KR102140910B1 - Chp(사이클로-히스프로)를 포함하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CHP(사이클로-히스프로)를 포함하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CHP를 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및/또는 항섬유성 조성물에 관한 것이다.

Description

CHP(사이클로-히스프로)를 포함하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION COMPRISING CHP (CYCLO-HIS PRO) FOR PREVENTING, IMPROVING OR TREATING OF FIBROSIS}

본 발명은 CHP(사이클로-히스프로)를 포함하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CHP를 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및/또는 항섬유성 조성물에 관한 것이다.

섬유증(fibrosis)은 섬유아세포에 의한 세포 외 기질의 비정상적 생성, 축적 및 침착이 일어나는 질환으로, 기관 또는 조직의 섬유화에 의해 발병한다. 섬유증은 장기 손상을 유발하는 매우 치명적인 질환이다. 일례로 IPF (idiopathic pulmonary fibrosis)는 섬유아세포 축적 및 근섬유아세포 분화와 관련된 재발성 폐포 상피세포 손상의 결과로 나타나며, 폐 실질 (lung parenchyma) 조직의 비가역적 파괴와 함께 세포 외 기질 (extracellular matrix; ECM)의 과량 축적을 야기하는 만성, 진행성, 그리고 치사성 질환이다.

종래의 치료 연구는 코르티코스테로이드 및 면역억제 약물을 사용하여, 대체로 섬유증의 염증 과정을 표적으로 삼아왔다. 그러나 이런 제제는 임상 실험에서 거의 효과를 나타내지 못하여 섬유증을 치료하기 위한 신규한 약물이 필요한 실정이다.

한편, 대한민국 공개특허 제10-2013-0006170호에는 CHP (CYCLO(His-Pro)를 고농도로 함유한 대두 가수분해물을 포함하는 혈당 조절용 조성물이 개시된 바 있으나, CHP의 항섬유화 효과에 대해서는 알려진 바 없다.

본 발명의 목적은 사이클로-히스프로를 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 사이클로-히스프로를 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사이클로-히스프로를 포함하는 항섬유성 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 사이클로-히스프로 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 사이클로-히스프로 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 섬유증은 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 발생하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 섬유증은 폐 섬유화증(Pulmonary Fibrosis), 특발성 폐 섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury) 또는 폐 섬유화, 폐부종, 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis), 간 섬유화, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심근경색(Myocardial Infarction), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 신경교 반흔(Glial scar), 신장 섬유증(Renal Fibrosis), 골수 섬유증(Myelofibrosis), 관절 섬유증(Arthrofibrosis), 지방 섬유증, 피부 섬유증, 신경 섬유증 및 근 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 또한, 사이클로-히스프로를 포함하는 항섬유성 조성물을 제공한다.

본 발명의 사이클로-히스프로를 포함하는 조성물은 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절과 같은 다양한 조직 또는 기관에서 발생하는 섬유화를 억제하여 섬유증을 예방, 개선 또는 치료에 효과적이다.

도 1은 인체 사구체 및 세뇨관으로부터의 세포 분리 및 초대배양 과정을 나타낸 것이다 (좌: 사구체, 우: 세뇨관).
도 2는 인체 유래 근위세뇨관 상피세포 섬유화 모델에서 농도별 CHP 처리(각각 4, 20 및 100 μg/ml)에 따른 세포의 형태학적 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 인체 유래 근위세뇨관 상피세포 섬유화 모델에서 농도별 CHP 처리 (각각 4, 20 및 100 μg/ml)에 따른 E-카데린 (E-cadherin), 피브로넥틴 (fibronectin) 및 pSTAT3 단백질의 발현 수준 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 4는 인체 유래 사구체 내피세포 섬유화 모델에서 농도별 CHP 처리 (각각40 및 100 μg/ml)에 따른 세포의 형태학적 변화를 나타낸 것이다.
도 5a는 사람 유래 간 세포 섬유화 모델에서 농도별 CHP 처리 (각각 62.5, 125 및 250 ng/ml)에 따른 피브로넥틴(fibronectin) 단백질의 발현 수준 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 밴드 결과이며, 도 5b는 밴드의 크기를 정량하여 그래프화한 결과이다.
도 6a는 간섬유화 동물 모델에서 농도별 CHP 투여 (각각 5 및 35 mg/kg)에 따른 피브로넥틴 (fibronectin) 단백질의 발현 수준 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 밴드 결과이며, 도 6b는 밴드의 크기를 정량하여 그래프화한 결과이다.
도 7a는 사람 유래 폐 세포 섬유화 모델에서 농도별 CHP 처리 (각각 62.5 및 125 ng/ml)에 따른 피브로넥틴(fibronectin) 단백질의 발현 수준 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 밴드 결과이며, 도 7b는 밴드의 크기를 정량하여 그래프화한 결과이다.
도 8은 폐 섬유화 동물 모델에서 농도별 CHP 투여 (각각 5 및 35 mg/kg)에 따른 TGFβ 및 Collagen 3 유전자의 발현 수준 변화를 그래프화한 결과이다.
도 9a는 사람 유래 피부 세포 섬유화 모델에서 농도별 CHP 처리 (각각 62.5, 125, 250 및 500 ng/ml)에 따른 피브로넥틴(fibronectin) 단백질의 발현 수준 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 밴드 결과이며, 도 9b는 밴드의 크기를 정량하여 그래프화한 결과이다.
도 10은 심장 섬유화 동물 모델에서 농도별 CHP 투여 (각각 5 및 35 mg/kg)에 따른 섬유화 마커 TGFβ, Fibronectin, Collagen 1, Collagen 2, Collagen 3 및 Collagen 4 유전자 발현 수준 변화를 그래프화한 결과이다.
도 11은 지방 섬유화 동물 모델에서 농도별 CHP 투여 (각각 5 및 35 mg/kg)에 따른 섬유화 마커 TGFβ, Fibronectin, Collagen 3, 및 CTGF 유전자 발현 수준 변화를 그래프화한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 섬유증 관련 치료 연구는 코르티코스테로이드 및 면역억제 약물을 사용하여, 대체로 섬유증의 염증 과정을 표적으로 삼아왔으나, 이러한 제제는 임상 실험에서 거의 효과를 나타내지 못하여 섬유증을 치료하기 위한 신규한 약물이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 사이클로-히스프로가 다양한 조직 또는 기관에서 발생하는 섬유화를 억제하여 섬유증을 예방, 개선 또는 치료에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 사이클로-히스프로 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및/또는 사이클로-히스프로 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 사이클로-히스프로를 포함하는 항섬유성 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "사이클로-히스프로(Cyclo-HisPro; CHP)"는 갑상선 자극호르몬 방출호르몬 (thyrotropin-releasing hormone, TRH)의 대사산물인 히스티딘-프롤린으로 구성된 자연적으로 발생하는 원형 디펩티드(dipeptide) 또는 TRH 대사과정과 de novo로 체내에서 합성되기도 하는 생리활성 디펩티드로, 뇌 전반과 척수 및 위장관 등에 널리 분포하는 물질을 말한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 CHP는 합성하여 사용하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, CHP가 함유된 물질, 예를 들어, 전립선 추출물 및 대두 가수분해물 등으로부터 정제하여 사용할 수 있다.

용어 "정제된"의 사용으로, CHP가 전립선 추출물과 같은 천연 유래로 얻을 수 있는 형태에 비하여 농축된 형태임을 의미하고자 한다. 정제된 성분들은 이들의 천연원으로부터 농축시키거나, 또는 화학적 합성 방법을 통해 얻을 수 있다.

본 발명에서, 용어 "섬유증(fibrosis)"은 "섬유증 병태", "섬유증식성 병태", "섬유증 질환", "섬유증식성 질환", "섬유증 장애" 및 "섬유증식성 장애"와 호환적으로 사용되며, 섬유모세포의 조절장애적 증식 또는 활성, 피브로넥틴의 이상 축적 및/또는 콜라겐성 조직의 병적 혹은 과도한 축적을 특징으로 하는 병태, 질환 또는 장애를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 병태, 질환 또는 장애는 항섬유성 활성을 지니는 화합물의 투여에 의해 치료 가능하다.

상기 섬유증은 예를 들어, 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 발생할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 섬유증은 폐 섬유화증(Pulmonary Fibrosis), 특발성 폐 섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury) 또는 폐 섬유화, 폐부종, 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis), 간 섬유화, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심근경색(Myocardial Infarction), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 신경교 반흔(Glial scar), 신장 섬유증(Renal Fibrosis), 골수 섬유증(Myelofibrosis), 관절 섬유증(Arthrofibrosis), 지방 섬유증, 피부 섬유증, 신경 섬유증 및 근 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.

구체적으로, 본 발명에 따른 CHP는 본원에 기술되는 다양한 섬유증에 치료 효과를 나타낸다.

본 발명의 조성물의 섬유증 예방, 개선 또는 치료 용도에 있어서, 제1 측면은 신장에서 발생하는 섬유증인 신장 섬유증에 관한 것이다.

신장 질환은 진행 상태에 따라 급성신부전증, 만성신부전증으로 분류되며, 또는 발병 원인에 따라 혈관 복합체의 침착으로 인한 사구체 신염, 당뇨병에 수반되는 당뇨병성 신장 질환 또는 고혈압에 수반되는 고혈압성 신장 질환, 항생제 또는 항암제 등의 약물투여에 의한 독성신병증, 세균 감염 등으로 나뉜다. 원인이 되는 신장 질환의 종류에 관계없이 만성적으로 신기능 장애가 진행되어 사구체 여과율이 50% 이하로 감소하면, 대부분의 경우 계속적으로 사구체 여과율이 감소하게 되며, 궁극적으로 말기 신부전증에 도달하게 되고 혈액학적 이상, 신경계합병증, 위장관계 합병증, 면역학적 합병증, 감염 또는 골이영양증 등의 합병증이 일어나 심한 경우 죽음에 이르게 된다.

만성 신부전이란, 이러한 신장 기능이 단방향(불가역성)으로 점차 감소하고, 생체의 항상성 유지하지 못하는 상태이다. 모든 신장 질환은 신장의 섬유화를 수반하며 결국 말기 신부전에 이른다. 특히 만성적인 신장 기능 저하는 신장 섬유화의 진행과 깊게 관련되고 있기 때문에, 섬유화의 진행 억제는, 만성 신부전의 진행 억제로 이어질 수 있다.

본 발명에서 용어 "신장 섬유증"은 다양한 원인으로 신장에서 섬유화가 발생된 모든 질환을 포함하며, 섬유증은 카테터 (catheter) 설치, 사구체 경화증, 사구체 신염, 신장염, 급성 신부전, 만성 신부전, 말기 신장 질환 및 대사성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 인한 것을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.

상기 신장염의 종류로는, 예를 들어, 임의의 사이질성 신장염, 예를 들면, 렌사 구균 신장염, 포도상구균 신장염, 폐렴 구균 신장염, 작은마마, B형 간염, C형 간염, HIV 등에 수반하는 바이러스성 신장염, 말라리아등의 기생충 감염에 의한 신장염, 진균류성 신장염, 마이코플라스마(mycoplasma) 신장염 등에 수반하는 감염성간질성 신장염, 전신성 에리테마토서스(erythematosus)(루프스(lupus) 신장염), 전신성강피증(교원병 신장), 시그렌(Sjgren) 증후군 등의 교원병에 수반하는 동안질성 신장염, 자반병성 신장염, 다발성 동맥염, 급속 진행성 사구체신염등의 혈관의 면역 질환에 수반하는 신장염, 방사선 방사능 노출에 수반하는 동안질성 신장염, 금 제재, NSAID, 페니실라민(penicillamine), 블레오마이신(bleomycin)등의 항암제, 항생 물질, 파라코트(paraquat) 등에 의한 약제성 간질성 신장염, 곤충의 자상, 화분, 옻과의 식물 등에 의한 알레르기성 신장염, 아밀로이도시스(amyloidosis) 신장염, 당뇨병성 신부전, 만성 사구체신염, 악성신장 경화증, 다발성 낭포신부전 등에 수반하는 신장염, 요세관간질성 신장염, 임신 중독증이나 암에 수반하는 신장염, 막성 증식성 사구체신염, IgA 신부전, 혼합형 클리오글로블린혈증(cryoglobulinemia) 신장염, 굿패스차(Goodpasture's)-증후군 신장염, 베게나 육아종증신장염, 급성간질성 신장염등의 특발성간질성 신장염일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

도 2 내지 4에서 입증된 바와 같이, CHP는 섬유화가 유도된 근위 세뇨관 상피세포에서 접합 마커인 E-카데린 단백질의 발현을 회복시키고, 피브로넥틴 및 pSTAT3 단백질의 발현을 감소시킴으로써 근본적인 항섬유화 효과를 나타내므로, 섬유화를 유도하는 원인에 관계없이 다양한 신장 섬유증를 치료하는데 적용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 섬유증 예방, 개선 또는 치료 용도에 있어서, 제2 측면은 간에서 발생하는 섬유증인 간섬유증에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "간섬유증 (liver fibrosis)"은 간의 만성 손상으로 섬유 조직이 증식하는 증상을 말하며, 만성 간 질환, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, D형 간염 바이러스 감염, 주혈흡충증, 알코올성 간 질환 또는 비-알코올성 지방간염, 대사성 질환, 단백질 결핍증, 관상 동맥 질환, 자가 면역 간염, 낭포성 섬유증, 알파-1 항트립신 결핍증, 일차성 담즙성 간경화증, 약물 반응 및 독소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로 인한 것을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

간섬유화는 간경변증의 전구병변으로 만성 간질환을 일으키는 심한 간 손상의 결과로 여러 가지 사이토카인과 성장인자의 작용에 의해 시작된다. 일반적으로 간섬유증은 가역적이고 얇은 피브릴 (thin fibril)로 구성되며 결절 형성이 없고 간손상 원인이 한시적인 경우 세포사멸(apoptosis) 과정과 MMP (matrix metalloproteinases)에 의해서 증가된 세포외기질(extracellular matrix, ECM)이 분해되어 정상 회복이 가능하나 간섬유증 과정이 반복적으로 지속되면 두꺼운 피브릴 (thick fibril)을 형성하고 결절이 있는 간경변으로 진행하게 된다. 또한 다양한 염증 유발요인으로 인해 간세포가 손상되어 콜라겐을 포함한 비정상적인 세포외기질 단백질이 축적되는 간섬유증의 과정을 통하여 간경변증이 유발되며 간경변증의 발현 조절을 위해서는 세포외기질의 축적을 조절하는 것이 중요하다. 간세포가 손상되는 경우의 염증반응은 휴지기의 간성상세포를 활성화시켜 세포외 기질과 다양한 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)을 분비하며 그 중 TGF-β1은 강력한 성장억제제의 역할을 한다. TGF-β1은 25 kD의 물질로서 잠재하는 TGF-β1 결합 단백질 (latent TGF-β1 binding protein)과 결합하여 비활성의 잠재성 (inactive latent) 형태로 분비되고 1,4형 교원질, 라미닌 및 디코린 (decorin) 등의 세포외기질과 결합한 상태로 존재하여 여러 가지 자극에 의해 활성화된다. TGF-β1은 콜라게나아제 (collagenase) 생산을 감소하거나 콜라게나아제 억제물질 생산을 증가하여 콜라겐 발현을 조절하며 대식세포에서 TNF-α, IL-1 및 PDGF 등의 생산을 증가시키며 섬유화 과정에 중요한 역할을 한다. 현재 TGF-β1은 섬유화가 진행된 곳에서만 발현되고 정상 간조직이나 비활동적인 곳에서는 발현되지 않아 간섬유화에서 TGF-β1이 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 비알콜성 지방간은 음주와 관계없이 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등의 원인에 의해 발병될 수 있으며, 진행 경과에 따라 염증 반응을 동반하지 않는 단순 지방간 (steatosis)과 간세포의 염증반응(hepatocellular inflammation)을 나타내는 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 진행 섬유화증 (advanced fibrosis) 및 간경변 (liver cirrhosis)까지 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미한다.

비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 현대 사회의 고지방 및 고열량 식이 섭취에 따른 성인병의 증가로 선진국 기준 성인 인구의 20-30%가 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)을 나타내며 그 중 2-3%가 비알코올성 지방간염(NASH) 환자로 이행된다고 보고되고 있을 뿐 아니라, 특히, 조직학적으로 섬유화와 염증을 동반한 지방간염 소견을 보여 간경변, 간부전 및 간암으로 발전할 위험이 매우 높아지게 된다.

이에 따라, 본 발명의 일 실시예에서는 고지방 식이로 유도된 간섬유화 동물모델을 확립하고, 해당 모델에서 CHP가 피브로넥틴 단백질 발현 감소 효과를 나타냄을 확인하였다.

지방간은 그 자체로 병적인 상태는 아니며, 원인물질이 제거되면 자연히 회복되는 가역적인 증상이다. 그러나, 간조직에 지방이 과다하게 축된 상태가 지속적으로 유지되면 지방간염이 발생하고, 그 결과 간세포 괴사와 재생이 반복적으로 일어나며, 이 과정에서 섬유상의 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)이 증가하여 간의 섬유화가 진행된다. 간 손상이 일정 단계에 이르게 되면 원인물질의 종류와 무관하게 ECM의 축적량이 증가하게 되며, 지속적인 간세포 파괴와 재생의 결과로 재생결절 (regenerative nodules)이 형성되어 비가역적인 간경변 (liver cirrhosis)으로 악화되게 된다.

따라서, 본 발명에서 간섬유증은 가역적인 증상인 지방간과는 명확히 구분되는 질환이고, 간 조직이 재생결절 등의 섬유화 조직으로 바뀌어 간 기능이 저하되는 모든 질환을 지칭한다.

도 5에서 입증된 바와 같이, CHP는 섬유화가 유도된 간 세포에서 섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질의 발현량을 감소시키고, 도 6에서 입증된 바와 같이, CHP는 간섬유화가 유도된 동물 모델에서 피브로넥틴 단백질의 발현을 감소시킴으로써 근본적인 항섬유화 효과를 나타내므로, 섬유화를 유도하는 원인에 관계없이 다양한 간섬유증뿐만 아니라 간경변으로부터 진행된 간부전 및 간암을 치료하는데에도 적용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 섬유증 예방, 개선 또는 치료 용도에 있어서, 제3 측면은 폐에서 발생하는 섬유증인 폐섬유증에 관한 것이다.

섬유증 중에서 특히, 폐 섬유증(Pulmonary fibrosis)은 폐 조직의 폐포 벽에 만성 염증 세포들이 침투하면서 조직 섬유화를 유도하여 폐 조직의 심각한 구조적 변이를 일으키는 질환을 말한다. 어떠한 원인에 의해 일단 섬유화가 진행되면 폐 조직이 단단하게 굳고 폐포 벽이 두꺼워져 혈액에 의한 산소 공급량이 줄어들게 되고, 이에 따라 호흡이 어려워지게 된다. 현재 의학으로는 이미 섬유화가 진행된 폐 조직을 완전히 복구할 수 있는 치료 방법이 없어, 섬유화 진행 초기에 발견하거나 또는 폐 이식을 제외하면 대개 증상이 발병되고 3 ~ 5년 이후 환자가 결국 사망에 이르게 된다.

구체적으로, 본 발명에서 용어 "폐섬유증"은, 폐에서의 과도한 섬유성 연결 조직의 형성 또는 발달(섬유증)로 인해, 흉터가 생긴(섬유성) 조직의 발달을 의미한다. 구체적으로, 폐 섬유증은 폐포 및 폐의 간질성 조직의 팽윤 및 흉터를 유발하는 만성 질환이다. 이와 같은 흉터 조직이 건강한 조직을 대체하여 염증을 유발하며, 만성 염증은 섬유증의 전조로 파악될 수 있다. 이와 같은 폐 조직의 손상으로 인하여 폐가 뻣뻣하게 될 수 있고, 개체가 자가호흡이 어려워지게 될 수 있다.

본 발명에서 폐섬유증은 특발성 폐섬유증 (Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury), 비특이성 간질성 폐렴 (Nonspecific Interstitial Pneumonia), 급성간질성 폐렴 (Acute Interstitial Pneumonia), 특발성 기질화 폐렴(Cryptogenic Organizing Pneumonia), 호흡계기관지염 관련성 간질성 폐질환 (Respiratory Bronchiolitisassociated Interstitial Lung), 박리성 간질성 폐렴 (Desquamative Interstitial Pneumonia), 임파구성 간질성 폐렴 (Lymphoid Interstitial Pneumonia), 간질성 폐섬유증 및 미만성 폐섬유증, 폐부종, 낭포성 섬유증 및 대사성 질환으로 인한 폐섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

상기 폐섬유증은 다양한 원인, 예를 들면 미세입자 (석면, 돌가루, 금속 분진, 담배연기에 존재하는 입자들, 실리카 분진 등)의 흡입에 의해 유도되는 폐의 미세 손상에 의해 발병할 수 있다. 또한, 폐섬유증은 다른 질병 (자가면역질환, 바이러스 또는 박테리아 감염 등)의 부차적인 영향으로 발생할 수 있고, 세포독성 제제 (블레오마이신, 부설판 및 메토트렉세이트 등); 항생제 (니트로푸란토인 및 술파살라진 등); 부정맥 치료제 (아미오다론 및 토카이니드 등); 항염증 약물(금 및 페니실아민 등); 불법 약물 (마약, 코카인 및 헤로인 등)과 같은 특정 약물들에 의해 유발될 수 있으며, 상기 특발성 폐섬유증의 경우에는 이와 같은 원인 이외의 다른 알 수 없는 원인에 의해 나타나는 것일 수 있다. 또한, 장기간의 고지방식의 섭취는 폐섬유화를 유도하며, 이는 고지방 섭취에 따른 염증 수치 증가로 인한 것으로 보인다.

도 7에서 입증된 바와 같이, CHP는 섬유화가 유도된 폐 세포에서 섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질의 발현량을 감소시키고, 도 8에서 입증된 바와 같이, CHP는 폐섬유화가 유도된 동물 모델에서 주요 섬유화 마커인 TGFβ 및 Collagen 3 유전자의 발현을 감소시킴으로써 근본적인 항섬유화 효과를 나타내므로, 섬유화를 유도하는 원인에 관계없이 다양한 폐 섬유증을 치료하는데 적용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 섬유증 예방, 개선 또는 치료 용도에 있어서, 제4 측면은 피부 섬유증에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "피부 섬유증"은 피부의 과도한 상흔이며, 병리학적 상처 치유 반응의 결과이다. 광범위한 섬유성 피부 질환이 있다: 강피증, 신성섬유화성 피부증, 혼합성 결합조직 질환, 경화성 점액수종, 경화성 수종, 및 호산구성 근막염. 화학 물질이나 물리적 작용제(기계적 외상, 화상상처)에 대한 노출은 또한 섬유성 피부 질환의 잠재적인 원인이다. 피부 섬유증은 면역, 자가 면역 및 염증 기전에 의해 주도될 수 있다. 섬유 아세포의 콜라겐 생성 및 분해의 균형은 피부 섬유증의 병태 생리 과정에서 중요한 역할을 한다. 형질전환 성장 인자-β (TGB-β) 및 인터루킨-4 (IL-4)와 같은 특정의 시토카인은 상처 치유 및 섬유화를 촉진한다. 정상 피부의 섬유아세포는 정지되어 있다. 이들은 결합조직 단백질의 양을 제어하고 낮은 증식활성을 갖는다. 피부 손상 후, 이러한 세포들은 활성화되고, 즉 이들은 α-평활근 액틴(α-SMA)을 발현하고 다량의 결합조직 단백질을 합성한다. 활성화된 세포들은 흔히 근육섬유 아세포라고 불리운다.

본 발명에서 용어 "피부 섬유증"은 또한 "피부경화증 (scleroderma)"을 포함하는 것을 의미한다.

피부경화증은 진피 내에 아교질의 과다한 축적으로 인해 피부의 일부분 또는 전신의 피부가 딱딱해지고 두꺼워지는 경화성 변화와 혈관계 이상을 특징으로 하는 원인 미상의 만성 자가면역 결합조직질환의 하나이다. 아교질 (Collagen: 콜라겐)은 결합조직을 구성하여 신체의 조직을 지지하고 연결해 주는 역할을 한다. 피부경화증은 몇 가지 형태가 있는데, 신체의 특정부위에만 증상이 나타나는 형태도 있고, 내장 기관을 비롯해서 몸 전체에 나타나는 형태도 있다. 즉, 피부의 일부분만 딱딱해지는 국소 피부경화증 (localized scleroderma)과 피부뿐만 아니라 폐, 소화기, 신장과 심장 등의 내부 장기에서도 아교질 증가에 의한 섬유화 증상을 나타내는 전신 경화증 (systemic scleroderma)으로 나눈다. 전신 경화증은 다시 피부와 내부 장기의 침범 정도, 예후, 면역학적 검사소견에 따라 제한형과 광범위형으로 분류된다.

본 발명의 피부 섬유증의 예방, 개선 또는 치료 용도에 있어서, 피부 섬유증은 반흔, 비후성 반흔, 켈로이드 반흔, 국소형 피부경화증 및 전신 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

피부경화증의 원인은 아직 확실히 밝혀지지 않았으나, 조직의 섬유화가 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

피부경화증의 초기 증상들은 매우 다양하게 나타나는데, 특히 후반기에는 피부 증상이 뚜렷해진다. 피부경화증의 공통적인 증상들로는 관절통, 아침에 나타나는 경직감, 피로, 그리고 체중 감소가 있다. 또한 추운 곳에 노출되면 손가락, 발가락, 코 그리고 귀에 혈액 공급이 일시적으로 제한된다. 이러한 증상은 피부경화증 환자의 초기 증상이며 자주 나타나는 증상들 중 하나이다. 피부경화증을 가진 환자들은 피부가 단단해진다. 이렇게 피부가 단단해지는 현상은 넓게 퍼지면서 전형적으로 몸의 양쪽에 생긴다. 결국 조직이 손상되며 피부에 색소가 침착된다.

"국소형 피부경화증 (localized scleroderma)"은 국소형은 여자에서 남자보다 2.6배 호발한다. 국소형은 20~50세 사이에 75%의 환자가 발생하며, 선피부경화증의 경우 더 이른 나이에 발생하는 경향을 보인다. 국소형 피부경화증은 국소피부경화증, 전신국소피부경화증, 선국소피부경화증 또는 피하국소피부경화증으로 분류된다.

국소피부경화증은 흔히 홍반 또는 적자색 반으로 시작하여 주위 정상피부와 경계가 뚜렷해지며 일정 부위의 피부가 탄력성을 잃고 딱딱해진다. 그 부위는 갈색을 띄거나 많은 경우 탈색되어 흰 색깔을 띠게 된다. 대부분 한 군데에 발생하지만 여러 개가 발생하는 경우도 있으며 크기는 매우 다양하여 동전 크기부터 어른 손바닥 크기에 이를 수 있다. 미용적인 문제를 초래하지만 전신경화증으로 진행하지는 않는다. 일부 환자에서는 치료를 하지 않아도 딱딱한 피부가 부드러워지면서 저절로 회복되기도 한다.

전신국소피부경화증은 국소피부경화증의 심한 형태로, 넓은 부위의 피부가 딱딱해지고 과다색소침착이 관찰되는 경우이다. 몸통, 엉덩이, 다리의 피부가 광범위하게 딱딱해진다. 그러나 레이노 (Raynaud) 현상, 내부장기 침범증상이 없어 전신경화증과 구별된다.

선국소피부경화증은 피부가 선상으로 길게 딱딱해지는 경우로 다리, 팔, 이마, 앞가슴의 순으로 잘 발생하며, 특히 이마에 수직선상으로 함몰되며 발생된 경우를 칼자국모양(en coup de sabre)이라 하고 미용적인 문제를 유발한다. 국소피부경화증과 달리 선피부경화증은 피부뿐 아니라 그 하부의 근육, 골막조직까지 침범하여 하부조직에 고정되게 된다. 소아에서 발생빈도가 높으며 때로는 팔다리와 얼굴에 골격의 심한 발육이상을 유발할 수 있다.

피하국소피부경화증은 지방층, 근막, 근육과 때로는 뼈의 경화증이 나타나며 관절 운동에 제한이 있을 수 있다. 병변이 심부에 나타나므로 피부경화증의 특징적인 피부색소 변화는 관찰되지 않는다.

전신 경화증 (systemic scleroderma)은 여자에서 남자보다 4배 정도 흔히 발생하며, 어느 연령대에서나 발생할 수 있으나 대체로 30~50세 사이에 많이 발생한다. 광범위형의 경우 제한형에 비해 좀 더 어린 나이에 발생하는 것으로 알려져 있다. 레이노 현상은 전신 경화증에서 가장 먼저 나타나는 증상이며, 곧이어 피부와 내부 장기에 경화 증상이 시작된다. 전신 경화증은 피부 증상과 내부 장기 증상으로 분류된다.

전신경화증에서 첫 피부증상은 손가락과 손에서 시작한다. 처음에는 레이노 현상만 보이다가 손가락과 손이 붓고 뻣뻣해지며 붉게 변한다. 점차 피부가 딱딱해지며 팔, 얼굴로 퍼지며 광범위형의 경우 몸통을 포함한 전신 피부가 지속적으로 딱딱해진다. 얼굴에 경화증이 오면 전반적으로 주름이 없어지고 표정을 짓기가 힘들게 된다. 코가 뾰족해 보이며, 입을 벌리기가 어렵고 입술이 얇아지며 입 주위에 방사상으로 주름이 발생하여 노인의 입처럼 변하게 된다. 관절의 운동이 제한되어 손을 끝까지 쥘 수 없게 되며 손가락이 구부러지고 뾰족해지는 손발가락경화증을 보인다. 손가락 끝과 관절에는 통증이 심하고 잘 낫지 않는 궤양이 발생한다.

광범위한 과다색소침착과 국소적인 색소침착저하가 나타날 수 있으며 침범된 부위에 탈모와 땀 분비가 저하된다. 모세혈관확장이 얼굴과 위쪽 몸통에 둥근 반점 형태로 나타나거나 손톱주름 주위에 관찰된다. 레이노병이 있는 환자에서 손톱주름의 모세혈관에 이상이 있으면 이후 전신경화증이 발생할 수 있어 모세혈관 변화는 예후 결정에 중요하다. 피부 석회화가 관찰될 수 있으며 손가락관절 주변에 비교적 흔히 발생된다.

내부 장기 증상으로, 위장관, 폐, 심장 또는 신장에서 발생한다. 위장관에서 식도는 가장 흔히 침범되는 부위로 90% 이상에서 침범된다. 식도의 연동운동 장애, 삼킴곤란과 역류식도염이 흔히 발생한다. 소장운동저하로 변비, 설사, 흡수장애 등의 증상이 나타날 수 있다. 전신경화증 환자가 사망하게 되는 가장 중요한 원인은 폐 증상으로 인한 것이며, 약 70%의 환자에서 발생한다. 폐의 섬유화로 인하여 운동시 호흡곤란, 기침을 호소한다. 폐포염이 흔히 발생하여 지속적으로 폐기능이 저하된다. 심장에서의 증상으로는 심장전도장애, 심부전, 심장막염이 나타날 수 있고, 심근의 경화증은 50-70%의 환자에서 나타날 수 있다. 신장에서의 증상은 전신경화증 환자의 약 45%에서 발생한다. 갑자기 발생하는 급성신부전, 고혈압 등으로 나타나며, 서서히 진행하는 요독증이 발생할 수도 있다.

따라서, 본 발명의 피부 섬유증의 예방, 개선 또는 치료 용도에 있어서, 피부 섬유증은 제한 없이, 혈관과 정맥, 하학골하 도관(ducts of submandibular), 담낭, 갑상선 여포, 땀샘관, 난소, 신장과 같은 기관 또는 샘(gland)의 내부 공동; 잇몸, 혀, 구개, 코, 후두, 식도, 위, 창자, 직장, 항문 및 질의 상피 세포; 진피, 반흔, 피부 및 두피를 비롯한 임의의 피부 조직과 상피 세포의 섬유증을 포괄한다.

도 9에서 확인된 바와 같이, CHP는 섬유화가 유도된 피부 세포에서 섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질의 발현량을 감소시킴으로써 근본적인 항섬유화 효과를 나타내므로, 섬유화를 유도하는 원인에 관계없이 다양한 피부 섬유증 (피부 경화증)을 치료하는데 적용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 섬유증 예방, 개선 또는 치료 용도에 있어서, 제5 측면은 심장에서 발생하는 섬유증인 심장 섬유증에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "심장 섬유증 (cardiac fibrosis)"은 심장 세포 사이에 기질 단백질이 과도하게 침착되어 심장이 딱딱하게 굳는 현상으로 심근경색 환자의 심장에서 주로 나타나며 심장의 기능이 감소하는 주원인 현상을 말하며, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 심부전, 심근경색 및 대사성 질환으로 인한 심장 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.

섬유증은 심근세포 사멸 후에 발생하는 섬유화 콜라겐의 불균형적인 축적, 염증, 증가된 작업 부하, 비대 및 다수의 호르몬, 사이토카인 및 성장 인자에 의한 자극을 특징으로 한다.

심장 섬유증은 또한 심장 섬유아세포의 불균형적 증식으로 인하여 심장 판막의 이상 농축을 의미할 수 있지만, 더욱 일반적으로는 심장 근육의 섬유아세포의 증식을 의미한다. 섬유 세포 (Fibrocyte cells)는 일반적으로 콜라겐을 분비하고, 심장에 대한 구조적 지지를 제공하는 작용을 한다. 지나치게 활성화되면, 이 과정은 판막의 농축과 섬유증의 원인이 된다.

심장의 섬유화는 심부전 및 심근경색의 주요 원인이므로, 용어 "심장 섬유증"은 심장 섬유화로 유발되는 심부전 및/또는 심근경색을 포괄하는 것으로 해석될 수 있다.

도 10에서 확인되는 바와 같이, CHP는 심장 섬유화가 유도된 동물 모델에서 주요 섬유화 마커인 Fibronectin, Collagen 1, Collagen 2, Collagen 3 및 Collagen 4 유전자의 발현을 감소시킴으로써 근본적인 항섬유화 효과를 나타내므로, 원인에 관계 없이 다양한 심장 섬유증의 치료에 유용하다.

본 발명의 조성물의 섬유증 예방, 개선 또는 치료 용도에 있어서, 제6 측면은 지방 섬유증에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "지방 섬유증"은 지방 조직에 섬유화가 발생한 모든 질환을 포괄하는 것을 의미한다.

정상 생쥐에게 60% 지방 함유 고지방 식이를 16~24주 동안 섭취시켰을 때 지방 조직의 섬유화가 나타나게 된다는 보고가 있다 (Hu, M et al., Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 1-12, 2018; Kwon, E. Y., & Choi, M. S., Nutrients, 10(10), 1415, 2018; Nakazeki, F et al., Scientific Reports, 8(1), 2018; Muniappan, L et al.. Scientific Reports, 7(1), 2017; Lancha, A et al., PLoS ONE, 9(5), e98398, 2014; Velαzquez, K. T et al., Physiological Reports, 5(18), e13412, 2017; Wang, L., Ye, X., Hua, Y., & Song, Y., Biomedicine & Pharmacotherapy, 105, 121-129, 2018).

이에, 본 발명자들은 고지방 식이로 유도된 지방 섬유화 동물 모델을 확립한 후 CHP 투여에 따른 섬유화 마커 TGFβ, Fibronectin, Collagen 3 및 CTGF 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 11에서 확인되는 바와 같이 CHP는 상기 섬유화 마커의 발현을 현저하게 감소시킴으로써 항섬유화 효과를 나타내므로, 지방 섬유증의 치료에 유용하다.

이상과 같이, 본 발명에서는 섬유화가 유도된 다양한 조직 세포 및 동물 모델에서 CHP가 다양한 섬유화 마커 유전자 또는 단백질의 발현을 감소시킴으로써 항섬유 활성을 나타냄을 확인하였는바, 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절을 비롯한 신체 내 다양한 조직 및/또는 기관에서 발생하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있음을 예상할 수 있다.

본 발명의 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 있어서, 용어 "예방", "개선" 및/또는 "치료"는 질병 또는 병증의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위, 질병 또는 병증 상태를 호전 또는 이롭게 변경하는 모든 행위, 및 질병 또는 병증의 진행을 지연, 중단 또는 역전시키는 모든 행위를 의미한다.

본원에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약제학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가산염이 바람직하다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 또는 메탄술폰산을 포함한다. 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 또는 붕산을 포함한다. 산 부가염은 바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산염 형태일 수 있다.

이외에도 추가적으로 염이 가능한 형태는 가바염, 가바펜틴염, 프레가발린염, 니코틴산염, 아디페이트염, 헤미말론산염, 시스테인염, 아세틸시스테인염, 메티오닌염, 아르기닌염, 라이신염, 오르니틴염 또는 아스파르트산염 등이 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다. 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이드레이트(예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스, 또는 덱스트란 등), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.

단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화 될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 '경피 투여'는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 사이클로-히스프로를 유효량으로 포함할 때 바람직한 섬유증의 예방, 개선 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 본원에서, 용어 "유효량"은 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며, 바람직하게는 섬유증을 예방, 개선 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물에 사이클로-히스프로가 0.01 내지 99.9% 포함될 수 있으며, 잔량은 약학적으로 허용가능한 담체가 차지할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 사이클로-히스프로의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태 등에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 예를 들어, 사이클로-히스프로를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.001 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 상기 사이클로-히스프로의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 사이클로-히스프로를 섬유증의 예방, 치료 또는 개선을 위한 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 또한 사이클로-히스프로를 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 조성물은 섬유증 예방 또는 개선용 의약외품 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 의약외품 일 수 있다.

상기 외용제는 피부 또는 구강 내에 직접 적용될 수 있다. 본 발명의 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 조성물이 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 액제, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 외약외품은 치약, 양치액 및 마우스 스프레이를 포함하는 구강관리 제품, 연고제, 마스크, 습포제, 첩부제 및 경피흡수제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약외품 조성물로 사용하는 경우, 사이클로-히스프로를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물 및 의약외품에 대하여 본 발명의 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물의 내용이 준용될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "건강기능식품"은 "기능성 식품"및 "건강 식품"의 의미를 모두 포함한다.

본 발명에서, 용어 "기능성 식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다.

본 발명에서 용어, "건강 식품(health food)"은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다. 상기 식품은 간 기능 개선 및 회복에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

이러한 기능성 식품의 구체적인 예로, 상기 조성물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 또한, 영양 보조제 (nutritional supplement), 식품 첨가제 (food additives) 및 사료 등의 형태로 제조될 수 있으며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식 대상으로 한다.

상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 사이클로-히스프로를 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 사이클로-히스프로를 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 상기 사이클로-히스프로를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 사이클로-히스프로를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 사이클로-히스프로와 섬유증의 예방 또는 개선에 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물이 건강음료 조성물로 이용되는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

사이클로-히스프로는 섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 상기 예방 또는 개선 효과를 얻기에 유효한 양으로, 예를 들어 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 사이클로-히스프로와 함께 섬유증의 예방 또는 개선에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

[준비예]

하기 실시예에서 사용한 CHP(사이클로-히스프로)는 바켐에서 구입하여 사용하였다.

CHP 처리에 따른 인체 유래 근위 세뇨관 상피세포에서의 항섬유 효과 확인

1-1. 인체 유래 근위세뇨관 상피세포의 분리 및 배양

도 1에 나타낸 바와 같이, 정상 성인의 신장조직에서 사구체 및 세뇨관 간질조직을 분리하고 이를 초대 배양함으로써 세포실험에 활용 가능한 인체 유래 사구체 내피세포 및 인체 유래 근위 세뇨관 상피세포를 순수분리 및 배양하였다.

1-2. 인체 유래 근위세뇨관 상피세포 섬유화 모델에서 CHP 처리 후 세포학적 형태 관찰

상기 실시예 1-1에서 분리 및 초대배양된 인체 유래 근위세뇨관 상피세포에 재조합 TGFβ (2 ng/ml)를 처리하여 세포 섬유화를 유도함으로써 세포골격 리모델링 (cytoskeletal remodeling)과 형태학적 변화 (가늘고 길어지며 구조가 사라짐)가 발생하여 섬유화가 적절히 유도된 것을 확인하였다 (도 2).

이후 다양한 농도의 CHP (4, 20 및 100 μg/ml)를 처리하였을 때 섬유화가 호전되는 것을 세포 형태학적으로 확인하였다 (도 2).

1-3. 인체 유래 근위세뇨관 상피세포 섬유화 모델에서 CHP 처리 후 E-카데린 (E-cadherin), 피브로넥틴 (fibronectin) 및 pSTAT3 단백질 발현 확인

상기 실시예 1-2와 같은 조건에서, CHP 투여 이후에 접합 마커(junction marker)인 E-카데린, 섬유화 마커인 피브로넥틴 및 섬유화 전사인자인 pSTAT3의 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 CHP 투여에 따라 E-카데린의 단백질 발현이 회복되고, 피브로넥틴 및 pSTAT3 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다.

CHP에 따른 인체 유래 사구체 내피세포에서의 항섬유 효과 확인

인체 유래 사구체 내피세포 섬유화 모델에서 CHP 처리 후 세포학적 형태 관찰

상기 실시예 1-1의 인체 유래 근위세뇨관 상피세포 섬유화 모델과 같이, rTGFβ (2 ng/ml)를 처리하여 사구체 내피세포에서 세포 섬유화를 유도함으로써, 세포골격 리모델링 (cytoskeletal remodeling)과 형태학적 변화가 발생하여 섬유화가 적절히 유도된 것을 확인하였다 (도 4).

이후 다양한 농도의 CHP (40 및 100 μg/ml)를 처리하였을 때 섬유화가 호전되는 것을 세포 형태학적으로 확인하였다 (도 4).

이상의 결과를 통해, 신장 섬유증에 대한 CHP의 우수한 치료효과를 확인할 수 있었다.

CHP 처리에 따른 사람 유래 간세포에서의 항섬유 효과 확인

3-1. 사람 유래 간세포 배양 및 섬유화 유도 후 CHP 처리

Huh7 간 세포주 배양을 위해 Hyclone 사에서 DMEM 배지와 FBS를 구입하였으며 섬유화 유도를 위한 TGFβ는 R&D systems 사에서 구입하였다. 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지로 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, TGFβ를 2 ng/ml 농도가 되도록 처리함과 동시에 CHP를 0, 62.5, 125, 250 ng/ml이 되도록 처리하고 처리 48시간째에 세포를 회수하였다.

3-2. 사람 유래 간세포 섬유화 모델에서 CHP 처리 후 섬유화 마커 피브로넥틴 (fibronectin) 단백질 발현 확인

섬유화 단백질인 피브로넥틴 (Fibronectin) 단백질 발현 분석을 위해 Thermo 사의 RIPA 용해 버퍼 (lysis buffer)와 Halt™ 프로테아제 (Protease) 및 포스파타아제 (Phosphatase) 저해제 칵테일을 구입하였고, 단백질 정량을 위해서는 Thermo 사의 BCA 단백질 정량 키트를 구입하였다. 웨스턴 블랏은 Thermo 사의 Bolt™ 단백질 젤 전기영동 시스템과 Bio-rad 사의 Wet 트랜스퍼 시스템을 준비하였다. 간섬유증 표지자인 피브로넥틴 단백질의 항체와 로딩 컨트롤로 사용되는 GAPDH 항체는 Abcam 사에서 구입하였다. 회수한 Huh7 세포에 프로테아제 및 포스파타아제 저해제가 첨가된 RIPA 버퍼 100 ul를 넣고 피펫팅으로 세포를 용해시켰다. 10분간 얼음에 방치시킨 후, 4℃에서 15,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 모아 BCA 정량법으로 단백질 농도를 측정하고, 동량의 샘플들을 Bolt^TM 단백질 젤 전기영동 시스템을 이용해 단백질을 분리 시키고, 니트로셀룰로스 멤브레인 (Nitrocellulose membrane)에 옮겼다. 멤브레인은 5% 스킴 밀크 (skim milk)로 상온에서 1시간 동안 차단(blocking)을 진행한 후 1차 항체인 피브로넥틴 및 GAPDH 항체와 4℃에서 밤새 (overnight) 반응시켰다. TBST로 10분씩 3회 씻은 후 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 10분씩 3회 씻은 후 ECL로 반응시켜 발현 정도를 측정하였다. 나타나는 밴드의 크기는 ImageJ 프로그램을 이용해 정량하였고, 피브로넥틴 밴드 크기 값을 GAPDH 밴드 크기 값으로 나누어 보정 하였다. 통계적 유의성은 대조군과의 스튜던트 티 검정 (Student’s t-test) 통계법을 사용하여 분석하였다. #p<0.05 (음성 대조군 : TGF

처리 대조군).

실험 결과, 도 5의 a와 b에 나타낸 바와 같이 TGFβ 처리에 따라 증가하는 섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질의 발현량이 TGFβ와 함께 CHP 250 ng/ml을 처리하였을 때 감소하는 경향이 나타난 것을 확인하였다. 이를 통해 간 세포주인 Huh7 세포에서 CHP가 섬유화를 개선시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

CHP 투여에 따른 간섬유화 동물모델에서의 항섬유 효과 확인

장기간의 고지방 식이 섭취는 간섬유화를 유발하는 위험 요소로 알려져 있다. 지방 식이를 장기간 섭취 시 나타나는 인슐린 저항성과 증가한 혈중 지방산, 아디포카인, 사이토카인으로 인해 간 조직에 염증 환경이 유발되며, 간 조직에 축적된 면역세포들의 상호작용은 섬유화를 진행시키는데, 특히, Th2 CD4+ T 세포가 분비하는 IL-13 사이토카인이 대식세포로부터 섬유화 핵심 유발 인자인 TGFβ를 다량 생성하게 한다. TGFβ에 의한 신호전달은 간 조직내 세포들의 변형을 야기하고 섬유화 진행을 촉진하게 된다 (Rosselli, M et al., Current Pharmaceutical Design, 20(31), 5010-5024, 2014; Wu. D et al., Science, 332:243-7, 2011; J Investig Med, 60(8): 1147-1150, 2012; Fichtner-Feigl S et al., Nat Med, 12:99-106, 2006; Lee CG et al., J Exp Med, 194:809-21, 2001).

정상 생쥐에 60% 지방 함유 고지방 식이를 10~16주 동안 섭취시켰을 때 간섬유화가 관찰되며 대표적인 섬유화 마커 단백질인 피브로넥틴의 발현을 통해 확인이 가능하다 (Kim, I. H et al., AGE, 38(4), 291-302, 2016; Chen, H. J., & Liu, J., Biomedicine & Pharmacotherapy, 97, 1386-1396, 2018.1-2).

4-1. 실험동물의 설계 및 간섬유화 유도

동물에서의 간섬유증 실험을 위해 미국의 Jackson 사에서 6주간 60% 지방 함유 고지방 식이를 섭취한 12주령의 C57BL/6 생쥐를 구입하였고, 60% 지방 함유 고지방 식이 사료는 Research diets D12492를 새론바이오 사에서 구입하여 17주간 섭취시켰다. 생쥐는 24±3℃의 환경에서 사료와 물에 자유롭게 접근이 가능하도록 사육하였다. 6주간 고지방 식이를 섭취한 C57BL/6 생쥐를 1주일간 사육 환경에 적응시키고 체중을 측정하여 표 1과 같이 균등하게 3 그룹으로 나누었다. CHP는 5 mg/kg 또는 35 mg/k 의 농도로 각 그룹에 1일 1회, 16주 동안 경구투여 하였고, 대조군에는 같은 양의 증류수를 같은 방법으로 경구투여 하였다.

그룹	HFD	CHP5	CHP35
투여	Vehicle(물)	CHP 5 mg/kg	CHP 35 mg/kg
마리 수	10	8	8

4-2. CHP를 투여 한 간섬유화 동물모델에서 섬유화 마커 피브로넥틴 단백질 발현 확인

생쥐의 마취와 해부에 필요한 아이소플루레인 (Isoflurane)을 하나제약에서 구입하였고, Vetequip 사의 RC2 Rodent Circuit Controller Anesthesia System을 준비하였다. 인산완충생리식염수(PBS)는 Hyclone 사에서 구입하였다. 생쥐의 간 조직 분리를 위해 3~3.5% 아이소플루레인으로 생쥐를 호흡마취 시켰다. 마취된 생쥐의 심장에서 혈액을 뽑아 낸 후, 간 조직을 즉시 적출하여 PBS로 세척한 후 간 조직을 50mg 잘라내어 프로테아제 및 포스파타아제 저해제가 첨가된 RIPA 버퍼 500 ul에 넣고 IKA사의 T10 균질기 (homogenizer)를 이용하여 분쇄하였다. 15분간 얼음에 방치시킨 후, 4℃에서 15,000rpm으로 원심분리 하였다. 섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질 발현 분석을 위해 실시예 3-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다. 통계적 유의성은 HFD 대조군과의 스튜던트 티 검정 (Student’s t-test) 통계법을 사용하여 분석하였다 (*p<0.05, **p<0.01).

실험 결과, 도 6의 a 및 b에 나타낸 바와 같이 대표적인 섬유증 마커인 피브로넥틴 단백질의 발현량이 CHP 투여 군에서 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었고, CHP의 농도에 따라 효과가 강해지는 것을 확인하였다. 이는 CHP가 간섬유화를 개선시킨다는 의미로, 간섬유증 치료에 적용될 수 있는 명확한 근거이다.

CHP 처리에 따른 사람 유래 폐세포에서의 항섬유 효과 확인

5-1. 사람 유래 폐세포 배양 및 섬유화 유도후 CHP 처리

L-132 폐 세포주 배양을 위해 Hyclone 사에서 MEM 배지와 FBS를 구입 하였으며 섬유화 유도를 위한 TGFβ는 R&D systems 사에서 구입하였다. 10% FBS를 첨가한 MEM 배지로 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, TGFβ를 2 ng/ml 농도가 되도록 처리함과 동시에 CHP를 0, 62.5 또는 125 ng/ml이 되도록 처리하고 처리 48시간째에 세포를 회수하였다.

5-2. 사람 유래 폐세포 섬유화 모델에서 CHP 처리 후 섬유화 마커 피브로넥틴 (Fibronectin) 단백질 발현 확인

섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질 발현 분석을 위해 실시예 3-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다. 통계적 유의성은 대조군과의 스튜던트 티 검정 (Student’s t-test) 통계법을 사용하여 분석하였다 (#p<0.05 (음성 대조군 : TGFβ 처리 대조군), **p<0.01 (TGF

처리 대조군 : CHP 125 ng/ml 처리군)).

실험 결과, 도 7의 a 및 7b에 나타낸 바와 같이 TGFβ 처리에 따라 증가하는 섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질의 발현량이 TGFβ와 함께 CHP 125 ng/ml을 처리하였을 때 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 폐 세포주인 L-132 세포에서 CHP가 섬유화를 개선시킨 이 결과를 통해 CHP가 폐 섬유증에 대한 우수한 치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

CHP 투여에 따른 폐섬유화 동물모델에서의 항섬유 효과 확인

장기간의 고지방 식이 섭취에 의해 폐 섬유화가 발생한다. 이는 고지방 섭취에 따른 염증 수치 증가로 인한 것으로 보이는데, 정상 생쥐에 60% 지방 함유 고지방 식이를 15주 동안 섭취시켰을 때 폐 섬유화가 나타난 보고가 있다 (Ge, X. N et al., Experimental Lung Research, 39(9), 365-378, 2016). 구체적으로, 고지방 식이의 장기간 섭취는 비만을 유도하고, 비대해진 지방 조직과 이곳으로 모인 면역세포들이 분비하는 아디포카인과 사이토카인들은 골수로부터 폐로의 면역세포의 이동을 교란시키고 만성 염증 반응을 일으키게 된다 (de Vries A et al., Clin Exp Allergy, 39:731-739, 2009). 또한, Th2 CD4+ T 세포가 분비하는 IL-13 사이토카인은 섬유화 핵심 유발 인자인 TGFβ가 다량 생성되게 하며, TGFβ에 의한 신호전달은 폐 조직의 변형과 섬유화 현상을 촉진하게 된다 (Fichtner-Feigl S et al., Nat Med, 12:99-106, 2006; Lee CG et al., J Exp Med, 194:809-21, 2001). 폐의 섬유화는 정상 대비 증가된 TGF

유전자 등의 발현량을 통해 확인이 가능하다 (Ge, X. N et al., Experimental Lung Research, 39(9), 365-378, 2016).

6-1. 실험동물의 설계 및 폐 섬유화 유도

동물에서의 폐 섬유증 실험을 위해 실시예 4-1과 동일하 방법으로 폐섬유화 동물 모델을 확립하였다.

6-2. CHP를 투여 한 폐 섬유화 동물모델에서 섬유화 마커 TGFβ 및 Collagen 3 유전자 발현 확인

생쥐의 마취와 해부에 필요한 아이소플루레인 (Isoflurane)을 하나제약에서 구입하였고, Vetequip 사의 RC2 Rodent Circuit Controller Anesthesia System을 준비하였다. 인산완충생리식염수(PBS)는 Hyclone 사에서 구입하였다. 생쥐의 폐 조직 분리를 위해 3~3.5% 아이소플루레인으로 생쥐를 호흡마취 시켰다. 마취된 생쥐의 심장에서 혈액을 뽑아 낸 후, 폐 조직을 즉시 적출하여 폐 50mg을 잘라내어 NucleoZOL 500μL를 넣고 IKA사의 T10 균질기를 이용하여 분쇄하였다. 이어서, NucleoZOL의 Total RNA 분리 프로토콜에 따라 RNA를 추출하고, 1㎍의 RNA를 iScript cDNA 합성 키트를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)으로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 각 유전자에 해당하는 정방향/역방향 프라이머 세트를 이용하여 iQ SYBR Green Supermix로 실시간 PCR을 진행하여 분석하였다. 각 유전자의 발현 값은 하우스키핑 유전자인 GAPDH 의 발현 값으로 나누어 보정하였다. 실시간 PCR을 위한 프라이머는 표 2와 같은 염기 서열로 Bioneer 사에서 합성하여 사용하였다.

유전자명	정방향 프라이머	서열번호	역방향 프라이머	서열번호
TGFβ	5’-cctgagtggctgtcttttga-3’	1	5’-aatcgaaagccctgtattccg-3’	2
Collagen 3	5’-agtcaaggagaaagtggtcg-3’	3	5’-ccagggaaacccatgacac-3’	4
GAPDH	5’-acactgagcaagagagaggc-3’	5	5’-tgggggtctgggatggaaat-3’	6

통계적 유의성은 일원분산분석 (One-way ANOVA) 통계분석법을 사용하였고, 던넷 (Dunnett) 사후검정법으로 대조군과의 유의성을 비교하였다 (*p<0.05, ***p<0.001).

실험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 폐에서 나타나는 주요 섬유화 마커인 TGFβ, Collagen 3 유전자의 발현이 CHP 투여 농도에 따라 더욱 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 이는 CHP가 폐섬유화를 개선 시킨다는 의미로, 폐섬유증 치료에 우수한 치료 효과를 확인할 수 있었다.

CHP 처리에 따른 사람 유래 피부세포에서의 항섬유 효과 확인

7-1. 사람 유래 피부세포 배양 및 섬유화 유도후 CHP 처리

HS68 피부 섬유아 세포 유래 세포주 배양을 위해 Hyclone 사에서 DMEM 배지와 FBS를 구입하였으며, 섬유화 유도를 위한 TGFβ는 R&D systems 사에서 구입 하였다. 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지로 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, TGFβ를 2 ng/ml 농도가 되도록 처리함과 동시에 CHP를 0, 62.5, 125, 250 또는 500 ng/ml이 되도록 처리하고 처리 48시간째에 세포를 회수하였다.

7-2. 사람 유래 피부세포 섬유화 모델에서 CHP 처리 후 섬유화 마커 피브로넥틴 단백질 발현 확인

섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질 발현 분석을 위해 실시예 3-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다. 통계적 유의성은 대조군과의 스튜던트 티 검정 (Student’s t-test) 통계법을 사용하여 분석하였다 (#p<0.05 (음성 대조군 : TGFβ 처리 대조군), *p<0.05 (TGFβ 처리 대조군 : CHP 500 ng/ml 처리군))

실험 결과, 도 9의 a 및 9b에 나타낸 바와 같이 TGFβ 처리에 따라 증가하는 섬유화 단백질인 피브로넥틴 단백질의 발현량이 TGFβ와 함께 CHP 500 ng/ml을 처리하였을 때 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 피부 세포주인 HS68 세포에서 CHP가 섬유화를 개선시킨 이 결과를 통해 CHP가 피부 섬유증 치료에 적용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

CHP 투여에 따른 심장 섬유화 동물모델에서의 항섬유 효과 확인

심장 섬유증의 위험요인으로는 잘못된 식습관과 비만, 높은 콜레스테롤 수치 등이 잘 알려져 있다. 고지방 식이를 장기간 섭취 시, 비만으로 인한 혈량과다증이 발생하여 심장에 과부하가 유발되어 심장의 수축과 이완 기능에 변형이 야기된다. 이와 더불어 나타나는 고혈당, 인슐린 저항성, 고지혈증, 만성 염증 등의 증상은 심장 섬유화에 결정적으로 작용하는 것으로 알려져 있다 (Kaltman AJ, Goldring RM., Am J Med, 60:645-653, 1976; Xia Y et al., Histochem Cell Biol, 131:471-481, 2009; Ulasova E et al., J Mol Cell Cardiol., 50:147-156, 2011; Lo CS et al., J Cell Biochem., 103:1999-2009, 2008; Cavalera, M et al., Translational Research, 164(4), 323-335, 2014). 특히, 비만으로 인한 심장 비만 세포 (Cardiac mast cell)의 증가와 이들의 탈과립 현상은 심장 조직에 TGFβ와 같은 섬유화 유발 인자들을 제공하고 심장 섬유화를 더욱 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Kong P, Christia P, Frangogiannis NG, Cell Mol Life Sci., 71:549-574, 2014).

또한, 정상 생쥐에게 장기간 동안 고지방 식이를 섭취시켰을 때 심장 섬유화가 나타난다는 보고가 있다. 정상 생쥐에 60% 지방 함유 고지방 식이를 14~22주 동안 섭취시켰을 때 심장 섬유화가 유발되며 정상에 비해 증가된 TGFβ, Collagen 유전자 등의 발현량 변화가 확인 가능하다고 보고되어 있다 (Li, W et al., Nutrition & Metabolism, 14(1);68, 2017; Ternacle, J et al., European Heart Journal, 18(11), 1283-1291, 2017; Zhao, Y et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 1863(8), 1991-2000, 2017; Xu, Z., & Kong, X. Q., Biomedicine & Pharmacotherapy, 89, 991-1004, 2017).

8-1. 실험동물의 설계 및 심장 섬유화 유도

동물에서의 심장 섬유증 실험을 위해 실시예 4-1과 동일하 방법으로 심장 섬유화 동물 모델을 확립하였다.

8-2. CHP를 투여 한 심장 섬유화 동물모델에서 섬유화 마커 TGFβ, Fibronectin, Collagen 1, Collagen 2, Collagen 3 및 Collagen 4 유전자 발현 확인

생쥐의 마취와 해부에 필요한 아이소플루레인 (Isoflurane)을 하나제약에서 구입하였고, Vetequip 사의 RC2 Rodent Circuit Controller Anesthesia System을 준비하였다. 인산완충생리식염수(PBS)는 Hyclone 사에서 구입하였다. 생쥐의 심장 조직 분리를 위해 3~3.5% 아이소플루레인으로 생쥐를 호흡 마취 시켰다. 마취된 생쥐의 심장에서 혈액을 뽑아 낸 후, 심장 조직을 즉시 적출하여 심장 50mg을 잘라내어 RNA 추출 및 유전자 발현 분석은 실시예 6-2와 동일하게 진행하였다. 실시간 PCR을 위한 프라이머는 표 3과 같은 염기서열로 Bioneer 사에서 합성하여 사용하였다. 각 유전자의 발현 값은 하우스키핑 유전자인 β-actin 의 발현 값으로 나누어 보정하였다.

유전자명	정방향 프라이머	서열번호	역방향 프라이머	서열 번호
Fibronectin	5’-ttggagaggagtgggagc-3’	7	5’-gaaatgaccactgccaaagc-3’	8
TGFβ	5’-cctgagtggctgtcttttga-3’	1	5’-aatcgaaagccctgtattccg-3’	2
Collagen 1	5’-ctaacgtggttcgtgaccg-3’	9	5’-atccatcggtcatgctctct-3’	10
Collagen 3	5’-agtcaaggagaaagtggtcg-3’	3	5’-ccagggaaacccatgacac-3’	4
Collagen 4	5’-cggtacacagtcagaccatt-3’	11	5’-catcacgaaggaatagccga-3’	12
β-actin	5’-gggaaggtgacagcattg-3’	13	5’-atgaagtattaaggcggaagatt-3’	14

통계적 유의성은 유의성은 일원분산분석 (One-way ANOVA) 통계분석법을 사용하였고, 던넷 (Dunnett) 사후검정법으로 HFD 대조군과의 유의성을 비교하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001).

실험 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 심장에서 나타나는 주요 섬유화 마커인 Fibronectin, TGFβ, Collagen 1, 3, 4 유전자의 발현이 CHP 투여에 의해 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 하지만 CHP의 농도에 따라 더욱 감소한 효과는 확인되지 않았는데, 이는 CHP 5 mg/kg 농도만으로 충분한 효과가 이미 발생했기 때문으로 볼 수 있다. CHP가 심장 섬유화의 진행을 억제하고 심장 섬유증을 개선시킨 이 결과는 CHP가 심장 섬유증의 치료에 적용될 수 있음을 의미한다.

CHP 투여에 따른 지방 섬유화 동물모델에서의 항섬유 효과 확인

섬유증을 막기 위해서는 염증반응을 차단하는게 최선이라고 알려져 있다. 특히, 지방 조직은 염증 물질을 분비하여 염증으로 인한 지방 섬유화의 악순환을 야기 하게 된다. 정상 생쥐에게 60% 지방 함유 고지방 식이를 16~24주 동안 섭취시켰을 때 지방 조직의 섬유화가 나타나게 된다는 보고가 있다 (Hu, M et al., Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 1-12, 2018; Kwon, E. Y., & Choi, M. S., Nutrients, 10(10), 1415, 2018; Nakazeki, F et al., Scientific Reports, 8(1), 2018; Muniappan, L et al.. Scientific Reports, 7(1), 2017; Lancha, A et al., PLoS ONE, 9(5), e98398, 2014; Velαzquez, K. T et al., Physiological Reports, 5(18), e13412, 2017; Wang, L., Ye, X., Hua, Y., & Song, Y., Biomedicine & Pharmacotherapy, 105, 121-129, 2018). 고지방 식이를 장기간 섭취 시, 영양 과다로 인해 지방세포의 확장이 일어나면서 중성지방 축적, 지방세포사멸, 아디포카인과 사이토카인의 생성, 소포체 스트레스, 지방조직 저산소증 등이 발생해 지방조직으로의 면역세포 침투가 일어나고 만성 염증이 일어나게 된다 (Schenk S et al., J Clin Invest, 118:2992-3002, 2008; Sun K, Kusminski CM, Scherer PE, J Clin Invest, 121:2094-101, 2011). 지방조직에 축적된 다양한 염증성 면역세포와 대식세포-지방세포 간의 상호작용은 섬유화 핵심 유발 인자인 TGFβ를 생성하고 이로 인해 지방 조직의 변형이 일어나 지방 섬유화가 유발되게 된다 (Lee CG et al., J Exp Med, 194:809-21, 2001; Fichtner-Feigl S et al., Nat Med, 12:99-106, 2006; Pessin, J. E., & Kwon, H, Journal of Investigative Medicine, 60(8), 1147-1150, 2012). 지방 조직의 섬유화는 정상 지방 조직에 대비하여 증가되는 대표적 섬유화 유전자 마커들의 발현 변화를 통해 확인이 가능하다.

9-1. 실험동물의 설계 및 지방 섬유화 유도

동물에서의 지방 섬유증 실험을 위해 실시예 4-1과 동일한 방법으로 지방 섬유화 동물 모델을 확립하였다.

9-2. CHP를 투여 한 지방 섬유화 동물모델에서 섬유화 마커 TGF

, Fibronectin, Collagen 3 및 CTGF 유전자 발현 확인

생쥐의 마취와 해부에 필요한 아이소플루레인 (Isoflurane)을 하나제약에서 구입하였고, Vetequip 사의 RC2 Rodent Circuit Controller Anesthesia System을 준비하였다. 인산완충생리식염수(PBS)는 Hyclone 사에서 구입하였다. 생쥐의 지방 조직 분리를 위해 3~3.5% 아이소플루레인으로 생쥐를 호흡마취 시켰다. 마취된 생쥐의 심장에서 혈액을 뽑아 낸 후, 부고환지방조직 (EAT)을 즉시 적출하여 지방 100mg을 잘라내어 RNA 추출 및 유전자 발현 분석은 실시예 6-2와 동일하게 진행하였다. 실시간 PCR을 위한 primer는 표 4와 같은 염기 서열로 Bioneer 사에서 합성하여 사용하였다. 각 유전자의 발현 값은 하우스키핑 유전자인 GAPDH 의 발현 값으로 나누어 보정하였다.

유전자명	정방향 프라이머	서열번호	역방향 프라이머	서열 번호
Fibronectin	5’-ttggagaggagtgggagc-3’	7	5’-gaaatgaccactgccaaagc-3’	8
TGFβ	5’-cctgagtggctgtcttttga-3’	1	5’-aatcgaaagccctgtattccg-3’	2
Collagen 3	5’-agtcaaggagaaagtggtcg-3’	3	5’-ccagggaaacccatgacac-3’	4
CTGF	5’-ctgtgcctgccattacaact-3’	15	5’-ccatgtctccgtacatcttcc-3’	16
GAPDH	5’-acactgagcaagagagaggc-3’	5	5’-tgggggtctgggatggaaat-3’	6

통계적 유의성은 일원분산분석 (One-way ANOVA) 통계분석법을 사용하였고, Dunnett 사후검정법으로 대조군과의 유의성을 비교하였다 (*p<0.05, **p<0.01).

실험 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 지방에서 나타나는 주요 섬유화 마커인 Fibronectin, TGFβ, Collagen 3, CTGF 유전자의 발현이 CHP 투여에 의해 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 이는 CHP가 지방 섬유화를 개선시킨다는 의미로, 지방 섬유증 치료에 우수한 치료 효과를 확인할 수 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> NovMetaPharma Co., Ltd. SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL Seoul National University R&DB Foundation <120> COMPOSITION COMPRISING CHP (CYCLO-HIS PRO) FOR PREVENTING, IMPROVING OR TREATING OF FIBROSIS <130> 1067299 <150> KR10-2019-0036269 <151> 2019-03-28 <160> 16 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TGFβ forward primer <400> 1 cctgagtggc tgtcttttga 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TGFβ reverse primer <400> 2 aatcgaaagc cctgtattcc g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Collagen 3 forward primer <400> 3 agtcaaggag aaagtggtcg 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Collagen 3 reverse primer <400> 4 ccagggaaac ccatgacac 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 acactgagca agagagaggc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 tgggggtctg ggatggaaat 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Fibronectin forward primer <400> 7 ttggagagga gtgggagc 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Fibronectin reverse primer <400> 8 gaaatgacca ctgccaaagc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Collagen 1 forward primer <400> 9 ctaacgtggt tcgtgaccg 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Collagen 1 reverse primer <400> 10 atccatcggt catgctctct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Collagen 4 forward primer <400> 11 cggtacacag tcagaccatt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Collagen 4 reverse primer <400> 12 catcacgaag gaatagccga 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> β-actin forward primer <400> 13 gggaaggtga cagcattg 18 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> β-actin reverse primer <400> 14 atgaagtatt aaggcggaag att 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CTGF forward primer <400> 15 ctgtgcctgc cattacaact 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CTGF reverse primer <400> 16 ccatgtctcc gtacatcttc c 21

Claims (7)

1. 정제된 사이클로-히스프로 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 섬유증은 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 발생하는 것인 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 섬유증은 폐 섬유화증(Pulmonary Fibrosis), 특발성 폐 섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury) 또는 폐 섬유화, 폐부종, 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis), 간 섬유화, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심근경색(Myocardial Infarction), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 신경교 반흔(Glial scar), 신장 섬유증(Renal Fibrosis), 골수 섬유증(Myelofibrosis), 관절 섬유증(Arthrofibrosis), 지방 섬유증, 피부 섬유증, 신경 섬유증 및 근 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 정제된 사이클로-히스프로 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 섬유증은 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 발생하는 것인 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
6. 제4항에 있어서, 상기 섬유증은 폐 섬유화증(Pulmonary Fibrosis), 특발성 폐 섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury) 또는 폐 섬유화, 폐부종, 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis), 간 섬유화, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심근경색(Myocardial Infarction), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 신경교 반흔(Glial scar), 신장 섬유증(Renal Fibrosis), 골수 섬유증(Myelofibrosis), 관절 섬유증(Arthrofibrosis), 지방 섬유증, 피부 섬유증, 신경 섬유증 및 근 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
7. 정제된 사이클로-히스프로 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항섬유성 조성물.

Images