CN106317238A - 一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺 - Google Patents
一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，所述提取工艺包括如下步骤：步骤a：菌体处理、步骤b：第一次提取、步骤c:第二次提取、步骤d：提取LPS。通过上述方式，本发明能够实现LPS的纯度提高，相比较现行技术的提取方法，具有在不增加新的设备和试剂的前提下，和不影响最终产品收率的前提下，提高LPS的纯度，并提高最终产品的纯度和安全性、有效性。
Description
技术领域
本发明涉及医药制备领域，具体涉及一种提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺方法。
背景技术
随着医学技术的发展，伤寒Vi多糖疫苗的广泛应用，伤寒的发病率逐渐降低，但甲型副伤寒（副甲）疫情凸现，国内、外近几年来副伤寒引起的肠热症均有明显的上升趋势，发病人数的不断增加越来越引起人们的重视。
甲型副伤寒是一种肠道传染病，可通过生活用水、食物、苍蝇、蟑螂接触等传播引起流行。症状：开始有全身不适，食欲不好，头痛；发热，5～6日内体温可达40℃，持续不退；表情呆板，前胸和腹部上有红色疹状，肝脾肿大，有轻度压痛；重时可有肠出血、肠穿孔、心肌炎等合并症，有合并症者死亡率高。
曾有的伤寒、副甲、乙三联菌体疫苗副反应大，对副伤寒的预防免疫效果不确定，早已不再使用。随着副伤寒耐药菌株的增多，治疗难度也日渐增大，因此迫切需要新的副伤寒疫苗。但研究发现，甲型副伤寒沙门氏菌LPS脱毒后O-SP特异多糖作为免疫保护抗原的发现，为研制该疫苗提供了希望。O-SP特异多糖的纯化与荚膜多糖的纯化方法迥异，纯化过程更复杂，对仪器设备的要求高。
现有工艺中对甲型副伤寒沙门氏菌（LPS）的提取工艺如下：菌体称重，以重量体积比1：10加入注射水，捣碎后加入90%苯酚，水浴1小时后冷库过夜，然后离心并取上清液，透析袋透析后，加入MgCl2和 NaAc，再加入乙醇至终浓度75%，离心收沉淀物，得到提取的LPS。但这种提取方法提取的LPS往往残留蛋白量较高，LPS纯度不够，会影响后续的水解收率。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明的主要目的是提供一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，该提取工艺能够有效降低残留蛋白含量，虽然在LPS收率上会略有降低，但LPS纯度提高了，后续水解产物以及纯度，均有提高。
为实现上述目的，本发明公开的技术方案如下：一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，所述提取工艺包括如下步骤：
步骤a：菌体处理：取适量菌体称重后，按比例加入注射水，并将菌体捣碎；
步骤b：第一次提取：向步骤a处理后的菌体中加入苯酚，并在水浴中加热1-3 h，然后将得到的溶液置于冷库中过夜，然后离心分离，收取上清液；
步骤c:第二次提取：向步骤b中得到的上清液中加入冷酚，振摇8-20min后离心分离，收取上清液，并将上清液置于透析袋中透析；
步骤d：提取LPS：向步骤c透析后的溶液中加入MgCl2和 NaAc，至终浓度为0.1-0.3mol/l MgCl2和 0.02-0.05mol/l NaAc；再向其中加入乙醇至终浓度75%，离心分离，收集沉淀，得到粗提LPS。
优选的，所述步骤a中，菌体与注射水的用量比是1：（8-10）。
优选的，所述步骤b中苯酚的用量与菌体的用量比是（1-2）：（1-3）。
优选的，所述步骤b中加入的是浓度为90%的苯酚。
优选的，所述水浴的温度维持在60-70℃之间。
优选的，所述步骤c中加入70%浓度的冷酚，所述冷酚与所述上清液的用量比是（1-2）：（1-3）。
优选的，所述步骤d中加入1mol/L MgCl2和 3mol/ L NaAc。
优选的，所述步骤d中加入95%乙醇。
优选的，所述步骤d中离心是在离心机9000rpm的转速下离心10min。
与现行技术相比，本发明在第一次提取后向上清液中加入冷酚，其作用是在热酚去掉大量的菌体蛋白质后，残留的少量蛋白，再通过冷酚萃取的方法，进一步去掉残留的蛋白，提高LPS的纯度。
本发明的有益效果是：本发明利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，通过对热酚提取后残留的低浓度的蛋白，进一步进行去除，能够实现LPS的纯度提高，相比较现行技术的提取方法，具有在不增加新的设备和试剂的前提下，和不影响最终产品收率的前提下，提高LPS的纯度，并提高最终产品的纯度和安全性、有效性。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，所述提取工艺包括如下步骤：
步骤a：菌体处理：取适量菌体称重后，按比例加入注射水，并将菌体捣碎；
步骤b：第一次提取：向步骤a处理后的菌体中加入苯酚，并在水浴中加热1-3 h，然后将得到的溶液置于冷库中过夜，然后离心分离，收取上清液；
步骤c:第二次提取：向步骤b中得到的上清液中加入冷酚，振摇8-20min后离心分离，收取上清液，并将上清液置于透析袋中透析；
步骤d：提取LPS：向步骤c透析后的溶液中加入MgCl2和 NaAc，至终浓度为0.1-0.3mol/l MgCl2和 0.02-0.05mol/l NaAc；再向其中加入乙醇至终浓度75%，离心分离，收集沉淀，得到粗提LPS。
实施例2：一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，所述提取工艺包括如下步骤：
步骤a：菌体处理：取适量菌体称重后，按菌体与注射水的用量比是1：（8-10）加入注射水，并将菌体捣碎；
步骤b：第一次提取：向步骤a处理后的菌体中加入浓度为90%的苯酚，苯酚的用量与菌体的用量比是（1-2）：（1-3）；并在60-70℃的水浴中加热1-3 h，然后将得到的溶液置于冷库中过夜，然后离心分离，收取上清液；
步骤c:第二次提取：向步骤b中得到的上清液中加入70%浓度的冷酚，冷酚与上清液的用量比是（1-2）：（1-3）；振摇8-20min后离心分离，收取上清液，并将上清液置于透析袋中透析；
步骤d：提取LPS：向步骤c透析后的溶液中加入1mol/L MgCl2和 3mol/ L NaAc，至终浓度为0.1-0.3mol/l MgCl2和 0.02-0.05mol/l NaAc；再向其中加入95%乙醇至终浓度75%，在离心机9000rpm的转速下离心10min，离心分离，收集沉淀，得到粗提LPS。
实施例3：利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，该工艺具体包括如下步骤：
步骤a：菌体处理：取适量菌体称重后，按比例1：10加入注射水，并将菌体捣碎；
步骤b：第一次提取：向步骤a处理后的菌体中按用量比1：1加入90%苯酚，并在68℃水浴中加热1h，然后将得到的溶液置于冷库中过夜，然后离心分离，收取上清液；
步骤c:第二次提取：向步骤b中得到的上清液中按用量比1：1加入70%冷酚，振摇10min后离心分离，收取上清液，并将上清液置于透析袋中透析；
步骤d：提取LPS：向步骤c透析后的溶液中加入MgCl2和 NaAc，至终浓度为0.1mol/lMgCl2和 0.03mol/l NaAc；再向其中加入乙醇至终浓度75%，离心分离，收集沉淀，得到粗提LPS。
实验例:
实验组：分别取1kg、1.5kg、2.0kg甲型副伤寒沙门氏菌菌体，分别标记为实验组1、实验组2、实验组3，三组均按上述实施例3的操作步骤进行LPS的提取；
对照组：分别取1kg、1.5kg、2.0kg甲型副伤寒沙门氏菌菌体，分别标记为对照组1、对照组2、对照组3，三组均按常规工艺的操作步骤进行LPS的提取；
常规工艺具体如下：菌体称重，以重量体积比1:10加入注射水，捣碎；按体积比1:1加入90%苯酚，68℃水浴1H，冷库过夜；然后在9000rpm离心40min，收上清，透析袋透析；透析后加入1mol/l MgCl2和 3mol/l NaAc，至终浓度为0.1mol/l MgCl2和 0.03mol/l NaAc。再加入95&乙醇至终浓度75%，9000rpm离心10min，收沉淀，称重得粗制lps。
六组实验的结果记录如下表：
| 序号 | 菌体质量 | 粗制lps质量 | 粗制lps蛋白含量 | O-sp多糖质量 |
| 实验组1 | 1kg | 98g | 9.6mg/g | 10.4g |
| 对照组1 | 1kg | 127g | 37 mg/g | 9.6 g |
| 实验组2 | 1.5kg | 159g | 12mg/g | 8.53g |
| 对照组2 | 1．5kg | 185g | 42 mg/g | 7.93g |
| 实验组3 | 2.0kg | 267g | 10.1mg/g | 11.27g |
| 对照组3 | 2.0kg | 299g | 47 mg/g | 10.3g |
通过上述表格可以看出，相同菌体量情况下，按照本发明工艺提取得到的粗制lps收率略低，粗制lps蛋白含量比常规工艺提取的量低，但最终水解纯化后得到的O-sp多糖收率大于常规工艺的提取量。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述提取工艺包括如下步骤：
步骤a：菌体处理：取适量菌体称重后，按比例加入注射水，并将菌体捣碎；
步骤b：第一次提取：向步骤a处理后的菌体中加入苯酚，并在水浴中加热1-3 h，然后将得到的溶液置于冷库中过夜，然后离心分离，收取上清液；
步骤c:第二次提取：向步骤b中得到的上清液中加入冷酚，振摇8-20min后离心分离，收取上清液，并将上清液置于透析袋中透析；
步骤d：提取LPS：向步骤c透析后的溶液中加入MgCl2和 NaAc，至终浓度为0.1-0.3mol/lMgCl2和 0.02-0.05mol/l NaAc；再向其中加入乙醇至终浓度75%，离心分离，收集沉淀，得到粗提LPS。
2.根据权利要求1所述的利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述步骤a中，菌体与注射水的用量比是1：（8-10）。
3.根据权利要求1所述的利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述步骤b中苯酚的用量与菌体的用量比是（1-2）：（1-3）。
4.根据权利要求1所述的利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述步骤b中加入的是浓度为90%的苯酚。
5.根据权利要求1所述的利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述水浴的温度维持在60-70℃之间。
6.根据权利要求1所述的利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述步骤c中加入70%浓度的冷酚，所述冷酚与所述上清液的用量比是（1-2）：（1-3）。
7.根据权利要求1所述的利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述步骤d中加入1mol/L MgCl2和 3mol/ L NaAc。
8.根据权利要求1所述的利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述步骤d中加入95%乙醇。
9.根据权利要求1所述的利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，其特征在于，所述步骤d中离心是在离心机9000rpm的转速下离心10min。
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