CN107805632A - OsMKK6蛋白及编码基因在调控植物种子发育中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种OsMKK6蛋白及编码基因在调控植物种子发育中的应用。本发明所提供的应用具体为OsMKK6蛋白或其相关生物材料在调控植物种子发育中的应用；所述OsMKK6蛋白为如下a1)或a2)所示的蛋白质：a1)由序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a2)在序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物种子发育相关的由a1)衍生的蛋白质。OsMKK6或与OsMKK6相关的生物材料可用于调控植物种子发育情况，对于培育高品质水稻新品种具有重要意义。

Description

OsMKK6蛋白及编码基因在调控植物种子发育中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种OsMKK6蛋白及编码基因在调控植物种子发育中的应用。
背景技术
水稻颖果(caryopsis)是人类最重要的食物来源之一。一粒种子由母体组织果皮(pericarp)和外种皮(testa)以及子代组织胚(embryo)和胚乳(endosperm)等构成。按照基因型来分水稻颖果包含三种不同基因型的组分，果皮、外种皮和珠心组织等二倍体母体组织；三倍体的胚乳和二倍体的子代胚。成熟种子中除了胚和糊粉层细胞之外都是死细胞。种子是由受精的子房发育而来，子房由外珠被、内珠被和珠心组成，其外包裹有果皮。受精两天后外珠被细胞开始退化，而内珠被的退化与水稻品种相关，珠心细胞未来会发育成植物外种皮。研究发现珠心凸起的退化对水稻种子的灌浆非常重要，Yin等报道OsMADS29在珠心凸起处表达，利用RNAi技术降低OsMADS29的表达会导致水稻灌浆异常，产生皱缩的种子(Yin and Xue,2012)。Bai等发现转录因子NF-YB1在糊粉层细胞表达，调控光合产物蔗糖向胚乳的运输(Bai et al.,2015)。
关于水稻胚和胚乳的发育调控，脂质转移蛋白基因OsLTPL36在发育中的种皮和胚乳糊粉层细胞表达。OsLTPL36-RNAi转基因植物造成种子白垩化严重，并且胚的发育延迟(Wang et al.,2015b)。DNA甲基化参与调控种子发育，MeDIP-seq(methylcytosineimmunoprecipitation DNA sequencing)检测发现发育中的胚转座子甲基化程度比胚乳高，胚乳发育早期(受精两天到三天)甲基化水平低，推测在胚乳发育早期存在去甲基化过程，而且在种子发育过程中胚和胚乳的甲基化水平变化很大(Xing etal.,2015)。Giant embryo编码一个CYP78A亚家族的P450单加氧酶。Giant embryo突变体胚增大，而且因其不能维持茎顶端分生组织的正常功能，突变体胚后发育迟缓；超表达株系生长旺盛，产量提高，但是会导致胚变小；因此该基因参与了水稻胚和胚乳的发育调控(Yanget al.,2013)。
MAPK级联参与植物生长发育、抗病和抗逆等多个过程。MAPK级联包括三个层级的蛋白激酶，细胞膜表面的受体蛋白接受信号之后通过直接或间接的方式激活MAP kinasekinase kinase(MAPKKK/MAP3K)(Dan et al.，2001)。依次磷酸化下游特定的MAPK kinase(MAPKK/MKK)，之后MKK磷酸化并激活MAP kinase(MAPK/MPK)。激活的MPK会磷酸化细胞质或细胞核中不同的底物蛋白，这些底物蛋白包括其它激酶、各种催化酶、转录因子和结构蛋白等(Khokhlatchev et al.，1998)。
发明内容
本发明的目的是提供一种OsMKK6蛋白及编码基因在调控植物种子发育中的应用。
本发明所提供的应用具体为如下A或B：
A.OsMKK6蛋白在调控植物种子发育中的应用；
所述OsMKK6蛋白为如下a1)或a2)所示的蛋白质：
a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a2)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物种子发育相关的由a1)衍生的蛋白质。
B.OsMKK6蛋白相关生物材料在调控植物种子发育中的应用；
所述OsMKK6蛋白为如下a1)或a2)所示的蛋白质：
a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a2)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物种子发育相关的由a1)衍生的蛋白质；
所述OsMKK6蛋白相关生物材料，为如下b1)-b5)中任一：
b1)编码所述OsMKK6蛋白的核酸分子；
b2)含有步骤b1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
b3)针对编码所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列的基因编辑工具；
所述基因编辑工具为序列特异核酸酶，所述序列特异核酸酶能够特异性剪切编码所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列中的靶标序列；所述序列特异核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectornucleases,TALEN)或锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)；
b4)编码所述基因编辑工具的核酸分子；
b5)含有步骤b4)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
其中，所述“编码所述OsMKK6蛋白的核酸分子”为编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子或RNA分子；所述DNA分子是如下1)至4)中任一所述的DNA分子；所述RNA分子是如下1)至4)中任一所述的DNA分子转录所得的RNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子；
4)与1)-3)任一限定的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子。
所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列具体为序列表中序列1。
所述“编码所述基因编辑工具的核酸分子”既可为编码所述基因编辑工具(所述序列特异核酸酶)的DNA分子，也可为编码所述基因编辑工具(所述序列特异核酸酶)的RNA分子。
在所述应用中，所述“调控植物种子发育”体现为：所述OsMKK6蛋白的表达量和/或活性改变，影响所述植物的种子发育情况；具体可为促进植物种子发育或抑制植物种子发育。
本发明还请求保护一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，可为如下(A)或(B)：
(A)培育抑制种子发育的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：抑制受体植物中OsMKK6蛋白的表达或降低受体植物中OsMKK6蛋白的活性，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的种子发育受到抑制(所述转基因植物中的杂合体有一半种子发育受到抑制)。
(B)培育促进种子发育的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：促进受体植物中OsMKK6蛋白的表达或提高受体植物中OsMKK6蛋白的活性，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的种子发育受到促进。
所述OsMKK6蛋白为如下(a)或(b)所示的蛋白质：
(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物种子发育相关的由(a)衍生的蛋白质。
在所述(A)中，可采用任何基因沉默相关技术抑制所述受体植物中所述OsMKK6蛋白的表达。如采用针对编码所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列的基因编辑工具对所述受体植物中的所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列进行基因编辑，使得所述受体植物中的所述OsMKK6蛋白的表达受到抑制；所述基因编辑工具为序列特异核酸酶，所述序列特异核酸酶能够特异性剪切所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列中的靶标片段；所述序列特异核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶、转录激活因子样效应因子核酸酶或锌指核酸酶。
所述序列特异核酸酶对所述靶标片段进行特异性剪切会造成所述靶标片段发生插入突变、缺失突变和/或替换突变，从而使得所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列发生能够抑制所述OsMKK6蛋白表达的突变。其中，所述靶标片段可位于所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列的如下区域中的至少一种：增强子区、启动子区、外显子区、内含子区、终止子区。
当所述核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶时，对所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列进行基因编辑，是通过如下方法实现的：向所述受体植物的细胞或组织中导入表达CRISPR/Cas9核酸酶的遗传物质，或者直接导入Cas9蛋白及向导RNA，再将导入后的细胞或组织培养成完整植株。当所述核酸酶为转录激活因子样效应因子核酸酶或锌指核酸酶时，对所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列进行基因编辑，是通过如下方法实现的：向所述受体植物的细胞或组织中导入表达转录激活因子样效应因子核酸酶或锌指核酸酶的遗传物质，或者直接导入转录激活因子样效应因子核酸酶或锌指核酸酶，再将导入后的细胞或组织培养成完整植株。所述遗传物质可为DNA质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA；即根据所述核酸酶种类的不同，所述遗传物质可为能表达转录激活因子样效应因子核酸酶、锌指核酸酶、Cas9蛋白、向导RNA、tracrRNA、crRNA的DNA质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA。所述细胞为任何能作为导入受体并能经过组织培养再生为完整植株的细胞(如原生质体细胞或悬浮细胞等)；所述组织为任何能作为导入受体并能经过组织培养再生为完整植株的组织(如愈伤组织、幼胚、成熟胚、叶片、茎尖，幼穗或下胚轴等)。所述导入的方法可为基因枪法、农杆菌侵染法、PEG诱导原生质体法、电击法、碳化硅纤维介导法、真空渗入法或其他任何导入方法。
其中，所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列具体为序列表中序列1。
在本发明的一个实施例中，所述序列特异核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶，所述靶标片段为所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，所述靶标片段的核苷酸序列为序列表中序列4。
在所述(B)中，所述促进受体植物中OsMKK6蛋白的表达可通过如下实现：向所述受体植物中导入编码所述OsMKK6蛋白的核酸分子，从而促进所述受体植物中所述OsMKK6蛋白的表达。
其中，所述“编码所述OsMKK6蛋白的核酸分子”可为编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子或RNA分子；所述DNA分子具体可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子；所述RNA分子具体可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子转录所得的RNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子；
4)与1)-3)任一限定的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子。
当所述“编码所述OsMKK6蛋白的核酸分子”为DNA分子时，可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果：
(1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据所述受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述OsMKK6蛋白的氨基酸序列不改变的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
(2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
(3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在所述受体植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
(4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率，任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
(5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
在本发明中，所述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以直接观察或采用计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
在本发明中，所述“转基因植物”理解为不仅包含将相关遗传物质或非遗传物质转化到所述受体植物中后得到的第一代转基因植物及其无性系，也包括其子代及其无性系。对于所述转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物可为种子、愈伤组织、完整植株或细胞。
在上述应用或方法中，所述植物既可以为单子叶植物，也可以为双子叶植物。
在本发明的一个实施例中，所述植物为单子叶植物中的禾本科植物，具体为水稻(具体如水稻品种日本晴)。
在本发明中，所述种子发育主要体现为胚乳发育。相应的，所述种子发育受到抑制体现为：胚乳皱缩，和/或种子大小停滞在形成期阶段(表现为长度正常，但是种子宽度和厚度均不再继续增加)。
本发明的实验证明，向日本晴水稻中导入针对所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列的基因编辑工具(CRISPR/Cas9核酸酶)的编码基因得到的OsMKK6突变体转基因水稻(OsMKK6基因发生突变，改变了OsMKK6基因的阅读框，使其失去功能)，纯合突变体致死，杂合突变体的一半种子胚乳发育异常，说明OsMKK6或与OsMKK6相关的生物材料可用于调控植物的种子发育，对于培育高品质的植物特别是水稻新品种具有重要意义。
附图说明
图1为pCAMBIA2300-C-OsMKK6在水稻原生质体的活性检测。其中，Marker中各条带由大到小依次为1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图2为T0代OsMKK6基因的CRISPR/Cas9敲除纯合突变体基因型。
图3为T2代OsMKK6杂合突变体的种子发育表型鉴定结果。其中，A为野生型种子的表型(灌浆正常种子饱满)；B为野生型种子横切后用I2-KI(0.2％I2,2％KI)溶液染色结果(胚乳发育和淀粉积累正常)；C为野生型种子灌浆后期种子休眠正常；D为OsMKK6+/-杂合体种子表型(部分种子皱缩，灌浆异常)；E为OsMKK6+/-杂合体种子横切后用I2-KI(0.2％I2,2％KI)溶液染色结果(部分种子表现为胚乳体积小，不能充满整个种子但可以被I2-KI染为黑褐色)；F为OsMKK6+/-杂合体种子成熟后(开花后25-30天)乳白色胚的皱缩种子中部分种子出现萌芽现象，收获后皱缩种子大多数不能萌发。
图4为T2代OsMKK6杂合突变体在田间正常种植时单穗种子的表型。其中，A-C分别为野生型种子的穗表型、胚乳表型以及种子表型的统计结果；D-F分别为OsMKK6+/-杂合体的穗表型、胚乳表型以及种子表型的统计结果。C和F中，normal seeds表示正常种子，shurnken seeds1表示胚乳体积变小的皱缩种子，shurnken seeds2表示没有胚乳形成的皱缩种子。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
农杆菌菌株AGL1(Agrobacterium strain AGL1)：文献：Hellens，R.，Mullineaux，P.，and Klee，H.(2000).Technical Focus：A guide to Agrobacterium binaryTivectors.Trends in Plant Science 5：446-451.公众可从中国科学院微生物研究所获得。
水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)：文献：StephenA.Goff et al.A Draft Sequence of the Rice Genome(Oryza sativaL.ssp.japonica).Science.2002，(296)：92，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
载体pCAMBIA2300-2x35S::Cas9-OsU3::sgRNA：该载体全序列如序列表中序列5所示。该载体中Cas9基因为植物密码子优化的编码核苷酸序列，而且Cas9蛋白两侧融合有核定位序列NLS，帮助蛋白入核发挥功能，启动子为2x35S。
本发明所涉及的OsMKK6基因在水稻基因组中的序列如序列表中序列1所示，cDNA序列如序列表中序列2所示，序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的OsMKK6蛋白。
实施例1、OsMKK6的生物信息学分析
OsMKK6是水稻OsMKK家族中的A组成员，该基因位于第1号染色体上。其在日本水稻注释计划Rice Annotation Project Database(RAP-DB)和美国水稻基因组注释计划TheMSU Rice Genome Annotation Project Database(RGAP7)的登录号分别是Os01g0510100和LOC_Os01g32660。该基因有8个外显子。本发明在基因的第三外显子上设计了CRISPR/Cas9系统中的sgRNA的靶序列。以期对OsMKK6进行敲除。
实施例2、OsMKK6靶位点的设计及相关敲除载体的构建
在水稻基因组中第三外显子区设计sgRNA序列，如下：
5’-GTGGTATCGTCCAactagtTCGG-3’(序列4)；
其中的小写字母为内切酶SpeI位点识别序列，下划线序列为PAM序列，将其命名为C-OsMKK6。
将C-OsMKK6利用II型内切酶AarI引入载体pCAMBIA2300-2x35S::Cas9-OsU3::sgRNA中。具体操作如下：
(1)将pCAMBIA2300-2x35S::Cas9-OsU3::sgRNA利用AarI酶切后回收骨架大片段。
(2)根据如上设计的sgRNA序列，合成带有如下粘性末端(下划线部分)的引物：
C-OsMKK6-F：5’-GTTTGTGGTATCGTCCAactagtT-3’；
C-OsMKK6-R：5’-AAACAactagtTGGACGATACCAC-3’。
(3)将C-OsMKK6-F和C-OsMKK6-R进行退火，形成具有粘性末端的双链DNA，将其与步骤(1)中胶回收的骨架大片段连接(16℃连接30分钟)之后转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养。阳性克隆测序验证后用于后续试验。
将测序验证正确的重组载体命名为pCAMBIA2300-C-OsMKK6。重组载体pCAMBIA2300-C-OsMKK6的结构描述为：在载体pCAMBIA2300-2x35S::Cas9-OsU3::sgRNA的酶切位点AarI处插入“GTGGTATCGTCCAactagtT”所示DNA片段后得到的重组质粒。
实施例3、OsMKK6靶位点sgRNA的活性筛选
将实施例2构建完成的重组载体pCAMBIA2300-C-OsMKK6大量提取之后通过PEG介导的方式转入水稻品种日本晴的原生质体，25℃避光培养48小时，然后提取原生质体的基因组DNA，用特异引物通过PCR扩增包含靶标片段C-OsMKK6的OsMKK6基因，然后将含有靶标片段C-OsMKK6的PCR扩增产物用Spe I酶切(如果PCR扩增产物有部分条带不能被切开，说明实施例1中设计的靶位点有活性)，将不能被限制性内切酶Spe I切开的PCR扩增产物进行测序。
用于扩增含有靶标片段C-OsMKK6的引物序列如下：上游引物OsMKK6-iden-F：GCAATGCATGGGATCCATGC(序列1的第1158-1177位)；下游引物OsMKK6-iden-R：ACACCATTTATGTAGAATGCC(序列1的第1725-1745位的反向互补序列)。
原生质体中检测重组载体活性的酶切结果见图1，泳道1为野生型对照PCR产物未经Spe I酶切(大小为588bp)；泳道2为转化后的原生质体，其中含有不能被Spe I切开的PCR条带(大小约为588bp，与设计预期一致)，同时也含有能被Spe I切开的两个DNA条带(大小分别为250bp和338bp，与设计预期一致)，说明靶位点C-OsMKK6有活性。进一步，将泳道2中未被酶切开的条带切胶回收后测序，结果表明靶位点处产生了少量碱基的插入与缺失，证实重组载体pCAMBIA2300-C-OsMKK6在靶标片段C-OsMKK6处进行了基因定点编辑。
将重组载体pCAMBIA2300-C-OsMKK6热激转化农杆菌菌株AGL1，获得含有重组载体pCAMBIA2300-C-OsMKK6的重组农杆菌，命名AGL1/pCAMBIA2300-C-OsMKK6；同时将空载体pCAMBIA2300热激转化农杆菌菌株AGL1，获得含有重组载体pCAMBIA2300的重组农杆菌，命名为AGL1/pCAMBIA2300。
实施例4、定点敲除水稻基因组中的OsMKK6基因
一，农杆菌介导法转基因水稻的构建
用实施例3中获得的重组农杆菌AGL1/pCAMBIA2300-C-OsMKK6和AGL1/pCAMBIA2300分别侵染水稻品种日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)成熟胚诱导的愈伤组织，将获得抗性愈伤组织分别命名为抗性愈伤C-OsMKK6和抗性愈伤CK1。
其中，重组农杆菌侵染愈伤组织的具体方法如下：
(1)将25％次氯酸钠消毒后的日本晴水稻种子接种于愈伤组织诱导培养基上，28℃黑暗培养7天，去除芽和残留胚乳后再置于愈伤组织继代培养基上继代培养4-6周，得到成熟胚愈伤组织。
(2)将重组农杆菌接种于YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平)中，28℃振荡培养至OD600为1.0-1.5；以10000rpm室温离心1min，用AAM液体培养基(其中，葡萄糖浓度为100g/L，乙酰丁香酮浓度为100μM，pH 5.2)重悬菌体并稀释至OD600为0.1，得到菌悬液。
(3)将步骤(1)得到的成熟胚愈伤组织浸于步骤(2)得到的菌悬液中25-30min后，于含有两层滤纸的共培养培养基上，25℃黑暗条件下共培养3天。
(4)将经过步骤(3)共培养的愈伤组织用无菌水清洗6次，再用含500mg/L羧苄青霉素(Car)的无菌水浸泡45min，之后置于无菌滤纸上风干。将愈伤组织接种于含有50mg/L潮霉素的筛选培养基中，28℃黑暗条件下筛选培养2周，转入新配置的筛选培养基中进行再次筛选培养，获得存活的淡黄色抗性愈伤组织。
(5)从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，一般经过15-25天左右，有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。
(6)当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，得到分别转入pCAMBIA2300-C-OsMKK6和pCAMBIA2300空载体的T0代转基因植物。将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，移栽至田间。
其中，所用的培养基如下：
1、培养基母液配方：
1)20×N6培养基母液：
注：配制时按表中所列顺序逐一添加。
2)100×B5微量母液(每升含量)：
3)B5有机母液：
4)100×铁盐
注：配制顺序如下：
①称取2.78g FeSO4·7H2O溶解于200ml去离子水中(A)。
②称取3.73g Na2 -EDTA·2H2O溶解于200ml去离子水中(B)。
③将B置于70℃水浴锅中直至溶质完全溶解(C)。
④将A倒入C中混合，置于70℃水浴锅中保温2h。
⑤定容至1L。
5)AA大量元素母液(每升含量)：
2、培养基配方
1)愈伤组织诱导培养基(每升含量)：
(CH：Casein Hydrolysate，水解酪蛋白)
2)愈伤组织继代培养基(每升含量)：
3)共培养培养基(每升含量)：
4)筛选培养基(每升含量)：
灭菌后(55℃)再加：
5)分化培养基配方(每升含量)：
6)生根培养基配方(每升含量)：
7)悬浮农杆菌感染愈伤组织团的培养基配方(AAM)每升含量：
二、CRISPR/Cas9诱导的转基因T0代植物突变筛选
1、在步骤一获得T0代转基因植物之后，利用PCR/RE对所有获得的转基因植物进行突变筛选。涉及到引物为实施例3中描述，涉及的内切酶和检测标准在实施例3中描述。
结果显示：经PCR/RE检测后，T0代共获得87株转入重组载体pCAMBIA2300-C-OsMKK6的转基因植株。其中共有27株植物中OsMKK6基因的靶标片段处(即sgRNA结合处)有突变；27株突变体中有2株为纯合突变体带型，25株为杂合突变体带型，突变效率为31％(携带突变的植株数目/T0代获得的转基因植物总数)。
2、OsMKK6突变体基因型测序确定
将上述T0代植物中的PCR/RE筛选出的转入重组载体pCAMBIA2300-C-OsMKK6的突变体植物的PCR产物连接pEASY-Blunt克隆载体(TransGen Biotech)。转化大肠杆菌后37℃培养过夜，在蓝白斑筛选培养基上挑取白色单克隆测序，确定各株系基因型。选取其中移码突变株系进行后续试验。
对T0代OsMKK6sgRNA结合位点纯合突变体植株(MKK6-C-T0-5、MKK6-C-T0-15和MKK6-C-T0-19)的测序结果见图2，其中MKK6-C-T0-5在设计的靶位点处含有1bp的碱基删除；MKK6-C-T0-15在设计的靶位点处含有5bp的碱基删除；MKK6-C-T0-19在设计的靶位点处含有2bp碱基的删除。所有株系的突变最终改变OsMKK6基因的阅读框，使其失去功能，获得OsMKK6纯合突变体。
对T0代OsMKK6sgRNA结合位点杂合突变体植株的测序结果也表明所有株系的突变部分最终改变OsMKK6基因的阅读框，使其失去功能，获得OsMKK6杂合突变体。
实施例5、水稻基因OsMKK6敲除突变体的种子发育表型
实施例4获得的T0代OsMKK6sgRNA结合位点纯合突变体植株(MKK6-C-T0-5、MKK6-C-T0-15和MKK6-C-T0-19)，表现出纯合致死。
将实施例4获得的T0代OsMKK6sgRNA结合位点杂合突变体植株自交，获得T2代OsMKK6sgRNA结合位点杂合突变体植株，将其进行种子发育表型鉴定相关实验。具体如下：田间正常条件种植，管理。在植株抽穗、开花、花粉发育、胚囊发育以及种子发育的各时期观察其表型，具体实验手段有：灌浆阶段对种子进行观察，将颖果横切后用I2-KI(0.2％I2和2％KI)溶液染色。
实验同时设置未转基因的日本晴水稻作为野生型对照，同时以转入pCAMBIA2300空载体的转基因水稻作为空载体对照。
实验设置3次重复。每次重复中保证供试的各水稻材料均不少于30株。
结果显示：
1、在灌浆阶段对种子进行观察，将颖果横切后用I2-KI(0.2％I2和2％KI)溶液染色。发现野生型种子胚乳发育和淀粉积累正常；从开花后6天均可以检测到淀粉的积累。OsMKK6+/-杂合体部分种子皱缩、灌浆异常，表现为胚乳体积小，不能充满整个种子但可以被I2-KI染为黑褐色，还有一部分没有观察到胚乳的形成，种子腔内被液体充满(图3)。因此OsMKK6+/-杂合体部分种子胚乳发育异常。种子成熟后(开花后25-30天)乳白色胚的皱缩种子中部分种子出现萌芽现象(图3)。收获后皱缩种子不能萌发，因此在OsMKK6+/-杂合后代中进行突变体筛选只能筛选到1:1的野生型和饱满的灌浆正常的种子萌发获得的杂合突变体。
2、OsMKK6+/-各株系杂合的抽穗、开花、花粉和胚囊发育没有观察到异常。开花后对水稻种子的发育进行了观察。在种子的形成期(开花后1-5天)所有种子迅速伸长、膨大，期间没有发现明显差异。进入乳熟期之后，杂合体植株部分种子不能继续膨大并占据整个内、外颖壳构成的空腔。种子大小停滞的形成期阶段，表现为长度正常，但是种子宽度和厚度均不再继续增加，而且出现灌浆异常导致出现胚乳皱缩现象。通过统计OsMKK6+/-的多个株系，发现每穗上皱缩种子约占总籽粒数的1/2；皱缩种子的灌浆程度也存在差异，有些能部分灌浆，有些种子没有任何胚乳的形成，见图4。
另外，空载体对照水稻的种子发育情况与野生型水稻基本一致。
以上结果表明：与野生型水稻相比，OsMKK6纯合突变致死，杂合突变体表现出抑制种子发育的表型。

Claims (10)

1.OsMKK6蛋白在调控植物种子发育中的应用；
所述OsMKK6蛋白为如下a1)或a2)所示的蛋白质：
a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a2)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物种子发育相关的由a1)衍生的蛋白质。
2.OsMKK6蛋白相关生物材料在调控植物种子发育中的应用；
所述OsMKK6蛋白为如下a1)或a2)所示的蛋白质：
a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a2)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物种子发育相关的由a1)衍生的蛋白质；
所述OsMKK6蛋白相关生物材料，为如下b1)-b5)中任一：
b1)编码所述OsMKK6蛋白的核酸分子；
b2)含有步骤b1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
b3)针对编码所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列的基因编辑工具；
所述基因编辑工具为序列特异核酸酶，所述序列特异核酸酶能够特异性剪切所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列中的靶标片段；所述序列特异核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶或转录激活因子样效应因子核酸酶、锌指核酸酶；
b4)编码所述基因编辑工具的核酸分子；
b5)含有步骤b4)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：编码所述OsMKK6蛋白的核酸分子为编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子或RNA分子；所述DNA分子是如下1)至4)中任一所述的DNA分子；所述RNA分子是如下1)至4)中任一所述的DNA分子转录所得的RNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子；
4)与1)-3)任一限定的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述OsMKK6蛋白的DNA分子；
或
所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列为序列表中序列1。
4.培育转基因植物的方法，为如下(A)或(B)：
(A)培育抑制种子发育的转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中OsMKK6蛋白的表达或降低受体植物中OsMKK6蛋白的活性，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的种子发育受到抑制；
(B)培育促进种子发育的转基因植物的方法，包括如下步骤：促进受体植物中OsMKK6蛋白的表达或提高受体植物中OsMKK6蛋白的活性，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的种子发育受到促进；
所述OsMKK6蛋白为如下(a)或(b)所示的蛋白质：
(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物种子发育相关的由(a)衍生的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述(A)中，所述抑制受体植物中OsMKK6蛋白的表达通过如下实现：采用针对编码所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列的基因编辑工具对所述受体植物中的所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列进行基因编辑，使得所述受体植物中的所述OsMKK6蛋白的表达受到抑制；所述基因编辑工具为序列特异核酸酶，所述序列特异核酸酶能够特异性剪切所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列中的靶标片段；所述序列特异核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶、转录激活因子样效应因子核酸酶或锌指核酸酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列为序列表中序列1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述序列特异核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶；所述靶标片段为所述OsMKK6蛋白的基因组DNA序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
具体的，所述靶标片段的核苷酸序列为序列表中序列4。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述(B)中，所述促进受体植物中OsMKK6蛋白的表达通过如下实现：向所述受体植物中导入编码所述OsMKK6蛋白的核酸分子，从而促进所述受体植物中所述OsMKK6蛋白的表达。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
具体的，所述单子叶植物为禾本科植物；
更加具体的，所述禾本科植物为水稻。
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述种子发育体现为胚乳发育。
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