CN116240218A - 一种参与桂花花香物质合成OfWRKY84基因及其表达蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种参与桂花花香物质合成的OfWRKY84基因及其表达蛋白和应用，属于植物分子生物学领域。本发明公开了一种参与桂花花香物质合成OfWRKY84基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明以日香桂盛花期花朵为材料，通过克隆得到桂花OfWRKY84全长基因，在此基础上构建其过量表达载体Super1300‑OfWRKY84，转入桂花花瓣中，得到转基因植株，基因功能鉴定结果表明OfWRKY84基因是增强桂花萜类香气物质合成过程中重要转录因子，可用于桂花基因工程中花香观赏性状的改良及遗传品质等繁育工作。

Description

一种参与桂花花香物质合成OfWRKY84基因及其表达蛋白和 应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，更具体地说，涉及一种参与桂花花香物质合成的OfWRKY84基因及其表达蛋白和应用。

背景技术

桂花(Osmanthusfragrans)属木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus)，是我国十大传统名花之一，也是目前最重要的园林植物之一。桂花素以树形优美、香气宜人为人民所喜爱。桂花是中国获得栽培品种国际登录权威的少数几种花卉之一，这也更凸显了桂花在中国花卉中的重要地位。富含浓郁的香气物质，其中起决定性作用的特征活性物质为包括芳樟醇、紫罗酮、罗勒烯及其衍生物在内的单萜化合物。

萜烯类化合物，尤其是单萜类和倍半萜类化合物，例如芳樟醇、月桂烯、反式-β-罗勒烯、金合欢烯和橙花醇等，都是构成花香的重要组分。萜类合酶(TPS)是位于萜类物质合成途径分支点的关键酶，其表达水平与萜类物质含量和组成密切相关，然而，关于TPS基因表达转录调控机制尚不明晰。因此，研究发掘桂花基因组中调控花香物质合成的重要相关基因具有重要意义，此举将为后期桂花优良品质繁育及提升桂花观赏性状具有重要的促进作用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种参与桂花花香物质合成的OfWRKY84基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种参与桂花花香物质合成OfWRKY84基因的表达蛋白。本发明还要解决的技术问题在于提供一种参与桂花花香物质合成OfWRKY84基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种参与桂花花香物质合成OfWRKY84基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的OfWRKY84基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的OfWRKY84基因的表达盒、载体、宿主菌或细胞系。

进一步地，所述的载体是植物表达载体。

进一步地，所述的植物表达载体是Super1300-OfWRKY84。

所述的OfWRKY84基因在增强桂花香气物质合成或桂花育种中的应用。

进一步地，所述的应用，包括以下步骤：

(1)构建OfWRKY84基因的载体；

(2)将所构建的OfWRKY84基因的载体转化到植物中；

(3)培育筛选得到香气物质合成增强的转基因植物。

进一步地，所述的桂花香气物质为α-罗勒烯、芳樟醇。

所述的OfWRKY84基因的表达蛋白在与其他蛋白互作中的应用。

进一步地，所述的其他蛋白包括Contig233.58与Contig50.126。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明以日香桂盛花期花朵为材料，通过克隆得到桂花OfWRKY84全长基因。同时，在此基础上构建其过量表达载体Super1300-OfWRKY84，转入桂花花瓣中，OfWRKY84在桂花中高效表达。转基因桂花花瓣和未转基因桂花花瓣避光培养48h后，未转基因桂花花瓣中萜类香气物质的含量并没有明显提升。转基因桂花花瓣中的α-罗勒烯、芳樟醇瞬时表达材料中显著高于对照，(E)-丁酸-3-己烯酯和cis-3-己烯基-α-甲基丁酸酯差异不显著。表明OfWRKY84基因是增强桂花萜类香气物质合成过程中重要转录因子，可用于桂花基因工程中花香观赏性状的改良及遗传品质等繁育工作。

(2)OfWRKY84蛋白可以与枯草杆菌蛋白酶蛋白(OfSLP)和果糖二磷酸醛缩酶蛋白(OfFBA)互作来调控桂花花香物质的合成。

附图说明

图1为目的基因扩增产物琼脂糖电泳图；

图2为OfWRKY84重组载体双酶切后琼脂糖电泳图，注：泳道1为双酶切载体条带，泳道2为对照；

图3为转化农杆菌GV3101后的菌检琼脂糖电泳图；

图4为OfWRKY84瞬时侵染桂花花瓣后阳性检测图。A为35S::OfWRKY84融合蛋白的GFP信号观察情况图(CK：野生型、NC：空载)、B为OfWRKY84瞬时侵染桂花花瓣后对应转入的目的基因表达情况图、C为OfWRKY84瞬时侵染桂花花瓣后在培养基上的生长情况图；

图5为OfWRKY84基因瞬时侵染桂花花瓣后引起的OfTPS27表达量变化图；

图6为OfWRKY84基因瞬时侵染桂花花瓣后物质代谢图，注：A为OfWRKY84转基因植株和野生型花朵挥发性物质代谢物的PCA-X散点图、B为OPLS-DA散点图、C为载荷分析散点图：红色和黄色箭头表示VIP>1的物质成分、D为图C中箭头标出的物质的相对含量分析图；

图7为OfWRKY84筛桂花酵母文库部分阳性克隆的电泳图；

图8为OfWRKY84筛库回转验证结果图；

图9为双分子荧光杂交互补验证OfWRKY84和筛库蛋白互作图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：日香桂OfWRKY84基因的克隆、超表达载体构建

1、总RNA提取与cDNA合成

本申请所用材料为日香桂盛花期花朵，瞬时转化所用的桂花花瓣为生长在南京林业大学校园内的金桂品种‘波叶金桂’。

采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总RNA。

采用TaKaRaPrimeScript^TMRTMasterMix(PerfectRealTime)反转录试剂盒将所提取到的RNA反转录成cDNA，最后得到的cDNA加水稀释10倍后于-20℃冰箱保存。

2、获取目的基因

根据前期课题组已发表的桂花全基因组数据库(Xiulian Yang,Yuanzheng Yue,et al.The chromosome-level quality genome provides insights into theevolution of the biosynthesis genes for aroma compounds ofOsmanthusfragrans.)，筛选得到1个基因序列，与模式植物拟南芥的序列进行比对，判断该基因属于WRKY基因家族，根据该基因家族成员在染色体上的位置命名为OfWRKY84。

利用BioXM软件对该基因的核苷酸全长序列进行酶切位点分析，选择SmaI和KpnI作为限制性内切酶酶切位点。利用CE design软件设计引物。按要求进行相关信息的填写，具体包括载体上的酶切位点附近的序列、目的基因全长、按照5′端和3′端的顺序填写酶切位点，即可得到扩增引物。设计好的序列由捷瑞生物公司合成。引物序列如下：

Super1300-OfWRKY84-F：

5′-AAGCTTCTGCAGGGGCCCGGGATGGCTGTAGATTTTCTCAGTTATGC-3′，

Super1300-OfWRKY84-R：

5′-GCCCTTGCTCACCATGGTACCATTCTTCCTCACTTTGTCGGAACA-3'。

以稀释10倍的日香桂OfWRKY84cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系(20μL)为：正向引物Super1300-OfWRKY84-F1μL；反向引物Super1300-OfWRKY84-R1μL；cDNA1μL；PrimeSTAR10μL(高保真PCR酶购买于宝日医生物技术(北京)有限公司高速高保真PCR酶R045A)；ddH₂O7μL。PCR反应程序为：98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸2min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。

将扩增产物进行琼脂糖电泳检测(图1)，获得目的基因片段，然后利用试剂盒对目的基因片段进行切胶回收。

3、目的基因片段与载体连接

1)提前将切Super1300载体从-80℃超低温冰箱中取出进行活化和摇菌，按照质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取Super1300载体质粒，随后进行双酶切实验，反应体系(20μL)为：限制性内切酶BamHI1μL；限制性内切酶XbaI1μL；Buffer2μL(Buffer为Takara限制性内切酶附带)；载体质粒XμL；ddH₂O补足至20μL。

其中X(μL)＝1000ng/载体质粒浓度(ng/μL)。将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养1h。将双酶切后的载体进行琼脂糖电泳(图2)，然后利用试剂盒进行切胶回收(湖南艾科瑞生物工程有限公司)，下同。

2)连接体系(20μL)如下：目的基因回收产物XμL；Super1300载体双酶切回收产物YμL；连接酶2μL；Buffer1μL；ddH₂O补足至20μL(连接酶和Buffer源于南京诺唯赞生物科技有限公司同源重组试剂c112)。

其中X(μL)＝200ng/目的基因回收产物浓度(ng/μL)，Y(μL)＝200ng/质粒双酶切回收产物浓度(ng/μL)。将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养30min，冰上2min。

3)转化：超净工作台内，用移液枪取5μL的连接产物于50μL的Trelief^TM5α感受态细胞，轻弹混匀，冰浴5min，42℃水浴60s，再冰浴2min，加250μL液体LB(不含Kana)，37℃，200rppm的摇床内孵育30min。

4)涂板：取200μL孵育后的菌液，用灭菌的玻璃棒均匀涂布在LB固体培养基上(内含50mg/L的Kana)并晾干，用封口膜后倒置在37℃恒温培养箱内培养12-14h。

4、重组质粒筛选

当培养基上长出菌后，于超净工作台内进行单菌落检测。每个基因挑取8个饱满的单菌落，依序依次在含Kana抗性的LB固体培养基上进行备份，并用无菌牙签将相应的单菌落沾取至以下20μL体系中进行菌检：Super1300-OfWRKY84-F1μL，Super1300-OfWRKY84-R1μL，GreenMix10μL(GreenMix购于南京诺唯赞生物科技有限公司)，ddH₂O8μL。

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳，挑取3个长度正确的阳性单菌落送测，测得OfWRKY84基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，片段长度为840bp，编码279个氨基酸的蛋白质，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，选取碱基错配率最低的且测序有重复的阳性单菌落提取质粒进行后续实验。

实施例2：OfWRKY84基因的转化及功能鉴定

1、重组质粒转化农杆菌

(1)将保存在-80℃超低温冰箱内的GV3101感受态取出放在冰上融化。每33μL感受态加入1μL质粒，吸打混匀后依次冰浴20min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；

(2)加500μL无抗性的LB液体培养基，28℃，200rppm摇床上培养1h；培养完成后，将菌液6000r，离心1min，弃去部分上清液，留100μL均匀涂布于LB固体培养基上(内含50mg/LKana)，封口膜密封，倒置于28℃培养箱中培养40-48h；

(3)菌检和备份：结果如图3所示，菌检中的目的条带正确且亮度一致，则将备份的板子中相对应的菌落挑入LB液体培养基(内含50mg/LKana)中摇菌，再将菌液和50％甘油按3:7的体积比保菌，液氮中速冻后保存在-80℃超低温冰箱内。

2、农杆菌介导转化‘波叶金桂’桂花花瓣

(1)摇菌：将Super1300空载、P19辅助表达载体和已转入农杆菌的GUS::Super1300-OfWRKY84目标基因融合表达载体的菌液于-80℃取出常温融化至冰水混合状态后插入冰中融化，按照300μL菌液加入30mLLB液体培养基中(含Kana10μg·mL^-1)，28℃、200rpm避光振荡培养，直至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8之间；

(2)准备混合菌液：称取0.0196g的乙酰丁香酮(AS)粉末，使用二甲基亚砜助溶(在通风橱操作)，再加入适量无菌水定容到100mL，获得母液，取母液15mL加入85mL的无菌水，从而获得150μmol·L^-1的AS；称取0.2035g的MgCl₂和0.2135g的2-(N-吗啉)乙磺酸一水物(MES)加入到配好的150μmol·L^-1的AS溶液中；将菌液进行离心(4℃、5000rpm、10min)，弃上清，收集菌体，使用当天配制的缓冲液进行重悬，最后按照最佳比例混合(P19辅助载体：目的基因(V:V)＝5:7)，充分震荡混匀后活化3h；

(3)侵染：选取生长状态良好的桂花花瓣，使用真空泵将混合菌液注入桂花花瓣；

(4)培养：将注射过目的基因混合菌液的瞬时转化植物和注射过空载体菌液的瞬时转化植物，避光培养48h，图4C为OfWRKY84瞬时侵染桂花花瓣后在培养基上的生长情况图；

3、GFP信号观察：取注射过的叶片，避开侵染部位选取1cm*1cm的方块，制片后，使用激光共聚焦显微镜在488mm的激发波下观察荧光信号。

结果如图4A所示，通过激光共聚焦显微镜观测，转空载和OfWRKY84的桂花花瓣可观察到明显的绿色荧光，而野生型即未作任何处理的花瓣则不可以。

4、荧光定量分析：采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总RNA。采用TaKaRa PrimeScript^TMRT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒将所提取到的RNA反转录成cDNA，最后得到的cDNA加水稀释10倍后于取1μL作为模板，加入F 0.4μL，R 0.4μL，TBGreen Mix 5μL，Rox染液0.2μL，ddH₂O 3μL，配成10μL的体系进行荧光定量试验，荧光定量试剂盒为TaKaRa TB Green Premix Ex Taq(RR420A)，实验中使用的热循环条件如下：95℃持续30s，然后在95℃持续5s，60℃持续30s，95℃持续15s，60℃持续1分钟的40个循环后，在95℃下持续15s。相对表达水平的计算使用的2^-△△CT法。

结果如图4B所示，转基因花瓣中OfWRKY84基因的表达量为转空载的3倍；结果如图5所示，超表达OfWRKY84基因后，萜类合酶基因OfWRKY27的表达量约为转空载的2倍，说明OfWRKY84可调控OfWRKY27基因的上调表达。

5、瞬时转化桂花花瓣的香气物质测定

室温下(25±2℃)用镊子夹取0.4g桂花花瓣，记录叶片重量后放置于密封的1mL萃取瓶中，加入内标溶液(1/10000葵酸乙酯:1微的葵酸乙酯标样加入到10mL的甲醇)后摇晃混匀后平衡15min；在温度45℃的水浴锅中，密封后用65μmDB/5MS的萃取头插入萃取瓶中部，萃取30min后将萃取头插入色谱柱TRACE TR-5MS C30m×0.25mm×0.25gym)，载气为高纯度氦气(He)，氦气流速为1mL/min，不分流进样，进样口温度250℃，解吸附时间为3min；温度程序为：首先温度60℃，保持2min，第一个升温程序为60℃上升到150℃，速度为5℃/min，第二个升温程序为150℃升至250℃速度为10℃/min，再保持1min；质谱条件为离子源温度250℃，电离方式EI，电子能量70eV；

结果如图6所示，将数据中的硅氧化物杂质去除后，计算出各种物质的相对含量，将物质的相对含量导入SIMCA5.0中，根据OPLS-DA聚类，依据VIP值得大小，挑选VIP>1的物质进行LOADING分析，选择挥发性物质中VIP大于1的物质进行含量分析，结果表明α-罗勒烯、芳樟醇瞬时表达材料中显著高于对照，(E)-丁酸-3-己烯酯和cis-3-己烯基-α-甲基丁酸酯差异不显著，表明OfWRKY84对差异性p<0.05的香气物质具有重要的调控作用。

实施例3：OfWRKY84互作蛋白筛选

1、pGBKT7::OfWRKY84载体的构建及酵母自激活实验

为了确定OFWRKY84是否具有转录自激活作用，扩增获得编码区，并将PCR产物插入线性化的pDEST-GBKT7质粒中。然后，将pGBKT7-OfWRKY84和空的pGBKT7载体引入酵母AH109中，转化步骤如下：取1μg的质粒加入到33μL的AH109感受态中；再加入酵母转化试剂盒中的EZ3100μL，30℃孵育45min；孵育完成后，菌液涂布在SD/-Trp固体培养基上，于30℃中倒置培养3d左右。在缺失Trp(SD/-Trp)的培养基上选择阳性单克隆菌株，然后将悬浮的酵母菌稀释至不同浓度，并将4μL稀释液点菌于SD-Trp、SD-Trp/Ade和SD-Trp/Ade(X-a-gal)的SD培养基上。在30℃下3d后观察酵母菌的生长情况。结果表明含有pGBKT7-OfWRKY84质粒的酵母菌可以在SD-Trp培养基上生长，但是在SD-Trp/Ade和SD-Trp/Ade(X-a-gal)的培养基上不能生长，说明OfWRKY84无自激活活性。

2、筛选cDNA文库

从SD-Trp平板挑取融合了BD-OfTPS84的Y109酵母单菌种接于液体SD-Trp培养基5mL，30℃，250rpm，振荡培养16h；从5mL菌液中取500μL于50mLYPDA培养基的250mL锥形瓶中，30℃，250rpm，振荡培养10h，至OD600＝0.15-0.3；室温3000rpm离心5min收菌，分别使用200mL新鲜的YPDA培养液收集菌体于1L的锥形瓶中，30℃，250rpm，培养4-6h，直至OD＝0.4-0.5；用5mL无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，3000rpm，5min，弃上清，此步骤重复一次；用2mL0.1MLiAc重悬菌体，轻轻混匀，置于冰上备用。

CarrierDNA95℃高温煮沸5min，立即置于冰上3min，重复3次，置于冰上备用；向每管离心管中依次加入如下试剂：10μg文库质粒DNA、100μLssDNA、5mLLiAc&50％PEG3350；30℃水浴孵育45min；加入600μLDMSO；42℃水浴热激，20min；摇匀后，4000rpm离心5min，弃上清，沉淀用10mL的YPDAplus重悬，30℃振荡培养90min；室温离心收菌，4000rpm，5min，弃上清，用10mL0.9％NaCl溶液重悬，尽量温和地混匀，从中取200μL培养物稀释后涂SD-TLH，共40块。30℃恒温倒置培养3-7d，观察菌落生长。挑取长出的克隆单菌落，转接到SD-TLH筛选培养基中继续培养3-5d。

3、酵母阳性克隆鉴定及测序比对

转接好的菌长大后，对其进行菌检，过程为：首先将菌点至加了50μL无菌水的小离心管中，吸打混匀，封口后放入超低温冰箱过夜，采用20μL通用菌检体系和程序，引物序列如下：

T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′，

ADR：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′。

菌检MIX为南京诺唯赞公司的快速菌检绿酶，取阳性菌落送上海生工公司测序，测序引物序列如下：

T7-F：5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′。

为了确定SD-TLH平板中筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，首先将测序结果与桂花基因组数据库进行比对，比对获得同源性最好的基因，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析，初步获得与OfWRKY84互作的蛋白信息。结果如图7所示，在SD-TLH筛选平板中筛选获得阳性酵母克隆，部分阳性克隆的电泳图，阳性克隆的长度长短不一，基本都在500bp以上，最长可达2000bp以上，平均长度为1000bp左右。

4、酵母阳性克隆回转验证：

将上述划线于SD-TLH缺陷型培养基上长出的阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点至SD-TLH、SD-TLHA和SD-TLHA+x-α-gal缺陷平板，30℃恒温培养3-4d。

结果如图8所示，筛选得到的84个酵母阳性克隆，57个在SD-TLH缺陷型平板上生长，8个在SD-TLHA缺陷型平板上生长和6个在SD-TLHA+x-α-gal缺陷型平板上显蓝色。将8个在SD-TLHA缺陷型平板上生长的序列与桂花基因组的数据库进行比对，得到的7个蛋白中，RAP2-12为转录因子，其他的为类枯草杆菌蛋白酶、果糖二磷酸醛缩酶、E3SUMO-蛋白质连接酶和S-腺苷甲硫氨酸合酶等。

5、双分子荧光互补实验(BiFC)：

根据与OFWRKY84互作的蛋白在四缺培养基上的生长状况，并结合其在桂花开花过程的表达模式，挑选与筛库OfWRKY84表达模式一致的基因进行双分子荧光互补实验。将OfWRKY84不含终止密码子的CDS序列克隆到pSPYCE载体上，将互作蛋白不含终止密码子的CDS序列克隆到pSPYNE载体上，采用冻融法将重组载体转化至农杆菌内，重摇农杆菌至OD600为0.8-1.0，将组合菌液和助侵染菌液P19按5:5:3比例瞬时共转化到本氏烟草叶片中。侵染后，使用激光共聚焦显微镜观察荧光信号，若有荧光信号产生，表明包含有的两个蛋白相互作用。

结果如图9所示，在激光共聚焦显微镜下观察共注射的烟草叶片，Contig233.58-YNE/OfWRKY84-YCE和Contig50.126-YNE/OfWRKY84-YCE共注射的烟草叶片细胞中可观察到GFP信号，对应的负对照中未见信号，其他组合

Contig78.77-YNE/OfWRKY84-YCE未见荧光信号。双分子荧光互补实验进一步验证了Contig233.58、Contig50.126与OFWRKY84互作。

Claims (10)

1.一种参与桂花花香物质合成OfWRKY84基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的OfWRKY84基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的OfWRKY84基因的表达盒、载体、宿主菌或细胞系。

4.根据权利要求3所述的含有OfWRKY84基因的载体，其特征在于，所述的载体是植物表达载体。

5.根据权利要求4所述的含有OfWRKY84基因的载体，其特征在于，所述的植物表达载体是Super1300-OfWRKY84。

6.权利要求1所述的OfWRKY84基因在增强桂花香气物质合成或桂花育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的OfWRKY84基因在增强桂花香气物质合成中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建OfWRKY84基因的载体；

(2)将所构建的OfWRKY84基因的载体转化到植物中；

(3)培育筛选得到香气物质合成增强的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的OfWRKY84基因在增强桂花香气物质合成中的应用，其特征在于，所述的桂花香气物质为α-罗勒烯、芳樟醇。

9.权利要求2所述的OfWRKY84基因的表达蛋白在与其他蛋白互作中的应用。

10.根据权利要求9所述的OfWRKY84基因的表达蛋白在与其他蛋白互作中的应用，其特征在于，所述的其他蛋白包括Contig233.58与Contig50.126。

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