CN1635121A - 鸭瘟疱疹病毒转移载体及其制备方法 - Google Patents

鸭瘟疱疹病毒转移载体及其制备方法 Download PDF

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CN1635121A
CN1635121A CN 200410044105 CN200410044105A CN1635121A CN 1635121 A CN1635121 A CN 1635121A CN 200410044105 CN200410044105 CN 200410044105 CN 200410044105 A CN200410044105 A CN 200410044105A CN 1635121 A CN1635121 A CN 1635121A
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transfer vector
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王君伟
韩先杰
马波
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Northeast Agricultural University
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Abstract

本发明提供的是一种鸭瘟疱疹病毒转移载体及其克隆方法。它是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因，在获得以上3个基因序列的基础上，利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列，将其亚克隆入克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC－TK2.9，将1acZ基因表达盒插入载体pUC－TK2.9中的TK基因内，构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC－TK2.9－1acZ。本产品可用来构建鸭瘟疱疹病毒基因缺失疫苗。可用来构建重组活载体疫苗。

Description

鸭瘟疱疹病毒转移载体及其制备方法
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种鸭瘟疱疹病毒转移载体以及它的制备方法。
(二)背景技术
在我国，鸭、鹅是重要的经济禽类。近几年来，养鸭、养鹅在我国的某些地区发展迅速，将成为继养鸡业后第二个实现资源配置和利润合理化的产业。目前，传染病仍然是危害鸭、鹅养殖业健康、持续发展的重要因素之一，加强对鸭、鹅传染病的防治显得尤为重要。鸭瘟是由鸭瘟疱疹病毒引起的鸭、鹅的急性、败血性传染病，以成年鸭、鹅常见，发病率、死亡率高，在我国被列入动物二类传染病。目前国内外防治鸭、鹅传染病仍使用传统的疫苗进行预防接种，与其它疾病的防治手段相比，相对落后。
随着DNA重组技术的发展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速发展，其中重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。重组病毒活载体疫苗是以病毒作为载体，在真核细胞中表达外源基因，它在病毒病的防治等方面展现了广阔的前景，其中以疱疹病毒作为病毒载体的研究近年来十分活跃。与传统疫苗相比，重组病毒活载体疫苗具有使用安全、免疫力持久、接近动物自然感染的方式，多价苗还可以达到一针预防多病的目的。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭瘟疱疹病毒转移载体及其制备方法。
本发明的产品是是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因，在获得以上3个基因序列的基础上，利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列，将其亚克隆入克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC-TK2.9，将lacZ基因表达盒插入载体pUC-TK2.9中的TK基因内，构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
本发明产品中的(1)鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼序列的大小为8481个碱基，即8481bp，包含鸭瘟疱疹病毒完整的UL24基因、TK基因、gH基因和UL25、UL21基因的部分序列；鸭瘟疱疹病毒UL24基因大小为1230bp，编码409个氨基酸；TK基因大小为1077bp，编码358个氨基酸；gH基因大小为2505bp，编码834个氨基酸。
本发明产品的核酸序列为：
AGGCCCCGTTCGTATTGCAAAGCTACCGCATCATGTGTCGTTAGTACCTCTTGAATAGGTA
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CTGCGCCAATACATTTCCGATCAAATGTCACTGCGCGACTCTTGCGAACGCTTAATCCGGC
GCGCTTTTTCTGTACCTTCGATGCCATTATGCCTCGTCCGCGTATACCTAGACGGGCCGTAT
GGAACTGGCAAAACCACAACTGGCAAACTGTTGTCGGAGGATACCCTTGCAGCCACTCTT
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GACGCATATGTGTGTTTATTGCCTGCCACATTTGTAAATGCACGCCTTCGCTACTCCCTATT
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ATATATACAGTCATAGTTTTTGAGGTTGTAAGTGCGGCGTGGATAGGTGTCGGGGAAGAA
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GTACTGCGCCTTGGGTATGGTCTGGCCGGCGATAAACGCCTAGACTCTGCACTAGATAAG
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GCGGCCTCTATAAATGTAAACCTGCAAGAAATATTCATTAGCGTTACTGATCGCGGCAATG
ATTTCAGTATGCTGGACCTATTTTCTCCATGTGCCACAGCATTGCGATACGACACACATGA
AGGAATACATAAACTATACGTGCTTAGTTCAATTCCTGATAGGTTACGCCTCGTCGCGGCT
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GAGGACTATAGGACGCTGGAGGAATCAGGACATAACTGCGATAAAACACTTCCTTCCCGA
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ATAGCGGTTGGGGGTATGGCTGTTGCCGTACTTGTCTTTTATGGGATAATTAAACTGATGT
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GCATCGCCAATTCTAGCTCTAGCGTCATTAAATTCGGGTTCGAGACCAAACCAAGTACTAA
TATCCTGAGAGACTACATCCCCAATCCTACAAAATACGGTCCAAAGGGCCCCAAGCGATC
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ATAGTCCATCGACCATAGCGGCAAGTGACTGCGGCAATGATGTAAGACGCGCCTGCATGA
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TACATCATATAATTTGATAACTTGATAGTTCGAAAATATATGACCCGTTGATAATATCAGG
CCTGACGATATTTCGAGTGAACCATATACTCAGCGATACACTGGTCGCGAACTTCAACCTC
AAGCGCCCCGCACAAACGAAGTAAGC
本发明鸭瘟疱疹病毒转移载体pUC-TK2.9-lacZ是利用基因工程技术，利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因，在获得以上3个基因序列的基础上，利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列，将其亚克隆入克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC-TK2.9，将lacZ基因表达盒插入载体pUC-TK2.9中的TK基因内，构建鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
采用本发明的方法生产的产品可用于：
①本产品可用来构建鸭瘟疱疹病毒基因缺失疫苗。
②本产品可用来构建重组活载体疫苗。
本发明的产品优点表现在：
①所克隆用于构建转移载体的TK基因及其侧翼序列目前在国内外尚未见报道。
②构建的转移载体为构建重组鸭瘟疱疹病毒搭建一物质平台。
③应用此转移载体可以构建多种重组活载体疫苗，预防鸭鹅等相关禽类的多种传染病。
(四)具体实施方案
上述已对本发明的产品作了具体地描述，本发明的产品可以采用这样的方法来制备：
1)设计扩增UL24、TK和gH基因的引物
根据鸭瘟疱疹病毒UL25、UL24、TK、gH和UL21基因的保守序列，设计兼并引物。
位于TK基因内的兼并引物DP1和DP2：
DP1：5′TCTCGAC(T)GGA(G，C，T)GCA(G，C，T)C(T)AC(T)GG  3′
DP2：5′GCGATTGGA(G)TGG(C，T)CG(T)A(G)TC  3′
位于UL24基因内的兼并引物
DP3  5′CGGCACGA(T)C(T)TTC(T)AA(G)C(T)TC  3′
位于gH基因内兼并引物：DP4  5′ATCATCGTACCA(G)TTAGG  3′
位于UL25基因内兼并引物：
DP5  5′AGGCCCTIT(G)TTCG(A)TAT(C)TG  3′
位于UL21基因内兼并引物：
DP6  5′GCTTAC(T)TTC(T)A(G，C，T)T A(G，C，T)TA(G)C(T)GG A(G，C，T)GG  3′
2)通过PCR扩增获得UL24、TK和gH基因的序列
利用设计合成的引物，通过5次兼并PCR分别克隆TK基因的保守序列、TK基因的上游侧翼序列FUL24-TK、FUL24-TK的上游序列FUL25-UL24、TK基因的下游侧翼序列FTK-gH和FTK-gH的下游侧翼序列FgH-UL21，将以上5个片段拼接，共得到8481bp的DNA序列，序列分析表明该序列含有完整的UL24、TK和gH基因。
3)PCR扩增TK基因及其侧翼序列(FTK2.9)
根据所得DNA序列的结果，设计2条引物：
上游引物为5′CCGGAATTCATTTGTCTGTGGTGTAAC  3′，
下游引物为5′CCCAAGCTTAGTGCTGATGGTAGGAG  3′，使用这两条引物，通过PCR克隆大小为2.9kb的PCR产物FTK2.9。
4)重组载体pUC-TK2.9的构建
将FTK2.9通过EcoRI和HindIII酶切位点亚克隆入克隆载体pUC18，形成重组质粒pUC-TK2.9。
5)转移载体pUC-TK2.9-lacZ的构建
将载体pUC-TK2.9用HpaI内切酶切开，并且用小牛碱性磷酸酶去磷酸化。用PstI和EcoRI内切酶酶切质粒pSV-β-Galactosidase，切出lacZ表达盒，并且用T4DNA聚合酶将黏性末端补平。将线性化的pUC-TK2.9和lacZ表达盒平端相连接，构建重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。

Claims (4)

1、鸭瘟疱疹病毒转移载体，其特征是：它是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因，在获得以上3个基因序列的基础上，利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列，将其亚克隆入克隆载体pUC18，构建重组质粒pUC-TK2.9，将lacZ基因表达盒插入载体pUC-TK2.9中的TK基因内，构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
2、根据权利要求1所述的鸭瘟疱疹病毒转移载体，其特征是：(1)鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼序列的大小为8481个碱基，即8481bp，包含鸭瘟疱疹病毒完整的UL24基因、TK基因、gH基因和UL25、UL21基因的部分序列；鸭瘟疱疹病毒UL24基因大小为1230bp，编码409个氨基酸；TK基因大小为1077bp，编码358个氨基酸；gH基因大小为2505bp，编码834个氨基酸。
3、根据权利要求1或2所述的鸭瘟疱疹病毒转移载体，其特征是：其核酸序列为：
AGGCCCCGTTCGTATTGCAAAGCTACCGCATCATGTGTCGTTAGTACCTCTTGAATAGGTA
CAGATATAGTCTTAGACCTGTTTTGCAATTCGACCGCAATGAGTCGCAAAAGGGCAGCCT
GGGCTCTATTCGTTGACACGTCTAAGACATGGCGTGTAGCATTTTGTGTTTTTATGTTACGT
GCATCCAAACAAAGAGCTACGAGACCAGGAAACATCTGTGTTATCTCAGTTTGCGGATCA
GCTGCATATAATGAAGCCATATAACGCTCGCAAAGGAACGCGAAATTGCGATTATCGCTT
TTCATGGTTTGGGCCCCCGCGGCCCCGCCATTGGACGCGCCGCGATTTAAGCGATCAGATG
GTACTGCACCTGGCAACAACGTTCCGATCTGAAAATTATTACACATGCGATCCGCATAGAC
ATTCGTATTCCATAATAATTTTCGCATGAGTATCAGTGATGTTATGGTATTTATAGTGGCGC
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CAGCTTTATTTACCTCATCTACATAAGCTCGTTGACTCTTATCAACATCCCTCGCAAGTCCA
TCTGGGGCGGCTACGCCAGGAGACAGCGGCAACACACCATGTTTTATAAGCATAGCTAGA
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TCTATAAAATTATCCAAATAAGCAGGTAGCTGCTCCACCATTCCTATAGCACTAGACGCGT
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TATCGCGCACTCTAGAGCTGTATAATGACGGACTCTTAAATACAAGCGCCCAGTGGCCTGT
AGTGATACTATAGCAGTAGTCATAAACGTTTTGGACTGCCGTCCATCGCGCTGGTCTAACC
GTTTGGACACAACAGGCCACTCAGTAATCAAACCGTCTTGGAGAGCTTTATACCAAGTAC
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ACAAGTCTGTACTCAAATTAGTGTCATAGCGCAATGGTGTATCGTTCTTAACTATCTGTAC
TTCGCGCCTTTCATCATTAGAATCACTTGTTTCTCCCAATTTATCCCCATCGCCGTCTTGTC
GGCTACGTTCATATGATCCATCGATCTCATCAGCCGGCGTCCGTCGCTTCTGCCATAGCAG
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AAACGCATTTCTAATTCGGCTGATATACAGTTATTCTTGATGCTTAAATGATCCAACGCCG
CCGATGCCGCAGTATTCCGTTGTTGTAATATACGTAATCTCTGTATCGCTGTTTCTTCTTCA
TGGCGATTTGCCTGCGATTTTGTCCAGTAGTGCGCTGGCCAATTCGGTGTTATAAAATTCC
TAGAATCTGATATGTAGCCCGCGGAGCTATGTCCTTTGCACATATCAAGTGGGGAGAAAA
AGAATCTTTCCATTGTTGATTATACAAGCCGATAGTTTTAAGAAATCCAATACACTTCTAA
TCGACAGACCCTCGCACAGCTAGTAACAAAAACCGTTGTCAAACAATTCTTTTTAAACACT
CGCGACCAGAACTCCCGCCCATAATAATCAACACTGCCAGACAATAGGATGGTAATATGC
GTTTCTGTAATAATGCACTAGTGTTTAGTTGGTCTGAATATGGATGCTACAAATCGCAATA
CTCCACCGCCTATTTGTGTCTCTGTATCGCTACAATTAATATCACTGTCTGATGCGACGCCA
TGCTTGCCATCATAACCGTATTCTCCATTAATACCATCTATATTCGTTTTGGGTTCTTCAGT
ATTGTTTAGTCCTGTATTTGTCTGTGGTGTAACCAACTGCCCATAACCCCATAGTCGCAAT
AGTCGTACGCTATGGATCCCAGTTGCATTGCCGTGTGGTATGTTCTCGCCTGCCGCAGAAC
TCGTCCCGACGCCTGGCGAAAATTCTTCCCACCAGCGTTTTTTCGCAAGACTGGAAGAATT
TTCGCTGGGTGTACGAGCACATGTCGGGTTCATAATGGCATCATCGATGTCGTCTTTGTCG
ACAATTTTGCACGCATCTTTACTGTATAATTCGGACTCCAATTGAACATACTGGCTACATA
TACATTTAGCCTTCCGGCGCTTACCTTTGGTAGGTATATGATATTCTGATAAACCTGCAAT
AGAGGCTGATAATGCCGCAAAGTTGGAGGATACGCGCCGATGAGCAAATCGTGTAATTCG
GAGTATGTCCAGACCGCGCTGGGCTACAAATACTAGCAACGGACATATTAAAAATTGACT
GCATCCAGGGGGCATGATACGTTCCAACAAGATGGCCGATTCCATCAATTGTCTAATTCCA
GTCCATGTTTGCTGTTGTTTACTTCCTGTTGTCATATTTTTTACAAACTTGCAAGTCTTGAGT
TCCAAAATAATACATATGACATCTGCAGTTTCTGCCTCGCCTGTCTTAATCATGCATATGC
AATCTGGGCGGCGCCTTCCTAAGTTGACTTCAAAAGTCAGCCTCACATCAAATGCAGTTTT
AAGTGTCTGCAAAGACAGAGTGTGTTCGAATAGCCGCACAATCAGTTTACTGGGCGATCC
ACCATTTGAACGAAATTTGTTCAAATCGTTAGCCAGGGCGCCATAAAAACGATTGTGGCA
GCGCACTCCAGCTTTGAGGCGACGTGCGACTGAACCGGACGTGTTGGCATCGGTTCGTCTC
TTGGATCCTGCTACGCGTCTACAAGGCCGCTGTTCCGCGTTCTTAAGTGCGGCTGTCGTCG
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AAGCGCCCCGCACAAACGAAGTAAGC
4、一种鸭瘟疱疹病毒转移载体的制备方法，其特征是：
1)设计扩增UL24、TK和gH基因的引物
根据鸭瘟疱疹病毒UL25、UL24、TK、gH和UL21基因的保守序列，设计兼并引物，
位于TK基因内的兼并引物DP1和DP2：
DP1：5′TCTCGAC(T)GGA(G，C，T)GCA(G，C，T)C(T)AC(T)GG  3′
DP2：5′GCGATTGGA(G)TGG(C，T)CG(T)A(G)TC  3′
位于UL24基因内的兼并引物
DP3 5′CGGCACGA(T)C(T)TTC(T)AA(G)C(T)TC 3′
位于gH基因内兼并引物：DP4 5′ATCATCGTACCA(G)TTAGG 3′
位于UL25基因内兼并引物：
DP5 5′AGGCCCTIT(G)TTCG(A)TAT(C)TG 3′
位于UL21基因内兼并引物：
DP6 5′GCTTAC(T)TTC(T)A(G，C，T)T A(G，C，T)TA(G)C(T)GG A(G，C，T)GG 3′
2)通过PCR扩增获得UL24、TK和gH基因的序列
利用设计合成的引物，通过5次兼并PCR分别克隆TK基因的保守序列、TK基因的上游侧翼序列FUL24-TK、FUL24-TK的上游序列FUL25-UL24、TK基因的下游侧翼序列FTK-gH和FTK-gH的下游侧翼序列FgH-UL21，将以上5个片段拼接，共得到8481bp的DNA序列，序列分析表明该序列含有完整的UL24、TK和gH基因；
3)PCR扩增TK基因及其侧翼序列FTK2.9
根据所得DNA序列的结果，设计2条引物：
上游引物为5′CCGGAATTCATTTGTCTGTGGTGTAAC 3′，
下游引物为5′CCCAAGCTTAGTGCTGATGGTAGGAG 3′，使用这两条引物，通过PCR克隆大小为2.9kb的PCR产物FTK2.9；
4)重组载体pUC-TK2.9的构建
将FTK2.9通过EcoRI和HindIII酶切位点亚克隆入克隆载体pUC18，形成重组质粒pUC-TK2.9；
5)转移载体pUC-TK2.9-lacZ的构建
将载体pUC-TK2.9用HpaI内切酶切开，并且用小牛碱性磷酸酶去磷酸化，用PstI和EcoRI内切酶酶切质粒pSV-β-Galactosidase，切出lacZ表达盒，并且用T4DNA聚合酶将黏性末端补平，将线性化的pUC-TK2.9和lacZ表达盒平端相连接，构建重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
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