CN109745562B - Erk信号通路小分子抑制剂在抑制衣原体感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了小分子抑制剂VX‑11e和BVD‑523在抑制衣原体感染中的应用。本发明研究发现信号通路抑制剂VX‑11e和BVD‑523能够显著抑制沙眼衣原体的感染，与已经报道的MEK抑制剂U0126相比，有显著性差异；本发明首次将小分子抑制剂VX‑11e和BVD‑523应用到衣原体感染中，有望成为衣原体靶向宿主治疗的新药物；同时研究还发现，抑制剂VX‑11e和BVD‑523与阿奇霉素联合应用有协同作用，在衣原体感染后VX‑11e和BVD‑523能促进阿奇霉素的抗感染作用，对治疗衣原体感染有重要应用价值。本发明为沙眼衣原体感染新药物的开发和寻找辅助宿主治疗的新靶点具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及ERK信号通路小分子抑制剂VX-11e和BVD-523在抑制衣原体感染中的应用。
背景技术
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）感染已成为全球范围内流行最广的性传播疾病之一。Ct感染如不及时治疗，可引起严重并发症，如男性附睾炎和前列腺炎，女性宫颈炎、盆腔炎、输卵管炎、异位妊娠和不孕症等；也可通过产道传播，引起新生儿眼结膜炎和肺炎。此外，Ct感染还是人类乳头瘤病毒致宫颈癌的协同因子，以及HIV感染的重要协同因素。
WHO、美国和我国等均推荐阿奇霉素、多西环素为首选治疗药物，但临床上Ct感染治疗失败的报道越来越多，Ct感染治疗失败已成为临床上不可忽视的问题，是衣原体治疗的难点。
近年来，辅助性靶向宿主治疗策略是微生物感染治疗的新方向，靶向宿主治疗策略在HIV、结核和真菌感染治疗方面取得了一定进展，但尚未见衣原体感染辅助靶向宿主治疗的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有沙眼衣原体治疗方案的缺陷和不足，提供一种新的治疗靶点，寻找靶向宿主治疗衣原体感染的新药物。
本发明的目的是提供ERK信号通路抑制剂在抑制衣原体感染方面的应用。
本发明另一目的是提供ERK信号通路抑制剂与阿奇霉素联用在抑制衣原体感染方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明为了探究ERK信号通路抑制剂在沙眼衣原体感染中的作用及机制，主要的研究及成果包括以下内容：
1、筛选对衣原体感染抑制作用最强的信号通路抑制剂
我们筛选p38 MAPK、JNK、Akt、PI3K和ERK信号通路的5种抑制剂，发现MAPK/MEK/ERK信号通路抑制剂Vx-11e能显著抑制衣原体感染，其他抑制剂对衣原体感染抑制作用较弱。
2、明确VX-11e和BVD-523能显著抑制衣原体的感染：
（1）我们选择2种ERK小分子抑制剂VX-11e和BVD-523进行深入研究, 发现VX-11e和BVD-523能显著抑制衣原体的感染，衣原体的感染率降低，包涵体的数量减少，包涵体变小，衣原体复活数量减少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
（2）我们将BVD-523和VX-11e与文献已经报道的MEK抑制剂U0126进行了比较，发现BVD-523和VX-11e对D型衣原体的抑制效果显著高于U0126，差异有统计学意义（P<0.05）。
（3）选用D型沙眼衣原体和人源性宫颈癌细胞（Hela），明确VX-11e和BVD-523在衣原体感染中的作用。
（4）建立鼠成纤维McCoy和绿猴肾Vero细胞感染模型，明确VX-11e和BVD-523在不同细胞类型中抑制衣原体感染的作用。
（5）选用不同血清型衣原体，如E、F和L1型，明确VX-11e和BVD-523在不同血清型衣原体感染中的作用。
3、VX-11e、BVD-523与阿奇霉素联合使用有协同作用。在感染后0小时加入VX-11e，BVD-523，阿奇霉素，VX-11e+阿奇霉素， BVD-523+阿奇霉素和DMSO，观察衣原体的感染率，包涵体的数量，包涵体大小，复种后产生的传染性衣原体的数量，发现VX-11e、BVD-523与阿奇霉素具有协同作用。
4、BVD-523能够抑制小鼠衣原体感染。
经过大量的研究探索验证，本发明得出如下结论：ERK信号通路小分子抑制剂VX-11e和BVD-523能够抑制沙眼衣原体的感染；首次将VX-11e和BVD-523应用到衣原体感染中。因此，ERK信号通路小分子抑制剂VX-11e和BVD-523有望成为衣原体靶向宿主治疗的新药物。另外，研究还发现，ERK信号通路抑制剂VX-11e和BVD-523与阿奇霉素联合应用有协同作用，对治疗衣原体感染有重要应用价值。
因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
ERK信号通路抑制剂在制备抑制衣原体感染的药物方面的应用。
ERK信号通路抑制剂与阿奇霉素联用在制备抑制衣原体感染的药物方面的应用。
优选地，所述ERK信号通路抑制剂为小分子抑制剂VX-11e和/或BVD-523。
优选地，所述衣原体为沙眼衣原体。
另外，基于上述研究，本发明还提供一种抑制衣原体感染的药物，该药物含有ERK信号通路抑制剂。
优选地，所述ERK信号通路抑制剂为小分子抑制剂VX-11e和/或BVD-523。
更优选地，所述药物还含有阿奇霉素。
另外，还可包括一种或多种药学上可接受的辅料，制备成不同的剂型。
另外优选地，ERK信号通路抑制剂与阿奇霉素的比例为5～30μM：0.02μg/ml。
具体优选地，抑制剂VX-11e：阿奇霉素=5～15μM：0.02μg/ml。
更优选地，抑制剂VX-11e：阿奇霉素=10μM：0.02μg/ml。
优选地，抑制剂BVD-523：阿奇霉素=15～25μM：0.02μg/ml。
更优选地，抑制剂BVD-523：阿奇霉素=20μM：0.02μg/ml。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次将ERK信号通路抑制剂应用到衣原体感染中，研究发现ERK信号通路抑制剂VX-11e和BVD-523能够抑制沙眼衣原体的感染；而且对不同细胞类型、不同血清型衣原体均有效。因此，小分子抑制剂VX-11e和BVD-523有望成为衣原体靶向宿主治疗的新药物。
同时，本发明研究ERK信号通路抑制剂在沙眼衣原体感染中的作用及机制，发现衣原体辅助宿主治疗的新靶点，为衣原体临床治疗的转化奠定基础。
另外，研究还发现，ERK信号通路抑制剂VX-11e和BVD-523与阿奇霉素联合应用有协同作用，能促进阿奇霉素的抗感染作用，对治疗衣原体感染有重要应用价值。
附图说明
图1为5种信号通路抑制剂在沙眼衣原体感染中作用的研究技术路线图。
图2为5种信号通路抑制剂在沙眼衣原体感染中的作用。
图3为VX-11e和BVD-523的在衣原体感染中作用的研究技术路线图。
图4为VX-11e和BVD-523 D型衣原体感染的抑制作用。
图5为VX-11e和BVD-523抑制衣原体感染的剂量效应。
图6为VX-11e和BVD-523抑制衣原体感染的时间效应。
图7为VX-11e和BVD-523能显著抑制McCoy细胞中衣原体的感染。
图8为VX-11e和BVD-523能显著抑制Vero细胞中衣原体的感染。
图9为VX-11e和BVD-523对不同血清型衣原体感染的作用。
图10为VX-11e、BVD-523与阿奇霉素联合使用效果的研究技术路线图。
图11为在感染后0小时VX-11e、BVD-523与阿奇霉素联合使用有协同作用。
图12为在感染后22小时VX-11e、BVD-523与阿奇霉素联合使用有协同作用。
图13为BVD-523在衣原体感染小鼠模型中作用的研究技术路线图。
图14为小鼠感染沙眼衣原体后第11天，对照组（A）、实验组（B、C）小鼠宫颈子宫及附件肉眼观察变化。
图15为在小鼠感染模型中BVD-523能抑制衣原体的感染。
图16为BVD-523和阿奇霉素治疗小鼠衣原体感染后子宫病理改变。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 抑制沙眼衣原体感染的信号通路抑制剂筛选
我们筛选了5种信号通路p38 MAPK、JNK、Akt、PI3K和ERK信号通路的抑制剂，明确5种信号通路抑制剂在沙眼衣原体感染中的作用，观察衣原体的感染率，包涵体的数量，包涵体大小，复种后产生的传染性衣原体的数量，选择抑制效果最强的抑制剂进行深入研究。研究技术路线如图1所示。
结果如图2，不同抑制剂作用下，D型沙眼衣原体生长情况免疫荧光图（绿色荧光：anti-MOMP）（×200） A：阴性对照（无衣原体感染）；B：阳性对照（正常感染），可见较多绿色荧光的大包涵体；C：0.08μg/ml阿奇霉素处理，视野内未见有包涵体；D：LY294002（PI3K通路抑制剂）处理组，视野内可见较多中等绿色荧光的包涵体；E：SP600125（JNK通路抑制剂）处理组，视野内可见较多中等大小绿色荧光的包涵体；F：SB20190（p38 MAPK通路抑制剂）处理组，视野内可见较多绿色荧光的包涵体； G：AZD5363（Akt通路抑制剂）处理组，视野内可见中等大小绿色荧光的包涵体；H：Vx-11e（ERK通路抑制剂）处理组，视野内可见少量针尖大小绿色荧光的包涵体。
结果显示MAPK/MEK/ERK信号通路抑制剂Vx-11e能显著抑制衣原体感染，其他抑制剂对衣原体感染抑制作用较弱。我们选择了抑制效果最强的ERK信号通路抑制剂进行深入研究。
实施例2 VX-11e和BVD-523能显著抑制衣原体的感染
选择2种ERK小分子抑制剂VX-11e和BVD-523进行深入研究，选用D型沙眼衣原体和人源性宫颈癌细胞（Hela），明确VX-11e和BVD-523在衣原体感染中的作用，并与文献已经报道的MEK抑制剂U0126进行比较，明确VX-11e和BVD-523抑制衣原体感染的优势。研究技术路线如图3。
具体实验方法如下：
1、实验方法
1.1细胞复苏和接种衣原体：从-70℃取出冻存Hela细胞，置于37℃水浴中振摇，速溶，在含10%新生牛血清的DMEM培养基，5%CO2、35℃的条件下培养，胰蛋白酶消化传代。Hela细胞铺24孔板，加入爬片，每孔1×105细胞，待细胞生长成单层，接种衣原体。从-70℃取出衣原体菌株，在旋涡振荡器上振荡30sec，无菌条件下将内容物移至单层细胞培养板中。同时设置阳性和阴性对照。将已接种标本的24孔培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，实验组分别加入10μM的VX-11e、20μM BVD-523和10μM U0126，5%CO2、35℃恒温湿度的条件下培养48h，然后观察结果。
1.2碘染色法观察：吸去培养孔中的分离培养基，加入0.2 ml甲醇于培养孔中固定细胞10min，弃去甲醇，加入0.2 ml卢格氏碘液，染色15min。倒置显微镜下观察衣原体包涵体。
1.3直接免疫荧光法：首先弃去细胞培养液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定细胞20min后，PBS漂洗3次；Triton 100作用细胞15分钟，PBS漂洗3次，取出爬片。加荧光标记的MOMP单克隆抗体，37℃下孵育30min，PBS漂洗3次；DAPI染色10分钟，PBS漂洗3次，晾干，封片剂封片，荧光显微镜下观察结果。
1.4 确定衣原体感染率：随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。
1.5 确定传染性衣原体的数量：在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集10μM的VX-11e、20μM BVD-523和10μM U0126作用的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色观察包涵体，计数传染性衣原体的数量。
2、实验结果：
结果如图4-6：
图4显示VX-11e和BVD-523能显著抑制D型衣原体的感染。图中，(a) D型沙眼衣原体包涵体荧光染色。阳性对照组可见较多绿色荧光的大包涵体，VX-11e、BVD-523和U0126作用后，包涵体的数量减少，包涵体变小。（b）衣原体感染率比较。VX-11e和BVD-523作用组，衣原体的感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（c）包涵体面积。VX-11e和BVD-523作用组，包涵体面积变小，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（d）传染性衣原体的数量。VX-11e、BVD-523和U0126作用组，复活的有传染性衣原体数量减少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（e）透射电子显微镜观察。VX-11e、BVD-523和U0126作用组，衣原体包涵体变小，VX-11e、BVD-523内可见异型包涵体，标尺为2μm，放大倍数为6000倍。
图5显示VX-11e和BVD-523抑制衣原体感染有剂量效应。图中，(a)不同浓度的U0126，VX-11e 和 BVD-523作用D型沙眼衣原体，随着抑制剂浓度的增加，衣原体感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（b）传染性衣原体的数量。不同浓度的VX-11e、BVD-523和U0126作用D型沙眼衣原体，随着抑制剂浓度的增加，复活的有传染性衣原体数量减少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
图6显示VX-11e和BVD-523抑制衣原体感染有时间效应。图中，(a) 不同时间点加入U0126，VX-11e和BVD-523的荧光图，阳性对照组可见较多绿色荧光的大包涵体，VX-11e、BVD-523和U0126作用后，包涵体的数量减少，包涵体变小。(b) 衣原体感染率比较。抑制剂VX-11e、BVD-523加入时间越早，D型沙眼衣原体感染率越低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。(c) 传染性衣原体的数量。不同时间点加入VX-11e、BVD-523和U0126，抑制剂加入时间越早，复活的有传染性衣原体数量越少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
结果显示，VX-11e和BVD-523能显著抑制衣原体的感染，衣原体的感染率降低，包涵体的数量减少，包涵体变小，衣原体复活数量减少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
此外，我们将BVD-523和VX-11e与文献已经报道的MEK抑制剂U0126进行了比较，发现BVD-523和VX-11e对D型衣原体的抑制效果显著高于U0126，差异有统计学意义（P<0.05）。
实施例3 VX-11e和BVD-523在不同细胞系中的作用相似
建立鼠成纤维McCoy和绿猴肾Vero细胞感染模型，明确VX-11e和BVD-523在不同细胞类型中抑制衣原体感染的作用。具体实验方法如下：
1、实验方法：
1.1接种衣原体：从-70℃取出冻存McCoy细胞和Vero细胞，37℃速溶，在含10%新生牛血清的DMEM培养基，5%CO2、35℃的条件下培养，待细胞生长成致密单层，胰蛋白酶消化传代。McCoy细胞和Vero细胞铺24孔板，加入爬片，每孔1×105细胞，待细胞生长成单层，接种衣原体。从-70℃取出衣原体菌株，在旋涡振荡器上振荡30sec，无菌条件下将内容物移至单层细胞培养板中。同时设置阳性和阴性对照。将已接种标本的24孔培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，McCoy细胞和Vero细胞实验组分别加入10μM的VX-11e和20μM BVD-523，5%CO2、35℃恒温湿度的条件下培养48h，然后观察结果。
1.2免疫荧光观察：弃去细胞培养液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定细胞20min后，PBS漂洗3次；Triton 100作用细胞15分钟，PBS漂洗3次，取出爬片。加荧光标记的MOMP单克隆抗体，37℃下孵育30min，PBS漂洗3次；DAPI染色10分钟，PBS漂洗3次，晾干，封片剂封片，荧光显微镜下观察结果。
1.3确定衣原体感染率：随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。
1.4 确定传染性衣原体的数量：在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集10μM的VX-11e和20μM BVD-523作用的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色观察包涵体，计数传染性衣原体的数量。
2、实验结果：
结果如图7和8所示：
图7显示VX-11e和BVD-523能显著抑制McCoy细胞中衣原体的感染。图中，(a)McCoy细胞为小鼠来源的成纤维细胞，D型沙眼衣原体感染McCoy细胞，对照组可见较多绿色荧光的大包涵体；VX-11e、BVD-523和U0126作用后，McCoy细胞中包涵体的数量减少，包涵体变小。（b）衣原体感染率比较。衣原体感染的McCoy细胞中加入小分子抑制剂VX-11e和BVD-523，衣原体的感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（c）包涵体面积。VX-11e和BVD-523作用组的衣原体包涵体面积变小，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（d）McCoy细胞中VX-11e和BVD-523作用的时间效应。不同时间点加入VX-11e、BVD-523和U0126，抑制剂加入时间越早，衣原体的感染率越低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（e）传染性衣原体的数量。衣原体感染的McCoy细胞中，不同时间点加入VX-11e、BVD-523和U0126，抑制剂加入时间越早，复活的有传染性衣原体数量越少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
图8显示VX-11e和BVD-523能显著抑制Vero细胞中衣原体的感染。图中，(a) 绿猴肾细胞（Vero细胞）中沙眼衣原体包涵体荧光染色。阳性对照组可见较多绿色荧光的大包涵体，VX-11e、BVD-523和U0126作用后，Vero细胞中包涵体的数量减少，包涵体变小。（b）衣原体感染率比较。衣原体感染Vero细胞中加入小分子抑制剂VX-11e和BVD-523，衣原体的感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（c）包涵体面积。衣原体感染Vero细胞中加入小分子抑制剂VX-11e和BVD-523，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（d）Vero细胞中 VX-11e和BVD-523作用的时间效应。不同时间点加入VX-11e、BVD-523和U0126，抑制剂加入时间越早，衣原体的感染率越低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（e）传染性衣原体的数量。衣原体感染Vero细胞中，不同时间点加入VX-11e、BVD-523和U0126，抑制剂加入时间越早，复活的有传染性衣原体数量越少，与对照组相比。
实施例4 VX-11e和BVD-523在不同血清型衣原体感染的作用相似
选用不同血清型衣原体，如E、F和L1型，明确VX-11e和BVD-523在不同血清型衣原体感染中的作用。具体实验方法如下：
1、实验方法：
1.1细胞复苏和接种衣原体：从-70℃取出冻存Hela细胞，置于37℃水浴中振摇，速溶，在含10%新生牛血清的DMEM培养基，5%CO2、35℃的条件下培养，胰蛋白酶消化传代。Hela细胞铺24孔板，加入爬片，每孔1×105细胞，待细胞生长成单层，接种衣原体。从-70℃取出E、F和L1型衣原体菌株，在旋涡振荡器上振荡30sec，无菌条件下将内容物移至单层细胞培养板中。同时设置阳性和阴性对照。将已接种标本的24孔培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，实验组分别加入10μM的VX-11e、20μM BVD-523和10μM U0126，5%CO2、35℃恒温湿度的条件下培养48h，然后观察结果。
1.2碘染色法观察：吸去培养孔中的分离培养基，加入0.2 ml甲醇于培养孔中固定细胞10min，弃去甲醇，加入0.2 ml卢格氏碘液，染色15min。倒置显微镜下观察衣原体包涵体。
1.3直接免疫荧光法：首先弃去细胞培养液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定细胞20min后，PBS漂洗3次；Triton 100作用细胞15分钟，PBS漂洗3次，取出爬片。加荧光标记的MOMP单克隆抗体，37℃下孵育30min，PBS漂洗3次；DAPI染色10分钟，PBS漂洗3次，晾干，封片剂封片，荧光显微镜下观察结果。
1.4 确定衣原体感染率：随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。
1.5 确定传染性衣原体的数量：在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集10μM的VX-11e、20μM BVD-523和10μM U0126作用的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色观察包涵体，计数传染性衣原体的数量。
2、实验结果：
结果如图9所示，图中，(a) E型、F型和L1型沙眼衣原体包涵体荧光染色。阳性对照组可见较多绿色荧光的大包涵体；VX-11e、BVD-523和U0126作用后，包涵体的数量减少，包涵体变小。（b）衣原体感染率比较。VX-11e和BVD-523作用后，E型、F型和L1型衣原体的感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（c）传染性衣原体的数量。VX-11e、BVD-523和U0126作用后，E型、F型和L1型复活的有传染性衣原体数量减少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
结果显示，VX-11e和BVD-523能显著抑制E型、F型和L1型多种不同血清型衣原体的感染。
实施例5 VX-11e、BVD-523与阿奇霉素联合使用有协同作用
本实施例在感染后0小时加入VX-11e，BVD-523，阿奇霉素， VX-11e+阿奇霉素，BVD-523+阿奇霉素和DMSO，观察衣原体的感染率，包涵体的数量，包涵体大小，复种后产生的传染性衣原体的数量；以明确VX-11e、BVD-523与阿奇霉素联合使用的效果。研究技术路线如图10，具体实验方法如下：
1、实验方法
1.1准备单层Hela细胞和衣原体，接种衣原体的24孔细胞培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，实验组分别加入10μM VX-11e、20μM BVD-523和0.02μg/ml阿奇霉素，10μM VX-11e+0.02μg/ml阿奇霉素，20μM BVD-523+0.02μg/ml阿奇霉素，同时设置阳性和阴性对照，5%CO2、35℃的条件下培养48h，然后碘染色和荧光染色观察包涵体的数量和大小等改变，方法同上。
1.2 确定衣原体感染率：随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。
1.3确定传染性衣原体的数量：在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集实验组的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色包涵体，确定传染性衣原体的数量。
2、实验结果：
结果如图11和12所示：
图11为在感染后0小时VX-11e、BVD-523与阿奇霉素联合使用有协同作用。在感染后0小时加入VX-11e，BVD-523，阿奇霉素，VX-11e+阿奇霉素， BVD-523+阿奇霉素和DMSO对照，培养至48h，观察衣原体的感染率，包涵体的数量，包涵体大小，复种后产生的传染性衣原体的数量。 A：阳性对照；B：10μM U0126处理；C：10μM Vx-11e处理；D：20μM BVD-523处理；E：阴性对照；F：0.02μg/ml阿奇霉素处理；G：0.02μg/ml阿奇霉素+10μM Vx-11e处理；H：0.02μg/ml阿奇霉素+20μM BVD-523处理。
图12为在感染后22小时VX-11e、BVD-523与阿奇霉素联合使用有协同作用。在感染后22小时加入VX-11e，BVD-523，阿奇霉素，VX-11e+阿奇霉素， BVD-523+阿奇霉素和DMSO，培养至48h，观察衣原体的感染率，包涵体的数量，包涵体大小，复种后产生的传染性衣原体的数量。A：阳性对照；B：10μM U0126处理；C：10μM Vx-11e处理；D：20μM BVD-523处理；E：阴性对照；F：0.02μg/ml阿奇霉素处理；G：0.02μg/ml阿奇霉素+10μM Vx-11e处理；H：0.02μg/ml阿奇霉素+20μM BVD-523处理。
结果显示，本研究发现VX-11e、BVD-523与阿奇霉素具有协同作用，小分子抑制剂与抗生素联合使用，能够增强抗生素的作用。
实施例6 BVD-523在衣原体感染小鼠模型中的作用：
1、 实验方法
研究技术路线如图13：取4-6周龄Balb/c雌性小鼠，C.t感染前10天皮下注射2.5mg醋酸甲羟孕酮注射液，随机将小鼠分为5组，分别为感染对照组，BVD-523组，阿奇霉素作用组，BVD-523和阿奇霉素联合作用组和空白对照组。
分别在接种沙眼衣原体3、5、8、11、14、17、21天取小鼠阴道拭子，确定传染性衣原体的数量。感染后8天，处死部分小鼠，取小鼠心、甘、脾、肾，观察BVD-523的毒性；观察小鼠外阴和小鼠子宫外形改变 ；取小鼠子宫，病理切片，HE染色，观察子宫内炎症细胞浸润情况。
2、实验结果如图14-16：
图14为小鼠感染沙眼衣原体后第11天，对照组（A）、实验组（B、C）小鼠宫颈子宫及附件肉眼观察变化。
图15为在小鼠感染模型中BVD-523能抑制衣原体的感染。图中，（a）衣原体感染阳性对照组，感染后第5天和第8天，阴道拭子取材细胞培养，计数包涵体数量，第5天和第8天产生的有活性的衣原体数量无显著性差异（P>0.05）。（b）阿奇霉素（AZM）处理组作用3天后，有活性的衣原体数量显著减少，用药前后差异有统计学意义（P<0.05）。（c）小分子抑制剂BVD-523作用后，有活性的衣原体数量显著减少，用药前后差异有统计学意义（P<0.05）。（d）阿奇霉素与BVD-523联合作用3天后，有活性的衣原体数量显著减少，用药前后差异有统计学意义（P<0.05）。
图16为BVD-523和阿奇霉素治疗小鼠衣原体感染后子宫病理改变。图中，（a）D型沙眼衣原体感染后7天，子宫肿大，可见较多多形核白细胞，阴性对照组未见炎症细胞。（b）感染后21天，HE染色观察小鼠子宫细胞形态学改变。衣原体感染阳性对照组，阿奇霉素（AZM）处理组，BVD-523作用组，阿奇霉素与BVD-523联合作用组，子宫内仍可见少量炎症细胞。
结果显示，BVD-523能够抑制小鼠衣原体感染，BVD-523和阿奇霉素联合使用具有协同作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.ERK信号通路抑制剂在制备抑制沙眼衣原体感染的药物方面的应用，其特征在于，所述ERK信号通路抑制剂为小分子抑制剂VX-11e和/或BVD-523。
2.ERK信号通路抑制剂与阿奇霉素联用在制备抑制沙眼衣原体感染的药物方面的应用，其特征在于，所述ERK信号通路抑制剂为小分子抑制剂VX-11e和/或BVD-523。
3.一种抑制沙眼衣原体感染的药物，其特征在于，含有ERK信号通路抑制剂，还含有阿奇霉素；所述ERK信号通路抑制剂为小分子抑制剂VX-11e和/或BVD-523。
4.根据权利要求3所述药物，其特征在于，ERK信号通路抑制剂与阿奇霉素的比例为5～30μM：0.02μg/ml。
5.根据权利要求3所述药物，其特征在于，还包括一种或多种药学上可接受的辅料。
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| Azithromycin Treatment Modulates the Extracellular Signal-Regulated Kinase Mediated Pathway and Inhibits Inflammatory Cytokines and Chemokines in Epithelial Cells from Infertile Women with Recurrent Chlamydia trachomatis Infection;Pragya Srivastava,et al;《DNA AND CELL BIOLOGY》;20111231;第30卷(第8期);第545-554页 * |
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