CN102935226A

CN102935226A - 伤寒甲型副伤寒结合疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102935226A
Application number: CN2012104641053A
Authority: CN
Inventors: 周富昌; 陈宣洪; 周家富; 任晓莉; 朱少军
Original assignee: ROYAL (WUXI) BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: ROYAL (WUXI) BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2032-11-16
Also published as: CN102935226B

Abstract

本发明公开了一种伤寒甲型副伤寒结合疫苗，包括伤寒Vi多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP。本发明还公开了该疫苗的制备方法，包括制备伤寒Vi多糖、制备甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP、制备伤寒Vi多糖-载体蛋白结合物、制备甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP-载体蛋白结合物及制备成品的步骤。通过动物实验证明，本发明能诱导出高水平的抗伤寒Vi多糖、抗甲型副伤寒LPS抗体，且具有免疫记忆反应,并无急性毒性反应。

Description

伤寒甲型副伤寒结合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及含有抗原的医药制品领域，特别是涉及一种伤寒甲型副伤寒结合疫苗及其制备方法。

背景技术

伤寒是由对人有致病力的沙门氏伤寒杆菌引起的一种全身性、急性、发热性传染病。主要表现为持续性高热，腹痛、不适、头痛及小肠结肠炎症等症状。通过改善公共卫生条件可以降低伤寒的发病率，但是，有效的控制该病流行的最佳方式仍是预防免疫。

沙门氏菌具有复杂的抗原构造，一般可分为3类抗原：(1)Vi抗原或表面抗原，即荚膜多糖；(2)0抗原或细胞壁抗原，是细胞壁的脂多糖，即内毒素；(3)H抗原或鞭毛抗原，是一种蛋白质抗原。沙门氏菌的不同菌株都有荚膜多糖，它具有抗吞噬作用和保护细菌避免相应的抗体在补体参与下的溶菌作用。同时，荚膜可以保护细菌在血液中得以生存。特异性的抗荚膜多糖抗体与细菌结合后通过活化补体而杀死伤寒杆菌。鉴于荚膜多糖这些与细菌侵袭力和毒力有关的特性，Felix和Pitt于20世纪50年代将沙门氏杆菌的荚膜多糖命名为Vi抗原，随后的研究发现，用粗制的Vi荚膜多糖抗原免疫小鼠后，小鼠可获得对伤寒沙门氏菌感染的抵抗力，可保护小鼠免受再次感染。

伤寒疫苗有注射用灭活全菌体疫苗、口服灭活全菌体疫苗、口服减毒活疫苗、Vi多糖疫苗等。20世纪60-70年代，灭活全菌体疫苗在许多国家进行了临床研究，效果不理想，已停止使用。链霉素依赖性伤寒突变株活疫苗在正常人体内繁殖能力较差，免疫后效果难尽人意，且冻干型的该种疫苗又完全丧失保护力，也停止了研究。伤寒Ty21a减毒活疫苗经过了大量临床实验，已被证实是目前较安全有效的伤寒疫苗之一，而且没有严重的副反应，但长期以来一些学者对Ty21a突变株提出以下仍然具有争议的问题：该减毒株的遗传稳定性不能确定，并推测其有毒力返祖的可能；gale基因的突变不能完全解释该疫苗的减毒机制；有其他不明部位的基因发生了突变；冻干剂型疫苗的稳定性不规律以及口服接种次数过多等。伤寒Vi多糖（又名伤寒荚膜多糖）疫苗与其他的多糖疫苗一样，为T淋巴细胞非依赖性抗原，不能用于2岁以内儿童的免疫，再次免疫接种时不会产生免疫记忆反应。伤寒Vi多糖疫苗免疫原性低且抗体水平不能保持在高水平，原因在于其多糖是半抗原，为非T细胞依赖性抗原，接种后不能激活Th细胞和T记忆细胞，不产生回忆加强反应。

多糖诱导抗体主要是通过刺激B细胞产生IgM和少量IgG抗体。由于它是非T细胞依赖性抗原(TI)，存在一定的缺点，表现在：①在婴幼儿体内产生的免疫反应很弱；②无免疫记忆及增强效应；③普通佐剂对之不易起到作用。所以此疫苗虽然有效、安全，但仍需改进。美国NIH的国立儿童健康和人类发育研究所（National Institute of ChildHealth and Human Development）研制的伤寒Vi多糖和重组绿脓杆菌外毒素A偶联制备的结合疫苗，在越南已完成三期临床试验，显示出良好的安全性和有效性。本发明参考了NIH的研究结果，结合冻干A、C群脑膜炎球菌结合疫苗的研制和生产经验，确定了多糖－蛋白结合物的制备和纯化工艺，多糖检定，活化蛋白所需EDAC的浓度及己二酰肼的浓度，衍生物的纯化、检定，Vi多糖和蛋白浓度，结合物的纯化、检定，结合物的抗原性，免疫原性、生化等质量标准，以及结合物的稳定性，安全性等进行了多方面的研究，并通过了各项实验室检定，成功制备出伤寒Vi多糖与破伤风类毒素（TT）的结合物原液伤寒Vi－TT。

甲型副伤寒 (S. paratyphoid A副甲) 是在东南亚、南亚、撒哈拉以南的非洲地区流行的伤寒肠热症中仅次于伤寒居第二位的病原菌，在我国广西、贵州等地区也时有爆发，严重危害人民健康。在地方流行区，学龄儿童的发病率最高。随着伤寒Vi多糖疫苗的广泛运用，原有的伤寒、副甲、副乙三联菌体苗（TAB）由于副反应大，已不再使用，形成伤寒发病逐渐减少，而副甲的疫情凸现的情况。市场迫切需要新的甲型副伤寒疫苗。

美国NIH的国立儿童健康和人类发育研究所（National Instituteof Child Health and Human Development）的J. B. Robbins等认为，应急水平的抗菌体特异多糖（Anti-O-SP）血清抗体可赋予人体对副甲的保护性免疫。因此，1996年NIH的 Robbins等用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼（CDAP）活化多糖的方法制备副甲多糖结合疫苗进行了动物试验，用高分子量的菌体特异多糖（O-SP）和破伤风类毒素（TT）按两种方法制备的结合物（多糖蛋白直接偶联和通过ADH连接臂的偶联）免疫了小鼠。注射一剂后，两种结合物均未诱导小鼠产生抗副甲酯多糖（LPS）的任何抗体；第二和第三剂后，均诱导小鼠产生低水平的IgM抗体。同时，第二剂即产生抗LPS的IgG抗体，而且第三剂免疫后还有明显的免疫回忆反应。两种结合物诱导的副甲抗体无明显差别。直接结合制备的结合物诱导的TT抗体水平较高。而且只有含O-乙酰基的O-SP制备的结合物诱导的抗LPS IgG血清抗体才有杀菌抗体活性。基于动物试验结果，2000年NIH的 Shousun C SZU等在越南用法国巴斯德公司用按上述两种方法制备的副甲结合疫苗（SPA-TT₁，有ADH连接臂；SPA-TT₂，直接结合）进行了I期和II期临床试验。试验选取成人、青少年和2-4岁儿童三组志愿者进行了安全性和免疫原性的观察。结果表明这两种副甲结合疫苗人体试验具有良好的免疫原性和安全性。

中国专利ZL200610111684.8公开了一种伤寒、副伤寒外膜蛋白疫苗，从伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌培养液中提取外膜蛋白制得，经小鼠实验证明可抵御致死剂量的活菌的攻击。但该疫苗提取的是外膜蛋白，而外膜蛋白是一组蛋白，不同的蛋白成分比较复杂，多数形成的是一个结合体，较难进行纯化，纯化后也不易进行标准化检测，容易混入较多的菌体蛋白等杂质。

发明内容

为克服现有技术伤寒甲型副伤寒二价疫苗副反应大，以及已公开的伤寒、副伤寒外膜蛋白疫苗质量控制方面的缺陷，本发明提供了一种伤寒Vi－TT和甲型副伤寒O-SP-TT结合物混合后制成的结合疫苗，使用伤寒Vi多糖和甲型副伤寒O-特异多糖（O-SP），两种多糖均为单一多糖，能很好的控制蛋白和核酸等杂质，并有完善的质量标准。

本发明的一方面提供了一种伤寒甲型副伤寒结合疫苗，包括伤寒菌体荚膜多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP。

优选地，上述伤寒菌体荚膜多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP均与载体蛋白形成结合物。

优选地，载体蛋白为破伤风类毒素。

优选地，每人份伤寒甲型副伤寒结合疫苗含伤寒菌体荚膜多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP均不低于10ug。

本发明的另一方面提供了一种上述伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法，包括以下步骤，

1）精制伤寒Vi多糖：伤寒沙门氏菌种经甲醛杀菌后，高速离心去除菌体，上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀形成沉淀，离心收集沉淀物，用CaCl₂溶液解离，再用乙醇沉淀制得粗制品；将粗制品溶解于10％饱和醋酸钠溶液中，然后用冷酚提取，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液透析；再加乙醇至最终浓度为75～80％(V／V)；离心收集沉淀物，洗涤后离心，弃上清，溶解沉淀的多糖，得精制伤寒Vi多糖；

2）制备甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP: 甲型副伤寒沙门氏菌种经甲醛杀菌后，高速离心收集菌体，热酚法粗制菌体中的副甲脂多糖；再用低温乙醇沉淀法精制副甲脂多糖，然后将副甲脂多糖以10mg/ml浓度溶解于1％醋酸溶液中，沸水浴后冷却，离心弃沉淀，透析上清，再以低温乙醇沉淀法收集沉淀，经分子筛层析法纯化；

3）制备伤寒Vi多糖-载体蛋白结合物:衍化载体蛋白；将精制伤寒Vi多糖溶液加入碳二亚胺，然后加入衍化的载体蛋白，维持pH在5.75进行结合反应，然后调pH至中性终止反应，反应物在生理盐水中透析过夜，过层析柱纯化，得伤寒Vi多糖-载体蛋白结合物；

4)制备甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP-载体蛋白结合物: 用己二酰肼与甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP进行连接反应，制得O-SP-AH衍生物，将其与载体蛋白混合，加入碳二亚胺进行结合反应，经超滤膜超滤去除小分子物质，过层析柱纯化，得甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP-载体蛋白结合物；

5）制备成品: 将伤寒菌体荚膜多糖-载体蛋白结合物原液与甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP-载体蛋白结合物原液混合后加入高压灭菌后的注射水及乳糖，除菌过滤后冻干。

优选地，上述步骤3）中，载体蛋白为破伤风类毒素。

优选地，上述步骤3）中，载体蛋白衍化度为1.0-3.0%，精制伤寒Vi多糖蛋白终浓度为2-3mg/ml。

优选地，上述步骤4）中，O-SP的衍化度为1.0～40％。

优选地，上述步骤4）中，结合反应pH控制在5.6～5.9，反应3小时。

优选地，上述步骤4）中，层析柱为琼脂糖4FF柱。

本发明的有益效果是：本发明对伤寒及甲型副伤寒同时免疫，且两种抗原间无干扰，均能产生和单独的结合物相同的免疫应答。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明系采用伤寒Vi多糖和甲型副伤寒O-SP特异多糖与精制破伤风类毒素化学偶联后加入乳糖作为赋形剂冻干制成的结合疫苗，供预防伤寒和甲型副伤寒。

实施例1

伤寒Vi多糖的制备方法：

1.菌种制备：将伤寒沙门氏菌种（50098）启种于葡萄糖肉汤培养基中，35～37℃，培养16～20小时，同样条件转种第二代、第三代于普通琼脂斜面培养基上，35～37℃培养16～20小时，再将第三代菌种分别采种于装有一定量改良半综合液体培养基的菌种罐中，35～37℃培养4～8小时。

2.大罐培养：将菌种罐中的菌种压入装有一定量改良半综合液体培养基的发酵罐中，进行扩大培养，35～37℃深层通气培养6～8小时。

3.杀菌：培养物按1～2％(V／V)甲醛溶液加入罐内杀菌，搅拌半小时以上静置过夜。

4.除菌体：用高速连续流离心机离心去菌体，收集上清液。

5.粗制：在上清液中加入10%十六烷基三甲基溴化铵至终浓度为0.1%，充分混匀形成沉淀，离心收集沉淀物即为伤寒Vi复合多糖。用2M CaCl₂溶液解离复合多糖至CaCl₂浓度为1M，解离时间为2小时。在解离液中加入95%酒精至终浓度为25%-27%，搅拌10分钟，静止1-3小时或过夜，高速离心去核酸，收上清。上清液中加入95%乙醇至酒精终浓度为75-80%，离心弃上清，沉淀即为粗制品。收集粗糖，用无水乙醇和丙酮洗涤，吹干、称重、备用；

6.精制：将粗制多糖溶解于10％饱和醋酸钠溶液中，多糖浓度在5-10mg/ml。然后按1:2体积比加入70%冷酚提取，振摇5-10分钟使多糖苯酚充分扒壁后离心收集上清液。如上清不清亮可重复加入苯酚抽提2-3次至上清清亮为止。用0.1mol/L氯化钙溶液透析多糖液后加入95%乙醇至最终浓度为75～80％(V／V)，离心收集沉淀物，洗涤后离心，弃上清，溶解精制多糖除菌过滤后备用。

实施例2

甲型副伤寒菌体O-SP多糖的制备方法：

1.菌种制备：将甲型副伤寒沙门氏菌种（50073）启种于葡萄糖肉汤培养基中，35～37℃培养16～20小时，同样条件转种第二代、第三代于普通琼脂斜面培养基上，35～37℃培养16～20小时，再将第三代菌种分别采种于装有一定量改良半综合液体培养基的菌种罐中，35～37℃培养4～8小时。

3.杀菌：培养物按1～2％(V／V)甲醛溶液加入罐内杀菌，搅拌半小时以上。

4.收集菌体：用高速连续流离心机离心收集菌体，弃上清液。

5.热酚法粗制LPS：菌体按1：10加入注射用水，再加入90％热酚溶液，68℃水浴加热1小时，流水降温，冷库过夜后10℃ 10000 rpm离心1小时，收集上清液。纯化水透析去酚，加入酒精至终浓度75％沉淀LPS，收集沉淀物，即为LPS粗制品。

6.低温乙醇沉淀法精制LPS：将粗制品按湿重150～200mg/ml溶解于注射用水中，再加乙醇至最终浓度为30％(V／V)。-20℃放置48～72小时，10000rpm离心收集上清，再补加乙醇至45％，-20℃放置48～72小时，10000rpm离心收集上清，上清加入乙醇至75％，冷库放置4～8小时，4000rpm离心收集沉淀即为精制LPS。

7.O-SP酸水解：LPS以10mg/ml溶解于1％醋酸溶液中，沸水浴1～2小时处理。水解液冷却后以20000rpm，离心2小时。弃沉淀，收集上清再次20000rpm，离心2小时。弃沉淀，收上清。注射用水透析。加入乙醇使终浓度为80%，放置冰库2-4小时。 4000rpm离心20分钟，收集沉淀吹干。

其中，醋酸溶液水解1小时，O-SP产量稳定，且适合于规模化生产。

8.分子筛层析法纯化O-SP：沉淀按10mg/ml溶于注射水中，滤去不溶物，Superdex 75层析，注射用水洗柱，收集外水体积第一峰洗脱物冷冻干燥即为精制O-SP。

实施例3

伤寒Vi多糖-载体蛋白结合物的制备方法：

以破伤风类毒素（TT）作为伤寒Vi多糖的载体蛋白。

1.TT衍化：将TT按蛋白量稀释为10mg/ml，在室温20～26℃每毫克蛋白加入3.5毫克1,6-己二酰肼（ADH），混匀，调pH值到5.75，加入碳二亚胺（EDAC）使EDAC与蛋白的比值为0.1-0.8，维持pH5.75搅拌1小时，用30k超滤膜超滤去ADH和EDAC等小分子杂质。测定蛋白含量和ADH残基（－AH）含量，计算其衍化率。

衍化蛋白时EDAC/TT定在0.1～0.15之间，能有较合适的衍化度。

2.伤寒Vi多糖与衍化载体蛋白结合：将伤寒Vi多糖用0.1mol/l HCl调pH值到5.75，按加入蛋白后的体积加入5～10mmol/l的EDAC，调pH至5.75，反应2分钟，加入等体积的衍化蛋白TT-AH，维持pH在5.75，反应3小时或pH不再变化时，调pH至中性终止反应。反应物在生理盐水中透析过夜，过Sepharose 4FF柱纯化，收集第一峰，去掉游离蛋白和其它小分子物质。

多糖和蛋白偶联时，高浓度和高衍化度结合物容易成胶，而在低浓度和低衍化度时不易结合，只有在合适的浓度时才有较好的偶联和合适的多糖蛋白比。蛋白衍化度在1.0-3.0%、多糖蛋白终浓度在2-3mg/ml时能避免成胶，又有较好的多糖蛋白比。

实施例4

O-SP-载体蛋白结合物的制备方法：

以TT作为甲型副伤寒O-SP多糖的载体蛋白。

1.O-SP-AH衍生物的制备：按5mg/ml将甲型副伤寒精制O-SP溶解在注射用水中。每毫克O-SP多糖加入0.5mg溴化氰，pH控制在10.8±0.2，反应温度23±3℃，活化40分钟，然后按每毫克多糖加入3.5mg己二酰肼（ADH）连接，用生理盐水超滤（10kd膜），能得到适宜数量的活化位点。

其中，控制衍化度在1.0～3.0％利于下一步结合反应。

2.O-SP-TT结合物的制备：O-SP－AH衍生物与TT蛋白定量混合，用HCl调pH至5.0～5.5，然后加入碳二亚胺（EDAC），2～8℃反应1～3小时，调pH至6.7～7.1中止反应。反应物经100Kd超滤膜超滤去除小分子物质。

其中，反应pH控制在5.0～5.5，反应3小时可较好结合。

3.O-SP-TT结合物的纯化：用琼脂糖4FF层析，收集甲型副伤寒O-SP-TT结合物的第一峰。

但琼脂糖CL-4B柱流速过慢，上样体积太小，不适宜于规模生产。一种替代方式是，选用和琼脂糖CL-4B分离范围一致，耐压，高流速的琼脂糖4FF柱用于结合物的分离纯化。在波长206nm下监测吸收峰，收集第一峰。经琼脂糖4FF柱（2.6×90cm）层析，只有一个多糖蛋白结合峰，后面有一个单独的蛋白峰，结合物和游离的蛋白能较好的分离。

实施例5

伤寒甲型副伤寒结合疫苗成品的制备

将伤寒Vi-TT结合物原液、甲型副伤寒O-SP-TT结合物原液混合后加入无菌无热原注射用水稀释,加入适量乳糖作为赋形剂，除菌过滤后冻干。每人份含伤寒Vi多糖、甲型副伤寒O-SP多糖均不低于10ug。

实施例6。

1.毒性逆转实验

结合物原液用pH7.0～7.4的PBS稀释至7～10Lf/ml，37℃放置42天，注射250～350g体重的健康豚鼠4只，每只皮下注射5ml，于注射后第7天、14天、21天进行观察，动物不得有破伤风症状，到期每只动物体重比注射前增加者判为合格。伤寒Vi-TT结合物毒性逆转试验结果见表1，甲型副伤寒O-SP-TT结合物毒性逆转试验结果见表2。

表1 伤寒Vi-TT结合物毒性逆转试验结果

表2 甲型副伤寒O-SP-TT结合物毒性逆转试验结果

结果：三批伤寒Vi-TT结合物和甲型副伤寒O-SP-TT结合物原液注射后7天、14天、21天观察，动物均无破伤风症状，注射后21天体重均有增加。符合《中国药典》三部（2005年版）《吸附破伤风疫苗》的要求。

2.效力实验

将成品疫苗稀释为10ug/ml（含伤寒Vi多糖和甲型副伤寒O-SP多糖分别为5ug/ml），接种18-20g小鼠，每组10只，间隔一周免疫一针,共免疫三次,每次注射0.5ml，第三针后一周采血,分离血清；用ELISA法测定血清抗伤寒Vi和抗甲型副伤寒O-SP多糖IgG抗体滴度，三针免后,多糖结合疫苗组抗体阳转率应不低于80%，抗体几何平均滴度(GMT)应高于等剂量多糖对照组4倍以上。结果见表3。

表3：伤寒甲型副伤寒结合疫苗免疫原性测定结果

从上表的结果可以看出，试制的三批成品鼠免疫原性试验结果都显示小鼠在注射两针后阳转率即达到了100%，注射三针后结合物成品GMT与单糖GMT有显著差异（P＜0.001）。因此伤寒Vi多糖、甲型副伤寒O-SP多糖分别和破伤风类毒素结合后，能诱导小鼠产生较高的抗体应答，且加强免疫后有记忆抗体产生。

3.异常毒性实验

3.1豚鼠毒性试验

用两只体重250～350g的健康豚鼠,每只腹腔注射10人份(5ml)疫苗,观察7天,应全部健存,无异常反应,豚鼠体重增加。结果见表4.

3.2小白鼠毒性试验

用5只体重18～22g的健康小白鼠,每只腹腔注射1人份(0.5ml)疫苗,观察7天, 应全部健存,无异常反应,小白鼠体重增加。结果见表4。

表4：异常毒性试验结果

结果可见三批样品全部符合规程要求。

通过以上的研究可以看出,本发明的结合疫苗,在动物中能诱导出高水平的抗伤寒Vi, 抗甲型副伤寒O-SP抗体，且具有免疫记忆反应,并无急性毒性反应,说明制备方法是可行的、制备工艺是稳定的。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种伤寒甲型副伤寒结合疫苗，其特征在于，包括：伤寒Vi多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP。

2.根据权利要求1所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗，其特征在于：所述伤寒Vi多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP均与载体蛋白形成结合物。

3.根据权利要求2所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗，其特征在于：所述载体蛋白为破伤风类毒素。

4.根据权利要求1所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗，其特征在于：所述疫苗含伤寒Vi多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP均不低于每人份10ug。

5.一种制备权利要求1-4任一所述伤寒甲型副伤寒结合疫苗的方法，包括以下步骤，

6.根据权利要求5所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法，其特征在于：制备伤寒 Vi多糖-载体蛋白结合物的步骤中，载体蛋白衍化度为1.0-3.0%，伤寒荚膜多糖蛋白终浓度为2-3mg/ml。

7.根据权利要求5所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法，其特征在于：制备甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP-载体蛋白结合物的步骤中，甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP的衍化度为1.0～3.0％。

8.根据权利要求5所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法，其特征在于：制备甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP-载体蛋白结合物的步骤中，所述结合反应的pH控制在5.0～5.5，反应3小时。

9.根据权利要求5所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法，其特征在于：制备甲型副伤寒菌体特意多糖O-SP-载体蛋白结合物的步骤中，所述层析柱为琼脂糖4FF柱。