CN109750036A - 核苷酸序列、使用其提高蛋白表达效率的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核苷酸序列、一种使用其提高蛋白表达效率的表达载体及用其制备蛋白的方法及应用。用该表达载体无论表达单个蛋白还是多个蛋白，与常规表达载体相比，所表达的可溶性蛋白含量占整个菌体总蛋白量均较高；内毒素含量均较低，仅需清除1次即可达到配苗要求，操作简单。用该表达载体表达后的蛋白制备疫苗均可使靶标动物获得完全保护。

Description

核苷酸序列、使用其提高蛋白表达效率的方法及应用

技术领域

本发明涉及具有特定序列的核苷酸序列，使用该核苷酸序列在大肠杆菌表达系统表达蛋白的方法及应用，属于生物医药领域。

背景技术

随着世界分子生物学研究不断深入，基因表达技术有了很大的提高，迄今为止，人们已经研究开发出多种原核、真核表达系统用以生产外源蛋白。在各种表达系统中，大肠杆菌表达系统因其遗传背景清楚、低成本、操作简便、特征明确、可以大规模发酵培养等优点，使之成为目前最常用的外源蛋白表达系统。

但在外源基因表达过程中，外源基因在宿主细胞中的表达水平受多种因素的影响，如目的基因本身特性、转录效率、mRNA稳定性、翻译效率、蛋白质稳定性等。其中，目的基因的序列影响至关重要，若目的基因序列本身的特征如稀有密码子、终止子、二级结构等常会影响其蛋白的表达水平；若目的基因含有较多的稀有密码子，常会造成重组蛋白的表达水平较低；若稀有密码子集中出现在氨基端，则情况更为严重；目的基因中碱基突变会产生意外的终止密码子从而导致蛋白翻译水平的下降；mRNA转录子中复杂的二级结构也会干扰翻译的起始和延伸。这些原因导致大肠杆菌表达系统对外源基因的原始基因序列直接进行表达时，往往存在表达效率低、表达后的蛋白为包涵体蛋白或可溶性蛋白含量低、以及内毒素含量高等问题。

故而，大肠杆菌表达系统表达蛋白时一般需要先对原始基因序列进行密码子优化，以试图提高表达效率，但即便如此，仍然存在表达效率不高、活性不够、内毒素含量较高需要复杂处理、表达过程中所产生的杂蛋白难以彻底去除等技术难题，用其制备的疫苗会使动物产生免疫反应，从而降低了目的蛋白对机体的免疫效果。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

当本发明的上述核苷酸序列重组到表达蛋白基因序列前，能大大提高mRNA的翻译起始效率，在使用相同蛋白基因序列，不对其基因序列进行密码子优化的条件下，也能高效表达目的蛋白。

本发明还提供了一种核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.1的3′端连接SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

本发明的上述核苷酸序列重组到表达蛋白基因序列前，能进一步提高目的蛋白的表达。

本发明还提供了一种重组载体，其中，所述重组载体起始密码子之后、蛋白编码序列之前为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组载体，其中，所述重组载体起始密码子之后、蛋白编码序列之前为SEQ ID No.1的3′端连接SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种转化子，所述转化子含有上述的重组载体。

本发明还提供了一种使用所述重组载体提高表达效率的表达蛋白的方法，所述方法包括：步骤(1)将含所述蛋白基因的所述重组载体转化大肠杆菌，所述重组载体为重组表达载体；以及步骤(2)表达所述蛋白。

本发明的用所述重组载体表达蛋白的方法，能在使用相同蛋白基因序列，不对其基因序列进行密码子优化的条件下，高效表达目的蛋白；且表达的蛋白为可溶性蛋白，且可溶性蛋白的表达量占整个菌体总蛋白的含量较高。

本发明还提供了使用上述表达方法制备的抗原蛋白。

本发明的上述表达方法制备的抗原蛋白中，内毒素含量很低，使得后续的疫苗制备过程中降低了内毒素去除的难度，使得疫苗的制备操作更简单。

本发明还提供了一种制备疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将所述的抗原蛋白使用非离子表面活性剂处理1次以除去内毒素；步骤(2)将所述去除内毒素的抗原蛋白与佐剂混匀，得到所述疫苗组合物。

本发明的制备疫苗组合物的方法，仅通过使用表面活性剂处理1次，就能使得其中的内毒素含量降低到制备疫苗的标准，降低了操作的复杂性。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

本发明提供了一种核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明的上述核苷酸序列重组到表达蛋白基因序列前，能大大提高mRNA的翻译起始效率，在使用相同蛋白基因序列，不对其基因序列进行密码子优化的条件下，也能高效表达目的蛋白。

本发明还提供了一种核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.1的3′端连接SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

本发明的上述核苷酸序列当连接到启动子之后、蛋白序列之前，能进一步提高目的蛋白的表达。

本发明提供了一种重组载体，其中，所述重组载体起始密码子之后、蛋白编码序列之前为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组载体，其中，所述重组载体起始密码子之后、蛋白编码序列之前为SEQ ID No.1的3′端连接SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

术语“载体(vector)”，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。

本发明提供了一种转化子，所述转化子含有所述的重组载体。

术语“转化子”，指转化重组载体后的受体菌。

本发明提供了一种使用所述重组载体提高表达效率的表达蛋白的方法，所述方法包括：步骤(1)将含所述蛋白基因的所述重组载体转化大肠杆菌，所述重组载体为重组表达载体；以及步骤(2)表达所述蛋白。

术语“大肠杆菌”(菌株)来源于市场上可得到的，包括但不限于BL21(DE3)、B834(DE3)、BLR(DE3)、JM109、XL1Blue、ER2566、Rosetta、GI698，优选为BL21(DE3)。

术语“表达载体”是指能够在适当的宿主细胞中表达目标蛋白或目标RNA的载体，并且是指包含必需调节元件的基因构建体，基因插入物以可表达的方式与所述必需调节元件可操作地连接。

本发明的使用所述重组载体提高表达效率的表达蛋白的方法，其表达的蛋白效率高，同时表达的蛋白为可溶性蛋白，可溶性蛋白的表达量占整个菌体总蛋白的含量较高；且该蛋白中内毒素含量较常规方法制备的抗原蛋白中的内毒素大大降低。

作为本发明的一种实施方式，本发明的使用所述重组载体提高表达效率的表达蛋白的方法中所述蛋白的表达为多蛋白的串联共表达或融合表达。

本发明的使用所述重组载体提高表达效率的表达蛋白的方法中所述步骤(1)中所述蛋白基因的重组表达载体为重组pET28质粒、pColdIII质粒、或pCDFDuet质粒，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

作为本发明的一种实施方式，本发明的使用所述重组载体提高表达效率的表达蛋白的方法所述步骤(1)中所述蛋白基因为鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白、禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、或禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白中的一种或一种以上。

术语“鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白”(简称IBDV VP2)至少包含3组抗原表位即中和性抗原表位、非中和性抗原表位及毒力相关性抗原表位，VP2具有血清型特异性位点，并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体，是IBDV的主要保护性抗原基因。

术语“禽腺病毒”(Fowl adenovirus，FADV)属于腺病毒科，基因组由没有分节的线形双链DNA构成，所引发的临床症状包括病鸡萎顿，蹲伏，羽毛蓬松，冠髯和面部皮肤苍白，生长不良。病理变化以卡他性气管炎和心包积液综合征为特征。该病毒呈无囊膜的球形结构，其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列，每个病毒颗粒包含一个36kb的线性双链DNA，线状双股DNA与核心蛋白形成直径为60～65nm的髓芯，被包裹于衣壳内。衣壳呈二十面体对称，由252个直径8～10nm的壳粒组成,壳粒排列在三角形的面上,每边6个，其中240个为六邻体(非顶点壳粒)，另12个为五邻体基底(顶点壳粒，penton蛋白)。每个五邻体基底上结合着2根长9～77.5nm的纤维突起(fiber-1蛋白和fiber-2蛋白)。

术语“禽减蛋综合征病毒”(Egg Drop Syndrome Virus,EDSV)属于禽腺病毒Ⅲ群，基因组为双股DNA，所引发的临床症状包括使蛋鸡产软壳、薄壳、无壳蛋，产蛋率严重下降。病理变化以卵巢静止不发育和输卵管萎缩为特征。该病毒基因组为约33kb的线状双股DNA，血清型单一，毒株之间抗原性无明显差异。病毒颗粒由结构蛋白构成，核衣壳直径70～80nm，呈二十面体对称，DNA被包于衣壳内。核衣壳由252个壳粒组成，其中240个是六邻体(Hexon蛋白)，构成二十面体的20个面以及棱的大部分。这些壳粒呈棱柱状，宽7nm，长11nm。另外12个是五邻体(Penton蛋白)，分别位于二十面体的12个顶角上。每个Penton蛋白有一条纤维突起(Fiber蛋白)。

“串联共表达”是指将多个基因插入到同一个载体中共表达，例如包括但不限于鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白、禽腺病毒Penton或Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton或Fiber蛋白之间的各种可能组合。

术语“融合表达”是指将多个基因连在一起(优选通过柔性氨基酸)作为一个蛋白，插入到载体中进行表达，例如包括但不限于鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白、禽腺病毒Penton或Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton或Fiber蛋白之间的各种可能组合。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的用所述重组载体表达蛋白的方法中，所述鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白为SEQ ID NO.4所示，所述禽腺病毒Penton蛋白为SEQ IDNO.5所示，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白为SEQ ID NO.6所示，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白为SEQ ID NO.7所示，所述禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白为SEQ ID NO.8所示。

本发明提供了根据所述方法制备的抗原蛋白。

本发明的用所述重组载体表达蛋白的方法制备抗原蛋白中，内毒素含量低，大大低于常规制备方法制备的抗原蛋白中所含的内毒素，为后续疫苗的制备降低了操作难度。

本发明提供了一种制备疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将所述的抗原蛋白使用非离子表面活性剂处理1次以除去内毒素；步骤(2)将所述去除内毒素的抗原蛋白与佐剂混匀，得到所述疫苗组合物。

本发明的制备疫苗组合物的方法，仅使用非离子表面活性剂处理1次表达的抗原蛋白，就能将其中的内毒素含量降低到能够制备疫苗的程度。

作为本发明的一种实施方式，本发明的制备疫苗组合物的方法中，所述步骤(1)中非离子表面活性剂为Triton X-114。

本发明还提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括按所述方法制备的鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白、禽腺病毒Penton或Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton或Fiber蛋白中的至少任一蛋白。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括按所述方法制备的鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白中的至少任一蛋白。

术语“兽医学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除抗原之外的其他所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。

作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；

优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；

优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；

优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；

优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；

优选地，所述佐剂为白油佐剂，制备油包水乳剂；

所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。

本发明疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物还包括由以下抗原组成的组中的一种或多种：鸡新城疫病毒灭活抗原、禽流感病毒灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原。

本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和治疗鸡传染性法氏囊、和/或禽腺病毒、和/或禽减蛋综合征的药物中的应用。

本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病毒、和/或禽腺病毒、和/或禽减蛋综合征病毒感染的药物中的应用。

实施例

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到PBS缓冲液配制：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH7.4，定容1L；化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1单个目的蛋白的制备及鉴定

质粒提取试剂盒购自天根生物，T4DNA Ligase购自BioLab，pColdⅢ_DH5α菌株购自TaKaRa，pET28质粒购自Novagen，琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。

1.1 IBDV VP2蛋白的制备及鉴定

1.1.1 IBDV RNA的提取及VP2基因扩增

按病毒RNA提取试剂盒操作，从感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒成都株的SPF鸡法氏囊中提取IBDV病毒RNA，并用随机引物进行逆转录。根据VP2基因5'和3'末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，合成寡聚核苷酸引物序列F：atgacaaacctgcaagatca、R：tcaccttagggcccggattatgtctttga，以进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，获得1.7kb大小的目的片段，送Invitrogen公司进行测序鉴定，IBDV VP2基因序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

1.1.2 pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株的构建

取上述制备的VP2cDNA进行双酶切，并将酶切后的片段按表1所述方法1、2、3中所对应的引物序列分别连接到pColdⅢ载体上；连接产物直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，并涂布在含有100μg氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即依次为pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)①、②、③菌株。

表1 IBDV VP2蛋白基因引物序列

1.1.3 IBDV VP2蛋白的制备

用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％分别接种pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)①、②、③菌株种子液，37℃培养，待菌液的OD_600nm值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。培养结束后收集菌体，并用PBS重悬菌体，超声破碎，离心收集上清液，分别制得IBDVVP2蛋白，编号依次为IBDV VP2①、②、③。通过凝胶扫描系统分析检测IBDV VP2①、②、③的表达量占整个菌体总蛋白量的含量，并测定AGP效价及内毒素含量，结果见表2。

1.1.4大肠杆菌表达IBDV VP2蛋白内毒素清除

1.5ml离心管中加入0.5ml待处理溶液和5μl终浓度为1％(v/v)的曲拉通X-114(Triton X-114)，涡旋振荡。样品在冰上放置5分钟。再次涡旋振荡冷却的样品后，离心管立即放入37℃水浴中温浴5min，使得产生新的两相。然后，把样品在37℃离心60s，离心后，目的蛋白留在上层，而含有内毒素的洗涤剂将会以油滴的形状残留在离心管底部。整个去除内毒素的操作循环1～3次。测定IBDV VP2蛋白的AGP效价及内毒素含量，结果见表2。

表2 IBDV VP2蛋白内毒素清除前后结果对比

注：*表示可溶性目的蛋白占整个菌体蛋白含量的大小。

由表2可知：用常规方法3表达IBDV VP2蛋白，表达量仅占整个菌体蛋白的10％，AGP效价仅为1∶64，内毒素含量为44827EU/ml，需循环3次清除内毒素才可配苗；而用改进后的方法1、2表达的IBDV VP2蛋白，表达量分别占整个菌体总蛋白的30％、38％，AGP效价为1∶256～1∶512，各自内毒素含量仅为8000、1500EU/ml，仅需1次清除内毒素即可配苗。

1.2 FADV Penton蛋白的制备及鉴定

1.2.1 FADV DNA的提取及Penton基因扩增

按照病毒DNA提取试剂盒说明书，取0.2ml感染禽腺病毒FAV-HN株(Fowlaviadenovirus,strain FAV-HN，保藏号为：CCTCC NO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日)的鸡的肝脏悬液于无菌1.5ml离心管中，加0.4ml VB于样品液中，旋涡混匀，室温静置10分钟。加0.45mlAD buffer于样品液中，用力混匀。将VB柱放入2ml收集管中，取0.6ml混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，将剩余的混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，弃掉2ml收集管，将VB柱放入新的2ml收集管中，加入0.4ml W1buffer，14000g离心30秒，加0.6ml Wash buffer于VB柱，14000g离心30秒，空离3分钟，加入50μl RNase free water置膜中央，静置3分钟，14000g离心1分钟，离心的液体即为DNA基因组。

根据penton基因5'和3'末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，引物序列为F：catgccatggtgggggttgcagccg、R：cccaagcttctactgcaaggtcgcgg，进行PCR。将PCR产物送Invitrogen公司测序，penton基因序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

1.2.2表达载体构建

将测序正确的PCR产物，通过酶切位点按表3所述方法1、2、3中所对应的引物序列分别连接到pET28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为pET28a-FADV-penton/E.Coli BL21(DE3)①、②、③表达菌株。

表3 FADV penton蛋白基因引物序列

1.2.3 FADV penton蛋白的制备

将制备的pET28a-FADV-penton/E.Coli BL21(DE3)①、②、③菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD₆₀₀＝0.4-0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1-1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后收集菌体，并用PBS重悬菌体，超声破碎，离心取上清，分别制得FADV penton蛋白，编号依次为FADV penton①、②、③。通过凝胶扫描系统分析确定FADV penton①、②、③的表达量占整个菌体总蛋白量的含量，并测定AGP效价及内毒素含量，结果见表4。

1.2.4大肠杆菌表达FADV penton蛋白内毒素清除

按实施例1.1.4所述方法清除内毒素，整个操作需循环1～3次。测定FADV penton蛋白的AGP效价及内毒素含量，结果见表4。

表4 FADV penton蛋白内毒素清除前后结果对比

注：*表示可溶性目的蛋白占整个菌体蛋白含量的大小。

由表4可知：用常规方法3表达FADV penton蛋白，表达量仅占整个菌体蛋白的8％，AGP效价仅为1∶32，内毒素含量为56000EU/ml，需循环3次清除内毒素才可配苗；而用改进后的方法1、2表达的FADV penton蛋白，表达量分别占整个菌体总蛋白的30％、40％，AGP效价为1∶128～1∶256，各自内毒素含量仅为9000、1700EU/ml，仅需1次清除内毒素即可配苗。

1.3 FADV Fiber-2蛋白的制备及鉴定

1.3.1 FADV DNA的提取及fiber-2基因扩增

按实施例1.2.1提取FADV DNA基因组，根据fiber-2基因5'和3'末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，引物序列为F：ctccgggccc ctaaaag、R：cgggacggaggccgc，进行PCR。将PCR产物送Invitrogen公司测序，结果如序列表SEQ ID NO.6所示。

1.3.2表达载体构建

将测序正确的PCR产物，通过酶切位点按表5所述方法1、2、3中所对应的引物序列分别连接到pET28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析鉴定，阳性克隆即为pET28a-FADV-fiber-2/E.Coli BL21(DE3)①、②、③表达菌株。

表5 FADV fiber-2蛋白引物序列

1.3.3 FADV fiber-2蛋白的制备

将含pET28a-FADV-fiber-2/E.Coli BL21(DE3)①、②、③菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD_600nm＝0.4-0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1-1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后收集菌体，并用PBS(氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。分别制得FADV fiber-2蛋白，编号依次为FADV fiber-2①、②、③。通过凝胶扫描系统分析确定FADVfiber-2①、②、③的表达量占整个菌体总蛋白量的含量，并测定AGP效价及内毒素含量，结果见表6。

1.3.4大肠杆菌表达FADV Fiber-2蛋白内毒素清除

按实施例1.1.4所述方法清除内毒素，整个操作需循环1～3次。测定FADV Fiber-2蛋白的AGP效价及内毒素含量，结果见表6。

表6 FADV Fiber-2蛋白内毒素清除前后结果对比

注：*表示可溶性目的蛋白占整个菌体蛋白含量的大小。

由表6可知：用常规方法3表达FADV Fiber-2蛋白，表达量仅占整个菌体蛋白的10％，AGP效价仅为1∶64，内毒素含量为48000EU/ml，需循环3次清除内毒素才可配苗；而用改进后的方法1、2表达的FADV penton蛋白，表达量分别占整个菌体总蛋白的30％、38％，AGP效价为1∶256～1∶512，各自内毒素含量仅为8700、1500EU/ml，仅需1次清除内毒素即可配苗。

1.4 EDSV Penton蛋白的制备及鉴定

1.4.1 EDSV DNA的提取及Penton基因扩增

质粒提取试剂盒购自天根生物；T4DNA Ligase购自BioLab；pET28a质粒购自Novagen；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。

按照病毒DNA提取试剂盒说明书，取0.2ml禽减蛋综合征病毒液于无菌1.5ml离心管中，加0.4ml VB于样品液中，旋涡混匀，室温静置10分钟。加0.45ml AD buffer于样品液中，用力混匀。将VB柱放入2ml收集管中，取0.6ml混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，将剩余的混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，弃掉2ml收集管，将VB柱放入新的2ml收集管中，加入0.4ml W1buffer，14000g离心30秒，加0.6ml Wash buffer于VB柱，14000g离心30秒，然后不加buffer再空离3分钟，将VB柱放入新的1.5mlEP管中，加入50μl RNase freewater置膜中央，静置3分钟，14000g离心1分钟，离心的液体即为DNA基因组。

根据Penton基因5'和3'末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，引物序列为F：atggagtcttttgtgccgccgcctc、R：ttattgcaaagtagcgctagaaatc，进行PCR。将PCR产物送Invitrogen公司测序，Penton基因序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

1.4.2表达载体构建

将测序正确的PCR产物，通过酶切位点按表7所述方法1、2、3中所对应的引物序列分别连接到pET28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析鉴定，阳性克隆即为pET28a-EDSV-Penton/E.Coli BL21(DE3)①、②、③表达菌株。

表7 EDSV Penton蛋白引物序列

1.4.3 EDSV Penton蛋白的制备

将含pET28a-EDSV-Penton/E.Coli BL21(DE3)①、②、③菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中，同时LB培养基中含有5-10ng/ml四环素用于分子伴侣蛋白的诱导表达，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD_600nm＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后收集菌体，并用PBS(氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。分别制得EDSV Penton蛋白，编号依次为EDSV Penton①、②、③。通过凝胶扫描系统分析确定EDSVPenton①、②、③的表达量占整个菌体总蛋白量的含量，并测定AGP效价及内毒素含量，结果见表8。

1.4.4大肠杆菌表达EDSV Penton蛋白内毒素清除

按实施例1.1.4所述方法清除内毒素，整个操作需循环1～3次。测定EDSV Penton蛋白的AGP效价及内毒素含量，结果见表8。

表8 EDSV Penton蛋白内毒素清除前后结果对比

注：*表示可溶性目的蛋白占整个菌体蛋白含量的大小。

由表8可知：用常规方法3表达EDSV Penton蛋白，表达量仅占整个菌体蛋白的45％，AGP效价仅为1∶32，内毒素含量为23000EU/ml，需循环3次清除内毒素才可配苗；而用改进后的方法1、2表达的EDSV Penton蛋白，表达量分别占整个菌体总蛋白的45％、55％，AGP效价为1∶256～1∶512，各自内毒素含量仅为9200、1560EU/ml，仅需1次清除内毒素即可配苗。

1.5 EDSV Fiber蛋白的制备及鉴定

1.5.1 EDSV DNA的提取及Fiber基因扩增

按照实施例1.4.1提取EDSV DNA基因组，根据Fiber基因5'和3'末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，引物序列F：atgaagcgactacggttggaccctg、R：ctactgtgctccaacatatgtaaag，进行PCR。将PCR产物送Invitrogen公司测序，Fiber基因序列如序列表SEQ ID NO.8所示。

1.5.2表达载体构建

将测序正确的PCR产物，通过酶切位点按表9所述方法1、2、3中所对应的引物序列分别连接到pET28a质粒上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序鉴定，阳性克隆即为pET28a-EDSV-Fiber/E.Coli BL21(DE3)①、②、③表达菌株。

表9 EDSV Fiber蛋白引物序列

1.5.3 EDSV Fiber蛋白的制备

将含pET28a-EDSV-Fiber/E.Coli BL21(DE3)①、②、③菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中诱导表达，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD_600nm＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。分别制得EDSV Fiber蛋白，编号依次为EDSV Fiber①、②、③。通过凝胶扫描系统分析确定EDSV Fiber①、②、③的表达量占整个菌体总蛋白量的含量，并测定HA效价及内毒素含量，结果见表10。

1.5.4大肠杆菌表达EDSV Fiber蛋白内毒素清除

按实施例1.1.4所述方法清除内毒素，整个操作需循环1～3次。测定EDSV Fiber蛋白的HA效价及内毒素含量，结果见表10。

表10 EDSV Fiber蛋白内毒素清除前后结果对比

注：*表示可溶性目的蛋白占整个菌体蛋白含量的大小。

由表10可知：用常规方法3表达EDSV Fiber蛋白，表达量仅占整个菌体蛋白的30％，HA效价仅为1∶512，内毒素含量为51000EU/ml，需循环3次清除内毒素才可配苗；而用改进后的方法1、2表达的EDSV Fiber蛋白，表达量分别占整个菌体总蛋白的30％、40％，HA效价为1∶1024～1∶2048，各自内毒素含量仅为9600、1800EU/ml，仅需1次清除内毒素即可配苗。

综上所述，改进后的方法1、2表达单个蛋白时，不仅可提高可溶性蛋白的表达含量，还可降低内毒素含量，仅需1次清除即可完成培苗，工艺简单、高效，且方法2的效果优于方法1的。

实施例2多个目的蛋白的制备及鉴定

2.1 IBDV VP2-FADV Fiber-2串联蛋白的制备及鉴定

按表11所述方法1、2、3中所对应的引物序列分别连接到pCDFDuet质粒上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析鉴定，阳性克隆即为pET28a-IBDV VP2-FADV Fiber-2/E.ColiBL21(DE3)①、②、③表达菌株。

表11 IBDV VP2-FADV Fiber-2蛋白引物序列

按实施例1相应蛋白的制备方法制备IBDV VP2-FADV Fiber-2蛋白，编号依次为IBDV VP2-FADV Fiber-2①、②、③蛋白，通过凝胶扫描系统分析确定IBDV VP2-FADVFiber-2①、②、③的表达量占整个菌体总蛋白量的含量，并测定IBDV AGP效价、FADV AGP效价及内毒素含量，并进行内毒素清除，结果见表12。

表12 IBDV VP2-FADV Fiber-2蛋白内毒素清除前后结果对比

由表12可知：用常规方法3表达IBDV VP2-FADV Fiber-2蛋白，表达量仅占整个菌体蛋白的6％，IBDV、FADV AGP效价均仅为1∶64，内毒素含量为54000EU/ml，需循环3次清除内毒素才可配苗；而用改进后的方法1、2表达的IBDV VP2-FADV Fiber-2蛋白，表达量分别占整个菌体总蛋白的30％、40％，IBDV、FADV AGP效价为1∶256～1∶512，各自内毒素含量仅为10100、2500EU/ml，仅需1次清除内毒素即可配苗。

2.2 IBDV VP2-EDSV Fiber串联蛋白的制备及鉴定

按表13所述方法1、2、3中所对应的引物序列分别连接到pCDFDuet质粒上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析鉴定，阳性克隆即为pET28a-IBDV VP2-EDSV Fiber/E.ColiBL21(DE3)①、②、③表达菌株。

表13 IBDV VP2-EDSV Fiber蛋白引物序列

按实施例1相应蛋白的制备方法制备IBDV VP2-EDSV Fiber蛋白，编号依次为IBDVVP2-EDSV Fiber①、②、③蛋白，通过凝胶扫描系统分析确定IBDV VP2-EDSV Fiber①、②、③的表达量占整个菌体总蛋白量的含量，并测定IBDV AGP效价、EDSV HA效价及内毒素含量，结果见表14。

表14 IBDV VP2-FADV Fiber-2蛋白内毒素清除前后结果对比

由表14可知：用常规方法3表达IBDV VP2-EDSV Fiber蛋白，表达量仅占整个菌体蛋白的7％，IBDV AGP效价仅为1∶64，EDSV HA效价仅为1∶256，内毒素含量为51000EU/ml，需循环3次清除内毒素才可配苗；而用改进后的方法1、2表达的IBDV VP2-EDSV Fiber蛋白，表达量分别占整个菌体总蛋白的30％、38％，IBDV AGP效价为1∶256～1∶512，EDSV HA效价为1∶1024～1∶2048，各自内毒素含量仅为9900、3000EU/ml，仅需1次清除内毒素便可配苗。

2.3 FADV Fiber-2-EDSV Fiber串联蛋白的制备及鉴定

按表15所述方法1、2、3中所对应的引物序列分别连接到pCDFDuet质粒上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析鉴定，阳性克隆即为pET28a-FADV Fiber-2-EDSV Fiber/E.Coli BL21(DE3)①、②、③表达菌株。

表15 FADV Fiber-2-EDSV Fiber蛋白引物序列

按实施例1相应蛋白的制备方法制备FADV Fiber-2-EDSV Fiber蛋白，编号依次为FADV Fiber-2-EDSV Fiber①、②、③蛋白，通过凝胶扫描系统分析确定FADV Fiber-2-EDSVFiber①、②、③的表达量占整个菌体总蛋白量的含量，并测定FADV AGP效价、EDSV HA效价及内毒素含量，结果见表16。

表16 FADV Fiber-2-EDSV Fiber蛋白内毒素清除前后结果对比

注：*表示可溶性目的蛋白占整个菌体蛋白含量的大小。

由表16可知：用常规方法3表达FADV Fiber-2-EDSV Fiber蛋白，表达量仅占整个菌体蛋白的4％，IBDV AGP效价仅为1∶64，EDSV HA效价仅为1∶256，内毒素含量为57000EU/ml，需循环3次清除内毒素才可配苗；而用改进后的方法1、2表达的FADV Fiber-2-EDSVFiber蛋白，表达量分别占整个菌体总蛋白的31％、41％，IBDV AGP效价为1∶256～1∶1024，EDSV HA效价为1∶1024～1∶2048，各自内毒素含量仅为10000、2800EU/ml，仅需1次清除内毒素便可配苗。

实施例3亚单位疫苗的制备

将实施例1、2制备的蛋白作为抗原，用PBS进行适当稀释，抗原∶吐温/96∶4作为水相；白油∶司本∶硬脂酸铝/94∶6∶1.5(V∶V∶m)作为油相，其中油相、吐温等使用前121℃、30min灭菌。按水相∶油相/1∶2混合，乳化机以17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液并使其终浓度为0.01％，即为疫苗，各组分终浓度见表19。

表19疫苗配比

实施例4含IBDV VP2蛋白的亚单位疫苗免疫效果评价

取21日龄的SPF鸡100只，分成10组，10只/组，第1～12组分别经颈部皮下注射免疫疫苗1-1～1-3、疫苗6-1～6-3、疫苗7-1～7-3，0.3ml/只；第10组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，第1～10组，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCC AV7株)购于中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只解剖，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少4只鸡发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。结果见表20。

表20单苗或串联表达联苗中法氏囊部分的免疫原性试验结果

结果显示，第13组对照组全部发病死亡，而第1～12组(免疫疫苗1-1～1-3、6-1～6-3、7-1～7-3)在免疫后21天，可以完全保护鸡传染性法氏囊病强毒的攻击。表明本发明提供的方法1、2制备的IBDV VP2蛋白所组成的疫苗可使遭受鸡传染性法氏囊强毒攻击时获得完全保护。

实施例5含FADV Penton蛋白亚单位疫苗的免疫效果评价

取21日龄的SPF鸡40只，分成4组，10只/组，第11～14组分别经颈部皮下注射免疫实施例3制备的疫苗2-1～2-3，0.3ml/只；第14组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表21。

表21单苗或串联表达联苗中禽腺病毒综合征部分的免疫原性试验结果

结果显示，第14组对照组全部发病死亡，而第11～13组(分别免疫疫苗2-1～2-3)免疫组均产生了较好的免疫保护效果，表明本发明提供的方法1、2制备的FADV Penton蛋白所组成的疫苗可使遭受禽腺病毒强毒攻击时获得完全保护。

实施例6含FADV Fbier-2蛋白亚单位疫苗的免疫效果评价

取21日龄的SPF鸡100只，分成10组，10只/组，第15～23组分别经颈部皮下注射免疫实施例3制备的疫苗3-1～3-3、6-1～6-3、8-1～8-3，0.3ml/只；第14组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表22。

表22单苗或串联表达联苗中禽腺病毒综合征部分的免疫原性试验结果

结果显示，第14组对照组全部发病死亡，而第15～23组免疫组均产生了较好的免疫保护效果，可使遭受禽腺病毒强毒攻击时获得完全保护。表明本发明提供的方法1、2制备的FADV Fbier-2蛋白所组成的疫苗可实现对鸡群提供有效的免疫保护。

实施例7含EDSV Penton蛋白亚单位疫苗的免疫效果评价

取21日龄的SPF鸡40只，分成4组，10只/组，第24～26组分别经颈部皮下注射免疫疫苗4-1～4-3，免疫剂量为0.5ml，第27组颈部皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫前及免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清中禽减蛋综合征中和抗体效价。结果见表23。

表23单苗或串联表达联苗中禽腺病毒综合征部分的免疫原性试验结果

结果显示，第27组对照组免后21日中和抗体效价为0，而第24～26组免疫组对免疫鸡均产生了较高的中和抗体。表明本发明提供的方法1、2制备的EDSV Penton蛋白所组成的疫苗可实现对鸡群提供有效的免疫保护。

实施例8含EDSV Fiber蛋白亚单位疫苗的免疫效果评价

取21日龄的SPF鸡100只，分成10组，10只/组，第28～36组分别经颈部皮下注射免疫疫苗5-1～5-3、7-1～7-3、8-1～8-3，免疫剂量为0.5ml，第37组颈部皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫前及免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清禽减蛋综合征HI抗体效价。结果见表24。表24单苗或串联表达联苗中禽腺病毒综合征部分的免疫原性试验结果

结果表明，第37组对照组免后21日HI抗体效价为0，而第28～36组免疫组在免疫后21天均产生了较高的HI抗体效价，表明本发明提供的方法1、2制备的禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白作为抗原制备的疫苗可有效保护鸡群产蛋综合征的发生。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 核苷酸序列、使用其提高蛋白表达效率的方法及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

cctagcgga 9

<210> 2

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

aaggag 6

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

gaggaa 6

<210> 4

<211> 1359

<212> DNA

<213> IBDV

<400> 4

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240

aagttcgatc agatgctcct gacggcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300

ctagtgagtc gaagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360

aatggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420

tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480

ggggaagggg taaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgagactc 540

ggtgacccca ttcccgctat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600

gacaggccca gagtctacac cataaccgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660

caagcaggtg gagtaacaat cacactgttc tcagctaaca tcgatgccat tacaagcctc 720

agcatcgggg gggaactcgt gttccaaaca agcgtccaag gccttatact gggtgctacc 780

atctacctta taggctttga tgggacggcg gtaattacca gagctgttgc cgcagacaat 840

gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900

ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga catccaaaag tggtggtcag 960

gcgggggatc agatgtcatg gtcagctagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc 1020

aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtggcct acgaaagagt ggcaacagga 1080

tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggcctacaag ggagtacaca 1260

gactttcgcg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa aattgcagga 1320

gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ctaaggtga 1359

<210> 5

<211> 1578

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(Fowl adenovirus)

<400> 5

atgtgggggt tgcagccgcc gacgtcgatt ccgccgcctc ctccgccgac cgagttaacg 60

ccctcgacct atccggcgat ggtgaacggc tatccgcctc cggccgcgtc cgcgcagagc 120

tgttcctcta gcggcggtca gagcgagctg tatatgcccc ttcagcgggt gatggcccct 180

acggggggac ggaacagcat taagtatcgc gattacacgc cgtgtcgtaa caccaccaag 240

ctgttttacg tagacaacaa ggctagcgat atcgatacgt ataataaaga cgccaaccat 300

agcaatttcc gcaccacggt gatccataac caggatctgg acgcggacac ggccgccacc 360

gagtccatcc agttggactc tcgttcttgc tggggtggtg acctgaaaac cgctgttcgt 420

accaactgcc cgaacgtttc ttctttcttc cagtctaact ctgttcgtgt tcgtatgatg 480

tggaagcgcg acccgccgac tagcacggct cctccgagcg cggtaggcag cggctattcg 540

gtgcccggcg cgcagtacaa gtggtacgac ctgacggtcc ccgagggtaa ctacgcgctg 600

tgcgaactga tagacctgct caacgagggc atcgtgcagc tctacctgag cgagggtcgc 660

cagaacaacg tgcaaaaatc ggacatcggg gtcaagttcg acacacgcaa cttcggcttg 720

ctccgcgacc ccgtgacggg actggtaact ccgggcacgt acgtgtacaa gggttaccac 780

cccgacatcg tgctgctgcc cggatgcgcg atcgacttta cgtacagccg cctgagcctg 840

ctcctgggca tagggaagcg cgagccctac tcgaaggggt tcgttattac ctacgaggat 900

ctgcagggag gggatatccc ggctctgctg gacctcgact ccgtcgacgt gaacgacgct 960

gacggtgaag tgatcgagct cgacaacgct gctccccttt tacatgacag cgcgggcgtg 1020

tcgtataacg tcatttacga ccaggtgacg ggtaaacccg tgacggcgta tcgatcgtgg 1080

atgttggctt acaacgtacc taactcgcag gccaatcaga cgaccttgct gacggtgccc 1140

gatatggcgg gcgggatcgg ggcgatgtac acgtccctgc ccgatacctt tatcgcgcct 1200

accgggttca aggaagataa cacgaccaac ctttgcccgg tcgtcggcat gaacctgttc 1260

cccacctaca ataaaattta ttaccaggcg gcgtccacgt acgtgcaacg cctggaaaat 1320

tcctgccagt cggccacagc cgccttcaac cgctttcccg aaaacgagat tctgaagcaa 1380

gcgcccccca tgaatgtttc gtccgtgtgc gataaccaac ccgccgtcgt tcagcagggt 1440

gtgttgcctg tgaagagctc gctccccgga ctgcagcgcg tgctgatcac agacgaccag 1500

cgtcgtccga taccctacgt gtataagtct atcgcgacgg ttcagccgac cgttctgagt 1560

tccgcgacct tgcagtag 1578

<210> 6

<211> 1440

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(Fowl adenovirus)

<400> 6

atgctgcgtg ctccgaaacg tcgtcactct gaaaacggtc agccggaaac tgaagctggt 60

ccgtctccgg ctccgatcaa acgtgctaaa cgtatggttc gtgcttctca gctggacctg 120

gtttacccgt tcgactacgt tgctgacccg gttggtggtc tgaacccgcc gttcctgggt 180

ggttctggtc cgctggttga ccagggtggt cagctgaccc tgaacgttac cgacccgatc 240

atcatcaaaa accgttctgt tgacctggct cacgacccgt ctctggacgt taacgctcag 300

ggtcagctgg ctgttgctgt tgacccggaa ggtgctctgg acatcacccc ggacggtctg 360

gacgttaaag ttgacggtgt taccgttatg gttaacgacg actgggaact ggctgttaaa 420

gttgacccgt ctggtggtct ggactctacc gctggtggtc tgggtgtttc tgttgacgac 480

accctgctgg ttgaccaggg tgaactgggt gttcacctga accagcaggg tccgatcacc 540

gctgactctt ctggtatcga cctggaaatc aacccgaaca tgttcaccgt taacacctct 600

accggttctg gtgttctgga actgaacctg aaagctcagg gtggtatcca ggctggttct 660

tctggtgttg gtgtttctgt tgacgaatct ctggaaatcg ttaacaacac cctggaagtt 720

aaaccggacc cgtctggccc actgaccgta agcgctaacg gtctgggtct gaaatacgac 780

tctaacaccc tggctgttac cgctggtgct ctgaccgttg ttggtggtgg ttctgtttct 840

accccgatcg ctaccttcgt ttctggttct ccgtctctga acacctacaa cgctaccatc 900

gttaactctt cttctcaccc gttctcttgc gcttactacc tgcagcagtg gaacgttcag 960

ggtctgctgt tcacctctct gtacgttaaa ctggactcta ccaccatggg tacccgtccg 1020

ggtgacaact cttctgctaa cgctaaatgg ttcaccttct gggtttctgc ttacctgcag 1080

cagtgcaacc cgagcggtat ccaggcgggt accgtaagcc cgtctaccgc tgctctggct 1140

gacttcgaac cgatggctaa ccgttctgtt tcttctccgt ggacctactc tgctaacgct 1200

tactaccagc cgtcttcggg tgagttccag gtcttcaccc cggtcgttac cggtgcttgg 1260

aacccgggta acatcggtat ccgtgttctg ccggttccgg ttaccgcttc tggtgaccgt 1320

tacaccctgc tgtgctactc tctgcagtgc accaactctt ctatcttcaa cccggctaac 1380

tctggtacca tgatcgttgg tccggttctg tactcttgcc cggctgcttc tgttccgtaa 1440

<210> 7

<211> 1359

<212> DNA

<213> EDSV

<400> 7

atggagtctt ttgtgccgcc gcctcgtgtg tttgctccga cggagggacg aaatagtatt 60

acctacaatg cctttgctcc tctacaagac acaacgaacc tgtattacat agacaacaaa 120

acatcagata ttgaggccct aaaccttaca aatgatcaca gtgattattt tacaaatatc 180

atacaaaatg ccgatgtgtc tccgacagaa tcggcaactc aagacatcaa attagatgag 240

cggtctaggt ggtcaggaaa tttggttact ttgttaaaaa caaattgccc taatgttact 300

gaatacaata atagtaataa ggtacgcgtt cgcctaatga ctgataagac tgatcctcag 360

aatcctgttt atgaatgggt agaaattgaa atacctgagg gtaactatac tggcaatgaa 420

attattgatt tgttaaataa tgctgtgctg gagcactatt tgaaagttgg aaggcagaat 480

aacgttgagg tgtctgatat tggagtgaaa tttgatacta gaatgtttgg gttggggcaa 540

gatcctgtaa cttctttgat tgtgccgggt cggtatactt ataaagcgtt ccatccagat 600

attgtacttt tgcccaattg cggtgtagat tttacctttt cacggttaaa caatattctt 660

ggcattcgga agcgtaatcc ttacatgaaa ggttttataa ttatgtatga tgatttagaa 720

caaggcaata ttccagcgct gttagataca acgaaatatc cggcagaggt attacctgtt 780

ctggcagatg ctgataatgt ctcatataga gtgcaacaaa tatctactga tcccccggct 840

tggcagactg aatatcggtc atgggctctt gcttatcata ataagggtcc tatacgcacg 900

actactcttc tgacagttcc tgatattact ggtggattgg gacagctata ttggtcaatt 960

ccagattctt ttaaagctcc tattactttt acaagtaata cgtccaatac agaaacactg 1020

cctgtcgttg ccatgcagtt gtttccatta caacaacgta ttgtatacaa tgcgtctgca 1080

gtatattctc agttggtgga gcagatgacc aataacacca aagtatttaa tagatttcca 1140

aacaatgaga ttcttatgca gccaccgtac gggaccctta catggattag cgaaaatgtc 1200

ccttctgttg cagatcacgg ccagcagccg ttgaaaaaca gcctgccggg tgttcaaaga 1260

ataactctga ccgacgatag gcggcgcact tgcccgtaca tctacaaatc tttggcccgc 1320

gtatctcctc gggtgatttc tagcgctact ttgcaataa 1359

<210> 8

<211> 1935

<212> DNA

<213> EDSV

<400> 8

atgaagcgac tacggttgga ccctgatcct gtttatccct tcgggacgag cgagacgatc 60

ccaatgcctc cgttcatcga agctgggtca ggtctagcag taaatggact gcagctttat 120

ataacagctc aagctccggt gggcttcacc aacaaagctg taacattaaa atatggagat 180

ggattggaag taaatgaaaa tggagaactc atagctacgg cttcttcggc agtaaagcca 240

ccactccatt ttgatagggg ttatatagtg ttaaatcttc aggatccatt gggtgttatt 300

gatgggaagc ttggggtcaa gttaggccct ggggttcaca tcaatggtga aggggctgtg 360

gcggtagaat cccctgtgga ccccattaca cttgatacgg ctggtagaat tactttaaat 420

tatggcacag gtttaaatgt gagtgatgga aaattacgac tagtaagtcc tgaaagtccg 480

ctcacacttc ttggaaatgg caaggttgct cttaattttg gtaattcaat ggagcttgtg 540

caagggacct tgcaactgaa agctccgcta aatcctttgt tcatgacccc cgcgggtgcg 600

atcggcttaa gggtggatga catgtttaac atttctgaag gtttactctc cttcaagatg 660

ccatccgatc caatttcgtt taatgctgat ggtatgttgt ctttgaacac aaatgacaca 720

ttgcaaacaa ctggtgggct gttagggttg accgaacctg ccaagccgtt aaaattggcc 780

gatggcaagt taggtgtaaa tgtgggcctt gggttagcgg tttctaatgg gtcattgact 840

gtaaatgcag ggcaggggtt gactattcga aataatgcgg tggcagttaa tgggggcaac 900

acgcttgctt ttaataatta tggagaggtg gaacttaaaa accctagaaa ccccataagc 960

ctgacccaag atggtgaatt ggttttgata atcggtcatg gcctaacaac ccttgatgga 1020

cggctcactc tacttaccgc ttcgacctct ccgatagctg tagggccaac cggtgttaca 1080

tttaatgtta caccgagtga tttttacttt ttatctagta aattagctct caatgttgag 1140

acccgtggcg gcttagaaaa aagtgacact ggtttaaaaa ttaaacgtgc ggcccctctc 1200

agtatcacat ctgatggtga gttgactttg gcttatgatt ccacggattt tcaggtgaca 1260

gaaaacggcc tagccctaaa ggtatctccg acgcagaccc ctctcaccag aataatttct 1320

atgggaaata acttgtttga ttctggttat gagatttttg cttcatgtcc gcagaacaaa 1380

gcagcaaagg ttgcagggta tgtgtattta acatcggttg gtgggcttgt acatgggacc 1440

attcagatta aagctactgc ggggtattgg tttacggggg gaaacagcgt gcaggaaagt 1500

atcaggtttg gattggtgtt gtgtcctttt agtgctcgcg accccactgc taacctgtca 1560

ggctggccag cgccagtagt gtggagtggt gatagcaata ctcccctata ttttgcggcc 1620

aatgccatta gttataccaa taaccgtgta aatcttgcag ttaccggtaa cttttacaag 1680

gaggaaaccg aattgccggg ttacactcgt cattctttct gccctaccgg gaccaccgga 1740

atgaatttta cagggggtaa tttgtatgtg tgtccgtgca ctgtaaatac aggggcaacc 1800

acactgaatg ccatttatat ggtgtttgtg attactcaat cagctttggg aactaatttc 1860

tttgcttcta acacccctcc caacacattc tttttaactc cccccattcc ctttacatat 1920

gttggagcac agtag 1935

Claims (10)

1.一种核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.一种核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.1的3′端连接SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

3.一种重组载体，其中，所述重组载体起始密码子之后、蛋白编码序列之前为权利要求1所述的核苷酸序列。

4.一种重组载体，其中，所述重组载体起始密码子之后、蛋白编码序列之前为权利要求2所述的核苷酸序列。

5.一种转化子，所述转化子含有权利要求3所述的重组载体。

6.一种转化子，所述转化子含有权利要求4所述的重组载体。

7.一种使用权利要求3或4所述重组载体提高表达效率的表达蛋白的方法，所述方法包括：

步骤(1)将含所述蛋白基因的所述重组载体转化大肠杆菌，所述重组载体为重组表达载体；以及

步骤(2)表达所述蛋白；

优选地，所述蛋白的表达为多蛋白的串联共表达或融合表达；

优选地，所述步骤(1)中所述蛋白基因的重组表达载体为重组pET28质粒、pColdIII质粒、或pCDFDuet质粒，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤(1)中所述蛋白基因为鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白、禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、或禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白中的一种或一种以上；

优选地，所述鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白为SEQ ID NO.4所示，所述禽腺病毒Penton蛋白为SEQ ID NO.5所示，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白为SEQ ID NO.6所示，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白为SEQ ID NO.7所示，所述禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白为SEQ ID NO.8所示。

9.根据权利要求7或8所述方法制备的抗原蛋白。

10.一种制备疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)将权利要求9所述的抗原蛋白使用非离子表面活性剂处理1次以除去内毒素；

步骤(2)将所述去除内毒素的抗原蛋白与佐剂混匀，得到所述疫苗组合物；

优选地，所述步骤(1)中非离子表面活性剂为Triton X-114。