CN105734001B - 一种o抗原糖链延长的甲型副伤寒沙门氏菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种O抗原糖链延长的甲型副伤寒沙门氏菌及其应用。该方法包括如下步骤:灭活甲型副伤寒沙门氏菌的O抗原链长控制酶基因cld,得到O‑抗原链长控制酶基因cld缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌;使鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2在O‑抗原链长控制酶基因cld缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中过表达,进而使甲型副伤寒沙门氏菌的O抗原糖链长度延长。本发明用O抗原糖链长度延长的甲型副伤寒沙门氏菌制备的甲型副伤寒沙门氏菌O多糖‑重组融合蛋白结合疫苗rCTB45733‑OPSSpty50973和rEPA4573‑OPSSpty50973均能诱导小鼠产生抗甲型副伤寒沙门氏菌的特异性抗体,抗体滴度明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种O抗原糖链延长的甲型副伤寒沙门氏菌及其应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella spp.)是一种具有高度传染性革兰氏阴性肠道致病菌,具有较强的内毒素及侵袭力,属胞内寄生菌,可通过侵袭小肠粘膜致病,引起肠热症、胃肠炎以及败血症等,严重者可导致肠出血或穿孔。对于沙门氏菌大多数血清型,半数感染量在105-108之间,但在暴发流行时,感染量一般都低于103个菌体,有时甚至少于100个细菌。在亚洲国家中,尤其在我国,由甲型副伤寒沙门氏菌引起的肠道疾病所占比例上升趋势明显,研究发现,平均每年每100000人中就有150例甲型副伤寒沙门氏菌感染病例。
目前治疗伤寒及副伤寒的主要方式是抗生素,但随着耐药性尤其是多重耐药菌株的出现,常规的抗生素治疗遇到了巨大的挑战,而免疫接种相关疫苗则是有效的预防手段。目前,针对伤寒沙门氏菌的口服减毒活疫苗、Vi荚膜多糖疫苗以及Vi多糖蛋白结合疫苗研发进展迅速,并且有多种产品上市,但这些疫苗均不能对甲型副伤寒沙门氏菌产生有效的交叉保护作用。目前,还没有针对甲型副伤寒沙门氏菌的疫苗被批准上市。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组菌。
本发明提供的重组菌,是将鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2导入O抗原链长控制酶基因cld缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中得到的。
上述重组菌中,所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶的氨基酸序列与SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列相似性超过90%;
所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶CldLT2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;
所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶CldLT2的编码基因序列如SEQ ID No.1所示。
上述重组菌中,所述O-抗原链长控制酶基因cld缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌可以通过Red重组技术敲除cld基因,也可以通过同源重组敲除cld基因,或者通过插入灭活cld基因,还可以通过诱变获得cld基因缺陷的菌株,优选为通过Red重组技术敲除cld基因的方法获得。
上述重组菌中,所述O-抗原链长控制酶基因cld缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌的获得方法具体包括如下步骤:
(1)制备线性打靶DNA片段1,其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示,其中含有cat基因;
(2)将pKD46质粒转化至Salmonella.paratyphi菌中,得到的重组菌记作S.paratyphi/pKD46;
(3)诱导所述S.paratyphi/pKD46菌株中Red重组系统表达,再将所述线性打靶DNA片段1转化至所述S.paratyphi/pKD46菌株中,所述线性打靶DNA片段1替换所述S.paratyphi/pKD46菌株中的cld基因,得到的重组菌记作S.paratyphi cld::cat/pKD46;
(4)去除S.paratyphi cld::cat/pKD46菌株中的pKD46质粒,得到的重组菌记作S.paratyphi cld::cat;
所述S.paratyph cld::cat是将cld基因序列替换成cat基因序列的S.paratyphi;
(5)将质粒pCP20转化至S.paratyphi cld::cat中,去除cat基因,得到的重组菌记作S.paratyphiΔcld;
所述S.paratyphiΔcld是缺失cld基因的S.paratyphi。
本发明的另一个目的是提供一种延长甲型副伤寒沙门氏菌O抗原糖链长度的方法。
本发明提供的延长甲型副伤寒沙门氏菌O抗原糖链长度的方法包括如下步骤:培养上述所述的重组菌,使所述cldLT2基因表达,使重组菌合成糖链长度延长的O抗原。
本发明还有一个目的是提供一种O抗原。
本发明提供的O抗原是按照上述所述的方法制备得到的。
上述所述的O抗原在制备预防或辅助预防甲型副伤寒沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明最后一个目的是提供一种一步生物交联法制备用于预防和/或治疗甲型副伤寒沙门氏菌引起的疾病的疫苗的方法。
本发明提供的一步生物交联法制备用于预防和/或治疗甲型副伤寒沙门氏菌引起的疾病的疫苗包括如下步骤:
(1)灭活甲型副伤寒沙门氏菌的O抗原链长控制酶基因cld和O-抗原连接酶基因waaL,得到O抗原链长控制酶基因cld和O-抗原连接酶基因waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌;
(2)将鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2、脑膜炎奈瑟球菌的O-寡糖转移酶基因pglL和重组融合蛋白的编码基因导入所述O抗原链长控制酶基因cld和O-抗原连接酶基因waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中,得到重组菌;
(3)培养所述重组菌,得到O抗原修饰的重组融合蛋白,将所述O抗原修饰的重组融合蛋白制备成目的疫苗。
上述方法中,所述O抗原链长控制酶基因cld和O-抗原连接酶基因waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌可以通过Red重组技术敲除cld和waaL基因获得,也可以通过同源重组敲除cld和waaL基因获得,或者通过插入灭活cld和waaL基因获得,还可以通过诱变获得cld和waaL基因缺陷菌株获得。其中,优选为通过Red重组技术技术获得。
上述方法中,所述O抗原链长控制酶基因cld和O-抗原连接酶基因waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌构建方法具体包括如下步骤:
(1)制备线性打靶DNA片段2,其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示,其中含有kan基因;
(2)将pKOBEG质粒转化至上述所述的S.paratyphiΔcld菌株中,得到的重组菌记作S.paratyphiΔcld/pKOBEG;
(3)诱导所述S.paratyphiΔcld/pKOBEG菌株中Red重组系统表达,再将所述线性打靶片段2转化至所述S.paratyphiΔcld/pKOBEG菌株中,所述线性打靶片段2替换所述S.paratyphiΔcld/pKOBEG菌株中的waaL基因,得到的重组菌记作S.paratyphi ΔcldwaaL::kan/pKOBEG;
(4)去除S.paratyphiΔcld waaL::kan/pKOBEG菌株中的pKOBEG质粒,得到的重组菌记作S.paratyphiΔcld waaL::kan;
所述S.paratyphiΔcld waaL::kan是将waaL基因序列替换成kan基因序列的S.paratyphiΔcld;
(5)将质粒pCP20转化至S.paratyphiΔcld waaL::kan菌株中,去除kan基因,得到S.paratyphiΔcldΔwaaL;
所述S.paratyphiΔcldΔwaaL是缺失cld基因和waaL基因的S.paratyphi。
上述方法中,所述重组融合蛋白包含N端信号肽、载体蛋白和包含脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE第63位丝氨酸O糖基化位点在内的肽段。
上述方法中,所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段。
上述方法中,所述细菌毒素蛋白为绿脓杆菌外毒素蛋白A、霍乱毒素、白喉毒素或破伤风毒素。
上述方法中,所述细菌毒素蛋白的无毒突变体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体、白喉毒素无毒突变体;所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位、破伤风毒素C蛋白。
上述方法中,所述载体蛋白具体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体或霍乱毒素B亚单位。
上述方法中,所述包含脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE第63位丝氨酸O糖基化位点在内的肽段为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE第45-73位氨基酸的肽段。
上述方法中,所述N端信号肽可以是PelB、DsbA、STⅡ、OmpA、PhoA、LamB、SpA、Enx等信号肽;所述N端信号肽具体是DsbA信号肽。
上述方法中,所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2、脑膜炎奈瑟球菌的O-寡糖转移酶基因pglL和重组融合蛋白的编码基因可以分别构建重组表达载体并导入所述cld和waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中,也可以将其构建至同一个重组表达载体并导入所述cld和waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中,还可以通过将其分别整合进宿主基因组的方式导入所述cld和waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中;所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2、脑膜炎奈瑟球菌的O-寡糖转移酶基因pglL和重组融合蛋白的编码基因可以由诱导型启动子控制,也可以由组成型启动子控制。
上述方法中,所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2、脑膜炎奈瑟球菌的O-寡糖转移酶基因pglL具体是通过pETtac28-pglL-cldLT2重组表达载体导入所述O抗原链长控制酶基因cld和O-抗原连接酶基因waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中的。
上述方法中,所述重组融合蛋白的编码基因具体是通过pMMB66EH-rCTB4573重组表达载体或pMMB66EH-rEPA4573重组表达载体或pMMB66EH-rCTB45733重组表达载体导入所述O抗原链长控制酶基因cld和O-抗原连接酶基因waaL双缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中的。
上述方法中,所述pETtac28-pglL-cldLT2重组表达载体的构建方法:用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2基因和pMMB66EH载体进行双酶切,连接,得到过度载体pMMB66EH-cldLT2;以所述过度载体pMMB66EH-cldLT2为模板,扩增得到cldLT2的表达盒,用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ对cldLT2的表达盒和pET28a载体进行双酶切,连接,得到pETtac28-cldLT2载体;用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对脑膜炎奈瑟球菌的O-寡糖转移酶基因pglL和pKK223-3载体进行双酶切,连接,得到pKK223-3-pglL载体;以所述pKK223-3-pglL载体为模板,扩增得到PglL的表达盒;用限制性内切酶BglⅡ将cldLT2的表达盒和所述pETtac28-cldLT2载体进行双酶切,连接,得到所述pETtac28-pglL-cldLT2重组表达载体。
上述方法中,所述pMMB66EH-rEPA4573重组表达载体的构建方法:将重组绿脓杆菌外毒素蛋白A融合蛋白rEPA4573的编码基因连入pMMB66EH载体的多克隆位点,得到所述pMMB66EH-rEPA4573重组表达载体。
上述方法中,所述pMMB66EH-rCTB4573重组表达载体的构建方法:将重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白rCTB4573的编码基因连入pMMB66EH载体的多克隆位点,得到所述pMMB66EH-rCTB4573重组表达载体。
上述方法中,所述pMMB66EH-rCTB45733重组表达载体的构建方法:将重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白rCTB45733的基因连入pMMB66EH的多克隆位点,得到所述pMMB66EH-rCTB45733重组表达载体。
上述方法中,所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶CldLT2的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示;所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶CldLT2的编码基因序列如SEQ ID No.1所示;
所述脑膜炎奈瑟球菌寡糖转移酶PglL的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示;所述脑膜炎奈瑟球菌寡糖转移酶PglL的编码基因序列如SEQ ID No.7所示;
所述重组绿脓杆菌外毒素蛋白A融合蛋白rEPA4573的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;所述如SEQ ID No.4所示序列中自N端起第1-19位为DsbA信号肽的氨基酸序列;第20-631位氨基酸为绿脓杆菌外毒素蛋白A的无毒突变体的氨基酸序列;第632-636位为柔性接头序列;第637-665位氨基酸为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位多肽的氨基酸序列,第666-674位为柔性接头序列和6×His标签序列;所述重组绿脓杆菌外毒素蛋白A融合蛋白rEPA4573的编码基因序列如SEQ ID No.3所示;
所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白rCTB4573的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示;所述如SEQ ID No.6所示序列中自N端起第1-19位为DsbA信号肽的氨基酸序列;第20-122位为霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列;第123-127位为柔性接头序列;第128-156位为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位多肽的氨基酸序列;第157-166位为柔性接头和6×His标签序列;所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白rCTB4573的编码基因序列如SEQID No.5所示;
所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白rCTB45733的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示;所述如SEQ ID No.10所示序列中自N端起第1-19位为DsbA信号肽的氨基酸序列;第20-122位为霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列;第123-127位为柔性接头序列;第128-222位为3个重复的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位多肽的氨基酸序列;第223-232位为柔性接头和6×His标签序列;所述重组霍乱毒素B亚单位融合蛋白rCTB45733的编码基因序列如SEQ ID No.9所示;
所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE第45-73位氨基酸的肽段的氨基酸序列如SEQID No.14所示;所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE第45-73位氨基酸的肽段的编码基因序列如SEQ ID No.13所示。
按照上述所述的方法制备的疫苗也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种延长甲型副伤寒沙门氏菌O多糖糖链长度并用于制备结合疫苗的方法。通过替换其O抗原链长控制酶基因,延长其O抗原糖链长度的方法,使其O抗原集中分布于某一较高分子量范围。同时本发明还进一步提供了用这种糖链延长的O抗原通过一步生物交联法制备甲型副伤寒多糖-蛋白结合疫苗的方法。该方法以O抗原链长被延长的、且O抗原链接酶基因waaL缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌为宿主菌,在此宿主菌中共表达重组融合蛋白基因和脑膜炎奈瑟球菌O寡糖转移酶基因pglL,利用宿主菌甲型副伤寒沙门氏菌的O抗原以O-糖基化修饰的形式直接修饰重组融合蛋白,获得甲型副伤寒沙门氏菌的O抗原修饰的重组融合蛋白,制备了甲型副伤寒多糖-蛋白结合疫苗rCTB45733-OPSSpty50973和rEPA4573-OPSSpty50973,本发明制备的疫苗均能诱导小鼠产生抗甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50973OPS的特异性抗体,且与只注射OPS组的小鼠相比,抗体滴度明显提高。
附图说明
图1为S.paratyphi CMCC50973cld基因敲除的PCR鉴定图。
图2为S.paratyphi CMCC50973cld基因替换前后LPS的银染图。
图3为替换cld基因后重组融合蛋白糖基化修饰的检测图。
图4为重组CTB融合蛋白多位点糖基化修饰的检测图。
图5为rEPA4573-OPSSpty50973纯化效果的检测图。
图6为rCTB45733-OPSSp50973纯化效果的检测图。
图7为糖蛋白缀合物的免疫原性评价。
图8为S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL的分子鉴定。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实验材料:甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50973株(Salmonella.paratyphiCMCC50973),购于中国医学细菌保藏管理中心。
pET-22b质粒购自Novagen公司,产品目录号为69744。
pKOBEG质粒在文献“A rapid method for efficient gene replacement in thefilamentous fungus Aspergillus nidulans[J].Nucleic Acids Res.2000Nov 15;28(22):E97”中公开过,公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得,该质粒为温度敏感型质粒,氯霉素抗性。
pKD3质粒在文献“Datsenko,K.A.and B.L.Wanner,One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl AcadSci U S A,2000,97(12):p.6640-5.”中公开过,公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
pKD46质粒在文献“Datsenko,K.A.and B.L.Wanner,One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl AcadSci U S A,2000,97(12):p.6640-5.”中公开过,公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。pKD46质粒的复制子对温度敏感,37℃培养时丢失,此质粒含有编码Red重组系统的三个重组酶,由阿拉伯糖启动子控制。
pCP20质粒在文献“Datsenko,K.A.and B.L.Wanner,One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl AcadSci U S A,2000,97(12):p.6640-5.”中公开过,公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。pCP20质粒的复制子对温度敏感,42℃培养时丢失,此质粒含有编码FLP重组酶的DNA,由温敏启动子控制,42℃培养时诱导FLP重组酶表达,同时该质粒丢失。
氢氧化铝佐剂Rehydragel LV购自General Chemical公司。
实施例1、甲型副伤寒沙门氏菌O抗原糖链长度延长的方法
一、敲除甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50973株的O抗原链长控制酶基因cld
1、线性打靶DNA片段1的制备
1)PCR引物的设计
根据GeneBack公布的S.paratyphi ATCC9150基因组序列(CP000026)设计cld基因(第887812至888789位)的打靶片段,敲除甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50973的cld基因。在cld基因的上游和下游截取500bp作为同源臂,通过PCR扩增两端含有500bp同源序列和FRT位点的氯霉素抗性基因的打靶片段,用50973cld up 5'和50973cld down 3'鉴定cld基因是否敲除,具体引物设计方案如表1。
表1、甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50973株cld基因敲除所用引物
2)线性打靶DNA片段1的获得
以质粒pKD3为模板,用引物50973cld cat 5’和50973cld cat 3'扩增两端带有cld基因上下游41bp同源臂以及FRT位点的氯霉素抗性基因片段50973cld cat;以甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50973基因组DNA为模板,用50973cld up5’和50973cld up3’扩增出cld上游500bp同源臂50973cld up,同时用50973cld down 5’和50973cld down 3’扩增出cld下游500bp同源臂50973cld down,然后通过PCR融合50973cld cat、50973cld up和50973clddown三个片段,从而得到线性打靶DNA片段1(SEQ ID No.11)。
PCR反应体系为50μL,其中Q5超保真DNA聚合酶0.5μL、5Xbuffer10μL、模板1μL、dNTP 4μL、引物各2.5μL、去离子水29.5μL;
PCR反应条件:98℃20s;98℃10s,55℃10s,72℃50s,30个循环;72℃5min。得到如SEQ ID No.11所示的线性打靶DNA片段1。用1%琼脂糖凝胶电泳分离,从凝胶上切下目标条带,用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物,操作步骤按说明书进行。
2、O-抗原链长控制酶基因cld缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphiCMCC50973Δcld)的获得
1)S.paratyphi CMCC50973/pKD46的制备
(1)将S.paratyphi CMCC50973接种于LB液体培养基中,37℃过夜培养后,按1:100转接到LB液体培养基中,放于37℃培养至OD600达到0.6。
(2)离心收集菌体,用高压灭菌过的10%甘油(v/v)洗涤四次,最后用400μL的10%甘油重悬菌体,即可获得电击转化用的感受态细胞,分装待用。
(3)将pKD46质粒电击转化至制备的S.paratyphi CMCC50973感受态细胞中,涂于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上,30℃培养过夜,得到的阳性克隆即为S.paratyphi CMCC50973/pKD46菌株。
2)S.paratyphi CMCC50973cld::cat菌株的获得
(1)将上述得到的S.paratyphi CMCC50973/pKD46于30℃培养过夜,以1:100传代于含氨苄青霉素的LB液体培养基。
(2)在OD600约为0.2时加入终浓度为0.2%(w/v)的L-阿拉伯糖诱导Red重组系统的表达,待OD600值为0.6时,制备S.paratyphi CMCC50973/pKD46感受态细胞,步骤同前所述。
(3)取10μL由上述步骤1得到的线性打靶DNA片段1电击转化至分装待用的S.paratyphi CMCC50973/pKD46感受态细胞中。
(4)快速加入提前预冷的1mL LB培养基中,30℃复苏2.5h左右,然后涂布于含终浓度为30μg/mL氯霉素的LB平板,放于30℃培养箱培养过夜。
(5)筛选阳性克隆,并用引物50973cld cat 5'和50973cld cat 3'进行PCR鉴定,野生菌不能扩增出片段,cld基因被cat基因替换后鉴定大小为1100bp,根据PCR结果选取S.paratyphi CMCC50973中cld基因被cat基因替换的阳性单克隆,得到缺失突变株S.paratyphi CMCC50973cld::cat/pKD46。
3)S.paratyphi CMCC50973Δcld菌株的获得
(1)将阳性克隆S.paratyphi CMCC50973cld::cat/pKD46接种于含终浓度为30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,37℃培养传代三次(每次培养12h时间),即可除去pKD46质粒,获得S.paratyphi CMCC50973cld::cat菌株。
(2)按照上述方法制备S.paratyphi CMCC50973cld::cat电转感受态细胞,并将质粒pCP20电转入S.paratyphi CMCC50973cld::cat电转感受态细胞,然后涂布含有氨苄青霉素的LB平板,获得S.paratyphi CMCC50973cld::cat/pCP20菌株。
(3)挑取S.paratyphi CMCC50973cld::cat/pCP20单克隆于LB液体培养基,30℃培养至OD600约为0.6时,转至42℃培养过夜。
(4)将42℃培养过夜的菌液在LB平板上划线分离单克隆,并在LB平板和含有氯霉素的LB平板上挑单克隆,选取在LB平板上生长而在含氯霉素LB平板上不生长的单克隆,用引物50973cld up 5'和50973cld down 3'进行PCR鉴定,野生菌S.paratyphiCMCC50973PCR鉴定片段大小为2028bp,cld基因敲除后鉴定大小为1100bp,PCR鉴定结果如图1。将阳性克隆命名为S.paratyphi CMCC50973Δcld。
二、O抗原糖链延长的甲型副伤寒沙门氏菌的获得及表型鉴定
1、鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2表达载体的构建
根据GeneBack公布的鼠伤寒沙门氏菌(GeneBank号:NC_003197.1)O抗原链长控制酶基因cld(第2156832至2157815位)的核苷酸序列,合成如SEQ ID No.1所示DNA序列,并将此基因命名为cldLT2,SEQ ID No.1所示cldLT2基因序列编码的O抗原链长控制酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
将合成的cldLT2基因用EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连入pMMB66EH表达载体(购自ATCC,ATCC37620),构建过度载体pMMB66EH-cldLT2,以pMMB66EH-cldLT2为模板,设计引物66tac 5’和66tac 3’,将带有cldLT2基因的表达框扩增,并连接到pET28a(购自Novagen)的XbaⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,从而构建表达载体pETtac28-cldLT2。引物序列如下:
66tac 5’:AAAATCTAGAGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCA;
66tac 3’:TTTTCTCGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAA。
测序表明:在pET28a载体的Xba Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点间插入SEQ ID No.1所示的序列,表明载体正确。
2、甲型副伤寒沙门氏菌LPS长度检测
将上述制备的S.paratyphi CMCC50973Δcld电转感受态细胞电击转化上述获得的pETtac28-cldLT2,涂布含有卡那霉素的LB平板,挑取阳性克隆37℃培养,当OD600约为0.6时加终浓度为1mM的IPTG诱导cldLT2基因表达。
诱导10h后,取1mL培养物,离心收集菌体,用PBS洗一次,加入100μL裂解缓冲液(10%SDS 2mL,2-巯基乙醇0.4mL,100%甘油1mL,2M Tris-HCL pH6.85mL,10%溴酚蓝20μL,ddH2O 1.6mL)充分混匀,沸水煮10min,加4μL 20mg/mL的蛋白酶K,60℃反应1-2h,取15μL上样,进行SDS-PAGE,分离胶为15%,浓缩胶为4%,待溴酚蓝出胶后30分钟终止电泳。
将上述的聚丙烯酰胺凝胶于固定液中放置过夜,加入增敏液作用30min,用去离子水洗3次,每次15min,加硝酸银溶液作用20min,用去离子水洗2次,每次1min,加显影液进行显色,最后终止反应,用去离子水洗。同时以野生株S.paratyphi CMCC50973为对照。
结果如图2所示,银染实验结果表明,野生株S.paratyphi CMCC50973的LPS分布于较低分子量的区域,而将其cld基因替换为cldLT2后,在较高分子量区域出现相对较集中的LPS条带,说明通过将S.paratyphi CMCC50973的cld基因替换为cldLT2后,其O抗原糖链得到明显延长。
实施例2、一步生物交联法制备甲型副伤寒沙门氏菌O抗原-重组融合蛋白结合疫苗及其应用
一、O抗原连接酶基因waaL缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌的构建
(一)线性打靶DNA片段2的制备
1、PCR引物的设计和合成
依据NCBI上甲型副伤寒沙门氏菌50973株(S.paratyphi CMCC50973)全基因组序列(NC_006511)中的waaL基因(GeneBank号为CP000026的第3696236-3697450位)及其上、下游序列,在waaL基因的上游(5’端)和下游(3’端)各设计一对引物,即73waaLu1/73waaLu2和73waaLd1/73waaLd2。为了方便操作,限制性酶切位点BamH Ⅰ和Sal Ⅰ将被添加到上游同源臂up的引物末端,限制性酶切位点Hind Ⅲ和Xho Ⅰ被添加到下游同源臂down的引物末端。同时,为了验证突变体是否够构建成功,设计了基因组上waaL基因上下游同源臂以外的一对引物(73waaLw1/73waaLw2),内部检测引物(73waaLn1/73waaLn2)以及kan基因引物(Kan1/Kan2)同时进行测序验证,上述引物序列如表2所示(下划线所示的序列为酶切识别位点)。
表2、引物序列
2、线性打靶DNA片段2的构建
1)以甲型副伤寒沙门氏菌50973株基因组DNA为模板,用73waaLu1/73waaLu2和73waaLd1/73waaLd2分别扩增出waaL基因的上下游同源臂up片段和down片段。PCR程序如下:94℃10min;94℃30s,50℃30s,72℃30s,30个循环;72℃10min。
2)pETKan的构建
人工合成如SEQ ID No.12中第578-2073位核苷酸分子所示的kan基因片段,用限制性内切酶Sal Ⅰ和Hind Ⅲ分别双酶切kan基因片段和pET-22b质粒,连接,得到重组质粒,将其命名为pETKan,将pETKan送测序,结果正确。
3)用限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切up片段,得到基因片段1;用限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切质粒pETKan,得到载体大片段1;将基因片段1与载体大片段1连接,得到中间载体1;
用限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切down片段,得到基因片段2;用限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切中间载体1,得到载体大片段2;将基因片段2与载体大片段2连接,得到中间载体2。
4)用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切中间载体2,得到两侧为同源臂中间含kan基因的目的打靶DNA片段,该片段的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。SEQ ID No.12中自5’末端起第7-571位核苷酸为up片段,第578-2073位核苷酸为kan基因,第2080-2543位核苷酸为down片段。
以SEQ ID No.12所示的DNA片段为模板,以73waaLu1和73waaLd2为引物,再次PCR扩增打靶片段,即可获得浓度高达300ng/μL的线性打靶DNA片段2(SEQ ID No.12)。
(二)S.paratyphi CMCC50973/pKOBEG的构建
由于pKOBEG质粒含有编码λ-Red重组系统所需各种酶,将pKOBEG质粒电击转化至S.paratyphi CMCC50973感受态细胞中,涂于氯霉素抗性(pKOBEG质粒的抗性,氯霉素)的LB平板上,30℃培养过夜,得到的阳性克隆,将其命名为S.paratyphi CMCC50973/pKOBEG菌株。
(三)线性打靶DNA片段2电击转化S.paratyphi CMCC50973/pKOBEG
1、将S.paratyphi CMCC50973/pKOBEG接种于含终浓度为30μg/mL氯霉素低盐LB液体培养基30℃培养过夜,并按照体积比1:100将其传代于低盐LB液体培养基,继续培养。
2、在步骤1的培养液在OD600值达到0.6前1h加入终浓度为1mmol/L的L-阿拉伯糖诱导Red重组系统的表达。
3、待步骤2的培养液OD600值为0.6时,取5μL步骤(一)制备得到的300ng/μL的线性打靶DNA片段2电击转化S.paratyphi CMCC50973/pKOBEG。
4、在转化后的细胞中快速加入提前预冷的1mL低盐LB液体培养基,30℃复苏2.5h左右,然后涂布于含有50ug/mL浓度的卡那霉素的LB平板,放于30℃培养箱培养过夜,筛选出阳性克隆。
5、将阳性克隆接种于液体LB培养基(有卡那霉素抗性,浓度为50μg/mL)中,42℃培养传代两次(每次培养12h时间),即可除去pKOBEG质粒,最终获得含卡那霉素抗性waaL缺失突变株,将其命名为S.paratyphi CMCC50973waaL::kan。
(四)将编码FRT位点特异性重组酶的质粒pCP20电击转入S.paratyphiCMCC50973waaL::kan,在含50ug/mL浓度的氯霉素及不含卡那霉素的LB平板上30℃培养,筛选CmrKms(氯霉素抗性、卡那霉素敏感)的阳性克隆。
(五)将步骤(四)筛选到的阳性克隆,转入液体LB中42℃培养12h,即可获得不含卡那霉素和质粒pCP20的目的基因缺失突变株,将其命名为S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL,即得到waaL基因缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌。
二、waaL基因缺失和cld基因缺失的甲型副伤寒沙门氏菌的构建
(一)线性打靶DNA片段2的制备
同上述步骤(一)的步骤。
(二)S.paratyphi CMCC50973Δcld/pKOBEG的构建
由于pKOBEG质粒含有编码λ-Red重组系统所需各种酶,将pKOBEG质粒电击转化至S.paratyphi CMCC50973Δcld感受态细胞中,涂于氯霉素抗性(pKOBEG质粒的抗性,氯霉素)的LB平板上,30℃培养过夜,得到的阳性克隆,将其命名为S.paratyphi CMCC50973Δcld/pKOBEG菌株。
(三)线性打靶DNA片段2电击转化S.paratyphi CMCC50973Δcld/pKOBEG
1、将S.paratyphi CMCC50973Δcld/pKOBEG接种于含终浓度为30μg/mL氯霉素低盐LB液体培养基30℃培养过夜,并按照体积比1:100将其传代于低盐LB液体培养基,继续培养。
2、在步骤1的培养液在OD600值达到0.6前1h加入终浓度为1mmol/L的L-阿拉伯糖诱导Red重组系统的表达。
3、待步骤2的培养液OD600值为0.6时,取5μL步骤(一)制备得到的300ng/μL的线性打靶DNA片段2电击转化S.paratyphi CMCC50973Δcld/pKOBEG。
4、在转化后的细胞中快速加入提前预冷的1mL低盐LB液体培养基,30℃复苏2.5h左右,然后涂布于含有50ug/mL浓度的卡那霉素的LB平板,放于30℃培养箱培养过夜,筛选出阳性克隆。
5、将阳性克隆接种于液体LB培养基(有卡那霉素抗性,浓度为50μg/mL)中,42℃培养传代两次(每次培养12h时间),即可除去pKOBEG质粒,最终获得含卡那霉素抗性waaL缺失突变株,将其命名为S.paratyphi CMCC50973Δcld waaL::kan。
(四)将编码FRT位点特异性重组酶的质粒pCP20电击转入S.paratyphi CMCC50973Δcld waaL::kan,在含50ug/mL浓度的氯霉素及不含卡那霉素的LB平板上30℃培养,筛选CmrKms(氯霉素抗性、卡那霉素敏感)的阳性克隆。
(五)将步骤(四)筛选到的阳性克隆,转入液体LB中42℃培养12h,即可获得不含卡那霉素和质粒pCP20的目的基因缺失突变株,将其命名为S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL。
二、S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL的分子鉴定
分别以S.paratyphi CMCC50973Δcld、S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL基因组DNA为模板,分别用一对waaL内部引物(73waaLn1/73waaLn2),一对waaL外部引物(73waaLw1/73waaLw2)和kan引物(kan1/kan2)进行PCR验证。结果如图8所示,图8中50973ΔwaaL代表S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL;50973代表S.paratyphi CMCC50973Δcld。
结果表明:以S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL的基因组DNA为模板,以waaL内部引物为引物进行PCR扩增,没有目的条带;而以S.paratyphi CMCC50973Δcld的基因组DNA为模板,以waaL内部引物为引物进行PCR扩增,具有目的条带。并且由于S.paratyphiCMCC50973ΔcldΔwaaL敲除了waaL基因,以S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL的基因组DNA为模板,以waaL外部引物为引物进行PCR扩增得到的条带比以S.paratyphi CMCC50973Δcld的基因组DNA为模板,以waaL外部引物为引物进行PCR扩增得到的条带小。由于最终去除了Kan抗性基因,以S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL的基因组DNA为模板,以kan引物为引物进行PCR扩增,没有目的条带。
上述结果证明成功构建waaL基因缺失和cld基因缺失的甲型副伤寒沙门氏菌50973突变株S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL。
三、糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌的构建
1、rEPA4573和rCTB4573表达载体的构建
根据GeneBack公布的绿脓杆菌外毒素A(AE004091.2)氨基酸序列,将其信号肽(前25位氨基酸)替换为DsbA信号肽,删除其553位的E,同时552位的L突变为V,同时在其C端融合脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位氨基酸所示的多肽序列(定义为Pla)和6×His tag标签,从而构建重组绿脓杆菌外毒素蛋白A融合蛋白(rEPA4573),优化后的rEPA4573的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示,其中第1-19位为DsbA信号肽的氨基酸序列;第20-631位氨基酸为绿脓杆菌外毒素蛋白A的无毒突变体的氨基酸序列;第637-665位氨基酸为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位多肽的氨基酸序列,第666-674位为柔性接头序列和6×His标签序列;优化后的rEPA4573的编码基因序列如SEQ IDNo.3所示。将人工合成的rEPA4573的编码基因序列用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,连入pMMB66EH表达载体(ATCC,ATCC37620),构建pMMB66EH-rEPA4573载体。
测序表明:在pMMB66EH表达载体的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点间插入SEQ ID No.3所示的序列,表明载体正确。
根据GeneBack公布的霍乱毒素B亚单位(CTB)(X76390.1)氨基酸序列,将其信号肽(前21位氨基酸)替换为DsbA信号肽,同时在重组融合蛋白的C端融合脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位的多肽序列和6×His tag标签,从而构建重组CTB融合蛋白(rCTB4573),优化后的重组CTB融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示,其中第1-19位为DsbA信号肽的氨基酸序列,第20-122位为霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列,第128-156位为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位多肽的氨基酸徐序列,第157-166位为柔性接头和6×His标签序列;优化后的重组CTB融合蛋白的编码基因序列如SEQ ID No.5所示。将人工合成的重组CTB融合蛋白编码基因用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,连入pMMB66EH表达载体(ATCC,ATCC37620),构建pMMB66EH-rCTB4573载体。
测序表明:在pMMB66EH表达载体的EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点间插入SEQ ID No.5所示的序列,表明载体正确。
2、cldLT2和pglL串联表达载体的构建根据GeneBack公布的脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的氨基酸序列(JN200826.1),全基因合成其DNA序列。脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示,脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的编码基因序列如SEQ ID No.7所示。
将人工合成的PglL编码基因用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,连入pKK223-3载体(购自瑞典Uppasla Pharmacia LKB Biotechniligy AB),利用引物223tac-box5'和223tac-box3'扩增得到PglL的表达盒,并将其连入实施例1中获得的pETtac28-cldLT2的Bgl Ⅱ位点,从而构建pETtac28-pglL-cldLT2重组表达载体。引物序列如下:
223tac-box5':ATCGAGATCTACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAG;
223tac-box3':ATCGAGATCTGTCTCATGAGCGGATACATATTTG。
3、pglL表达载体的构建
将上述步骤2制备的pglL的表达盒连入pET28a(购自Novagen)的BglⅡ位点,从而构建pETtac28-pglL重组表达载体。
4、S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573/pETtac28-pglL-cldLT2的构建
依次将pMMB66EH-rEPA4573和pETtac28-pglL-cldLT2质粒电击转化按照上述所述方法制备的S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL电转感受态,从而构建糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573/pETtac28-pglL-cldLT2。
5、S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573/pETtac28-pglL的构建
依次将pMMB66EH-rEPA4573和pETtac28-pglL质粒电击转化按照上述所述的方法制备S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL电转感受态,从而构建糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573/pETtac28-pglL。
6、S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573/pETtac28-pglL-cldLT2的构建
依次将pMMB66EH-rCTB4573和pETtac28-pglL-cldLT2质粒电击转化按照上述所述的方法制备S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL电转感受态,从而构建糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573/pETtac28-pglL-cldLT2。
7、S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573/pETtac28-pglL的构建
依次将pMMB66EH-rCTB4573和pETtac28-pglL质粒电击转化按照上述所述的方法制备S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL电转感受态,从而构建糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573/pETtac28-pglL。
8、S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573的构建
将pMMB66EH-rCTB4573质粒电击转化按照上述所述的方法制备S.paratyphiCMCC50973ΔwaaL电转感受态,从而构建糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphiCMCC50973ΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573。
9、S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573的构建
将pMMB66EH-rEPA4573质粒电击转化按照上述所述的方法制备S.paratyphiCMCC50973ΔwaaL电转感受态,从而构建糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphiCMCC50973ΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573。
四、rEPA4573和rCTB4573糖基化情况的检测
挑取糖基工程菌单克隆,接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基,37℃培养至OD600约为0.6时,加入终浓度为1mM的IPTG,并降温至16℃诱导20h。
次日取上述16℃诱导20h的菌液1mL,离心取菌体,用1X还原样缓悬起,沸水浴10min,进行SDS-PAGE电泳,电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上,20V恒压转印1h,用anti-His鼠源单克隆抗体(购自Sigma,货号A7058)检测,具体步骤参见分子克隆实验指南。
从图3可以看出,将S.paratyphi CMCC50973自身的cld基因替换为cldLT2后,糖基化修饰的rEPA4573-OPSSpty50973和rCTB4573-OPSSpty50973的分子量明显提高,说明替换为cldLT2后,糖蛋白的多糖蛋白比得到明显提高。
五、通过串联O-糖基化位点提高甲型副伤寒沙门氏菌O多糖-重组CTB融合蛋白中多糖的比例
1、含三个P1a序列的重组CTB融合蛋白(rCTB45733)表达载体的构建
为了提高糖蛋白的多糖蛋白比,本发明将三个脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位的多肽序列(P1a序列)串联融合至CTB的C端,即rCTB45733。重组CTB融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示,其中第1-19位为DsbA信号肽的氨基酸序列;第20-122位为霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列;第123位至127位为柔性接头序列;第128-222位为3个重复的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位多肽的氨基酸序列;第223-232位为柔性接头和6×His标签序列;重组CTB融合蛋白的编码基因序列如SEQID No.9所示。其中脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(NC_003112.2)第45-73位的多肽的编码基因序列如SEQ ID No.14所示,该基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.13所示。
将人工合成的重组CTB融合蛋白的编码基因序列用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,连入pMMB66EH表达载体(ATCC,ATCC37620),构建pMMB66EH-rCTB45733载体。
测序表明:在pMMB66EH表达载体的EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点间插入SEQ ID No.9所示的序列,表明载体正确。
2、S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL/pMMB66EH-rCTB45733/pETtac28-pglL-cldLT2的构建
依次将pMMB66EH-rCTB45733和pETtac28-pglL-cldLT2质粒电击转化按照上述所述的方法制备S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL电转感受态,从而构建糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL/pMMB66EH-rCTB45733/pETtac28-pglL-cldLT2。
3、rCTB45733-OPSSpty50973的制备
方法同前所述。
从图4可以看出在加入3个糖基化位点后,重组CTB融合蛋白发生O糖基化修饰,同时,由于加入多个糖基化位点,出现多簇糖基化条带表明多个位点均有效糖基化。
六、rEPA4573-OPSSpty50973和rCTB45733-OPSSpty50973的获得
1、rEPA4573-OPSSpty50973的纯化
挑取糖基工程菌S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573/pETtac28-pglL-cldLT2单克隆,接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素双抗LB培养基,37℃培养至OD600约为0.6时,加入终浓度为1mM的IPTG,并降温至25℃诱导20h。
1)样品预处理
取上述25℃诱导20h的菌体10g,加入100mL纯水,超声破菌(超声3s暂停5s,累计超声时间30min),用12000g的离心力离心,收集上清,向该粗提液中加入终浓度为20mMpH7.5Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑,充分搅拌,再次用12000g的离心力离心,收集上清,此上清为含有被甲型副伤寒沙门氏菌OPS修饰的重组EPA融合蛋白(rEPA4573-OPSSpty50973)的粗提液。
2)用Chelating亲和层析柱纯化样品
用Chelating亲和层析柱(Φ1.6cm*15cm)初步纯化样品。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积,然后用去离子水平衡至pH中性,然后用0.5M的NiSO4平衡3个柱床体积,再用B1液(20mM pH7.5Tris-HCl,0.5M NaCl,500mM咪唑)平衡一个柱床体积,最后用A1液(20mM pH7.5Tris-HCl,0.5M NaCl,10mM咪唑)平衡三个柱床体积,以上流速均为4mL/min。从A管道将上述含有rEPA4573-OPSSpty50096的粗提液上样,再用A液洗去未结合蛋白,最后用100%B1洗脱,收集洗脱液30mL。
3)样品除盐
用G25fine层析柱(Φ1.6cm*30cm)将Chelating亲和层析柱初步纯化样品除盐,流动相为A3液(20mM pH7.5Tris-HCl)。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积,然后用去离子水平衡至pH中性,最后用A3液平衡三个柱床体积,从A管道上样,并收集样品60mL,以上流速均为4mL/min。
4)用ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱进一步纯化rEPA4573-OPSSpty50973
将除盐后的样品用ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱(waters)进一步纯化。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积,然后用去离子水平衡至pH中性,然后用A3液(20mM pH7.5Tris-HCl)平衡三个柱床体积,将样品从A管道上样,用A3液洗去未结合糖蛋白,然后0~50%的B3液(20mM pH7.5Tris-HCl、1M NaCl)30min内线性洗脱,并收集洗脱液,以上流速均为1mL/min。糖蛋白rEPA4573-OPSSpty50973的出峰位置在电导为约8~18mS/cm处。
5)用Superdex 75层析柱精纯化rEPA4573-OPSSpty50973
将ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱纯化的样品用Superdex 75FPLC(Φ1cm*30cm,GE公司)进一步精纯化。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积,然后用去离子水平衡至pH中性,然后用A4液(20mM pH7.5PB、0.9%NaCl)平衡三个柱床体积,通过上样环上样1mL,收集8~11mL流出的样品,此样品即精纯化的rEPA4573-OPSSpty50973。
将此样品用8%SDS-PAGE和western blot分析,结果如图5所示。
2、rCTB45733-OPSSpty50973的纯化
挑取糖基工程菌S.paratyphi CMCC50973ΔcldΔwaaL/pMMB66EH-rCTB45733/pETtac28-pglL-cldLT2单克隆,接种于氨苄青霉素和卡那霉素双抗LB培养基,37℃培养至OD600约为0.6时,加入终浓度为1mM的IPTG,并降温至16℃诱导20h。
1)样品预处理
取上述16℃诱导20h的菌体10g,加入100mL纯水,超声破菌(超声3s暂停5s,累计超声时间30min),用12000g的离心力离心,收集上清,向该粗提液中加入终浓度为20mMpH7.5Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑,充分搅拌,再次用12000g的离心力离心,收集上清,此上清为含有被甲型副伤寒沙门氏菌O多糖修饰的重组CTB融合蛋白(rCTB45733-OPSSpty50973)的粗提液。
2)用Chelating亲和层析柱纯化样品
用Chelating亲和层析柱(Φ1.6cm*15cm)初步纯化样品。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积,然后用去离子水平衡至pH中性,然后用0.5M的NiSO4平衡3个柱床体积,再用B1液(20mM pH7.5Tris-HCl,0.5M NaCl,500mM咪唑)平衡一个柱床体积,最后用A1液(20mM pH7.5Tris-HCl,0.5M NaCl,10mM咪唑)平衡三个柱床体积,以上流速均为4mL/min。
从A管道将上述含有rCTB45733-OPSSpty50973的粗提液上样,再用A液洗去未结合蛋白,最后用100%B1洗脱,收集洗脱液30mL。
3)样品除盐
用G25fine层析柱(Φ1.6cm*30cm)将Chelating亲和层析柱初步纯化样品除盐,流动相为A2液(20mM pH5.4HAc-NaAc)。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积,然后用去离子水平衡至pH中性,最后用A2液平衡三个柱床体积,从A管道上样,并收集样品60mL,以上流速均为4mL/min。
4)用ProteinPak SP8HR阳离子交换层析柱进一步纯化rCTB45733-OPSSpty50973
将除盐后的样品用ProteinPak SP8HR阳离子交换层析柱(waters)进一步纯化。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积,然后用去离子水平衡至pH中性,然后用A2液(20mMpH5.4HAc-NaAc)平衡三个柱床体积,将样品从A管道上样,用A2液洗去未结合糖蛋白,然后0~50%B2(20mM pH5.4HAc-NaAc、1M NaCl)液30min内线性洗脱,并收集洗脱液,以上流速均为1mL/min。糖蛋白rCTB45733-OPSSp50973的出峰位置在电导为约35~45mS/cm处,将样品用12%SDS-PAGE和western blot分析,结果如图6所示。
七、rCTB45733-OPSSpty50973和rEPA4573-OPSSpty50973多糖蛋白结合疫苗的制备及动物实验评价
1、rCTB45733-OPSSpty50973和rEPA4573-OPSSpty50973多糖蛋白结合疫苗的制备
将纯化的rCTB45733-OPSSpty50973和rEPA4573-OPSSpty50973过滤除菌,与氢氧化铝佐剂(Rehydragel LV,General Chemical)按照9:1的比例混合。
2、O抗原(OPS Spty50973)的制备
先用热酚水法(孙洋,冯书章,祝令伟,等.肠出血性大肠杆菌O157LPS单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国人兽共患病学报,2007,23(10):971-973.)提取LPS,冻干保存,用1%冰醋酸以10mg/ml的浓度溶解,沸水浴90分钟后冷却至室温,调节pH至7.0。经64000×g离心5小时后收集上清,用去离子水彻底透析后冻干保存。
3、rCTB45733-OPSSpty50973和rEPA4573-OPSSpty50973结合疫苗的动物免疫及效果评价
取40只6周龄大的雌性Balb/c小鼠,随机分为4组。向每组小鼠的肌肉中分别注射氢氧化铝、OPSSpty50973、rCTB45733-OPSSpty50973和rEPA4573-OPSSpty50973样品,其中氢氧化铝组为阴性对照,其余三组以多糖含量计量,均注射10μg的多糖;分别在第1、22、50天免疫,三免后10天取血。
用间接ELISA法测各组小鼠血清中抗甲型副伤寒沙门氏菌O多糖的抗体滴度。用提取的甲型副伤寒沙门氏菌LPS包被酶联板,每孔包被10μg的LPS,其他操作步骤参见《精编分子生物学实验指南》。
从图7可以看出,本发明通过延长甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50973的OPS,制备的rCTB45733-OPSSpty50973和rEPA4573-OPSSpty50973均能诱导小鼠产生抗甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50973OPS的特异性抗体,且与只注射OPS组的小鼠相比,抗体滴度明显增高。
Claims (4)
1.一种重组菌,是将鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶基因cldLT2导入O抗原链长控制酶基因cld敲除的甲型副伤寒沙门氏菌中得到的;
所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶CldLT2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;
所述O抗原链长控制酶基因cld的核酸序列如GenBank上编号为CP000026的第887812至888789位所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌,其特征在于,
所述鼠伤寒沙门氏菌O抗原链长控制酶CldLT2的编码基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌,其特征在于,所述O抗原链长控制酶基因cld敲除的甲型副伤寒沙门氏菌的获得方法包括如下步骤:
(1)制备线性打靶DNA片段1,其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示,其中含有cat基因;
(2)将pKD46质粒转化至Salmonella.paratyphi菌中,得到的重组菌记作S. paratyphi/pKD46;
(3)诱导所述S. paratyphi /pKD46菌株中Red重组系统表达,再将所述线性打靶DNA片段1转化至所述S. paratyphi/pKD46菌株中,所述线性打靶DNA片段1替换所述S.paratyphi/pKD46菌株中的cld基因,得到的重组菌记作S. paratyphicld::cat/pKD46;
(4)去除S. paratyphi cld::cat/pKD46菌株中的pKD46质粒,得到的重组菌记作S.paratyphicld::cat;
所述S. paratyph cld::cat是将cld基因序列替换成cat基因序列的S. paratyphi;
(5)将质粒pCP20转化至S. paratyphicld::cat中,去除cat基因,得到的重组菌记作S.paratyphiΔcld;
所述S. paratyphiΔcld是敲除cld基因的S. paratyphi。
4.一种延长甲型副伤寒沙门氏菌O抗原糖链长度的方法,包括如下步骤:培养权利要求1-3任一所述重组菌,使所述cldLT2基因表达,使重组菌合成糖链长度延长的O抗原。
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