CN103285016B - 氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用，属于医药技术领域。Hemin（ChloroprotoporphyrinIXiron(III)）中文名称是氯化血红素，是亚铁血红素Heme（ironprotoporphyrinIX）的氧化形式，本发明通过体外实验证明氯化血红素具有明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的作用，为通过药物治疗增强猪繁殖与呼吸综合征病毒防控提供有力支持。

Description

氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用

技术领域

本发明属于抗病毒研究技术领域，具体涉及氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive andrespiratory syndrome, PRRS），又称猪蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的，能引起妊娠母猪繁殖障碍（后期出现流产、弱胎、死胎、木乃伊等）及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状（间质性肺炎）和高死亡率为主要特征的猪重要传染病，因此对养猪业的危害极大。

猪繁殖与呼吸综合症对整个养猪行业构成严重威胁，由于人们对该病免疫逃避的分子机制缺乏了解，目前疫苗的使用也不能提供有效且可持续的疾病控制，特别是对那些RNA类病毒更是无能为力；同时基于对健康安全食品的关注和需求，动物抗生素的使用已引起越来越多消费者的反对。因此，开发有效的抗病毒药物及制定新型抗病毒策略仍然极为重要和迫切。

Hemin（Chloroprotoporphyrin IX iron(III)）中文名称是氯化血红素，是亚铁血红素heme（iron protoporphyrin IX）的氧化形式，其结构式如式（Ⅰ）所示；

式（Ⅰ）。

Hemin在医学上应用主要是作为亚铁血红素heme（iron protoporphyrin IX）的商业化药物，从上世纪70年代开始就已经被美国FDA批准为急性卟啉症（acute porphyria，AP）的治疗药物。Hemin也是生产补铁食品、药品、保健品、化妆品的首选原料，是现代医学公认的防治缺铁性贫血的有效生物铁源。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用。

本发明的另一个目的是提供一种氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制制剂中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物制剂。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明通过体外实验发现hemin具有明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的作用，为通过药物治疗增强对猪繁殖与呼吸综合征病毒的防控提供有力支持。因此，本发明提供一种氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应，同时本发明提供一种氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制制剂中的应用。

一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物制剂，包括有效量的氯化血红素和药学上可接受的辅料。优选地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。更优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂；所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。

本发明首先采用Alamar Blue及流式细胞术的方法检测hemin这种药物对细胞的毒力及凋亡影响，选取最优浓度。然后再通过qPCR、western blot、观察细胞病变效应（CPE）、细胞上清病毒滴度测定及间接免疫荧光技术检测hemin对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响。最后，通过Alarmblue及CPE法分别计算该药物的细胞毒性浓度（50% cytotoxic concentration ，CC₅₀）和半数抑制浓度（50% inhibition concentration，IC₅₀），对hemin在MARC-145细胞中的抗病毒效果进行评价。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）Hemin的生产工艺成熟；可以为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物制备提供充足的原料。

（2）Hemin抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果明显；本发明通过体外实验发现：hemin在MARC-145细胞中的CC₅₀为124.80±1.00 μM，即约在124 μM hemin条件下，可以造成50%细胞毒性；而IC₅₀为31.94±0.41 μM，即约在31.94μM hemin条件下可以抑制50%病毒的复制或产生。

（3）使用方便，药品为粉末制剂，2~8℃密封避光即可保存，易于运输，且即溶即用。

附图说明

图1. 不同浓度Hemin处理对MARC-145细胞活力的影响。

图2. 流式细胞仪检测Hemin处理36 小时后MARC-145细胞的凋亡情况。

图3. 不同浓度的Hemin处理对PRRSV N基因表达的影响。

图4. 不同浓度的Hemin处理后上清PRRSV拷贝数的测定。

图5. 不同浓度的Hemin处理后上清PRRSV CCID₅₀的测定。

图6. Western blot检测不同浓度Hemin及DFO处理后对PRRSV蛋白表达的影响。

图7. 间接免疫荧光检测不同浓度Hemin处理后对PRRSV蛋白表达的影响，图片为合并绿光与蓝光的结果，其中蓝色为细胞核部分，由Hochest 33258染色；绿色荧光为标记了FITC的病毒N蛋白。

图8. 不同浓度的Hemin处理后对PRRSV引起的CPE的观察；对照：不接毒；Mock：接病毒；DMSO：加入DMSO的接毒组； Hemin-50：加入50 μM hemin的接毒组。

图9.Hemin 在体外抑制PRRSV的复制结果；A，用Alarm blue的方法检测CC₅₀，图示为一组数据所得结果，计算后可得CC₅₀=124.80±1.00 μM；B，用CPE法检测IC₅₀，结果显示，MARC-145细胞中hemin对CH-1a毒株的IC₅₀=31.94±0.41。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术。本发明实施例中选用MARC-145细胞（恒河猴肾细胞MA-104的衍生细胞系）作为PRRSV经典毒株CH-1a株繁殖的营养基质，为PRRSV的繁殖提供营养，因此选用MARC-145细胞不对本发明的范围做任何限定。

实施例中所用生物材料来源如下：

Hemin、DMEM购自Sigma公司；Alamar Blue、Alexa Fluor 488 annexin-V /PI凋亡检测试剂盒购自Invitrogen公司；anti-PRRSV NC抗体购自Jeno Biotech Inc公司；qPCR定量试剂购自TAKARA公司；PRRSV经典毒株CH-1a株，由华南农业大学兽医学院张桂红教授惠赠；MARC-145细胞（恒河猴肾细胞MA-104的衍生细胞系）由中山大学生命科学学院曹永长教授惠赠。

实施例1 hemin对MARC-145细胞生长及凋亡的影响

S1.细胞活力测定实验

AlamarBlue 为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞的生长活力。

用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释对数期生长期的MARC-145细胞后接种于96孔板，每孔100 μl。培养至细胞汇合度达60~70%时，加入试验药物hemin。设置hemin不同浓度的处理组（hemin的浓度分别为5μM、10μM、50μM、100μM）及DMSO对照组（DMSO的浓度为：5%），每组设6个复孔。根据实验需要设置测试时间，测定前6h把待测细胞的培养液更换为含10% Alamar Blue 的培养液，37℃继续培养6 h 后，用多功能酶标仪读取数据（检测时设计的激发光和发射光波长分别为540 nm和590 nm）。从图1可以看出，在hemin的各处理组中，当浓度达到100 μM时MARC-145细胞活力出现显著下降，差异呈现极显著，而50 μM却未有影响。

DMEM培养液购自sigma公司，具体成分可参考公司网站试剂说明书。

S2.Alexa Fluor 488 annexin-V /PI 双染检测细胞凋亡

将步骤S1中经hemin不同浓度处理和DMSO处理并培养后的MARC-145细胞上清转移至2 ml离心管中，600×g 离心5 min，弃去上清。底层贴壁的细胞经1×PBS 润洗后，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化，终止消化后，转移至前述相应的离心管中，600 × g离心5 min 后弃去上清。用 1 ml 4℃预冷的1×PBS 重悬， 600×g离心10 min，重复一次，计数板计数。用稀释好的1×annexin binding buffer 重悬细胞，将浓度调整至1×10⁶ / ml ，重悬前尽量将上清弃净，以免 PBS 残留，转移100 μl MARC-145细胞悬液至5 ml 流式管中，加入5 μl Alexa Fluor 488 annexin-V 和1 μl PI ，轻柔混匀，室温避光温育 15 min，加 400 μl 1×annexin binding buffer，上机分析。实验中选择化疗药物cisplatin（顺铂）作为凋亡检测的阳性对照。从图2可以看出，与对照组相比，MARC-145细胞在DMSO处理组，以及hemin不同浓度处理组中均未引起较大范围的细胞凋亡现象。由此，后续的实验可以采用50 μM浓度的hemin药物对细胞进行处理而不至于造成细胞活力的明显降低或是大规模细胞凋亡的产生。

实施例2 hemin对PRRSV病毒复制的影响

S1.样品的收集

PRRSV毒株CH-1a接种80%汇合度的MARC-145细胞，4℃、37℃各吸附1 h；吸除病毒液，分别加入含有不同浓度的 hemin （5μM、10 μM、50μM）以及2%胎牛血清的DMEM维持培养基；同时用含5 % DMSO以及2%胎牛血清的DMEM维持培养基作为对照，36 hpi收集细胞及上清。

S2. qPCR检测细胞内PRRSV N基因的相对表达量

总RNA提取使用Invitrogen公司的RNAizol 试剂。对于贴壁培养的MARC-145细胞，移除培养液，用1×PBS洗涤两次后加入适量RNAizol 裂解细胞。转移裂解液到1.5 ml的无RNA酶的EP管中振荡混匀，室温放置5 min 后，按照1ml RNAizol加入200μl的比例加入氯仿，振荡混匀后于 4℃条件下12，000×g离心15 min，转移上层无色透明水相至新的EP管中，加入等体积异丙醇溶液沉淀RNA，-20℃条件下静置2 h ；4℃ 12，000×g 离心10 min ，弃上清后用70％乙醇洗沉淀一次，（为提高纯度，可重复一次）待乙醇全部挥发后加入适量的DEPC 水溶解沉淀并保存于－80℃备用。以上试剂均在 4℃预冷，所有操作在冰上进行。

S3. mRNA定量：用mRNA的反转录试剂盒（Progema, A3500）进行反转录，反转录体系及操作详见说明书。反转后对cDNA进行浓度测定，将其稀释到100ng/μl。使用Takara 的荧光定量试剂（DRR091A）进行基因表达量检测。反应体系为：Premix Ex Taq (2×) 5.0μl，上游引物ORF7 (N) -qF (10 μM) 0.5μl ，下游引物ORF7 (N)- qR(10 μM) 0.5μl ， cDNA 模板1.0 μl，dH₂O 3.0μl ，总体系为10μl。采用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪进行反应，反应条件为95℃, 30 s；95℃, 5 s；60℃, 30 s；72℃, 20 s；40个循环，在每个循环中60℃延伸结束时采集一次荧光数据，而后进行溶解曲线分析，95℃，1 s；60℃，15s；95℃进行连续采集荧光信号。内参选定为GAPDH。内参引物序列如下：

GAPDH-qF: 5’-TGACAACAGCCTCAAGATCG-3’，如SEQ ID NO：1所示。

GAPDH-qR: 5’-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’，如SEQ ID NO：2所示。

利用内参引物可扩增出109 bp的核苷酸序列。

病毒引物序列为：

ORF7 (N)- qF: 5’- AAAACCAGTCCAGAGGCAAG-3’，如SEQ ID NO：3所示。

ORF7 (N)- qR: 5’- CGGATCAGACGCACAGTATG-3’，如SEQ ID NO：4所示。

利用上述引物可扩增出250bp的核苷酸序列。

从细胞内PRRSV病毒N基因相对定量（图3）的结果可以看出，随着hemin浓度的增加，病毒N基因表达逐渐降低，且与DMSO组比较差异均极显著。

S4. qPCR检测细胞上清中病毒的拷贝数

PRRSV病毒的RNA 提取按照TAKARA公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit说明书进行，具体操纵可参考产品说明书。

设计的PRRSV病毒引物序列和探针序列如下：

NSP2-qF: 5’-GTGGGTCGGCACCAGTT-3’，如SEQ ID NO：5所示。

NSP2-qR: 5’-GACGCAGACAAATCCAGAGG-3’，如SEQ ID NO：6所示。

利用上述引物可扩增出172 bp的核苷酸序列。

探针序列：NSP2-probe Pball：CACAGTTCTACGCGGTGCAGG如SEQ ID NO：7所示，探针5’端标记FAM，探针3’端标记TAMRA。

将利用NSP2-qF/NSP2-qR扩增出来的172bp的基因片度连接到克隆载体pMD20上得重组质粒pMD20-CH1a（目的基因的扩增和重组质粒的连接可参照分子克隆常规操作方法），将含有目的片段的重组质粒pMD20-CH1a用Nano Drop -1000测定浓度，换算质粒浓度(ng/μl)至拷贝数/μl。然后用EASY Dilution(for Real Time PCR) 将其做10倍梯度稀释，稀释的浓度分别为：10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、100拷贝/μl，最后以梯度稀释的质粒作为标准品制作标准曲线。

PRRSV TaqMan 探针荧光定量PCR 的反应体系为：Premix Ex Taq (2×) 5.0μl ，上游引物NSP2-qF (10 μM) 0.2μl ，下游引物NSP2-qR(10 μM) 0.2μl ，TaqMan探针Pball (10 μM) 0.4μl ，质粒 DNA或cDNA 模板1.5μl，dH₂O 2.7μl ，总体系为 10μl 。在罗氏的公司的LightCycler® 480的荧光定量PCR 仪上的反应条件为：95℃ 预变性10s； 95℃变性5s，60℃退火与延伸40s，40个循环；在每个循环中60℃延伸结束时采集一次荧光数据。

根据标准曲线及定量数据计算上清中病毒的拷贝数，从图4可以看出，病毒的拷贝数随hemin浓度的增加而降低。

S5.药物处理后细胞上清的病毒滴度测定（即CCID₅₀）

将步骤S1制备得到的细胞上清用含2%胎牛血清的DMEM培养基作10倍系列稀释10^-1至10^-8，接种在长满MARC-145细胞单层的96孔培养板上，每稀释度接种8孔，每孔0.1 ml，37℃吸附1 h后每孔再加入0.1 ml 含2%胎牛血清的DMEM维持培养基维持液，37℃、5%CO₂培养箱中静置培养7d，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算病毒的CCID₅₀。从图5可以看出，随着hemin浓度的增加，上清中PRRS病毒的滴度在下降，且呈剂量依赖性。

S6. Western blot检测不同浓度Hemin 处理后对病毒N蛋白表达的影响。

制备浓度为12 %的SDS-PAGE 分离胶及浓缩胶；分别按稳压80 V和120V 进行浓缩胶和分离胶电泳；半干转移法恒压15 V转膜约1 h；取出膜后，用1×TBS 洗5 min 后加入封闭液，室温缓慢摇动2 h （或4℃过夜）；弃去封闭液，用TBS/T 洗三次，每次室温晃动5 min ；加入合适比例稀释的一抗溶液，室温缓慢摇动2 h 或者4℃过夜；用TBS/T在室温条件下洗膜三次，每次室温摇动5 min，之后加入二抗溶液，室温下平缓摇动约1 h；用 TBS/T 溶液洗膜3 次，每次室温摇动5 min；ECL显色，并在发光成像仪上曝光。

从图6可以看出，对病毒N蛋白的检测发现当hemin量加入至50 μM浓度时，病毒的蛋白表达受到了明显的抑制。

S7. 间接免疫荧光法检测不同浓度Hemin处理后对病毒N蛋白表达的影响。

用含10% 胎牛血清的DMEM培养液稀释对数期生长期细胞后接种于铺有爬片的24孔板，培养至细胞汇合度达60~70%时，感染PRRSV，4℃、37℃各吸附1 h；吸除病毒液，加入含有50 μM hemin以及2% 胎牛血清的DMEM维持培养基；36 hpi的细胞爬片用1×PBS润洗3次，弃去上清。用4%多聚甲醛固定10 min，弃去固定液，加入1×PBS漂洗3次，每次5 min。之后加入0.5% Triton X-100 透化处理15 min，弃去上清，加入1×PBS漂洗3次，每次5 min。用含1% BSA的PBS（封闭液）封闭30 min，吸出封闭液，加入1% BSA稀释的一抗，并于4℃摇晃杂交过夜。吸出一抗溶液，加入1×PBS漂洗3次，每次5 min。之后在培养板中加入FITC标记的二抗，并于37℃杂交1 h。吸出二抗溶液，用1×PBS漂洗3次，每次5 min。加入细胞核染色液Hoechst 33258（终浓度2 ug/ml）染色4~5 min，之后弃去，加入1×PBS漂洗3次，每次5 min。最后用抗猝灭剂VECTASHIELD 封片，并及时在荧光显微镜下观察、拍照。

从图7可以看出，随着hemin浓度的增加，标记了FITC的N蛋白表达(绿色荧光标记)在减少，且呈剂量依赖性。而DMSO处理的各组显示，N蛋白的表达并无显著变化。从而更加确认hemin在PRRSV感染的MARC-145细胞中可以发挥抗病毒作用。

S8.不同浓度Hemin处理后对病毒引起的CPE的观察。

在将不同浓度Hemin（5μM、10μM、50μM）处理并感染病毒36 hpi用普通显微镜观察MARC-145细胞病变情况，同时，设以未接毒的MARC-145细胞组、Mock组（仅接PRRSV病毒）、DMSO处理组作为对照。观察结果如图8所示，加入hemin（50 μM）处理后的MARC-145细胞并未产生明显病变且与未接毒的细胞组细胞形态并无差别；然而Mock组（仅接毒）、DMSO处理组的细胞却出现较多的CPE。

S9. hemin在MARC-145细胞中的抗病毒效果评价

通过Alarmblue的方法及通过Alarmblue的方法分别计算细胞毒性浓度（50% cytotoxic concentration ，CC₅₀）及半数抑制浓度（50% inhibition concentration，IC₅₀）。结果如图9所示，hemin在MARC-145细胞中的CC₅₀为124.80±1.00 μM，即约在124 μM hemin条件下，可以造成50%细胞毒性；而IC₅₀为31.94±0.41 μM，即约在31.94μM hemin条件下可以抑制50%病毒的复制或产生。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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<212> DNA

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cggatcagac gcacagtatg 20

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gacgcagaca aatccagagg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Pball

<400> 7

cacagttcta cgcggtgcag g 21

Claims (2)

1.氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用。

2.氯化血红素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制制剂中的应用。