CN110699357B

CN110699357B - 纹枯病菌微小rna、其对玉米基因的调控作用及其应用

Info

Publication number: CN110699357B
Application number: CN201911089937.XA
Authority: CN
Inventors: 李晓明; 储昭辉; 孟红绪; 丁香玉
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN110699357A

Abstract

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一个立枯丝核菌致病力相关的微小RNA(microRNA)Rhi‑milR‑9829‑5p对玉米基因GRMZM2G412674的调控作用及其应用。在纹枯病菌侵染玉米的过程中，Rhi‑milR‑9829‑5p的表达量发生显著变化，并且与玉米基因GRMZM2G412647的表达量呈现较高程度的线性负相关。利用双荧光素酶报告系统，验证了玉米基因GRMZM2G412647的表达受到Rhi‑milR‑9829‑5p的负调控。这证明Rhi‑milR‑9829‑5p能够调控玉米基因的表达，为微小RNA参与跨物种分子调控提供了证据，有可能应用于玉米抗纹枯病的分子育种。

Description

纹枯病菌微小RNA、其对玉米基因的调控作用及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及纹枯病菌微小RNA、其对玉米基因的调控作用及其应用。

背景技术

玉米是我国重要的粮食作物，随着种植面积不断扩大，农药化肥使用量不断增加，病虫害越来越成为玉米增产的限制因素。其中，由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的玉米纹枯病，是玉米生产最常见的真菌病害之一，在部分地区已成为玉米生产的第一大病害，个别田块和品种发病率甚至达到100％(贾雷娜等，2013，安徽农学通报，19:64,79)，严重影响了玉米的品质和产量。通过遗传改良提高玉米抗病性是解决这一农业问题的有效途径之一，而纹枯病菌-玉米互作调控机制的阐明，将为通过分子育种培育抗病品种提供理论依据。

在长期的进化过程中，植物的免疫系统和病原菌的致病能力互相博弈并各自完善。病原菌入侵植物后，若植物产生免疫反应，则能够抑制死病原菌生长；反之，病原菌在植物体内繁殖，则会引起相应病症。植物的先天免疫系统由两个主要的免疫反应组成，即病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP)激发的免疫反应(PTI)和效应蛋白(effector)激发的免疫反应(ETI)。目前，在革兰氏阴性菌中已鉴别出鞭毛蛋白(flg22)、脂多糖等可作为病原相关分子激发PTI反应，而真菌中的麦角甾醇、几丁质等也有类似功能(Nürnberger等，2004，Immunol.Rev.198:249-266；Zipefel等，2005，Curr.Opin.Plant Biol.8:353-360)。同时，植物中发现了大量编码抗病效应蛋白的抗病基因，如Hm1、Rpg1、Mla1等，它们能够激活特异性防卫反应的信号转导系统(Jones和Dangl，2006，Nature444:323-329)。相应地，病原菌也进化出一系列的致病机制来应对植物的防御反应。通常病原菌会分泌一些效应蛋白来应对植物的防御反应，如AvrPtoB(Xiang等，2011，Mol.Plant Microbe Interact.24:100-107)、T3SS HopF2、HopAI1(Wang等，2010，PlantCell22:2033-2044)等，这些效应因子是毒性因子或毒性效应蛋白，通过干扰寄主的正常生理功能提高病原菌的致病力。

MicroRNA(miRNA)是一类非编码的单链小分子RNA，长度一般为18-25nt，广泛存在于动物、植物及低等真核生物的基因组中。它可以通过与靶基因的mRNA结合，引起靶基因mRNA的降解或者阻止mRNA的翻译，从而在转录或者转录后水平上对靶基因发挥负调控作用。一般来说，当miRNA与靶基因mRNA完全互补时，miRNA会促使mRNA被降解；当miRNA与靶基因mRNA不完全互补时，则会抑制mRNA的翻译过程(Wahid等，2010，Biochim.Biophys.Acta.1803:1231-1243；Mallory和Bouché，2008，Trends in PlantSci.13:359-367)。由此可见，miRNA作为基因调控路径中的一类负调控子，能够在转录后水平直接控制下游靶基因的表达量。

目前越来越多的研究表明，miRNA参与了真菌与寄主的互作调控过程(Zhang等，2011，Mol.Cell 42:356-366)。一方面，植物体内miRNA的表达受到病原调控。利用高通量测序技术，Yin等(Yin等，2012，PLoS One 7：e35765)发现棉花中miR482、miR1444和miR2118等65个miRNA受到黄萎病病菌(Verticillium dahliae)侵染的诱导或抑制。Chen等(Chen等，2012，Planta 235:873-883)在北京杨(Populus beijingensis)中鉴定出74个保守性miRNA和27个新miRNA的表达量受到溃疡菌(Dothiorella gregaria)的调控。虽然miRNA同一家族不同成员之间的核酸序列大体一致，但在同一致病环境下存在不同的表达调控方式。例如miR166家族在毛果杨中有16个成员，在受到葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的侵染时，其中13个成员(miR166a-m)的表达量在接种后3天、5天、7天呈现连续上升的趋势，而miR166n、miR166o和miR166q的表达量则呈现先上升后下降的变化趋势(Zhao等，2012，PLoSOne 7：e44968)。以上研究表明miRNA不仅应答植物真菌病害胁迫，而且参与真菌与植物的互作调控过程。另一方面，随着真菌中越来越多的miRNA被发现(Jiang等，2012，PLoS One7：e52734；Lau等，2013，PLoS Negl.Trp.Dis.7:e2398；Raman等，2013，BMC Genomics 14:326)，真菌自身的miRNA也被发现通过直接调控寄主靶基因参与致病过程。Weiberg等(Weiberg等，2013，Science 342:118-123)发现灰霉菌(Botrytis cinerea)中的miRNA能够通过干扰拟南芥、烟草等寄主中的RNAi途径抑制寄主抗性，增强其自身的致病力。该研究首次证明真菌中miRNA能够作为效应因子直接作用于寄主中的靶基因从而调控真菌-寄主的互作，但相关机制在其它物种与病原菌互作中尚未得到证实。因此，研究miRNA在纹枯菌与玉米的互作过程中的调控机制，能够为验证病原miRNA作为广谱致病因子提供实验证据，并有望为玉米耐/抗病的转基因分子育种提供新的育种设计方案。

目前，Zheng等(Zheng等，2013，Nat.Commun.4:1424-1433)应用全基因组鸟枪法测序，得到了纹枯菌(AG1 IA)中6452个重叠群序列(contig sequences)，并对其中6156个基因进行了功能注释，发现257个与病原菌-寄主互作有关的基因。这些序列信息为纹枯菌中miRNA的生物信息学预测及靶基因分析提供了依据。而玉米B73自交系作为纹枯病的感病品系，其全基因组测序已经完成。应用新兴的大规模测序技术和全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)，研究者已经在水稻(Silva等，2012，Theor.Appl.Genet.124:63-74)、玉米(Kump等，2011，Nat.Genet.43:163-168)中对纹枯菌侵染过程中所有基因的表达量进行了检测，建立了此过程中受诱导和抑制基因的表达谱。这为我们寻找纹枯菌miRNA在玉米中的靶基因进而研究纹枯菌miRNA对玉米基因的表达调控奠定了理论基础。

miRNA及其靶基因则为利用转基因技术进行作物改良提供了新的丰富候选资源，目前基于miRNA机制的转基因技术成为新的研究热点。植物miRNA应用于作物抗病育种具有明显优势：(1)许多基因在植物体内存在冗余现象，单纯敲除或过量表达某个基因并不能明显改变植物性状，而miRNA由于特异性地与靶向序列结合，因而可以一次性调控整个家族基因的表达；(2)miRNA在不同物种中具有高度保守性，因此不仅能够调控自身基因的表达，还能作为效应因子直接作用于其它物种的靶基因而发挥自身功能。应用这一特性选择合适的目的miRNA转化植物，可以从调控植物和致病菌的基因表达两个方面影响植物抗病性，大大提高抗病效率；(3)miRNA序列与调控靶基因序列并不是完全匹配，即使发生少数碱基的错配miRNA依然能发挥对靶基因的调控作用，因而，即使致病菌的保守功能区发生突变，miRNA依然能保持对致病菌的抗性；(4)在实际育种应用中，miRNA并不是只能负向调控基因表达，应用miRNA Target Mimics、超表达miRNA-resistant tagerts等技术，可以使目的靶基因的表达量升高。基于以上几点，miRNA技术已被成功应用于水稻(Carbonell等，2015，PlantJ.82:1061-1075)，马铃薯(Chi等，2014，BMC Plant Biol.14:62)、棉花(Ali等，2013，Virol.J.10:231)等多种作物的抗病毒品种培育研究中。miRNA在植物分子育种中有广阔的应用前景，研究miRNA在植物-病原菌互作中的作用，进而筛选可用于玉米抗病分子育种的候选miRNA具有重要的理论价值和实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一个立枯丝核菌致病力相关的微小RNA Rhi-milR-9829-5p，所述微小RNA Rhi-milR-9829-5p对玉米基因GRMZM2G412674的调控作用，以及其在玉米抗纹枯病方面的应用。

作为本发明的第一个目的，在于提供了纹枯病菌微小RNA Rhi-milR-9829-5p，其序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

所述纹枯病菌具体为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。

本发明提供了从立枯丝核菌中分离出的微小RNA Rhi-milR-9829-5p的非编码RNA片段，通过特殊设计的引物利用茎环式荧光定量PCR检测了纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p在立枯丝核菌侵染玉米叶鞘过程中的表达量变化，所用引物5'-TTCTTGGTGAGTCGGCATGCC-3'其序列如SEQ ID NO.6所示。发现在侵染过程中，Rhi-milR-9829-5p的表达量变化显著。

作为本发明的第二个目的，在于提供了微小RNA Rhi-milR-9829-5p对玉米基因GRMZM2G412674的调控作用，所述玉米基因GRMZM2G412674的完整序列如序列表SEQ IDNO.2所示。

具体的，所述微小RNA Rhi-milR-9829-5p对玉米基因GRMZM2G412674的调控作用，编码序列如序列表SEQ ID NO.3所示，编码氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，3'非编码区(3'UTR)序列如序列表SEQ ID NO.5所示。Rhi-milR-9829-5p在纹枯病菌侵染玉米叶鞘的过程中，表达量发生显著变化，并且对玉米基因GRMZM2G412674有较为显著的抑制作用，可见纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p能够调控玉米基因的表达，从而参与玉米-纹枯病菌的互作。

玉米基因GRMZM2G412674的片段来源于玉米B73，其通过特殊设计的引物利用荧光定量PCR检测其表达，其中所述的引物包括引物1，5′-AGATGGAGGTCTTAAAACCGTT-3′其序列如序列表SEQ ID NO.7所示，引物2，5′-CTTGCGCTTGTTTGGTATGATA-3′其序列如序列表SEQID NO.8所示。利用荧光定量PCR技术检测了GRMZM2G412674在纹枯病菌侵染玉米叶鞘的过程中的表达量，发现其表达量变化显著。应用SPSS软件，对立枯丝核菌Rhi-milR-9829-5p和玉米GRMZM2G412674在不同侵染时间点的表达量进行了相关性分析，发现二者呈现较强的负相关，相关系数r＝-0.657。由此推测，在纹枯病菌侵染玉米的过程中，玉米基因GRMZM2G412674的表达可能受到纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p的负调控。

通过特殊设计的引物扩增玉米基因GRMZM2G412674的3'UTR片段，将其与合适的荧光素酶报告载体连接，所用引物1，5'-ATGGCAGCATGAACCCCATAG-3'，其序列如序列表SEQ IDNO.9所示，引物2，5'-ACTAGCGGCTGTACTTCCTATCC-3'，其序列如序列表SEQ ID NO.10所示。在获得了纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p片段和玉米基因GRMZM2G412674的3‘UTR片段之后，将其分别与合适的荧光素酶报告载体连接，共同转入烟草细胞后，发现玉米基因GRMZM2G412674的荧光素酶信号强度被显著抑制。由此证明Rhi-milR-9829-5p对玉米基因GRMZM2G412674有显著的抑制作用。

作为本发明的第三个目的，在于提供微小RNA Rhi-milR-9829-5p在玉米抗纹枯病中的应用。由于本发明验证了一个纹枯病菌微小RNA对玉米基因的调控功能，证明了真菌的微小RNA可以参与真菌-植物互作，未来可能通过转基因、基因编辑等技术手段可能应用于玉米抗纹枯病的分子育种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一个立枯丝核菌致病力相关的微小RNA Rhi-milR-9829-5p对玉米基因GRMZM2G412674的调控作用，Rhi-milR-9829-5p可以显著抑制玉米基因GRMZM2G412674的表达；

(2)本发明验证了一个纹枯病菌微小RNA对玉米基因的调控功能，证明了真菌的微小RNA可以参与真菌-植物互作，未来可能通过转基因、基因编辑等技术手段可能应用于玉米抗纹枯病的分子育种。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为侵染玉米过程中纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p的表达检测；

图2为接种纹枯病菌YWK196后GRMZM2G412674基因的表达检测；

图3为荧光素酶报告系统检测Rhi-milR-9829-5p对GRMZM2G412674的调控作用；

图4为纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p与玉米基因GRMZM2G412674的互作位点分析。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术。

实施例1：纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p片段的分离

为了在纹枯病菌中分离Rhi-milR-9829-5p片段，首先提取了培养三天的纹枯病菌菌丝的总RNA，以此总RNA为模板，利用大肠杆菌加腺嘌呤(A)聚合酶为纹枯病菌所有微小RNA添加聚合A尾。以此加A微小RNA为模板，通过特殊设计的引物，利用反转录酶合成Rhi-milR-9829-5p片段，所用引物为5'-TTCTTGGTGAGTCGGCATGCC-3'其序列如SEQ ID NO.6所示。此Rhi-milR-9829-5p片段可用于荧光定量PCR检测其表达量，在添加合适的酶切位点后也可应用于表达载体的构建及转基因分析。

实施例2：纹枯病菌侵染玉米过程中Rhi-milR-9829-5p的表达模式

为了检测在纹枯病菌侵染玉米的过程中Rhi-milR-9829-5p的表达模式，利用茎环式qRT-PCR检测了这个微小RNA的表达，所用引物为5'-TTCTTGGTGAGTCGGCATGCC-3'，其序列如SEQ ID NO.6所示。反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃20s，退火58℃20s，延伸72℃1.5min，反应35个循环。结束后，应用2^-ΔΔCt方法计算Rhi-milR-9829-5p的表达量。分析结果表明，在纹枯病菌侵染玉米的过程中，Rhi-milR-9829-5p被诱导表达，如图1所示，说明其参与了纹枯病菌对玉米的致病过程。

实施例3：接种纹枯病菌YWK196后GRMZM2G412674基因的表达模式

为了检测GRMZM2G412674基因受纹枯病菌诱导的表达模式，利用qRT-PCR检测了这个基因接种病原菌后的表达，所用引物为引物1，5′-AGATGGAGGTCTTAAAACCGTT-3′其序列如序列表SEQ ID NO.7所示,引物2，5′-CTTGCGCTTGTTTGGTATGATA-3′其序列如序列表SEQ IDNO.8所示。反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火56℃40s，延伸72℃40s，反应35个循环。结束后，应用2^-ΔΔCt方法计算GRMZM2G412674基因的表达量。分析结果表明，接种纹枯病菌后，玉米基因GRMZM2G412674的表达量逐渐下降，在24小时略有升高，其后又逐渐下降，在接种5天时达到最低值。玉米GRMZM2G412674的表达趋势与纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p的表达趋势呈现较高程度的负相关，相关系数r＝-0.657，这说明该基因参与了纹枯病菌与玉米的互作过程。

实施例4：纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p抑制玉米基因GRMZM2G412674表达的实验验证

为了构建纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p的表达载体，分别人工合成了Rhi-milR-9829-5p的正向序列和反向序列，正向序列为5'-GGATCCTTCTTGGTGAGTCGGCATGCCACTAGT-3'，其序列如序列表SEQ ID NO.11所示，反向序列为5'-GGTACCGGCATGCCGACTCACCAAGAAGAGCTC-3'，其序列如序列表SEQ ID NO.12所示。所用载体为p1300-35S-X，正向序列插入多克隆位点5’BamHI---SpeI 3’之间，反向序列插入多克隆位点5’SacI---KpnI 3’之间。分别用BamHI、SpeI和SacI、KpnI进行双酶切后，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，直接送到华大基因测序，测得长度为21bp的Rhi-milR-9829-5p片段，具有序列表SEQ IDNO.1的DNA序列，证明Rhi-milR-9829-5p表达载体p1300-35S：：Rhi-milR-9829-5p构建成功。

为了构建玉米基因GRMZM2G412674的荧光素酶报告载体，发明人根据数据库GRMZM2G412674的基因序列设计引物，扩增其3'UTR序列(如序列表SEQ ID NO.5所示)。所用引物1，5'-ATGGCAGCATGAACCCCATAG-3'，其序列如序列表SEQ ID NO.9所示，引物2，5'-ACTAGCGGCTGTACTTCCTATCC-3'，其序列如序列表SEQ ID NO.10所示。提取玉米B73 RNA并通过反转录获得cDNA，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s，反应35个循环，后延伸72℃7min；结束后，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T中(Promega公司)，转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序由华大基因完成，获得长度为919bp的GRMZM2G412674的3'UTR片段，具有序列表SEQ ID NO.5的DNA序列。将上述纯化的cDNA片段通过TA克隆连入荧光素酶报告载体p1300-LUC，热激转化E.coliDH5α感受态细胞后对重组子进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测，重组子中包含有与目的片段大小相同的条带。将鉴定好的重组子扩大培养后提取质粒，质粒测序后与原序列比对，连入的片段为全长cDNA并且没有碱基突变和缺失，证明GRMZM2G412674荧光素酶报告载体p1300-LUC：：GRMZM2G412674构建成功。

将p1300-35S：：Rhi-milR-9829-5p和p1300-LUC：：GRMZM2G412674载体共同转化烟草叶片，同时转化pGreenII 0800-Luc载体作为阴性对照。发现玉米基因GRMZM2G412674的荧光强度明显变弱。证明纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p能够抑制玉米基因GRMZM2G412674的表达，如图3所示。

实施例5：纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p与玉米基因GRMZM2G412674的互作位点分析

利用在线软件psRNATarget将纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p序列与玉米B73自交系的全基因组序列进行比对并寻找结合位点，从而预测纹枯病菌Rhi-milR-9829-5p在玉米中的靶基因。发现Rhi-milR-9829-5p可与玉米基因GRMZM2G412674的2080-2100bp的位点结合，如图4所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>山东农业大学

<120>纹枯病菌微小RNA、其对玉米基因的调控作用及其应用

<160>14

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>立枯丝核菌(Rhizcotonia Solani)

<400>1

uucuugguga gucggcaugc c 21

<210>2

<211>2576

<212>DNA

<213>玉米 (Zea mays)

<400>2

ctttattttt cttttttcct tttcatatgt tttctcttct actaggctga aatgggccta 60

ctaggcctta ggtgctcgcc ttaacgcttt aataactatg gtccggaact gaagctgaac 120

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45 50

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70 75 80 85

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90 95 100

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105 110 115

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120 125 130 135

agc aca gga atg gtg ccc tct att gga gta gta cat gat ggc aag tgg tat 1174

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140 145 150

cta aaa ggt cta aat tct cat cgc cag gtc gtg agt gag gtc tat ctt cca 1225

Leu Lys Gly Leu Asn Ser His Arg Gln Val Val Ser Glu Val Tyr Leu Pro

155 160 165 170

gca tcc aaa atg tgg tca gcc acc ggt aat gaa atg gta acg ggc tgg cgg 1276

Ala Ser Lys Met Trp Ser Ala Thr Gly Asn Glu Met Val Thr Gly Trp Arg

175 180 185

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Asn Pro Ser Ile Ser Leu Asn Gly His Leu Tyr Ser Ala Asp Cys Arg Asp

190 195 200

ggc tgt aag ctt cga gtt tat aat aga gag atg gga tca tgg aca agg ttc 1378

Gly Cys Lys Leu Arg Val Tyr Asn Arg Glu Met Gly Ser Trp Thr Arg Phe

205 210 215 220

att gac acc aga cac cat atg gga agc tca cgg tct ctc gaa gcc gca gcc 1429

Ile Asp Thr Arg His His Met Gly Ser Ser Arg Ser Leu Glu Ala Ala Ala

225 230 235

ttt gtc tcc ctt aat ggg aag ctc tgc atc atc cgt aac aat atg agt atc 1480

Phe Val Ser Leu Asn Gly Lys Leu Cys Ile Ile Arg Asn Asn Met Ser Ile

240 245 250 255

act att gtt gat ata ttg gac cca aca aca gct act gag gtc gac agt gcg 1531

Thr Ile Val Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr Ala Thr Glu Val Asp Ser Ala

260 265 270

cgc atg tgg gag gct ttt gct cga aag ggg cag cac aga tca tca ttc atg 1582

Arg Met Trp Glu Ala Phe Ala Arg Lys Gly Gln His Arg Ser Ser Phe Met

275 280 285

gca aac cta tgg tta atc atc aca ggt cgt aat ctg aag aca gac att atg 1633

Ala Asn Leu Trp Leu Ile Ile Thr Gly Arg Asn Leu Lys Thr Asp Ile Met

290 295 300 305

cat tgt cag gtg ctc caa gtt 1654

His Cys Gln Val Leu Gln Val

310

tgagtttgtc catgtatgaa gtggagtata cttacacaac ctcagagcct gacttggaag 1714

ctgaaatggg tacatgagcc ataccaaaga gaccagcttt cgctttgaac tctgtaaata 1774

tccctgattt cgtccttttg aactttctaa ttttggcacc tatctgtcag tgagcttcca 1834

agagattggt cctggggact ggagaaagaa tatgccatgg ctcatgaggc attaagggtt 1894

tgaatggcag catgaacccc ataggtcaga agcgtaggaa gcactgacga aagatggtat 1954

aagcccagag ctggaacaga gcagaggcag ggctattgac tactaaagcc ccagaggtgt 2014

tacttcagtt tggtaaaatg caggtctcca ataacttcca tagaattgat gctttgtttc 2074

agaatggcaa gctgactcat caggaatttg cacaactgat acagttgatg taggccgccg 2134

cacaggttac tgccatgctg tcatacattt tcaggatagg aagtacagcc gctagtttga 2194

aaactcaaat ccccacaatc ctcgagggta tatgagtttc caaactagcc ctgactgtgc 2254

atatcctcct ctatgagttt ccaaactagc cctgactgta catatcctcc tcttggttta 2314

tcagtcatgg gaagtactcg tatgctttat accttgaaat cttccctcct taattattgt 2374

ttgctgagaa atctgtagaa actgatcggt gctatttctg aaaggaaatt ctagacacca 2434

tcgaattatg tgttgctaat aatgcggtct tgtgagaact ttgaaccatg aacatatcga 2494

ctcttatctt atgaatgtca tggccattgg ataatatttg gcagtggttt gatatataaa 2554

tataaaagaa catgtcagct ca 2576

<210>3

<211>942

<212>DNA

<213>玉米 (Zea mays)

<400>3

atggcagaag aatggatcta tgtcttcaaa agggaccgtg atcagaagct atcttggtat 60

gcgtttgatc ctgtaaacca gctctggaag tcattgcctc cagttccacc agagtattct 120

gaagctgttg gttttggtag tgctgttctc aacggatgct atctgtactt atttggcggc 180

aaagacccag tacatggatc tatgaggcgc gttgtatttt acaatgctcg gataaacaaa 240

tggctacgag ctccagatat gctgcaaaaa cggcacttct ttggttcttg tgtcataaac 300

aactgccttt atgttgctgg tggagagtgt gtagggatac agagaattct aagatccgct 360

gaggtatatg atccgaacag gaatagatgg tctagcattg ctgaaatgag cacaggaatg 420

gtgccctcta ttggagtagt acatgatggc aagtggtatc taaaaggtct aaattctcat 480

cgccaggtcg tgagtgaggt ctatcttcca gcatccaaaa tgtggtcagc caccggtaat 540

gaaatggtaa cgggctggcg gaatccaagc atttccctca atgggcatct ttattctgct 600

gattgtcgtg atggctgtaa gcttcgagtt tataatagag agatgggatc atggacaagg 660

ttcattgaca ccagacacca tatgggaagc tcacggtctc tcgaagccgc agcctttgtc 720

tcccttaatg ggaagctctg catcatccgt aacaatatga gtatcactat tgttgatata 780

ttggacccaa caacagctac tgaggtcgac agtgcgcgca tgtgggaggc ttttgctcga 840

aaggggcagc acagatcatc attcatggca aacctatggt taatcatcac aggtcgtaat 900

ctgaagacag acattatgca ttgtcaggtg ctccaagttt ga 942

<210>4

<211>313

<212>PRT

<213>玉米

<400>4

Met Ala Glu Glu Trp Ile Tyr Val Phe Lys Arg Asp Arg Asp Gln Lys Leu

1 5 10 15

Ser Trp Tyr Ala Phe Asp Pro Val Asn Gln Leu Trp Lys Ser Leu Pro Pro

20 25 30

Val Pro Pro Glu Tyr Ser Glu Ala Val Gly Phe Gly Ser Ala Val Leu Asn

35 40 45 50

Gly Cys Tyr Leu Tyr Leu Phe Gly Gly Lys Asp Pro Val His Gly Ser Met

55 60 65

Arg Arg Val Val Phe Tyr Asn Ala Arg Ile Asn Lys Trp Leu Arg Ala Pro

70 75 80 85

Asp Met Leu Gln Lys Arg His Phe Phe Gly Ser Cys Val Ile Asn Asn Cys

90 95 100

Leu Tyr Val Ala Gly Gly Glu Cys Val Gly Ile Gln Arg Ile Leu Arg Ser

105 110 115

Ala Glu Val Tyr Asp Pro Asn Arg Asn Arg Trp Ser Ser Ile Ala Glu Met

120 125 130 135

Ser Thr Gly Met Val Pro Ser Ile Gly Val Val His Asp Gly Lys Trp Tyr

140 145 150

Leu Lys Gly Leu Asn Ser His Arg Gln Val Val Ser Glu Val Tyr Leu Pro

155 160 165 170

Ala Ser Lys Met Trp Ser Ala Thr Gly Asn Glu Met Val Thr Gly Trp Arg

175 180 185

Asn Pro Ser Ile Ser Leu Asn Gly His Leu Tyr Ser Ala Asp Cys Arg Asp

190 195 200

Gly Cys Lys Leu Arg Val Tyr Asn Arg Glu Met Gly Ser Trp Thr Arg Phe

205 210 215 220

Ile Asp Thr Arg His His Met Gly Ser Ser Arg Ser Leu Glu Ala Ala Ala

225 230 235

Phe Val Ser Leu Asn Gly Lys Leu Cys Ile Ile Arg Asn Asn Met Ser Ile

240 245 250 255

Thr Ile Val Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr Ala Thr Glu Val Asp Ser Ala

260 265 270

Arg Met Trp Glu Ala Phe Ala Arg Lys Gly Gln His Arg Ser Ser Phe Met

275 280 285

Ala Asn Leu Trp Leu Ile Ile Thr Gly Arg Asn Leu Lys Thr Asp Ile Met

290 295 300 305

His Cys Gln Val Leu Gln Val

310

<210>5

<211>942

<212>DNA

<213>玉米 (Zea mays)

<400>5

gtttgtccat gtatgaagtg gagtatactt acacaacctc agagcctgac ttggaagctg 60

aaatgggtac atgagccata ccaaagagac cagctttcgc tttgaactct gtaaatatcc 120

ctgatttcgt ccttttgaac tttctaattt tggcacctat ctgtcagtga gcttccaaga 180

gattggtcct ggggactgga gaaagaatat gccatggctc atgaggcatt aagggtttga 240

atggcagcat gaaccccata ggtcagaagc gtaggaagca ctgacgaaag atggtataag 300

cccagagctg gaacagagca gaggcagggc tattgactac taaagcccca gaggtgttac 360

ttcagtttgg taaaatgcag gtctccaata acttccatag aattgatgct ttgtttcaga 420

atggcaagct gactcatcag gaatttgcac aactgataca gttgatgtag gccgccgcac 480

aggttactgc catgctgtca tacattttca ggataggaag tacagccgct agtttgaaaa 540

ctcaaatccc cacaatcctc gagggtatat gagtttccaa actagccctg actgtgcata 600

tcctcctcta tgagtttcca aactagccct gactgtacat atcctcctct tggtttatca 660

gtcatgggaa gtactcgtat gctttatacc ttgaaatctt ccctccttaa ttattgtttg 720

ctgagaaatc tgtagaaact gatcggtgct atttctgaaa ggaaattcta gacaccatcg 780

aattatgtgt tgctaataat gcggtcttgt gagaactttg aaccatgaac atatcgactc 840

ttatcttatg aatgtcatgg ccattggata atatttggca gtggtttgat atataaatat 900

aaaagaacat gtcagctca 919

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ttcttggtga gtcggcatgc c 21

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

agatggaggt cttaaaaccg tt 22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cttgcgcttg tttggtatga ta 22

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

atggcagcat gaaccccata g 21

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

actagcggct gtacttccta tcc 23

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ggatccttct tggtgagtcg gcatgccact agt 33

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ggtaccggca tgccgactca ccaagaagag ctc 33

Claims

1.纹枯病菌微小RNA Rhi-milR-9829-5p，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述纹枯病菌微小RNA Rhi-milR-9829-5p对玉米基因GRMZM2G412674的调控作用，其特征在于，所述玉米基因GRMZM2G412674的序列如序列表SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述纹枯病菌微小RNA Rhi-milR-9829-5p在玉米抗纹枯病中的应用。