的基因型中，Bx1和Igl的联合表达始终较低(图11B和C)。
实施例11：ZmWAK-RLK1中的突变与次级代谢物DIM2BOA-Glc的减少有关
为了进一步分析不同的BXD生物合成基因以及该途径的代谢物在NCLB抗性中的作用，使用ZmWAK-RLK1突变体(RLK1b、d和f，SEQ ID NO：3至6和SEQ ID NO：2的G548R突变体)及其姊妹系(Hurni et al.2015)。定量几个BXD基因的转录水平和突变体中主要BXD化合物的含量，这些突变体丧失由ZmWAK-RLK1引起的抗性(图6A至D)。与NIL形成对照，DIMBOA-Glc、DIMBOA和HMBOA、HDMBOA-Glc浓度没有差异。然而，当ZmWAK-RLK1完整时，DIM2BOA-Glc的含量显著更低(图6A，并且未显示进一步的数据)。减少的DIM2BOA-Glc与Igl转录水平中的降低有关，而ZmWAK-RLK1中没有检测到ZmWAK-RLK1和Bx1的转录水平中的明显差异(图6B至D)，Bx6、Bx7和Bx13是BXD途径的关键基因以产生DIM2BOA-Glc，并且这些基因在突变体中略有上调但没有显著上调(数据未显示)。这种现象可以通过反馈调节来解释。因此，ZmWAK-RLK1显然似乎与次级代谢物DIM2BOA-Glc的减少有关，这可能是通过降低Bx1和/或Igl的表达水平。
实施例12：BXD生物合成基因中的突变降低NCLB易感性
为了进一步分析BXD在NCLB抗性/易感性中的作用，接种玉米大斑病菌后，测试三个BXD生物合成基因Bx1，Bx2和Bx6中的突变体。这些突变体显示出几种BXD化合物(包括DIM2BOA-Glc)的强烈减少(图7)。有趣的是，所有三个突变体在苗期都表现出强烈的NCLB易感性降低(图8A和B)。这证实BXD含量与NCLB疾病抗性呈负相关。此外，检查在10dpi下的ZmWAK-RLK1表达(图8C)。如果与野生型相比，在bx突变体中未检测到显著差异。考虑到ZmWAK-RLK1基因型中Bx1和Igl共表达的减少(图6A、图5B和C、图9B)，数据表明BXD合成途径可能在ZmWAK-RLK1的下游起作用。
因此，潜在于定量NCLB疾病抗性的ZmWAK-RLK1是基于次级代谢物BXD的生物合成的减少，而DIM2BOA-Glc作为促进真菌感染的候选易感性组分(图8D)。
实施例13：WAK-RLK1的组织特异性表达
除了确定ZmWAK-RLK1蛋白的亚细胞定位(参见以上实施例8)，确定不同基因型和不同时间点的RLK1的组织特异性表达。FPGS和ACTIN基因用作标准化表达的参考。图10中显示的结果证明RLK1是普遍存在且稳定表达的基因，其进一步加强所述激酶作为相关植物代谢途径中的主调控因子的功能。
实施例14：TILLING
为了开发和筛选植物材料的突变种群，进行TILLING。可以例如根据Kato(2000,The maize handbook,pp.212-219)从KWS系RP3Htn1开始创建TILLING突变体种群。从田间生长的RP3Htn1植物收获花粉，并用0.1％EMS溶液处理45分钟。然后将单个植物的丝进行授粉，并然后将出现的穗装袋。在一项实验中，从436种授粉的M0植物中收获种子。额外的繁殖和自交导致10084个单独的M1植物。收集来自这些M1植物的叶片材料用于DNA分离。使用CTAB提取方法(Traitgenetics，Gatersleben，德国)从10,000个M1个体分离出干叶样品的DNA(10个叶盘束/样品)。然后将DNA以20ng/μl等分为100μl。进行用于突变体筛选的引物开发。扩增测定由20ng/μlDNA、5x GoTaq-Buffer、25μMdNTP、10μM正向引物、10μM反向引物、5单位/μlGoTaq组成。在94℃变性300s后，以35个循环进行扩增循环：94℃为60s、60℃为60s，72℃为60s，然后在72℃最终延伸时长600s。接下来，根据已建立的方案对PCR产物进行Sanger测序。然后，例如，在软件Lasergene Seqman NGen(DNASTAR)和杂合子SNP的帮助下，用软件默认设置组装序列。再次用Sanger法对阳性突变植物测序，以证实其多态性。
序列表
<110> 科沃施种子欧洲股份两合公司
伯尔尼大学
苏黎世大学
<120> 在作物植物中增加的真菌抗性
<130> KWS0272PCT
<150> EP 17187309.4
<151> 2017-08-22
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2004
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 1
atggctgctc accagcctca cctctccgtc ctcctcctcg tcctcctcgc tgcccatgtc 60
gtctccacct ccgcccatgg cgagcctcct cttccgagcc cttacaacac ctccgcccat 120
ggcgagcctc ctcttccgag cacttacaac gcctccatgt gctcgtcgtt ctggtgtggc 180
ggcgtcgaga tccgctaccc gttctatctt gccaacgcaa tcgccgacta cagcgggagc 240
tactactcct gcggctacac cgacttgagc gtttcctgcg aactcgaggt cgaggggtcg 300
ccgacgacct ggacccctac catccgtctc ggcggcggcg actacaccgt caagaacatc 360
tcctacctct acgaccagca gaccatctca ctggcggaca gagatgtgct cggaggcggc 420
ggctgccccg tcgtccgcca caacgtcagc ttcgacgaga cgtggctgca cctgcacaac 480
gccagcgcct tcgacaacct caccttcttc ttcggatgcc actgggggcc acggaataca 540
ccgcctgaat ttgccgacta caacatcagc tgcgccgggt tcaatactcc aactatcagc 600
ggtggaaggt ccttcgtgtt caagactgga gatcttgacg aacaagagga gcaggagttg 660
gctttacact gcgacgaggt tttctccgtg ccagtgagaa gagatgctct gcaggcgatc 720
gtcagcaact tcagcctcac acgggacggg tacggcgagg tgcttaggca ggggttcgag 780
ttggaatgga atcggacatc ggaggatcag tgtggccggt gcgagggatc gggctccggc 840
ggatggtgcg cctacagcca gaagagagaa ttcctgggct gcttgtgcag cggagggaag 900
gtgggcagcc cgttctgcaa accatcgaga tcaaaaagga aagaaggacc tattgttggt 960
gctgttgccg ttgcattcct gtgtctagtc attctcacat gcttcttggc ttgtagacat 1020
ggttcgctgc ccttcaaatc ggagaacaaa ccagggacaa ggattgagtc cttcctacag 1080
aagaacgaga gtatacatcc gaaaagatac acctacgcgg acgtgaaaag aatgacaaaa 1140
tccttcgctg tgaagctagg ccaaggtggg tttggtgctg tatacaaagg cagcctccac 1200
gatggccgac aggtagcagt caagatgctg aaggacaccc aaggtgacgg cgaggaattc 1260
atgaacgagg tggctagcat cagcaggact tctcatgtca acgtcgtgac acttctaggg 1320
ttttgcttgc aagggtcgaa aagagcactg atctacgagt acatgcccaa tggttcgctc 1380
gaaaggtatg ccttcaccgg tgacatgaac agtgagaatt tgctaacctg ggaaaggcta 1440
tttgacatag caattggcac ggccagaggg ctcgaatacc tacaccgggg atgcaacact 1500
cggatcgtgc attttgacat caagccacac aacatcctgt tagaccagga tttctgtcct 1560
aagatctctg actttggact ggccaagcta tgtctgaaca aagagagcgc tatctccatt 1620
gctggcgcaa gagggacgat agggtatatc gccccggagg tctactcaaa gcaatttgga 1680
ataataagca gcaagtctga tgtctatagc tatgggatga tggtccttga gatggttgga 1740
gcaagggaca ggaatacaag cgcagatagt gaccatagca gccaatattt ccctcagtgg 1800
ctttatgaac atttggacga ctattgtgtt ggtgcttccg agattaatgg tgagaccaca 1860
gagctcgtga ggaagatgat agttgtaggt ctgtggtgca tacaagtgat tccgactgat 1920
cgaccaacaa tgacgagagt cgtcgagatg ttggaaggga gcacaagtaa tctagagttg 1980
ccacccagag ttctcttgag ctga 2004
<210> 2
<211> 667
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 2
Met Ala Ala His Gln Pro His Leu Ser Val Leu Leu Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala His Val Val Ser Thr Ser Ala His Gly Glu Pro Pro Leu Pro
20 25 30
Ser Pro Tyr Asn Thr Ser Ala His Gly Glu Pro Pro Leu Pro Ser Thr
35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Met Cys Ser Ser Phe Trp Cys Gly Gly Val Glu Ile
50 55 60
Arg Tyr Pro Phe Tyr Leu Ala Asn Ala Ile Ala Asp Tyr Ser Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Tyr Ser Cys Gly Tyr Thr Asp Leu Ser Val Ser Cys Glu Leu Glu
85 90 95
Val Glu Gly Ser Pro Thr Thr Trp Thr Pro Thr Ile Arg Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Asp Tyr Thr Val Lys Asn Ile Ser Tyr Leu Tyr Asp Gln Gln Thr
115 120 125
Ile Ser Leu Ala Asp Arg Asp Val Leu Gly Gly Gly Gly Cys Pro Val
130 135 140
Val Arg His Asn Val Ser Phe Asp Glu Thr Trp Leu His Leu His Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ala Phe Asp Asn Leu Thr Phe Phe Phe Gly Cys His Trp Gly
165 170 175
Pro Arg Asn Thr Pro Pro Glu Phe Ala Asp Tyr Asn Ile Ser Cys Ala
180 185 190
Gly Phe Asn Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gly Arg Ser Phe Val Phe Lys
195 200 205
Thr Gly Asp Leu Asp Glu Gln Glu Glu Gln Glu Leu Ala Leu His Cys
210 215 220
Asp Glu Val Phe Ser Val Pro Val Arg Arg Asp Ala Leu Gln Ala Ile
225 230 235 240
Val Ser Asn Phe Ser Leu Thr Arg Asp Gly Tyr Gly Glu Val Leu Arg
245 250 255
Gln Gly Phe Glu Leu Glu Trp Asn Arg Thr Ser Glu Asp Gln Cys Gly
260 265 270
Arg Cys Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Trp Cys Ala Tyr Ser Gln Lys
275 280 285
Arg Glu Phe Leu Gly Cys Leu Cys Ser Gly Gly Lys Val Gly Ser Pro
290 295 300
Phe Cys Lys Pro Ser Arg Ser Lys Arg Lys Glu Gly Pro Ile Val Gly
305 310 315 320
Ala Val Ala Val Ala Phe Leu Cys Leu Val Ile Leu Thr Cys Phe Leu
325 330 335
Ala Cys Arg His Gly Ser Leu Pro Phe Lys Ser Glu Asn Lys Pro Gly
340 345 350
Thr Arg Ile Glu Ser Phe Leu Gln Lys Asn Glu Ser Ile His Pro Lys
355 360 365
Arg Tyr Thr Tyr Ala Asp Val Lys Arg Met Thr Lys Ser Phe Ala Val
370 375 380
Lys Leu Gly Gln Gly Gly Phe Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu His
385 390 395 400
Asp Gly Arg Gln Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Thr Gln Gly Asp
405 410 415
Gly Glu Glu Phe Met Asn Glu Val Ala Ser Ile Ser Arg Thr Ser His
420 425 430
Val Asn Val Val Thr Leu Leu Gly Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Arg
435 440 445
Ala Leu Ile Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Glu Arg Tyr Ala
450 455 460
Phe Thr Gly Asp Met Asn Ser Glu Asn Leu Leu Thr Trp Glu Arg Leu
465 470 475 480
Phe Asp Ile Ala Ile Gly Thr Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Leu His Arg
485 490 495
Gly Cys Asn Thr Arg Ile Val His Phe Asp Ile Lys Pro His Asn Ile
500 505 510
Leu Leu Asp Gln Asp Phe Cys Pro Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala
515 520 525
Lys Leu Cys Leu Asn Lys Glu Ser Ala Ile Ser Ile Ala Gly Ala Arg
530 535 540
Gly Thr Ile Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Val Tyr Ser Lys Gln Phe Gly
545 550 555 560
Ile Ile Ser Ser Lys Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Met Met Val Leu
565 570 575
Glu Met Val Gly Ala Arg Asp Arg Asn Thr Ser Ala Asp Ser Asp His
580 585 590
Ser Ser Gln Tyr Phe Pro Gln Trp Leu Tyr Glu His Leu Asp Asp Tyr
595 600 605
Cys Val Gly Ala Ser Glu Ile Asn Gly Glu Thr Thr Glu Leu Val Arg
610 615 620
Lys Met Ile Val Val Gly Leu Trp Cys Ile Gln Val Ile Pro Thr Asp
625 630 635 640
Arg Pro Thr Met Thr Arg Val Val Glu Met Leu Glu Gly Ser Thr Ser
645 650 655
Asn Leu Glu Leu Pro Pro Arg Val Leu Leu Ser
660 665
<210> 3
<211> 2004
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLK1b - mutant Htn1
<400> 3
atggctgctc accagcctca cctctccgtc ctcctcctcg tcctcctcgc tgcccatgtc 60
gtctccacct ccgcccatgg cgagcctcct cttccgagcc cttacaacac ctccgcccat 120
ggcgagcctc ctcttccgag cacttacaac gcctccatgt gctcgtcgtt ctggtgtggc 180
ggcgtcgaga tccgctaccc gttctatctt gccaacgcaa tcgccgacta cagcgggagc 240
tactactcct gcggctacac cgacttgagc gtttcctgcg aactcgaggt cgaggggtcg 300
ccgacgacct ggacccctac catccgtctc ggcggcggcg actacaccgt caagaacatc 360
tcctacctct acgaccagca gaccatctca ctggcggaca gagatgtgct cggaggcggc 420
ggctgccccg tcgtccgcca caacgtcagc ttcgacgaga cgtggctgca cctgcacaac 480
gccagcgcct tcgacaacct caccttcttc ttcggatgcc actgggggcc acggaataca 540
ccgcctgaat ttgccgacta caacatcagc tgcgccgggt tcaatactcc aactatcagc 600
ggtggaaggt ccttcgtgtt caagactgga gatcttgacg aacaagagga gcaggagttg 660
gctttacact gcgacgaggt tttctccgtg ccagtgagaa gagatgctct gcaggcgatc 720
gtcagcaact tcagcctcac acgggacggg tacggcgagg tgcttaggca ggggttcgag 780
ttggaatgga atcggacatc ggaggatcag tgtggccggt gcgagggatc gggctccggc 840
ggatggtgcg cctacagcca gaagagagaa ttcctgggct gcttgtgcag cggagggaag 900
gtgggcagcc cgttctgcaa accatcgaga tcaaaaagga aagaaggacc tattgttggt 960
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ggttcgctgc ccttcaaatc ggagaacaaa ccagggacaa ggattgagtc cttcctacag 1080
aagaacgaga gtatacatcc gaaaagatac acctacgcgg acgtgaaaag aatgacaaaa 1140
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ccacccagag ttctcttgag ctga 2004
<210> 4
<211> 667
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> ZmWAK-RLK1 plasmid
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tgttggtgct tccgagatta atggtgagac cacagagctc gtgaggaaga tgatagttgt 2580
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gatgttggaa gggagcacaa gtaatctaga gttgccaccc agagttctct tgagccaccc 2700
agctttcttg tacaaagtgg tgatgggacg tccgcggaga tctacgcgtg tcgactcgag 2760
atatccaact agtatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct 2820
ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg 2880
cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt 2940
gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc 3000
cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga 3060
gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga 3120
gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa 3180
catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga 3240
caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag 3300
cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct 3360
gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg 3420
cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga 3480
gctgtacaag ttataagcgg ccatgctaga gtccgcaaaa atcaccagtc tctctctaca 3540
aatctatctc tctctatttt tctccagaat aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat 3600
tagggttctt atagggtttc gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt 3660
tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtga 3720
cctgcaggca tgcgacgtcg ggccctctag aggatccccg ggtaccgcga attatcgatc 3780
atgagcggag aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt 3840
tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc cactgagccg cgggtttctg 3900
gagtttaatg agctaagcac atacgtcaga aaccattatt gcgcgttcaa aagtcgccta 3960
aggtcactat cagctagcaa atatttcttg tcaaaaatgc tccactgacg ttccataaat 4020
tcccctcggt atccaattag agtctcatat tcactctcaa ctcgatcgag gggatctacc 4080
atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 4140
gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 4200
caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 4260
gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggtccctg gaaggcacgc 4320
aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 4380
ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 4440
agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 4500
ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 4560
gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtgccgc cccgtccggt cctgcccgtc 4620
accgaaatct gatgacccct agagtcaagc agatcgttca aacatttggc aataaagttt 4680
cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta 4740
cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat 4800
gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa 4860
ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcgaccgg catgcaagct 4920
gataattcaa ttcggcgtta attcagtaca ttaaaaacgt ccgcaatgtg ttattaagtt 4980
gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat atatcctgcc accagccagc caacagctcc 5040
ccgaccggca gctcggcaca aaatcaccac tcgatacagg cagcccatca gtccgggacg 5100
gcgtcagcgg gagagccgtt gtaaggcggc agactttgct catgttaccg atgctattcg 5160
gaagaacggc aactaagctg ccgggtttga aacacggatg atctcgcgga gggtagcatg 5220
ttgattgtaa cgatgacaga gcgttgctgc ctgtgatcaa ttcgggcacg aacccagtgg 5280
acataagcct gttcggttcg taagctgtaa tgcaagtagc gtatgcgctc acgcaactgg 5340
tccagaacct tgaccgaacg cagcggtggt aacggcgcag tggcggtttt catggcttgt 5400
tatgactgtt tttttggggt acagtctatg cctcgggcat ccaagcagca agcgcgttac 5460
gccgtgggtc gatgtttgat gttatggagc agcaacgatg ttacgcagca gggcagtcgc 5520
cctaaaacaa agttaaacat catgggggaa gcggtgatcg ccgaagtatc gactcaacta 5580
tcagaggtag ttggcgtcat cgagcgccat ctcgaaccga cgttgctggc cgtacatttg 5640
tacggctccg cagtggatgg cggcctgaag ccacacagtg atattgattt gctggttacg 5700
gtgaccgtaa ggcttgatga aacaacgcgg cgagctttga tcaacgacct tttggaaact 5760
tcggcttccc ctggagagag cgagattctc cgcgctgtag aagtcaccat tgttgtgcac 5820
gacgacatca ttccgtggcg ttatccagct aagcgcgaac tgcaatttgg agaatggcag 5880
cgcaatgaca ttcttgcagg tatcttcgag ccagccacga tcgacattga tctggctatc 5940
ttgctgacaa aagcaagaga acatagcgtt gccttggtag gtccagcggc ggaggaactc 6000
tttgatccgg ttcctgaaca ggatctattt gaggcgctaa atgaaacctt aacgctatgg 6060
aactcgccgc ccgactgggc tggcgatgag cgaaatgtag tgcttacgtt gtcccgcatt 6120
tggtacagcg cagtaaccgg caaaatcgcg ccgaaggatg tcgctgccga ctgggcaatg 6180
gagcgcctgc cggcccagta tcagcccgtc atacttgaag ctagacaggc ttatcttgga 6240
caagaagaag atcgcttggc ctcgcgcgca gatcagttgg aagaatttgt ccactacgtg 6300
aaaggcgaga tcaccaaggt agtcggcaaa taatgtctag ctagaaattc gttcaagccg 6360
acgccgcttc gcggcgcggc ttaactcaag tcgttagatg cactaagcac ataattgctc 6420
acagccaaac tatcaggtca agtctgcttt tattattttt aagcgtgcat aataagccct 6480
acacaaattg ggagatatat catgcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 6540
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 6600
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 6660
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 6720
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 6780
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 6840
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 6900
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 6960
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 7020
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 7080
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 7140
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cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 7380
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atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga 7500
cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 7560
agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 7620
aaacgcgcga ggcagggtgc cttgatgtgg gcgccggcgg tcgagtggcg acggcgcggc 7680
ttgtccgcgc cctggtagat tgcctggccc taggccagcc atttttgagc ggccagcggc 7740
cgcgataggc cgacgcgaag cggcggggcg tagggagcgc agcgaccgaa gggtaggcgc 7800
tttttgcagc tcttcggctg tgcgctggcc agacagttat gcacaggcca ggcgggtttt 7860
aagagtttta ataagtttta aagagtttta ggcggaaaaa tcgccttttt tctcttttat 7920
atcagtcact tacatgtgtg accggttccc aatgtacggc tttgggttcc caatgtacgg 7980
gttccggttc ccaatgtacg gctttgggtt cccaatgtac gtgctatcca caggaaagag 8040
accttttcga cctttttccc ctgctagggc aatttgccct agcatctgct ccgtacatta 8100
ggaaccggcg gatgcttcgc cctcgatcag gttgcggtag cgcatgacta ggatcgggcc 8160
agcctgcccc gcctcctcct tcaaatcgta ctccggcagg tcatttgacc cgatcagctt 8220
gcgcacggtg aaacagaact tcttgaactc tccggcgctg ccactgcgtt cgtagatcgt 8280
cttgaacaac catctggctt ctgccttgcc tgcggcgcgg cgtgccaggc ggtagagaaa 8340
acggccgatg ccgggatcga tcaaaaagta atcggggtga accgtcagca cgtccgggtt 8400
cttgccttct gtgatctcgc ggtacatcca atcagctagc tcgatctcga tgtactccgg 8460
ccgcccggtt tcgctcttta cgatcttgta gcggctaatc aaggcttcac cctcggatac 8520
cgtcaccagg cggccgttct tggccttctt cgtacgctgc atggcaacgt gcgtggtgtt 8580
taaccgaatg caggtttcta ccaggtcgtc tttctgcttt ccgccatcgg ctcgccggca 8640
gaacttgagt acgtccgcaa cgtgtggacg gaacacgcgg ccgggcttgt ctcccttccc 8700
ttcccggtat cggttcatgg attcggttag atgggaaacc gccatcagta ccaggtcgta 8760
atcccacaca ctggccatgc cggccggccc tgcggaaacc tctacgtgcc cgtctggaag 8820
ctcgtagcgg atcacctcgc cagctcgtcg gtcacgcttc gacagacgga aaacggccac 8880
gtccatgatg ctgcgactat cgcgggtgcc cacgtcatag agcatcggaa cgaaaaaatc 8940
tggttgctcg tcgcccttgg gcggcttcct aatcgacggc gcaccggctg ccggcggttg 9000
ccgggattct ttgcggattc gatcagcggc cgcttgccac gattcaccgg ggcgtgcttc 9060
tgcctcgatg cgttgccgct gggcggcctg cgcggccttc aacttctcca ccaggtcatc 9120
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cgggcttggg ggttccagtg ccattgcagg gccggcagac aacccagccg cttacgcctg 9240
gccaaccgcc cgttcctcca cacatggggc attccacggc gtcggtgcct ggttgttctt 9300
gattttccat gccgcctcct ttagccgcta aaattcatct actcatttat tcatttgctc 9360
atttactctg gtagctgcgc gatgtattca gatagcagct cggtaatggt cttgccttgg 9420
cgtaccgcgt acatcttcag cttggtgtga tcctccgccg gcaactgaaa gttgacccgc 9480
ttcatggctg gcgtgtctgc caggctggcc aacgttgcag ccttgctgct gcgtgcgctc 9540
ggacggccgg cacttagcgt gtttgtgctt ttgctcattt tctctttacc tcattaactc 9600
aaatgagttt tgatttaatt tcagcggcca gcgcctggac ctcgcgggca gcgtcgccct 9660
cgggttctga ttcaagaacg gttgtgccgg cggcggcagt gcctgggtag ctcacgcgct 9720
gcgtgatacg ggactcaaga atgggcagct cgtacccggc cagcgcctcg gcaacctcac 9780
cgccgatgcg cgtgcctttg atcgcccgcg acacgacaaa ggccgcttgt agccttccat 9840
ccgtgacctc aatgcgctgc ttaaccagct ccaccaggtc ggcggtggcc catatgtcgt 9900
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cgtcgcggtc aatcgtcggg cggtcgatgc cgacaacggt tagcggttga tcttcccgca 10080
cggccgccca atcgcgggca ctgccctggg gatcggaatc gactaacaga acatcggccc 10140
cggcgagttg cagggcgcgg gctagatggg ttgcgatggt cgtcttgcct gacccgcctt 10200
tctggttaag tacagcgata accttcatgc gttccccttg cgtatttgtt tatttactca 10260
tcgcatcata tacgcagcga ccgcatgacg caagctgttt tactcaaata cacatcacct 10320
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ctcgaacacg tacccggccg cgatcatctc cgcctcgatc tcttcggtaa tgaaaaacgg 10500
ttcgtcctgg ccgtcctggt gcggtttcat gcttgttcct cttggcgttc attctcggcg 10560
gccgccaggg cgtcggcctc ggtcaatgcg tcctcacgga aggcaccgcg ccgcctggcc 10620
tcggtgggcg tcacttcctc gctgcgctca agtgcgcggt acagggtcga gcgatgcacg 10680
ccaagcagtg cagccgcctc tttcacggtg cggccttcct ggtcgatcag ctcgcgggcg 10740
tgcgcgatct gtgccggggt gagggtaggg cgggggccaa acttcacgcc tcgggccttg 10800
gcggcctcgc gcccgctccg ggtgcggtcg atgattaggg aacgctcgaa ctcggcaatg 10860
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tcggtgctga cgcgggcata gcccagcagg ccagcggcgg cgctcttgtt catggcgtaa 11220
tgtctccggt tctagtcgca agtattctac tttatgcgac taaaacacgc gacaagaaaa 11280
cgccaggaaa agggcagggc ggcagcctgt cgcgtaactt aggacttgtg cgacatgtcg 11340
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tggatcaaag tactttaaag tactttaaag tactttaaag tactttgatc ccgaggggaa 11460
ccctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga cgaacggata aaccttttca cgccctttta 11520
aatatccgtt attctaataa acgctctttt ctcttaggtt tacccgccaa tatatcctgt 11580
caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg aaacgacaat ctgatccaag ctcaagctgc 11640
tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 11700
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tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 11820
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc 11880
tcgg 11884
<210> 10
<211> 1044
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 10
atggctttcg cgcccaaaac gtcctcctcc tcctcgctct cctcggcgtt gcaggcagct 60
cagtcgccgc cgctgctcct gaggcggatg tcgtcgaccg caacaccgag acggaggtac 120
gacgcggccg tcgtcgtcac taccaccacc actgctagag ctgctgcggc tgctgtcacg 180
gttcccgccg ccccgccgca ggcgccggcg ccggcgccgg tgccgccaaa gcaagcggcg 240
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ggcaagacgg cgttcatccc gtacataacc gccggcgacc ccgacctagc gacgacggcc 360
gaggcgctgc ggctgctgga cggctgtggc gccgacgtca tcgagctggg cgtgccctgc 420
tcggacccct acatcgacgg gcccatcatc caggcgtcgg tggcgcgggc tctggccagc 480
ggcaccacca tggacgccgt gctggagatg ctgagggagg tgacgccgga gctgtcgtgc 540
cccgtggtgc tcctctccta ctacaagccc atcatgtctc gcagcttggc cgagatgaaa 600
gaggcggggg tccacggtct tatagtgcct gatctcccgt acgtggccgc gcactcgctg 660
tggagtgaag ccaagaacaa caacctggag ctggtgctgc tgacaacacc agccatacca 720
gaagacagga tgaaggagat caccaaggct tcagaaggct tcgtctacct ggtgagcgtg 780
aacggagtga caggtcctcg cgcaaacgtg aacccacgag tggagtcact catccaggag 840
gttaagaagg tgactaacaa gcccgttgct gttggcttcg gcatatccaa gcccgagcac 900
gtgaagcaga ttgcgcagtg gggcgctgac ggggtgatca tcggcagcgc catggtgagg 960
cagctgggcg aagcggcttc tcccaagcaa ggcctgagga ggctggagga gtatgccagg 1020
ggcatgaaga acgcgctgcc atga 1044
<210> 11
<211> 347
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 11
Met Ala Phe Ala Pro Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ala
1 5 10 15
Leu Gln Ala Ala Gln Ser Pro Pro Leu Leu Leu Arg Arg Met Ser Ser
20 25 30
Thr Ala Thr Pro Arg Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Val Val Val Thr Thr
35 40 45
Thr Thr Thr Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Val Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Val Pro Pro Lys Gln Ala Ala
65 70 75 80
Ala Pro Ala Glu Arg Arg Ser Arg Pro Val Ser Asp Thr Met Ala Ala
85 90 95
Leu Met Ala Lys Gly Lys Thr Ala Phe Ile Pro Tyr Ile Thr Ala Gly
100 105 110
Asp Pro Asp Leu Ala Thr Thr Ala Glu Ala Leu Arg Leu Leu Asp Gly
115 120 125
Cys Gly Ala Asp Val Ile Glu Leu Gly Val Pro Cys Ser Asp Pro Tyr
130 135 140
Ile Asp Gly Pro Ile Ile Gln Ala Ser Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser
145 150 155 160
Gly Thr Thr Met Asp Ala Val Leu Glu Met Leu Arg Glu Val Thr Pro
165 170 175
Glu Leu Ser Cys Pro Val Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Lys Pro Ile Met
180 185 190
Ser Arg Ser Leu Ala Glu Met Lys Glu Ala Gly Val His Gly Leu Ile
195 200 205
Val Pro Asp Leu Pro Tyr Val Ala Ala His Ser Leu Trp Ser Glu Ala
210 215 220
Lys Asn Asn Asn Leu Glu Leu Val Leu Leu Thr Thr Pro Ala Ile Pro
225 230 235 240
Glu Asp Arg Met Lys Glu Ile Thr Lys Ala Ser Glu Gly Phe Val Tyr
245 250 255
Leu Val Ser Val Asn Gly Val Thr Gly Pro Arg Ala Asn Val Asn Pro
260 265 270
Arg Val Glu Ser Leu Ile Gln Glu Val Lys Lys Val Thr Asn Lys Pro
275 280 285
Val Ala Val Gly Phe Gly Ile Ser Lys Pro Glu His Val Lys Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Trp Gly Ala Asp Gly Val Ile Ile Gly Ser Ala Met Val Arg
305 310 315 320
Gln Leu Gly Glu Ala Ala Ser Pro Lys Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu
325 330 335
Glu Tyr Ala Arg Gly Met Lys Asn Ala Leu Pro
340 345
<210> 12
<211> 1182
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 12
atgtacggcg ccaccgactc gtgcttcgcg ccctacggcg accacttccg caaggcgcgg 60
aagctggtca ccgtgcacct gctcaacgcc agcaaggtgc ggtcgcagcg gcccgcgcgg 120
gaggaggagg tgcgcggcgc gctcgacagg gtgcgccgcg ccgccgccgc gcgggaggcc 180
ctggacatga gcgagctcct gcactccttc gtcaacaacc tcgtctgccg cgccgtctcg 240
ggcaagttct ccatggagga aggccgcaac aggctgttcc gggagctcac cgacatcaac 300
gcgggactcc tcggagggtt ccacatccag gactacttcc ctagcctggg ccggatcgag 360
ctcgtcagga aggtggcgtg cgccaagacc aggcgcgtca ggaagcgctg ggacgacctc 420
ctcgacaagc tcatcgacga ccatgcggcc aggatggcaa cccatcagga cgaggacgac 480
gataaggact tcatatacgt cttgctgtct cttcagaagg agtatggcct caccagagac 540
catatcaagg ctatcttgat agacatgttc gaggccggaa ccgacacctc gtacatgacg 600
ttggagttcg ccatgacgga gctcatacgg aagccacacc tgatgaagaa gctgcaggaa 660
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atgacctacc tcaaggccgt catcaaggag acgctccgcc tgcacccgcc ggtcccgctc 780
ctcctcccgc actactccct ggacgcctgc gaggtcgccg gctacaccat cccggccaac 840
acccgcgtcg tcgtcaacgc ctgggcgctc ggccgccaca gcggctactg ggagcgcgag 900
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cccaacgagt tccagttcct ggcgttcggg tccggccgga ggatgtgccc cggggtccac 1020
tcggcgtccg cgaccatcga ggcgatgctg tccaacctca tgtaccggtt cgactggcag 1080
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tcgaggaagg agaagctgct cctagtccca caggctgcgt ga 1182
<210> 13
<211> 393
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 13
Met Tyr Gly Ala Thr Asp Ser Cys Phe Ala Pro Tyr Gly Asp His Phe
1 5 10 15
Arg Lys Ala Arg Lys Leu Val Thr Val His Leu Leu Asn Ala Ser Lys
20 25 30
Val Arg Ser Gln Arg Pro Ala Arg Glu Glu Glu Val Arg Gly Ala Leu
35 40 45
Asp Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Ala Arg Glu Ala Leu Asp Met Ser
50 55 60
Glu Leu Leu His Ser Phe Val Asn Asn Leu Val Cys Arg Ala Val Ser
65 70 75 80
Gly Lys Phe Ser Met Glu Glu Gly Arg Asn Arg Leu Phe Arg Glu Leu
85 90 95
Thr Asp Ile Asn Ala Gly Leu Leu Gly Gly Phe His Ile Gln Asp Tyr
100 105 110
Phe Pro Ser Leu Gly Arg Ile Glu Leu Val Arg Lys Val Ala Cys Ala
115 120 125
Lys Thr Arg Arg Val Arg Lys Arg Trp Asp Asp Leu Leu Asp Lys Leu
130 135 140
Ile Asp Asp His Ala Ala Arg Met Ala Thr His Gln Asp Glu Asp Asp
145 150 155 160
Asp Lys Asp Phe Ile Tyr Val Leu Leu Ser Leu Gln Lys Glu Tyr Gly
165 170 175
Leu Thr Arg Asp His Ile Lys Ala Ile Leu Ile Asp Met Phe Glu Ala
180 185 190
Gly Thr Asp Thr Ser Tyr Met Thr Leu Glu Phe Ala Met Thr Glu Leu
195 200 205
Ile Arg Lys Pro His Leu Met Lys Lys Leu Gln Glu Glu Val Arg Arg
210 215 220
Asn Val Pro Ala Gly Gln Glu Met Val Thr Glu Asp Asn Leu Pro Gly
225 230 235 240
Met Thr Tyr Leu Lys Ala Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro
245 250 255
Pro Val Pro Leu Leu Leu Pro His Tyr Ser Leu Asp Ala Cys Glu Val
260 265 270
Ala Gly Tyr Thr Ile Pro Ala Asn Thr Arg Val Val Val Asn Ala Trp
275 280 285
Ala Leu Gly Arg His Ser Gly Tyr Trp Glu Arg Glu Asn Glu Phe Val
290 295 300
Pro Glu Arg Phe Leu Ser Gly Asp Val Ala Gly Gly Val Asp Leu Lys
305 310 315 320
Pro Asn Glu Phe Gln Phe Leu Ala Phe Gly Ser Gly Arg Arg Met Cys
325 330 335
Pro Gly Val His Ser Ala Ser Ala Thr Ile Glu Ala Met Leu Ser Asn
340 345 350
Leu Met Tyr Arg Phe Asp Trp Gln Leu Pro Ala Gly Met Lys Ala Glu
355 360 365
Asp Val Asp Met Thr Glu Val Phe Gly Ile Thr Val Ser Arg Lys Glu
370 375 380
Lys Leu Leu Leu Val Pro Gln Ala Ala
385 390
<210> 14
<211> 1020
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 14
atggcctccg cgatcaaggc tgcatcgacc tcctcccagt ggtcttcttc cccggcggca 60
gtccactcgt cgccgttatc gaagcggcta ccagctgcag tggccatgcc ggggcggcgg 120
aggtctgtgg ccactgtaag ggcggtcgcc gcggtagctc cggctgcccc ggcggcgccg 180
gccaagctca ccgccggtgc cggcggccga tgcctgccgg tgtcgcagac catgtccagg 240
ctcagggcgc agggcaagac ggcgttcatc ccgtacatca ccgccggcga cccggacctg 300
gcgacgacgg cggaggcgct gcggctcctg gacgcctgcg gcgccgacgt catcgagctc 360
ggcgttccct tctcggaccc ctacgccgac gggccggtca tccaggcgtc ggcggcgcgg 420
gcactggcga gcggcacgac gccggacggc gtgctggcga tgctgaagga ggtgacgccg 480
gagctgtcct gccccgtggt gctcttctcc tacttcaacc ccatcgtgcg gtggggcctg 540
gccgacttcg ccgccgccgt caaggaagcc ggcgtgcacg gcctcatagt tcccgacctc 600
ccgtatggga actcgtgcgc tctcactctc aggaccgaag ccatcaagaa caacctcgag 660
ctggtgctgc tcacaacacc atctacgcca gcggacagga tggaggagat aacacgagct 720
tcacgaggat tcgtctatct cgcgagcgtc aatggagtta caggtccacg cgcaaacgtg 780
aacacacgtg tccagtctct cattcaggag gttaaacagg tcactgacat acccgtggct 840
gtcgggtttg gcatatcgaa acctgagcat gtaaagcaga ttgcagagtg gggtgcagat 900
ggtgtgatca ttggtagcgc aatggtgaga cagttaggcg aagcagcctc tcccaaagaa 960
ggattgaaga ggctagagaa atacgccagg atcatgaaga acgcgctacc atgccagtga 1020
<210> 15
<211> 339
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 15
Met Ala Ser Ala Ile Lys Ala Ala Ser Thr Ser Ser Gln Trp Ser Ser
1 5 10 15
Ser Pro Ala Ala Val His Ser Ser Pro Leu Ser Lys Arg Leu Pro Ala
20 25 30
Ala Val Ala Met Pro Gly Arg Arg Arg Ser Val Ala Thr Val Arg Ala
35 40 45
Val Ala Ala Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Lys Leu Thr
50 55 60
Ala Gly Ala Gly Gly Arg Cys Leu Pro Val Ser Gln Thr Met Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Ala Gln Gly Lys Thr Ala Phe Ile Pro Tyr Ile Thr Ala Gly
85 90 95
Asp Pro Asp Leu Ala Thr Thr Ala Glu Ala Leu Arg Leu Leu Asp Ala
100 105 110
Cys Gly Ala Asp Val Ile Glu Leu Gly Val Pro Phe Ser Asp Pro Tyr
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Val Ile Gln Ala Ser Ala Ala Arg Ala Leu Ala Ser
130 135 140
Gly Thr Thr Pro Asp Gly Val Leu Ala Met Leu Lys Glu Val Thr Pro
145 150 155 160
Glu Leu Ser Cys Pro Val Val Leu Phe Ser Tyr Phe Asn Pro Ile Val
165 170 175
Arg Trp Gly Leu Ala Asp Phe Ala Ala Ala Val Lys Glu Ala Gly Val
180 185 190
His Gly Leu Ile Val Pro Asp Leu Pro Tyr Gly Asn Ser Cys Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Arg Thr Glu Ala Ile Lys Asn Asn Leu Glu Leu Val Leu Leu
210 215 220
Thr Thr Pro Ser Thr Pro Ala Asp Arg Met Glu Glu Ile Thr Arg Ala
225 230 235 240
Ser Arg Gly Phe Val Tyr Leu Ala Ser Val Asn Gly Val Thr Gly Pro
245 250 255
Arg Ala Asn Val Asn Thr Arg Val Gln Ser Leu Ile Gln Glu Val Lys
260 265 270
Gln Val Thr Asp Ile Pro Val Ala Val Gly Phe Gly Ile Ser Lys Pro
275 280 285
Glu His Val Lys Gln Ile Ala Glu Trp Gly Ala Asp Gly Val Ile Ile
290 295 300
Gly Ser Ala Met Val Arg Gln Leu Gly Glu Ala Ala Ser Pro Lys Glu
305 310 315 320
Gly Leu Lys Arg Leu Glu Lys Tyr Ala Arg Ile Met Lys Asn Ala Leu
325 330 335
Pro Cys Gln
<210> 16
<211> 1125
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 16
atggctccaa cgaccgccac caaggacgac agtggctacg gcgacgagcg ccggcgcgag 60
ctgcaggcgt tcgacgacac gaagctgggg gtgaaaggtc tggtggactc cggcgtcaag 120
tccatcccgt ccatcttcca ccacccgccg gaagccctga gcgacataat ttctccggcg 180
cctctgccgt cgtcgccacc ctccggcgcc gccatcccgg tggtggacct ctcggtgacg 240
cggcgcgagg acctagtcga gcaggtgagg cacgcggccg ggacggtggg cttcttctgg 300
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<212> PRT
<213> Zea mays
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Met Ala Pro Thr Thr Ala Thr Lys Asp Asp Ser Gly Tyr Gly Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Arg Glu Leu Gln Ala Phe Asp Asp Thr Lys Leu Gly Val Lys
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Gly Leu Val Asp Ser Gly Val Lys Ser Ile Pro Ser Ile Phe His His
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50 55 60
Ser Pro Pro Ser Gly Ala Ala Ile Pro Val Val Asp Leu Ser Val Thr
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Arg Arg Glu Asp Leu Val Glu Gln Val Arg His Ala Ala Gly Thr Val
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Gly Phe Phe Trp Leu Val Asn His Gly Val Ala Glu Glu Leu Met Gly
100 105 110
Gly Met Leu Arg Gly Val Arg Gln Phe Asn Glu Gly Pro Val Glu Ala
115 120 125
Lys Gln Ala Leu Tyr Ser Arg Asp Leu Ala Arg Asn Leu Arg Phe Ala
130 135 140
Ser Asn Phe Asp Leu Phe Lys Ala Ala Ala Ala Asp Trp Arg Asp Thr
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Leu Phe Cys Glu Val Ala Pro Asn Pro Pro Pro Arg Glu Glu Leu Pro
165 170 175
Glu Pro Leu Arg Asn Val Met Leu Glu Tyr Gly Ala Ala Val Thr Lys
180 185 190
Leu Ala Arg Phe Val Phe Glu Leu Leu Ser Glu Ser Leu Gly Met Pro
195 200 205
Ser Asp His Leu Tyr Glu Met Glu Cys Met Gln Asn Leu Asn Val Val
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Cys Gln Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Glu Pro His Arg Thr Val Gly Val
225 230 235 240
Lys Arg His Thr Asp Pro Gly Phe Phe Thr Ile Leu Leu Gln Asp Gly
245 250 255
Met Gly Gly Leu Gln Val Arg Leu Gly Asn Asn Gly Gln Ser Gly Gly
260 265 270
Cys Trp Val Asp Ile Ala Pro Arg Pro Gly Ala Leu Met Val Asn Ile
275 280 285
Gly Asp Leu Leu Gln Leu Val Thr Asn Asp Arg Phe Arg Ser Val Glu
290 295 300
His Arg Val Pro Ala Asn Lys Ser Ser Asp Thr Ala Arg Val Ser Val
305 310 315 320
Ala Ser Phe Phe Asn Thr Asp Val Arg Arg Ser Glu Arg Met Tyr Gly
325 330 335
Pro Ile Pro Asp Pro Ser Lys Pro Pro Leu Tyr Arg Ser Val Arg Ala
340 345 350
Arg Asp Phe Ile Ala Lys Phe Asn Thr Ile Gly Leu Asp Gly Arg Ala
355 360 365
Leu Asp His Phe Arg Leu
370
<210> 18
<211> 1128
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 18
atggcactca tcatgcagga gagtagtagc catgatttgc tccaagctca cgacgagctc 60
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gagactgcgc tccacccaag caagcttcgc gcccttcgcc gcctcatgcg cgtgctcacc 240
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cacacgtcgg acgacgaagc tgtcgtcgtc tacaggttga cggcagcctc ccgcttcctc 360
gtcagcgacg aggtgagcac ggcgaccttg gctccctttg tgagtctggc gctccagcct 420
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catggtggcg ccgccgccgc catcgccgcc gccttccccc acctcaagtg cagcgtgctt 720
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<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 19
Met Ala Leu Ile Met Gln Glu Ser Ser Ser His Asp Leu Leu Gln Ala
1 5 10 15
His Asp Glu Leu Leu His His Ser Leu Cys Phe Ala Lys Ser Leu Ala
20 25 30
Leu Ala Val Ala Leu Asp Leu Arg Ile Pro Asp Ala Ile His His His
35 40 45
Gly Ala Gly Gly Ala Thr Leu Leu Gln Ile Leu Ala Glu Thr Ala Leu
50 55 60
His Pro Ser Lys Leu Arg Ala Leu Arg Arg Leu Met Arg Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Thr Gly Ile Phe Ser Val Glu Gln Pro Pro Ala Gly Gly Gly Asp
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Asn Ser Thr Val His Thr Ser Asp Asp Glu Ala Val Val Val Tyr Arg
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Leu Thr Ala Ala Ser Arg Phe Leu Val Ser Asp Glu Val Ser Thr Ala
115 120 125
Thr Leu Ala Pro Phe Val Ser Leu Ala Leu Gln Pro Ile Ala Ala Cys
130 135 140
Pro His Ala Leu Gly Ile Ser Ala Trp Phe Arg Gln Glu Gln His Glu
145 150 155 160
Pro Ser Pro Tyr Gly Leu Ala Phe Arg Gln Thr Pro Thr Ile Trp Glu
165 170 175
His Ala Asp Asp Val Asn Ala Leu Leu Asn Lys Gly Met Ala Ala Asp
180 185 190
Ser Arg Phe Leu Met Pro Ile Val Leu Arg Glu Cys Gly Glu Thr Phe
195 200 205
Arg Gly Ile Asp Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly His Gly Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ala Phe Pro His Leu Lys Cys Ser Val Leu
225 230 235 240
Asp Leu Pro His Val Val Ala Gly Ala Pro Ser Asp Gly Asn Val His
245 250 255
Phe Val Ala Gly Asn Met Phe Glu Ser Ile Pro Pro Ala Thr Ala Val
260 265 270
Phe Leu Lys Lys Thr Leu His Asp Trp Gly Asp Asp Glu Cys Val Lys
275 280 285
Ile Leu Lys Asn Cys Lys Gln Ala Ile Ser Pro Arg Asp Ala Gly Gly
290 295 300
Lys Val Ile Ile Leu Asp Val Val Val Gly Tyr Lys Gln Ser Asn Ile
305 310 315 320
Lys His Gln Glu Thr Gln Val Met Phe Asp Leu Tyr Met Met Ala Val
325 330 335
Asn Gly Val Glu Arg Asp Glu Gln Glu Trp Lys Lys Ile Phe Ile Glu
340 345 350
Ala Gly Phe Lys Asp Tyr Lys Ile Leu Pro Val Ile Gly Asp Val Ser
355 360 365
Val Ile Ile Glu Val Tyr Pro
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<210> 20
<211> 1101
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 20
atggcactca tgcaggagag cagccaggac ttgctcgaag cgcacgacga gctcttccac 60
cactgcctgt gcttcgccaa atcgctcgcg ctcgccgtgg cgcaggacct ccgcatcccc 120
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gtcttcaccg tccagtattc ttcaaccgtc gacgcgtcgg acggagctga tgtcgtctac 300
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ttggctccct ttgcgaacct ggcgctccac cctatcgcca tctccccgca cgccgtgggc 420
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<212> PRT
<213> Zea mays
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Met Ala Leu Met Gln Glu Ser Ser Gln Asp Leu Leu Glu Ala His Asp
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Glu Leu Phe His His Cys Leu Cys Phe Ala Lys Ser Leu Ala Leu Ala
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Val Ala Gln Asp Leu Arg Ile Pro Asp Ala Ile His His His Gly Gly
35 40 45
Gly Ala Thr Leu His Gln Ile Leu Ala Glu Ala Ala Leu His Pro Ser
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Lys Leu Arg Ala Leu Arg Arg Leu Met Arg Val Leu Thr Val Ser Gly
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Val Phe Thr Val Gln Tyr Ser Ser Thr Val Asp Ala Ser Asp Gly Ala
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Asp Val Val Tyr Arg Leu Thr Ala Ala Ser Arg Phe Leu Val Ser Asp
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Ser Asp Glu Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ala Pro Phe Ala Asn Leu Ala
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Leu His Pro Ile Ala Ile Ser Pro His Ala Val Gly Ile Cys Ala Trp
130 135 140
Phe Arg Gln Glu Gln His Asp Pro Ser Pro Tyr Gly Leu Ala Phe Arg
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Gln Ile Pro Thr Ile Trp Glu His Ala Asp Asn Val Asn Ala Leu Leu
165 170 175
Asn Lys Gly Leu Leu Ala Glu Ser Arg Phe Leu Met Pro Ile Val Leu
180 185 190
Arg Glu Cys Gly Asp Glu Val Phe Arg Gly Ile Asp Ser Leu Val Asp
195 200 205
Val Gly Gly Gly His Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ile Ala Ala Ala Phe
210 215 220
Pro His Val Lys Cys Ser Val Leu Asp Leu Pro His Val Val Ala Gly
225 230 235 240
Ala Pro Ser Asp Ala Cys Val Gln Phe Val Ala Gly Asn Met Phe His
245 250 255
Ser Ile Pro Pro Ala Thr Ala Val Phe Phe Lys Thr Thr Leu Cys Asp
260 265 270
Trp Gly Asp Asp Glu Cys Ile Lys Ile Leu Lys Asn Cys Lys Gln Ala
275 280 285
Ile Ser Pro Arg Asp Glu Gly Gly Lys Val Ile Ile Met Asp Val Val
290 295 300
Val Gly Tyr Gly Gln Ser Asn Met Lys Arg Leu Glu Thr Gln Val Met
305 310 315 320
Phe Asp Leu Val Met Met Ala Val Asn Gly Val Glu Arg Asp Glu Gln
325 330 335
Glu Trp Lys Glu Met Phe Ile Glu Ala Gly Phe Lys Asp Tyr Lys Ile
340 345 350
Arg Pro Val Ala Gly Leu Met Ser Val Ile Glu Val Tyr Pro
355 360 365
<210> 22
<211> 1122
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 22
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gtgccgcagc cacacgccgc cgtgtactac tcgcaacgcg ccaccagggg tggcctgctc 180
atcgcggagg ccacgggggt gtcggccacc gcgcaggggt tcccggagtc tcctggcatc 240
tggacgcagg agcaggtcga ggcgtggaag cccatcgtcg acgccgtcca ccgcaagggc 300
gccatcttcg tctgccagat ctggcatgtg ggcagggtct ccaccaacga gctccagccc 360
aacggcgacg cgcctatctc gagcacggac aagcagatct cccccgacgc caagtccgga 420
acggcgtact cgaagccgcg ccggctgcgg accgacgagg tccccgggat cgtcgacgac 480
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tgcgtggact cggacccggt ggcgctcggc cactacatgg tgcagcagct caacaggcat 780
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ctcaacaaat acgaccgctc caccttctac acgcaagatc ctattgttgg ctacacagat 1080
taccctttct ttgaagaaga agatggcaag aatgagaggt ga 1122
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<211> 373
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<213> Zea mays
<400> 23
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
His Arg Lys Gly Ala Ile Phe Val Cys Gln Ile Trp His Val Gly Arg
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Phe Arg Arg Ala Ala Arg Asn Ala Ile Gln Ala Gly Phe Asp Ala Val
165 170 175
Glu Ile His Gly Ala His Gly Tyr Leu Leu Glu Gln Phe Met Lys Asp
180 185 190
Ser Cys Asn Asp Arg Thr Asp Gln Tyr Gly Gly Ser Leu Glu Asn Arg
195 200 205
Cys Arg Leu Ala Val Glu Val Val Asp Ala Val Val Arg Glu Val Gly
210 215 220
Ala Arg Arg Val Gly Ile Arg Leu Ser Pro Phe Val Asp Phe Val Asp
225 230 235 240
Cys Val Asp Ser Asp Pro Val Ala Leu Gly His Tyr Met Val Gln Gln
245 250 255
Leu Asn Arg His Ser Gly Leu Leu Tyr Cys His Met Val Glu Pro Arg
260 265 270
Ile Thr Ala His Gly Arg Arg Gln Ile Pro His Gly Leu Leu Pro Phe
275 280 285
Arg Lys Ala Phe His Gly Thr Phe Ile Ala Ala Gly Gly Tyr Asp Arg
290 295 300
Glu Glu Gly Asn Lys Val Val Ala Glu Gly Tyr Ala Asp Leu Val Ala
305 310 315 320
Tyr Gly Lys Leu Phe Leu Ala Asn Pro Asp Leu Pro Arg Arg Phe Glu
325 330 335
Leu Asp Val Ala Leu Asn Lys Tyr Asp Arg Ser Thr Phe Tyr Thr Gln
340 345 350
Asp Pro Ile Val Gly Tyr Thr Asp Tyr Pro Phe Phe Glu Glu Glu Asp
355 360 365
Gly Lys Asn Glu Arg
370
<210> 24
<211> 2595
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 24
atgctgagcg ggatcatcga cgggctgacg ggggcgaaca agcatgcgcg gctcaagggc 60
acggtggtgc tcatgcgcaa gaacgtgctg gacctcaacg acttcggcgc caccgtcgtt 120
gacagcatca gcgagttcct cggcaagggg gtcacctgcc agctcatcag ctccaccctc 180
gtcgacgcca acaacggcaa ccgcgggcgg gtcggggcgg aggcgaacct ggagcagtgg 240
ctgacgagcc tgccgtcgct gacgaccggc gagtccaagt tcggcgtcac gttcgactgg 300
gaggtggaga agctgggagt gccgggggcc gtcgtcgtca agaacaacca cgccgccgag 360
ttcttcctca agacaatcac cctcgacgac gtgcccggcc gcggcgccgt caccttcgtc 420
gccaactcct gggtctaccc cgcgggcaag taccgctaca accgcgtctt cttctccaac 480
gatacgtacc tgccaagcca gatgccggcg gcgctgaagc cgtaccgcga cgacgagctc 540
cgcaacctcc gcggcgacga ccagcagggc ccctaccagg agcacgaccg cgtgtaccgc 600
tacgacgtct acaacgacct cggcgagccc gacggcggca acccgcgccc catcctcggc 660
ggctccgccg accacccgta cccgcgccgc tgccgcacgg gccgcaagcc caccaaaacc 720
gaccccaact cggagagccg actgtcgctg gtggagcaga tctacgtgcc gcgggacgag 780
cgcttcggcc acctcaagat gtccgacttc ctgggctact ccatcaaggc catcacgcag 840
ggcatcatcc cggcggtgcg cacgtacgtg gacaccaccc cgggcgagtt cgactccttc 900
caggacatca tcaacctgta cgagggcggg atcaagctgc ccaagatcca ggcgctcgag 960
gacatgcgca agctcttccc gctccagctc gtcaaggacc tcctccccgc cggcggggac 1020
tacctgctca agctccccat cccacagatc atccaagagg acaagaacgc gtggaggacc 1080
gacgaggagt tcgcgcggga ggtgctcgcc ggcgtcaacc cgatggtgat cacgcgcctc 1140
acggagttcc cgcccaagag cacgctggac cccagcaagt acggcgacca caccagcacg 1200
atcacggcgg agcacatcga gaagaacctc gagggcctca cggtgcagca ggcgctggac 1260
ggcaacaggc tctacatcct ggaccaccac gaccgcttca tgccgttcct catcgacgtc 1320
aacaacctgg agggcaactt catctacgcc accaggacgc tcttcttcct gcgcggcgac 1380
ggcaggctcg cgcccctcgc catcgagctc agcgagccgt acatcgacgg ggacctcacc 1440
gtggccaaga gcaaggtcta cacgccggcg tccagcggcg tcgaggcctg ggtgtggcag 1500
ctcgccaagg cctatgtcgc cgtcaacgac tctggctggc accaactcgt cagccactgg 1560
ctgaacaccc acgcggtgat ggagccgttc gtgatcgcga cgaaccggca gctgagcgtg 1620
acgcacccgg tgcacaagct cctgagctcg cacttccgcg acaccatgac catcaacgcg 1680
ctggcgcggc agacgctcat caacggcggc ggcatcttcg agatgaccgt cttcccgggc 1740
aagtacgcgc tgggcatgtc ctccgtggtg tacaagagct ggaacttcac cgagcagggc 1800
ctccccgccg acctcgtcaa gaggggcgtg gcggtggcgg acccgtccag cccgtacaag 1860
gtgcggctgc tgatcgagga ctacccgtac gcgagcgacg ggctggccat ctggcacgcc 1920
atcgagcagt gggtgggcga gtacctggcc atctactacc ccgacgacgg cgcgctgcgg 1980
ggcgacgagg agctgcaggc gtggtggaag gaggtgcgcg aggtcgggca cggcgaccac 2040
aaggacgcgc cctggtggcc caagatgcag gccgtgtcgg agctcgccag cgcctgcacc 2100
accatcatct ggatcgcgtc ggcgctccac gccgccgtca acttcggcca gtacccgtac 2160
gcggggtacc tcccgaacag gcccacggtg agccggcgcc ggatgccgga gcccggcagc 2220
aaggagtacg aggagctgga gcgcgacccg gagcgcggct tcatccacac catcacgagc 2280
cagatccaga ccatcatcgg catctcgctc atcgagatcc tctccaagca ctcctccgac 2340
gaggtgtacc tcggccagcg cgacaccccc gagtggacct ccgacgcccg ggcgctggcg 2400
gcgttcaaga ggttcagcga cgcgctggtc aagatcgagg gcaaggtggt gggcgagaac 2460
cgcgacccgc agctgaggaa caggaacggc cccgccgagt tcccctacat gctgctctat 2520
cccaacacct ctgaccacag tggcgccgcc gcagggctca ctgccaaggg catccccaac 2580
agcatctcca tctga 2595
<210> 25
<211> 864
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 25
Met Leu Ser Gly Ile Ile Asp Gly Leu Thr Gly Ala Asn Lys His Ala
1 5 10 15
Arg Leu Lys Gly Thr Val Val Leu Met Arg Lys Asn Val Leu Asp Leu
20 25 30
Asn Asp Phe Gly Ala Thr Val Val Asp Ser Ile Ser Glu Phe Leu Gly
35 40 45
Lys Gly Val Thr Cys Gln Leu Ile Ser Ser Thr Leu Val Asp Ala Asn
50 55 60
Asn Gly Asn Arg Gly Arg Val Gly Ala Glu Ala Asn Leu Glu Gln Trp
65 70 75 80
Leu Thr Ser Leu Pro Ser Leu Thr Thr Gly Glu Ser Lys Phe Gly Val
85 90 95
Thr Phe Asp Trp Glu Val Glu Lys Leu Gly Val Pro Gly Ala Val Val
100 105 110
Val Lys Asn Asn His Ala Ala Glu Phe Phe Leu Lys Thr Ile Thr Leu
115 120 125
Asp Asp Val Pro Gly Arg Gly Ala Val Thr Phe Val Ala Asn Ser Trp
130 135 140
Val Tyr Pro Ala Gly Lys Tyr Arg Tyr Asn Arg Val Phe Phe Ser Asn
145 150 155 160
Asp Thr Tyr Leu Pro Ser Gln Met Pro Ala Ala Leu Lys Pro Tyr Arg
165 170 175
Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gln Gln Gly Pro Tyr
180 185 190
Gln Glu His Asp Arg Val Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr Asn Asp Leu Gly
195 200 205
Glu Pro Asp Gly Gly Asn Pro Arg Pro Ile Leu Gly Gly Ser Ala Asp
210 215 220
His Pro Tyr Pro Arg Arg Cys Arg Thr Gly Arg Lys Pro Thr Lys Thr
225 230 235 240
Asp Pro Asn Ser Glu Ser Arg Leu Ser Leu Val Glu Gln Ile Tyr Val
245 250 255
Pro Arg Asp Glu Arg Phe Gly His Leu Lys Met Ser Asp Phe Leu Gly
260 265 270
Tyr Ser Ile Lys Ala Ile Thr Gln Gly Ile Ile Pro Ala Val Arg Thr
275 280 285
Tyr Val Asp Thr Thr Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Gln Asp Ile Ile
290 295 300
Asn Leu Tyr Glu Gly Gly Ile Lys Leu Pro Lys Ile Gln Ala Leu Glu
305 310 315 320
Asp Met Arg Lys Leu Phe Pro Leu Gln Leu Val Lys Asp Leu Leu Pro
325 330 335
Ala Gly Gly Asp Tyr Leu Leu Lys Leu Pro Ile Pro Gln Ile Ile Gln
340 345 350
Glu Asp Lys Asn Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Val
355 360 365
Leu Ala Gly Val Asn Pro Met Val Ile Thr Arg Leu Thr Glu Phe Pro
370 375 380
Pro Lys Ser Thr Leu Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Asp His Thr Ser Thr
385 390 395 400
Ile Thr Ala Glu His Ile Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr Val Gln
405 410 415
Gln Ala Leu Asp Gly Asn Arg Leu Tyr Ile Leu Asp His His Asp Arg
420 425 430
Phe Met Pro Phe Leu Ile Asp Val Asn Asn Leu Glu Gly Asn Phe Ile
435 440 445
Tyr Ala Thr Arg Thr Leu Phe Phe Leu Arg Gly Asp Gly Arg Leu Ala
450 455 460
Pro Leu Ala Ile Glu Leu Ser Glu Pro Tyr Ile Asp Gly Asp Leu Thr
465 470 475 480
Val Ala Lys Ser Lys Val Tyr Thr Pro Ala Ser Ser Gly Val Glu Ala
485 490 495
Trp Val Trp Gln Leu Ala Lys Ala Tyr Val Ala Val Asn Asp Ser Gly
500 505 510
Trp His Gln Leu Val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu
515 520 525
Pro Phe Val Ile Ala Thr Asn Arg Gln Leu Ser Val Thr His Pro Val
530 535 540
His Lys Leu Leu Ser Ser His Phe Arg Asp Thr Met Thr Ile Asn Ala
545 550 555 560
Leu Ala Arg Gln Thr Leu Ile Asn Gly Gly Gly Ile Phe Glu Met Thr
565 570 575
Val Phe Pro Gly Lys Tyr Ala Leu Gly Met Ser Ser Val Val Tyr Lys
580 585 590
Ser Trp Asn Phe Thr Glu Gln Gly Leu Pro Ala Asp Leu Val Lys Arg
595 600 605
Gly Val Ala Val Ala Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Lys Val Arg Leu Leu
610 615 620
Ile Glu Asp Tyr Pro Tyr Ala Ser Asp Gly Leu Ala Ile Trp His Ala
625 630 635 640
Ile Glu Gln Trp Val Gly Glu Tyr Leu Ala Ile Tyr Tyr Pro Asp Asp
645 650 655
Gly Ala Leu Arg Gly Asp Glu Glu Leu Gln Ala Trp Trp Lys Glu Val
660 665 670
Arg Glu Val Gly His Gly Asp His Lys Asp Ala Pro Trp Trp Pro Lys
675 680 685
Met Gln Ala Val Ser Glu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Thr Ile Ile Trp
690 695 700
Ile Ala Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gln Tyr Pro Tyr
705 710 715 720
Ala Gly Tyr Leu Pro Asn Arg Pro Thr Val Ser Arg Arg Arg Met Pro
725 730 735
Glu Pro Gly Ser Lys Glu Tyr Glu Glu Leu Glu Arg Asp Pro Glu Arg
740 745 750
Gly Phe Ile His Thr Ile Thr Ser Gln Ile Gln Thr Ile Ile Gly Ile
755 760 765
Ser Leu Ile Glu Ile Leu Ser Lys His Ser Ser Asp Glu Val Tyr Leu
770 775 780
Gly Gln Arg Asp Thr Pro Glu Trp Thr Ser Asp Ala Arg Ala Leu Ala
785 790 795 800
Ala Phe Lys Arg Phe Ser Asp Ala Leu Val Lys Ile Glu Gly Lys Val
805 810 815
Val Gly Glu Asn Arg Asp Pro Gln Leu Arg Asn Arg Asn Gly Pro Ala
820 825 830
Glu Phe Pro Tyr Met Leu Leu Tyr Pro Asn Thr Ser Asp His Ser Gly
835 840 845
Ala Ala Ala Gly Leu Thr Ala Lys Gly Ile Pro Asn Ser Ile Ser Ile
850 855 860
<210> 26
<211> 717
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 26
atggccgccg cgctcaggtg cccggcctcc gtcagggtct cgggccccgc cgccgcgggg 60
ctcgccaagg tgcgccaggc gtccagagtc gtcgcggtga gcggggcccg gcagagccgc 120
ggcggcggcg tcgccgtgcg ggcgtcgctg ttctcgccca agcccgcggc ggccaaggac 180
gcgcggccga ccaaggtgca ggagctgtac gtgtacgaga tcaacgagcg ggaccgcgag 240
agccccgcgt acctgcgcct cagcgccaag cagacggaga acgcgctggg cgacctcgtc 300
cccttcacca acaaggtgta caacggcagc ctggacaagc ggctgggcgt caccgcgggc 360
atctgcgtgc tcatccagca cgtccccgac cgcaacggcg accgctacga ggccatctac 420
agcttctact tcggagacta cggccacatc tcggtgcagg gcccgtacct gacctacgag 480
gagtcgtacc tggcggtcac cggcggctcc ggcgtcttcg agggcgtcta cggccaggtc 540
aagctcaacc agatcgtctt ccccttcaag atcttctaca ccttctacct ccggggcatc 600
ccggacctgc ccagggacct gctctgcacg cccgtcccgc cgtcgcccac cgtcgagccc 660
acccccgccg ccagggccgc cgagccgcac gcatccctcg acaactacac caactga 717
<210> 27
<211> 238
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 27
Met Ala Ala Ala Leu Arg Cys Pro Ala Ser Val Arg Val Ser Gly Pro
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Leu Ala Lys Val Arg Gln Ala Ser Arg Val Val Ala
20 25 30
Val Ser Gly Ala Arg Gln Ser Arg Gly Gly Gly Val Ala Val Arg Ala
35 40 45
Ser Leu Phe Ser Pro Lys Pro Ala Ala Ala Lys Asp Ala Arg Pro Thr
50 55 60
Lys Val Gln Glu Leu Tyr Val Tyr Glu Ile Asn Glu Arg Asp Arg Glu
65 70 75 80
Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Leu Ser Ala Lys Gln Thr Glu Asn Ala Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Val Pro Phe Thr Asn Lys Val Tyr Asn Gly Ser Leu Asp
100 105 110
Lys Arg Leu Gly Val Thr Ala Gly Ile Cys Val Leu Ile Gln His Val
115 120 125
Pro Asp Arg Asn Gly Asp Arg Tyr Glu Ala Ile Tyr Ser Phe Tyr Phe
130 135 140
Gly Asp Tyr Gly His Ile Ser Val Gln Gly Pro Tyr Leu Thr Tyr Glu
145 150 155 160
Glu Ser Tyr Leu Ala Val Thr Gly Gly Ser Gly Val Phe Glu Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Gln Val Lys Leu Asn Gln Ile Val Phe Pro Phe Lys Ile Phe
180 185 190
Tyr Thr Phe Tyr Leu Arg Gly Ile Pro Asp Leu Pro Arg Asp Leu Leu
195 200 205
Cys Thr Pro Val Pro Pro Ser Pro Thr Val Glu Pro Thr Pro Ala Ala
210 215 220
Arg Ala Ala Glu Pro His Ala Ser Leu Asp Asn Tyr Thr Asn
225 230 235
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 28
taccatgttc cctagggatt g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 29
gtggcgcaat cactttaacc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 30
atctcgttgg ggatgtcttg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 31
agcaccgttc aaatgtctcc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 32
tattgttggt gctgttgccg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 33
ggactcaatc cttgtccctg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 34
cccgagcacg taaagcagat 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 35
cttcatgccc ctggcatact 20
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 36
gacgaggacg acgataagga ctt 23
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 37
ggccatactc cttctgaaga gacag 25
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 38
atggccgagc tcatcaacaa 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 39
tcgtcctcac ctccgtctgt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 40
tgttcctccg gatcatctgc 20
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 41
aagaggctgt cccaccgct 19
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 42
ccatttcgac tgggaggtcc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 43
gtccatgctc accttccagc 20
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 44
aagttcaaca ccataggact cgatg 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 45
caggtagcta gagcctgaag tggtc 25
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 46
ggctgggttc cgtgactaca 20
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 47
gacctcgatg atggacggg 19
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 48
ggaagaggat gaacgagctc aa 22
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 49
gacccagcag attcatcgat g 21
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 50
gggaccagtt cggcaacat 19
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 51
tgcccacctt ccacacgt 18
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 52
cagcaggtgg tggtgataat 20
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 53
agcgccagac tcacaaagg 19
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 54
gcccacccaa gtaagcttcg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 55
agagacagcg ataggatgga 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 56
catcgtgtgc cagtactacc 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 57
accggtcatt cgtcacaagc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 58
gcctcatagt tcccgacctc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 59
gaatcctcgt gaagctcgtg 20
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 60
cctcatgatg tgggtgcag 19
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 61
atgcatgaca aggccagact 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 62
aaaaacatgg gacctcgtga 20
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 63
attgcatgac gacaatgcta ga 22
<210> 64
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 64
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggctgct caccagcctc acct 54
<210> 65
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 65
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gctcaagaga actctgggtg gcaa 54

Claims (15)

1.一种产生具有增加的真菌抗性的植物的方法，其中所述真菌抗性由至少一种壁相关激酶调节，所述方法包括：
(i)(a)提供至少一个具有基因型的植物细胞、组织、器官或整株植物，所述基因型与在所述植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中至少一个编码壁相关激酶的基因的存在相关；或
(i)(b)将至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因导入植物细胞、组织、器官或整株植物的至少一种的至少一个细胞的基因组中；和
(ii)(a)在所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中修饰至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因；和/或
(ii)(b)在所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中调节至少一种壁相关激酶的表达水平和/或从所述至少一种壁相关激酶到合成至少一种苯并恶唑嗪酮类合成的信号传导途径内或至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径内的至少一种分子的转录水平、表达水平或功能；
(iii)从所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物中产生植物群体，以及
(iv)从该群体中选择具有增强的真菌抗性的植物，任选地基于对响应于真菌病原体感染的至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成减少的确定，其中所述至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成受所述至少一种壁相关激酶的调控。
2.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种壁相关激酶是WAK-RLK1基因，优选选自Htn1、Ht2或Ht3或其等位基因变体、其突变体或功能片段、或编码其的基因，优选其中所述至少一种壁相关激酶
a)由包含SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列的核酸分子或其功能片段编码，
b)由包含与SEQ ID NO：1或7的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的核苷酸序列的核酸分子编码，所述序列相同性优选在序列的整个长度上，
c)由在严格条件下与a)或b)的互补序列杂交的核酸分子编码，
d)由包含编码SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列或其功能片段的核苷酸序列的核酸分子编码，
e)由包含编码与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子编码，所述序列相同性优选在序列的整个长度上，
f)包含SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列，或
g)包含与SEQ ID NO：2或8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列，所述序列相同性优选在序列的整个长度上，
条件是a)至g)中的任何序列，任选地在表达后，仍编码至少一个功能性Htn1、Ht2或Ht3或其等位基因变体、突变体或功能片段。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中其合成受所述至少一种壁相关激酶调控的苯并恶唑嗪酮类选自以下至少一种：DIM2BOA、DIMBOA、HMBOA、HM2BOA、HDMBOA、HDM2BOA、HBOA、DHBOA、DIBOA或TRIBOA，葡萄糖苷或糖苷配基形式的前述苯并恶唑嗪酮类，或苯并恶唑啉酮，或前述苯并恶唑嗪酮类的任意组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中其抗性增加的真菌抗性，或由所述真菌引起的疾病选自格孢腔菌(Pleosporales)目的真菌，包括引起玉米大斑病(NCLB)，特别是影响玉米和小麦植物的大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum)，或包括引起南部玉米叶枯病的玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)，引起锈病的Pucciniales目，包括引起常见锈病的高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)，或引起Diploida叶条纹/枯萎的Diploidamacrospora或引起炭疽病的禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)，或镰刀菌属(Fusarium spp.)，优选引起镰刀菌茎腐烂的Fusarium verticilioides，或赤霉菌属(Gibberella spp.)，例如引起赤霉茎腐病的玉米赤霉菌(Gapberella zeae)，或引起玉米丝黑穗病的丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因被稳定地整合到所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中，或所述编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因被瞬时导入所述植物细胞、组织、器官或整株植物中，或其中所述编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因被稳定地整合到所述至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物的基因组中，其中所述编码至少一种壁相关激酶的至少一个基因的引入包括植物育种期间所述至少一个基因的渐渗。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在从所述至少一种壁相关激酶到合成至少一种苯并恶唑嗪酮类的信号传导途径内或在至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径中的所述至少一种分子选自由以下组成的组：基因bx1(SEQ ID NO：10)、bx2(SEQ ID NO：12)、igl(SEQ ID NO：14)、bx6(SEQ ID NO：16)、bx11(SEQ ID NO：18)、bx14(SEQ ID NO：20)、opr2(SEQ ID NO：22)、lox3(SEQ ID NO：24)或aoc1(SEQ ID NO：26)或其同源基因，或蛋白BX1(SEQ ID NO：11)、BX2(SEQ ID NO：13)、IGL(SEQ ID NO：15)、BX6(SEQ ID NO：17)、BX11(SEQ ID NO：19)、BX14(SEQ ID NO：21)、OPR2(SEQ ID NO：23)、LOX3(SEQ ID NO：25)或AOC1基因(SEQ ID NO：27)或其同源物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过提供至少一种壁相关激酶、其等位基因变体、突变体或功能片段或编码其的基因，来实现至少一种苯并恶唑嗪酮类的减少的合成，其中所述至少一种壁相关激酶包含可直接或间接影响苯并恶唑嗪酮类途径和至少一种额外的植物代谢途径优选疾病抗性相关途径的序列，其中所述植物代谢途径选自由以下组成的组：茉莉酸途径、乙烯途径、木质素合成途径、防御途径、受体样激酶途径、细胞壁相关途径。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(ii)(a)或(ii)(b)中对至少一个编码至少一种壁相关激酶的基因的修饰是通过至少一种位点特异性核酸酶(SSN)或其催化活性片段或编码其的核苷酸序列、寡核苷酸定向诱变、化学诱变或TILLING来进行的。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(i)中提供的至少一个植物细胞、组织、器官或整株植物选自由以下组成的组：大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、双色高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉蜀黍属(Zea spp.)包括玉米(Zea mays)、小米(Setaria italic)、小粒稻(Oryza minuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malus domestica)、紫短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucus glochidiatus、甜菜属(Betaspp.)包括甜菜(Beta vulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、Erythrante guttata、螺旋狸藻(Genlisea aurea)、黄瓜(Cucumis sativus)、川桑(Morus notabilis)、Arabidopsisarenosa、深山南芥(Arabidopsis lyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursapastoris)、Olmarabidopsis pumila、筷子芥(Arabis hirsute)、欧洲油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassica oeleracia)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassica nigra)、Eruca vesicaria subsp.sativa、甜橙(Citrus sinensis)、麻风树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、山下鹰嘴豆(Cicer yamashitae)、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、网状鹰嘴豆(Cicer reticulatum)、Cicer judaicum、木豆(Cajanuscajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉属(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotusjaponicas)、夏堇(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、蒜(Allium sativum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthus tuberosus)和韭菜(Allium tuberosum)，或属于上述植物之一的任何变种或亚种，优选其中步骤(i)中所述植物细胞、组织、器官或整株植物选自玉米或小麦属，或属于上述植物之一的任何变种或亚种
10.植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代，其可通过根据权利要求1至9中任一项的方法获得。
11.一种鉴定在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中参与增加的病原体抗性，优选参与增加的真菌抗性的至少一个基因的方法，所述方法包括：
(i)确定所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因型，所述基因型与在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的基因组中编码壁相关激酶的至少一个基因的存在相关；
(ii)任选地：确定步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的苯并恶唑嗪酮类特征；
(iii)将步骤(i)或(ii)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料暴露于刺激下，任选地其中所述刺激与所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的苯并恶唑嗪酮类特征相关，优选其中所述刺激与真菌病原体感染相关；
(iv)在暴露于刺激后，对从步骤(i)或(ii)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料获得的至少一种分析物进行分析；
(v)，确定在所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的至少一个细胞中在暴露于根据步骤(iii)的刺激后受到调控的至少一个基因，其可从步骤(iv)中定义的至少一种分析物的分析推导出，
(vi)对步骤(v)中所确定的所述至少一个基因进行功能表征；和
(vii)提供在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中参与增加的病原体抗性，优选增加的真菌抗性的至少一个基因。
12.植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代，其通过将根据权利要求11所述的方法提供的至少一个基因引入植物细胞、组织、器官、或整株植物中至少一种的至少一个细胞中而可获得。
13.如权利要求12所述的可获得的植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料或其衍生物或后代，其中通过权利要求11所述的方法提供的至少一个基因的引入是稳定的引入，优选由常规植物育种介导的稳定引入，或由分子生物学的手段介导的稳定引入，包括基因组编辑，或它们的组合。
14.一种在植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中增加病原体抗性，优选真菌抗性的方法，所述方法包括：
(i)提供至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料；
(ii)(a)用中和至少一种苯并恶唑嗪酮类的作用的物质处理根据步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料，和/或
(ii)(b)用活化至少一种壁相关激酶下游信号传导途径的物质处理根据步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料；和/或
(ii)(c)用修饰或调节步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料的至少一个基因的至少一个启动子或至少一个调控序列的物质处理根据步骤(i)的所述至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料，其中所述至少一个启动子或至少一个调控序列参与调节参与至少一种壁相关激酶的信号传导途径或至少一种壁相关激酶下游或参与至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成途径的至少一个基因的转录；
(ii)(d)用抑制至少一种苯并恶唑嗪酮类的合成的物质处理根据步骤(i)的至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料；
(iii)在至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中减少至少一种苯并恶唑嗪酮类的量，并从而增加病原体抗性，优选地为真菌抗性。
15.权利要求14定义的物质用于在至少一个植物细胞、组织、器官、整株植物或植物材料中提高病原体抗性，优选真菌抗性的用途。
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