CN110904111A

CN110904111A - 一种靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9载体及其应用

Info

Publication number: CN110904111A
Application number: CN201911319231.8A
Authority: CN
Inventors: 刘小丰; 江东; 赵晓春; 朱世平; 申晚霞; 余歆
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110904111B

Abstract

本发明提供了靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9载体及其应用，涉及植物基因工程技术领域；所述sgRNA序列包括：FcMYC2sgRNA‑1或FcMYC2sgRNA‑2；利用所述sgRNA序列构建CRISPR/Cas9载体；最后将含有所述CRISPR/Cas9载体转化柑橘上胚轴，获得FcMYC2基因被编辑、蛋白功能敲除的植株。本发明具有sgRNA靶向性好、对FcMYC2基因切割效率高、且能在甜橙、金柑等柑橘类型中获得纯合编辑的植株，从而为进一步研究调控柑橘精油合成机制提供强有力的工具。

Description

一种靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9载体及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9载体及其应用。

背景技术

FcMYC2(Fortunella crassifolia Swing.MYC2transcription factor)是MYC2型bHLH转录因子，正调控柑橘精油的主要成分—单萜和倍半萜的合成。该基因是茉莉酸响应途径关键基因，位于柑橘5号染色体上，在柑橘中无其它同源基因，具有高度的特异性。

FcMYC2蛋白是bHLH超家族的成员，其N端的MYC结构域包括7个螺旋和6个折叠，能与其它的MYC2、MYC3和MYC4蛋白形成多蛋白聚合体，在JA信号传导中行使与其它响应蛋白结合的功能。C端的HLH结构域包括两个螺旋和一个环状结构，第一个螺旋的第6位的谷氨酸(Glu，E)是与靶基因启动子区域的G-box结合的特异氨基酸位点。两个MYC型的HLH结构域形成类似“剪刀”似的交叉结构，共同作用靶基因启动的G-box序列上，调控靶基因的表达。

FcMYC2是一个调控柑橘柑橘精油合成的关键调控因子，研究表明，下调FcMYC2的表达水平能显著降低柑橘中单萜和倍半萜的合成，同时对类黄酮、柠檬苦素等次生代谢产物的合成造成影响。目前并没有一种方法，可简单快速且高效率的敲除柑橘中的FcMYC2基因。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9载体及其应用，可直接获得敲除FcMYC2基因的柑橘材料，为研究柑橘精油合成调控机制提供强有力的工具。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列，所述sgRNA序列包括：FcMYC2sgRNA-1或FcMYC2sgRNA-2；

所述FcMYC2sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述FcMYC2sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述FcMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示。

本发明还提供了一种靶向敲除FcMYC2基因的CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体中含有所述sgRNA序列。

本发明还提供了所述CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：(1)将所述sgRNA序列设计为寡核苷酸序列；所述寡核苷酸序列包括FcMYC2sgRNA-1Forward oligo和FcMYC2sgRNA-1Reverse oligo，或FcMYC2sgRNA-2Forward oligo和FcMYC2sgRNA-2Reverseoligo；所述FcMYC2sgRNA-1Forward oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述FcMYC2sgRNA-1Reverse oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述FcMYC2sgRNA-2Forward oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述FcMYC2sgRNA-2Reverse oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

(2)将所述寡核苷酸序列退火后连接入线性化的pPIC.5载体中，得载体pPIC.5::FcMYC2sgRNA；

(3)利用EcoRI和NheI双酶切所述载体pPIC.5::FcMYC2sgRNA，将切下的表达单元AtU6::FcMYC2sgRNA，连接入用EcoRI酶切并去磷酸化的pPICL载体中，得CRISPR/Cas9载体pPICL::FcMYC2sgRNA-1或pPICL::FcMYC2sgRNA-2。

优选的，步骤(2)所述退火的体系以25μL计，包括：寡核苷酸序列各10μL，10X退火缓冲液2.5μL，ddH₂O 2.5μL；所述退火为在95℃下孵育10min。

本发明还提供了一种靶向敲除FcMYC2基因的方法，将利用所述构建方法构建得到的所述CRISPR/Cas9载体pPICL::FcMYC2sgRNA-1或pPICL::FcMYC2sgRNA-2转化农杆菌后，再转化入柑橘上胚轴形成的愈伤组织中，得敲除FcMYC2基因的柑橘植株。

优选的，所述柑橘包括柑橘属、金柑属或枳属植物。

本发明还提供了所述sgRNA序列或所述CRISPR/Cas9载体在柑橘育种中的应用。

本发明提供了一种靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列，能特异靶向FcMYC2基因，将其构建入CRISPR/Cas9载体中，能特异靶向敲除FcMYC2基因，得到敲除FcMYC2基因的柑橘植株。特别是FcMYC2sgRNA-2，可获得纯合的编辑植株，从而有利于柑橘精油合成调控机制的研究。

附图说明

图1为FcMYC2基因敲除植株与对照植株株型及叶片表型分析，WT为锦橙对照，RNAi为FcMYC2干扰植株，箭头所示为叶片油胞；

图2为FcMYC2基因敲除植株与对照植株中编辑位点测序分析，WT为锦橙对照，CC-e1-5为一株sgRNA-1位点编辑植株，有两种编辑方式，分别造成了编辑位点2bp和13bp的缺失；CC-e2-2为一株sgRNA-2位点编辑植株，为纯合编辑，红色箭头所示为插入的T碱基；

图3为FcMYC2基因敲除锦橙与对照植株中LS的表达分析，WT为锦橙对照，CC-e1-2，CC-e1-4和CC-e1-5为sgRNA-1位点编辑植株，CC-e2-2，CC-e2-3和CC-e2-7为sgRNA-1位点编辑植株；

图4为FcMYC2敲除锦橙与对照的类黄酮和柠檬苦素含量分析，类黄酮含量为总的类黄酮含量，柠檬苦素含量为Limonin含量。

具体实施方式

所述FcMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示。

本发明所述FcMYC2是一个调控柑橘柑橘精油合成的关键调控因子，研究表明，下调FcMYC2的表达水平能显著降低柑橘中单萜和倍半萜的合成，同时对类黄酮、柠檬苦素等次生代谢产物的合成造成影响。本发明所述FcMYC2基因仅一个外显子，无内含子。

在本发明中，所述FcMYC2sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-CTCCCTCACGCTTGATACAC-3’；

所述FcMYC2sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-TTGTTCAAAACCGGCCTGAG-3’。

本发明还提供了一种靶向敲除FcMYC2基因的CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体中含有所述sgRNA序列。本发明所述CRISPR/Cas9载体优选以pPIC.5和pPIC.1载体为基本载体，本发明对所述基本载体的来源并没有特殊限定，优选购自江苏吉锐生物技术有限公司。

在本发明所述构建方法中，将所述sgRNA序列设计为寡核苷酸序列；所述寡核苷酸序列包括FcMYC2sgRNA-1Forward oligo和FcMYC2sgRNA-1Reverse oligo，或FcMYC2sgRNA-2Forward oligo和FcMYC2sgRNA-2Reverse oligo。本发明在所述sgRNA序列正链的5’-端加上GATTG，在sgRNA的互补链的5’-端加上AAAC序列，3’-端加上C，具体如表1所示：

表1FcMYC2靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列

得寡核苷酸序列后，本发明将所述寡核苷酸序列退火后连接入线性化的pPIC.5载体中，得载体pPIC.5::FcMYC2sgRNA。本发明得所述寡核苷酸序列后，优选的还包括分别将其与ddH₂O混合，制备成100μM的溶液，然后进行退火。本发明所述退火的体系优选如表2所示：

表2退火反应体系

体系成分	体积
		Forward oligo	10μL
Reverse oligo	10μL
		10X退火缓冲液*	2.5μL
ddH<sub>2</sub>O	2.5μL

注：10X退火缓冲液成分：100mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM EDTA，1MNaCl。

本发明所述退火优选为在95℃下孵育10min，随后取出，在室温下缓冲冷却。将退火后的双链寡核苷酸-20℃保存备用。本发明将得到的所述双链寡核苷酸连接入线性化的pPIC.5载体中，所述线性化优选为利用BbsI酶切pPIC.5载体后得到。本发明对所述连接的方法和体系并没有特殊限定，利用本领域的常规连接方法和体系即可。

得载体pPIC.5::FcMYC2sgRNA后，本发明利用EcoRI和NheI双酶切所述载体pPIC.5::FcMYC2sgRNA，将切下的表达单元AtU6::FcMYC2sgRNA，连接入用EcoRI酶切并去磷酸化的pPICL载体中，得CRISPR/Cas9载体pPICL::FcMYC2sgRNA-1或pPICL::FcMYC2sgRNA-2。本发明对所述去磷酸化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段去磷酸化即可。

本发明对所述方法中转化和再转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述柑橘优选包括柑橘属、金柑属或枳属植物。

本发明还提供了所述sgRNA序列或所述CRISPR/Cas9载体在柑橘育种中的应用。发明所述应用优选与上述方法相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9载体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

sgRNA寡核苷酸链合成与退火

使用CRISPR-P 1.0在线设计工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR/)根据评分系统，在FcMYC2上选择设计2个20bp的sgRNA(FcMYC2sgRNA-1和FcMYC2sgRNA-2)，并通过BLAST验证无非特异性基因。在sgRNA正链的5’-端加上GATTG，在sgRNA的互补链的5’-端加上AAAC序列，3’-端加上C。形成如表1所示的寡核苷酸，并由华大基因公司合成。

取出合成sgRNA寡核苷酸序列，加入适量ddH2O，配成100μM的溶液，按表2的体系配制退火反应液。

将配制好的反应液在95℃孵育10分钟，随后取出，在室温下缓冲冷却。将退火后的双链寡核苷酸-20℃保存备用。

实施例2

敲除柑橘FcMYC2载体的构建

本实施例中所用pPIC.5和pPIC.1购自江苏吉锐生物技术有限公司；所用p1301NG载体参见文献nptⅡ::mgfp5融合基因的构建及其在柑桔遗传转化中的应用(刘小丰，彭爱红，许兰珍等，nptⅡ::mgfp5融合基因的构建及其在柑桔遗传转化中的应用.热带作物学报，2013年第7期)。

用EcoRI/XhoI从p1301NG载体切下“CAMV35S+nptⅡ::mgfp5融合基因”，连接入相同酶切的pPIC.1中，获得适合柑橘转基因使用的具有NPTII选择标记和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的表达载体pPICL(保藏于实验室内，并承诺对公众发放，可用于重复本发明实验)。

分别将两个退火后的双链寡核苷酸连接入用BbsI酶切的pPIC.5载体中，连接入用EcoRI酶切并去磷酸化的pPICL载体中，获得pPICL::FcMYC2sgRNA-1和pPICL::FcMYC2sgRNA-2。

实施例3

敲除FcMYC2基因锦橙的获得

受体材料为锦橙(C.sinensis(L.)Osbeck cv.Jincheng)上胚轴。MS基础培养基型号为M519(PhytoTechnology Laboratories，美国)。所有激素和抗生素都采用过滤灭菌的方式，在培养基使用时加入。具体遗传转化操作步骤如下：

(1)上胚轴的培育

在转化前25d左右，取成熟且未受到伤害的锦橙果实，在加有洗涤剂的温水中仔细清洗干净，室温凉干后在超净工作台上用70％酒精浸泡15min。用刀片切开果实，取出饱满的种子，剥去外种皮和内种皮，放入装有萌发培养基[MS(5％Suc)+9g·L^-1agarpowder，pH5.8]的试管中，28℃培养箱中暗培养。转化前3-5d将取出试管见光培养。

(2)农杆菌准备

转化前3d取出在-80℃保存的农杆菌菌株，在LB固体培养基(含50μg·ml^-1卡那霉素和50μg·ml^-1的利福平)上划单克隆。转化前1d挑取单克隆，在含有LB液体培养基(含50μg·ml^-1卡那霉素和50μg·ml^-1的利福平)中摇菌过夜。转化当天早晨，取1ml过夜培养的菌液，加到50ml相同的LB液体培养基中二次培养。当二次培养的农杆菌菌液达到OD₆₀₀＝0.5时，取出菌液，在50ml的离心管中5000rpm 20min离心收集菌液，然后用激活培养基[MS(3％Suc)+100μMAS，pH5.2]重悬菌株，室温静置备用。

(3)外植体的预培养

农杆菌二次活化期间，在超净台上取出准备好的锦橙上胚轴，放入15cm玻璃培养皿中，切成1-2cm长的外植体。将外植体放到装有液体预培养基[MS(3％Suc)+2mg·L^-1BA+1mg·L^-1IAA+2mg·L^-12,4-D+100μMAS，pH5.8]的三角瓶中，100rpm摇床上室温振荡培养2-4h。

(4)外植体的侵染与共培养

从预培养基中取出外植体，放入带有农杆菌的激活培养基中侵染10-15min，期间轻轻摇晃2-3次。将侵染后的外植体用灭菌滤纸擦干并整齐摆放在共培养基[MS(3％Suc)+3g·L^-1phytagel+2mg·L^-1BA+1mg·L^-1IAA+2mg·L^-12,4-D+100μM AS，pH5.8]上，26℃暗培养2-3天。

(5)外植体筛选培养

外植体共培养3d后，将外植体直接转入筛选培养基[MS(3％Suc)+3g·L^-1phytagel+2mg·L^-1BA+1mg·L^-1IAA+500mg·L^-1Car，pH5.8]中，28℃暗培养10d左右进行光照培养，光周期为16/8h。4周左右继代一次。

(6)再生芽的筛选与嫁接

再生芽用DFP-1荧光蛋白观测镜(NightSea，美国)观察，确认带有绿色荧光的再生芽。待绿色荧光芽长到0.5cm后，微嫁接于1月龄的锦橙试管砧木上，放入带有滤纸桥的嫁接培养基[MS(5％Suc)，pH5.8]上培养。待再生芽长出数片新叶，并形成再生小苗时，将小苗从试管中取出，嫁接于1年生的枳壳砧木上，放在温室中培养。再生幼苗嫁接存活后，及时取叶片提取DNA，通过PCR检测是否为阳性转化植株。

结果如图1所示，FcMYC2基因敲除锦橙叶片油胞非常细小，几乎肉眼看不到精油在油胞中积累。

实施例4

FcMYC2基因敲除锦橙及对照编辑位点测序

为检测FcMYC2基因敲除锦橙是否成功，分别对sgRNA-1位点设计引物sgRNA-1-ES-F和sgRNA-1-ES-R，sgRNA-2位点设计引物sgRNA-2-ES-F和sgRNA-2-ES-R。利用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增，取部分扩增产物测序。若测序结果为纯合峰，则表明该植株未发生编辑，或全部为同一编辑方式，编辑位点为纯合。若测序结果显示产物为杂合峰，则取其余部分扩增产物，重组入pEASY-Blunt Cloning Vector中，转化大肠杆菌，每个植株至少挑30个阳性克隆测序，以获取该植株在该位点的编辑方式。

表3sgRNA-1和sgRNA-2位点测序检测引物

sgRNA名称	合成sgRNA寡核苷酸序列	SEQ ID NO
			sgRNA-1-ES-F	5’-CGATGTGAAGATTGTAGGA-3’	9
sgRNA-1-ES-R	5’-CAGTTAATAAGCAAGATCGAG-3’	10
			sgRNA-2-ES-F	5’-CTTTTCTGAAGCCATGGAA-3’	11
sgRNA-2-ES-R	5’-AATGAACGGGTAACCGACAC-3’	12

测序结果显示如图2和表4所示，转pPICL::FcMYC2sgRNA-1载体获得10株植株。其中6株实现基因编辑，其中4株发生移码突变，1株发现大片段删除，这5株都为完全编辑，无法形成完整的蛋白，植株表现出油胞中无精油储存；1株实现部分编辑，从植株表型可以看出基因功能保留。转pPICL::FcMYC2sgRNA-1载体获得15株植株，10株实现基因编辑。其中4株为同CC-e2-2式的纯合编辑，5株为移码突变，这9株都为完全编辑，无法形成完整的蛋白，植株表现出油胞中无精油储存；1株部分编辑，仅删除掉3个密码子，造成一个氨基酸的缺失，从植株表型可以看出基因功能保留。

表4基因编辑植株叶片油胞形态及编辑特征

实施例5

FcMYC2基因敲除锦橙及对照的柠檬烯合成酶基因表达分析

本例中所涉及的柠檬烯合成酶(Limonene synthase，LS)基因(Cs3g04360)来源于柑橘，柠檬烯是锦橙叶片精油中含量最高的成分，能达到精油成分的50％以上。以Actin(Cs1g05000)作为内参基因。结果如图3所示，FcMYC2基因敲除锦橙中LS的表达量较对照都极显著下调，其中表达分析所设计的引物如表5所示：

表5sgRNA-1和sgRNA-2位点测序检测引物

实施例6

FcMYC2基因敲除锦橙及对照的精油成分分析

利用HS-SPME-GCMS(headspace solid-phase microextraction and gaschromatography-mass spectrometry)的方法对转基因锦橙和对照的叶片进行精油成分测定，设6个生物学重复。精油成分分析前，每个株系取保存的叶片1g，液氮速冻后研磨成粉，倒入20mL的瓶中，加入3mL饱和NaCl溶液和2μL环己酮(内标)，立即用聚四氟乙烯隔热垫密封盖盖紧，上机检测。顶空固相微萃取条件：40℃平衡15min，顶空吸附40min。萃取头的型号为美国Supelco公司的二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS 50/30μm)。吸附完毕后萃取头移入气相色谱仪中250℃解吸5min。气相色谱和质谱型号分别为美国Agilent公司的7890A和5975C，色谱柱为DB-5MS(30m×250μm，0.25μm)。升温程序分三步：35℃保持5min，然后以3℃·min^-1升至180℃并保持2min，再以5℃·min^-1升至240℃并保持2min。进样口温度250℃，不分流进样。载气为氦气(纯度>99.999％)，流速为1mL·min^-1。质谱条件：电子电离(electron ionization，EI)源，电子能量70eV，传输线温度280℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，质量扫描范围m/z 35-400。

获得的质谱数据与NIST 2008和Flavor 2.0质谱库进行比对，鉴定出的挥发性成分的含量计算公式为：挥发性物质含量(μg·g^-1)＝各成分的峰面积×环己酮的质量/(环己酮的峰面积×样品质量)。

结果如表6所示，FcMYC2敲除植株中仅检测到微量单萜柠檬烯(limonene)以及单萜氧化物β-环柠檬醛(β-Cyclocitral)，倍半萜和倍半萜氧化物都未检测到，其它非萜类成分含量也明显低于对照，可见敲除FcMYC2基因能显著降低了植株中精油的含量。

表6敲除FcMYC2基因锦橙及对照叶片精油成分分析(μg·g^-1)

U：未检出

*无标准差的成分仅在6个生物学重复中的一个重复中检出

注：造成部分成分标准差较大的原因是转基因株系间成分含量的差异

实施例7

FcMYC2基因敲除锦橙及对照的类黄酮和柠檬苦素含量分析

利用广靶代谢组学检测方法对FcMYC2基因敲除锦橙及对照的类黄酮和柠檬苦素含量进行了分析，在武汉迈特维尔生物科技有限公司提取并完成检测，FcMYC2基因敲除锦橙及对照各取6个株系，每2个株系设为一组，各3组进行检测。结果如图4所示，FcMYC2基因下调表达的锦橙中类黄酮的含量显著下调，而柠檬苦素含量显著上调。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9载体及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctccctcacg cttgatacac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgttcaaaa ccggcctgag 20

<210> 3

<211> 1563

<212> DNA

<213> Fortunella crassifolia Swing.

<400> 3

atggaagaga ttgtgtcttc gtcttcttcg tcttatccca tgccattttg tcaagaaacc 60

tcaccaactc ttcaacagag acttcaattc attgttcaaa accggcctga gtggtgggtc 120

tattccatct tctggcaacc actgaaagac gtgaacggcc gccttgtttt atcatggggt 180

gatggctatt tccgcgggag caaagatttt gctacaaggg cggcggcagg caaacaaggc 240

gcaggcaacg agcccaaatt cggcttcttt ttggagagga agaaggtgag caaagaggtt 300

caagttcatt tcggagagga tatggacttg gatagaatgg tggatgggga tgttactgac 360

ggggaatggt attacacagt gtcggttacc cgttcatttg caattgggga tggtagtgtt 420

cttggtaggg tgtttagctc tggtgattat gtgtggctaa ctggtgacca tgagctccaa 480

ctgtacgagt gtgaaagagt taaagaagct cgtatgcatg ggattcagac tttggtctgc 540

gtttcaactg cttgtggagt tgttgaattg ggctcttcag atttgatcaa agaagattgg 600

agcttggtgc aattagccaa atctctcttc ggccctgtca ttgctactat gctcacaaag 660

caagtcaatc ttaattctga gagccaactt caactaccca atcccacgac cagaaataat 720

aataatacta ataatgttgc tcctctgcta gacattggaa tgttctcagg tgcaggcgcc 780

ccccaccacc accaccacca tcatcatcaa aaagagtggt cccttgaaga gaattcgaag 840

cagcagaccc gagaagtatc cggcgatgta attaagaaag aacagctagc tgctggtttt 900

ggccgttcat cttcagattc ggggccttct gactcagacg gtcacttcgt ttcaggattt 960

actgacatta atgttacatc caaaaaacga ggaagaaagc caacaagcgg aagagagtct 1020

cctctcaacc acgtggaagc agagaggcag cgccgtgaga ggcttaatca tcgcttctat 1080

gctctccgct ctgtggttcc aaacgtttcc aaaatggaca aagcttcttt actcgctgat 1140

gctgttgcct acatcaaaga gctcagggcc aaggttgacg aacttgaggc gaaactccgt 1200

gaacaggcta gaaaatcaaa ggtggtgtac aacgtttatg acaacaatca aagcactggc 1260

tctacaatca tgatgccaac gtcgtcttcg actactcatc atcttggcat taatattaat 1320

attatggatg tcgatgtgaa gattgtagga tcagaagcca tgatacgtgt tcaatgccca 1380

gatatcaatt atccggcggc taaattgatg gatgtgctca gagatcttga gtttcatgtt 1440

catcatgcca gtgtatcaag cgtgagggag actatgcttc aggatgttgt cgtcaggatt 1500

cccgagggat tgattagtga agaggttatt agaagtgcta ttttccaaag aatgcaaaac 1560

tag 1563

<210> 4

<211> 1563

<212> DNA

<213> Fortunella crassifolia Swing.

<400> 4

atggaagaga ttgtgtcttc gtcttcttcg tcttatccca tgccattttg tcaagaaacc 60

tcaccaactc ttcaacagag acttcaattc attgttcaaa accggcctga gtggtgggtc 120

tattccatct tctggcaacc actgaaagac gtgaacggcc gccttgtttt atcatggggt 180

gatggctatt tccgcgggag caaagatttt gctacaaggg cggcggcagg caaacaaggc 240

gcaggcaacg agcccaaatt cggcttcttt ttggagagga agaaggtgag caaagaggtt 300

caagttcatt tcggagagga tatggacttg gatagaatgg tggatgggga tgttactgac 360

ggggaatggt attacacagt gtcggttacc cgttcatttg caattggtga tggtagtgtt 420

cttggtaggg tgtttagctc tggtgattat gtgtggctaa ctggtgacca tgagctccaa 480

ctgtacgagt gtgaaagagt taaagaagct cgtatgcatg ggattcagac tttggtctgc 540

gtttcaactg cttgtggagt tgttgaattg ggctcttcag atttgatcaa agaagattgg 600

agcttggtgc aattagccaa atctctcttc ggccctgtca ttgctactat gctcacaaag 660

caagtcaatc ttaattctga gagccaactt caactaccca atcccacgac cagaaataat 720

aataatacta ataatgttgc tcctctgcta gacattggaa tgttctcagg tgcaggcgcc 780

ccccaccacc accaccacca tcatcatcaa aaagagtggt cccttgaaga gaattcgaag 840

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ggccgttcat cttcagattc ggggccttct gactcagacg gtcacttcgt ttcaggattt 960

actgacatta atgttacatc caaaaaacga ggaagaaagc caacaagcgg aagagagtct 1020

cctctcaacc acgtggaagc agagaggcag cgccgtgaga ggcttaatca tcgcttctat 1080

gctctccgct ctgtggttcc aaacgtttcc aaaatggaca aagcttcttt actcgctgat 1140

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tctacaatca tgatgccaac gtcgtcttcg actactcatc atcttggcat taatattaac 1320

attatggatg tcgatgtgaa gattgtagga tcagaagcca tgatacgtgt tcaatgccca 1380

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catcatgcca gtgtatcaag cgtgagggag actatgcttc aggatgttgt cgtcaggatt 1500

cccgagggat tgattagtga agaggttatt agaagtgcta ttttccaaag aatgcaaaac 1560

tag 1563

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Claims

1.一种靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列包括：FcMYC2sgRNA-1或FcMYC2sgRNA-2；

所述FcMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示。

2.一种靶向敲除FcMYC2基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体中含有权利要求1所述sgRNA序列。

3.权利要求2所述CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求1所述sgRNA序列设计为寡核苷酸序列；所述寡核苷酸序列包括FcMYC2sgRNA-1Forward oligo和FcMYC2sgRNA-1 Reverse oligo，或FcMYC2sgRNA-2 Forward oligo和FcMYC2sgRNA-2 Reverse oligo；所述FcMYC2sgRNA-1 Forward oligo的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述FcMYC2sgRNA-1 Reverse oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述FcMYC2sgRNA-2 Forward oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述FcMYC2sgRNA-2Reverse oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤(2)所述退火的体系以25μL计，包括：寡核苷酸序列各10μL，10X退火缓冲液2.5μL，ddH₂O 2.5μL；所述退火为在95℃下孵育10min。

5.一种靶向敲除FcMYC2基因的方法，其特征在于，将利用权利要求3或4所述构建方法构建得到的所述CRISPR/Cas9载体pPICL::FcMYC2sgRNA-1或pPICL::FcMYC2sgRNA-2转化农杆菌后，再转化入柑橘上胚轴形成的愈伤组织中，得敲除FcMYC2基因的柑橘植株。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述柑橘包括柑橘属、金柑属或枳属植物。

7.权利要求1所述sgRNA序列或权利要求2所述CRISPR/Cas9载体在柑橘育种中的应用。