CN114836356B - 一种胞内劳森菌弱毒疫苗菌株、疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胞内劳森菌弱毒疫苗菌株、疫苗及其应用，所述胞内劳森菌弱毒疫苗菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，命名为LJS19051‑P80，保藏日期为2022年5月12日，保藏编号为CCTCC NO：V202239。所述胞内劳森菌弱毒疫苗菌株用于制作胞内劳森菌弱毒疫苗菌株疫苗，能有效预防猪增生性回肠炎。本发明以前期分离的胞内劳森菌LJS19051菌株为疫苗候选菌株，使用体外传代致弱方式对其进行致弱，并选择合适代次的致弱菌株制备胞内劳森菌弱毒疫苗，为猪增生性回肠炎商品化弱毒疫苗的研制及猪场猪增生性回肠炎的有效防控奠定了基础。

Description

一种胞内劳森菌弱毒疫苗菌株、疫苗及其应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种胞内劳森菌弱毒疫苗菌株、疫苗及其应用。
背景技术
猪增生性回肠炎(Porcine proliferative enteropathy,PPE)是由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis,LI)感染引起、在世界各地猪场中普遍存在的一种肠道疾病，以生长育肥猪生长发育缓慢，料肉比下降为主要特征，给养猪业带来严重经济损失。据报道，美国每年因PPE造成的经济损失高达2000万美元。据美国学者Moller报道，回肠炎对每头感染猪的经济损失至少为1.531美元。
临床上对于PPE的防控，目前主要依赖疫苗免疫预防和药物治疗。研究表明，高剂量的泰妙菌素、泰乐菌素、金霉素、林可霉素和喹乙醇等药物对LI有效。迄今为止，全球共有2种商品化PPE疫苗，一种为勃林格殷格翰公司生产的弱毒疫苗另一种为默克动物保健公司生产的灭活疫苗/>Ileitis。已有研究表明，两种疫苗对预防PPE均有一定的免疫保护效果。Jacobs等通过对/>Lawsonia有效性进行评价，发现该疫苗无论单独使用，还是与/>PCV M Hyo混合免疫接种，均能够提高猪群日增重、降低粪便排菌数量、减轻组织病理损伤等，对猪群具有较好的免疫保护作用。
在国内，由于国外PPE商品化疫苗价格昂贵，加之PPE为一种慢性损耗性疾病，猪群感染后多呈亚临床症状，死亡率低，因此并未引起养殖户的高度重视，从而限制了商品化疫苗在中国的使用，而抗菌药物已成为国内兽医或养殖户控制该病的首选方法。研究表明，对LI有效的药物可在短时间内控制PPE，但由于LI为严格胞内寄生菌，无法在体外无细胞培养基上生长，导致其分离培养极其困难。因此，当爆发PPE时，很难像其他细菌一样，在短时间内通过药敏试验筛选出对LI敏感的药物。此外，随着农业农村部禁抗减抗政策的实施，无抗饲养将成为未来养猪业发展的必然趋势。因此，研制安全、有效的具有自主知识产权的PPE疫苗对于PPE的有效防控具有重要意义。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种胞内劳森菌弱毒疫苗菌株、疫苗及其应用，制备的胞内劳森菌弱毒疫苗，为猪场PPE有效防控奠定基础。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种胞内劳森菌弱毒疫苗菌株，所述胞内劳森菌弱毒疫苗菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，命名为LJS19051-P80，保藏日期为2022年5月12日，保藏编号为CCTCC NO：V202239。
所述的胞内劳森菌弱毒疫苗菌株在制备预防动物感染胞内劳森菌的药物中的应用。
所述的胞内劳森菌弱毒疫苗菌株在制备预防猪感染胞内劳森菌的药物中的应用
所述的胞内劳森菌弱毒疫苗菌株在制备预防猪增生性回肠炎的药物中的应用。
本发明还提供了一种胞内劳森菌弱毒疫苗，其有效成分为所述的胞内劳森菌弱毒疫苗菌株。
所述的胞内劳森菌弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)LJS19051传代致弱；
(2)评价不同代次LJS19051致弱效果，选择第80代LJS19051；
(3)利用上述第80代LJS19051，制备所述胞内劳森菌弱毒疫苗。
所述的胞内劳森菌弱毒疫苗在制备预防动物感染胞内劳森菌的药物中的应用。
所述的胞内劳森菌弱毒疫苗在制备预防猪感染胞内劳森菌的药物中的应用
所述的胞内劳森菌弱毒疫苗在制备预防猪增生性回肠炎的药物中的应用。
本发明制备了一种胞内劳森菌弱毒疫苗，并在小鼠体内评价了该疫苗免疫保护效果，为猪场PPE的有效防控奠定基础。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1、本发明制备了一种胞内劳森菌弱毒疫苗，通过体外传代致弱，发现第80代的候选菌株对小鼠的毒力最小，且比德国商品化弱毒疫苗更加安全；
2、本发明制备的弱毒疫苗，可通过口服免疫方式对动物进行免疫，无需佐剂，且无需多次注射即可达到较好的免疫保护效果，此外，与其他类型疫苗相比，它所需抗原剂量小，还能够诱导机体产生黏膜免疫应答；
3、本发明所得胞内劳森菌弱毒疫苗。后续该疫苗还可用于免疫猪，为猪回肠炎的有效防控奠定基础。
附图说明
图1为不同代次LJS19051对小鼠生长速度的影响；
图2为不同代次LJS19051攻毒后粪便排菌量测定结果；
图3为不同代次LJS19051攻毒后21天小鼠回肠组织H&E染色结果；
图4为不同代次LJS19051攻毒后21天小鼠回肠组织免疫荧光染色结果；
图5为PPEV对小鼠生长速度的影响；
图6为PPEV对小鼠粪便中LI排菌量的影响；
图7为PPEV对小鼠血清中特异性IgG抗体水平的影响；
图8为PPEV对小鼠回肠组织病理病变观察结果；
图9为PPEV对小鼠回肠组织LI定植情况测定结果；
图10为PPEV对小鼠回肠组织中sIgA含量测定结果；
图11为PPEV对小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；
图12为PPEV对小鼠肠黏膜屏障功能的影响，其中，A为PPEV对小鼠肠屏障通透性的影响；B为qPCR分析PPEV免疫攻毒后对ZO-1和Occludin基因转录水平的影响；C为蛋白免疫印迹分析PPEV对攻毒小鼠回肠Occludin和MUC2蛋白表达水平的影响。数据表示为means±SEM，试验重复3次，通过方差分析，与阳性攻毒对照组相比，*P＜0.05和**P＜0.01；
图13为PPEV攻毒后对小鼠肠道抗氧化能力的影响，其中，A为SOD活性测定结果；B为MDA含量测定结果。数据表示为means±SEM，试验重复3次。通过方差分析，与阳性攻毒对照组相比，*P＜0.05表示差异显著；
图14为PPEV对小鼠回肠组织中消化、吸收酶活性的影响，其中，A为α-AMS活性测定结果；B为LPS活性测定结果；C为AKP活性测定结果。数据表示为means±SEM，试验重复3次。通过方差分析，与阳性攻毒对照组相比，*P＜0.05和**P＜0.01。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本发明所用的材料来源：
LJS19051菌株由本实验室分离、鉴定、保存，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点中国武汉武汉大学，保藏日期为2020年7月21，保藏编号为CCTCC NO：V202046，分类命名为胞内劳森菌菌株LJS19051；
第10、20、40、60和80代的胞内劳森菌LJS19051由本实验室保存；
商品化PPE弱毒疫苗，购于德国勃林格殷格翰；
McCoy购自美国ATCC；
DMEM高糖培养基、胎牛血清购于GIBCO公司；
100只3周龄SPF级雌性ICR小鼠购于扬州大学比较医学中心；
胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体由本实验室制备、保存(专利2021107506194)；
动物组织基因组DNA提取试剂盒以及粪便基因组DNA提取试剂盒，购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；
SteadyPure通用型RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒以及Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒，购于湖南艾科瑞生物工程有限公司；
小鼠sIgA ELISA检测试剂盒以及小鼠IFN-γELISA检测试剂盒，购自凡科维；
总sod活性检测试剂盒和脂质氧化(mda)检测试剂盒，为碧云天生物技术有限公司产品；
碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒、α-淀粉酶(α-AMS)测定试剂盒以及脂肪酶(LPS)测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。
其他未列出的试剂都是能通过正规商业渠道购买；
实施例1 LJS19051传代致弱
(1)LJS19051培养
1)接种前一天，用含1％L-谷氨酰胺，7％胎牛血清和0.5％两性霉素B的DMEM培养液将McCoy细胞按0.5×105个/mL铺于T-75cm2细胞培养瓶中；
2)次日，弃培养液，将稀释后的LJS19051菌液(MO1＝100)接种至细胞单层中，随后置于37℃，含8％O2、8.8％CO2和83.2％N2的三气培养箱中培养，3h后更换为含50μg/L新霉素和100μg/mL万古霉素的培养液，连续培养7天，期间每2～3天更换一次培养液；
3)培养后第7天，将培养物从三气培养箱取出，弃旧培养液，加0.1％KCI，37℃作用15min，加入SPG溶液后将感染细胞从瓶壁上分离后，用巴氏吸管将细胞悬液转移至50mL离心管中；
4)用21号针头反复吹打细胞悬液8次以充分裂解细胞；
5)200×g，室温离心10min，取上清重复离心3次以去除残留的细胞碎片，最后一次离心获得的细胞上清8000×g，室温离心15min，沉淀用含7％FBS的DMEM培养液重悬后，部分接种至McCoy细胞单层中继续进行下一代次培养，其余部分加入终浓度为10％的DMSO，充分混匀后1mL/管分装于冻存管中，-80℃冰箱保存。
(2)攻毒液的制备
从-80℃冰箱分别取出第7代、17代、37代、57代和77代的LJS19051，迅速置于37℃水浴锅中，融化后用含1％L-谷氨酰胺，7％胎牛血清和0.5％两性霉素B的DMEM培养液对菌种进行稀释，随后将稀释后的菌液分别加入细胞密度为30％左右的McCoy细胞中，置于37℃，含8％O2、8.8％CO2和83.2％N2的三气培养箱中培养，3h后更换为含50μg/L新霉素和100μg/mL万古霉素的培养液，期间每2～3天更换一次培养液，7天后进行收获，连续培养3代，将收获的第10代、20代、40代、60代和80代菌液经IPMA法测定细菌数量后，用含5％胎牛血清的DMEM培养液将菌液浓度调整至1×108个/mL，4℃冰箱保存，备用。
实施例2 LJS19051致弱效果评价
(1)小鼠攻毒试验
将60只ICR小鼠按10只/组，随机分为6组。其中第1～5组分别为第10代(Passage10)、第20代(Passage 20)、第40代(Passage 40)、第60代(Passage 60)和第80代(Passage80)LJS19051攻毒组；第6组为阴性对照(Control)。将实施例1中制备好的菌液置于37℃水浴锅预热，各组小鼠人工灌服0.5mL菌液，阴性对照组小鼠灌等量含5％胎牛血清的DMEM，攻毒后每天观察小鼠的健康状态、每隔3天记录小鼠体重，整个试验周期为21天。结果如图1所示，Passage 80攻毒组小鼠生长速度与对照组无显著影响，而Passage 10，Passage 20和Passage 40攻毒组会显著降低小鼠生长速度，Passage 60在感染后前13天对小鼠生长速度没有显著影响，而从感染后第15天，感染组小鼠生长速度开始下降。以上结果说明低代次的LI会降低小鼠日增重。但随着传代次数的增加，对小鼠生长速度影响也越来越小，其中以第80代LJS19051对小鼠生长速度造成的影响最小，与未攻毒对照组小鼠无显著差异。
(2)粪便排菌量检测
分别于攻毒后第0、7、14和21天采集各组小鼠粪便，按北京庄盟生物商品化粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组小鼠粪便DNA，随后以其为模板，采用荧光定量PCR法检测各组小鼠粪便中LI含量。结果如图2所示，除阴性对照组外，攻毒后第7天，其他各组小鼠粪便均开始向外排菌，且在攻毒后第14天排菌量最高，第21天排菌量开始下降，但差异不显著。但与低代次组(第10和20代)相比，随着传代次数增加，高代次组(第40、60和80代)小鼠粪便中LI排菌量显著下降，其中以第80代LJS19051组小鼠粪便只LI排菌量最低，上述结果说明高代次的LJS9051能够降低攻毒组小鼠粪便中LI含量。
(3)H&E染色
攻毒后第21天，分别采用颈椎脱臼法处死小鼠，剖检后观察小鼠肠道有无出血、增厚等临床症状，并做好记录，随后将小鼠回肠浸泡于福尔马林溶液中，固定后的样品委托武汉皮诺飞生物科技有限公司进行H&E染色，并在普通光学显微镜下拍照、分析结果。根据肠上皮细胞增生严重程度，对回肠组织进行0-3级评分：0-无增生；1-轻度增生；2-中度增生；3-严重增生。结果如图3所示，Passage10和Passage 20攻毒组小鼠回肠隐窝肠上皮细胞出现严重增生(评为3分)；Passage 40攻毒组小鼠隐窝肠上皮细胞出现中度增生(评为2分)；第60代组回肠上皮细胞出现轻度增生(评为1分)；而Passage80攻毒组和阴性对照组小鼠回肠未出现典型隐窝肠上皮细胞增生病变，且肠绒毛结果完整(评为0分)。上述结果说明随着传代次数增加，LJS19051对小鼠回肠组织造成的病理损伤逐渐减弱，其中第80代LJS19051攻毒后并未对小鼠回肠组织造成病理损伤。
(4)小鼠回肠组织中LI定植情况检测
攻毒后第21天，采用颈椎脱臼法随机处死小鼠，剖检后观察小鼠肠道有无出血、增厚等临床症状，并做好记录，随后将小鼠回肠浸泡于福尔马林溶液中，委托武汉皮诺飞生物科技有限公司以LI Omp2蛋白单克隆抗体4D9为一抗，采用间接免疫荧光法检测各组小鼠回肠组织中LI定植情况。结果如图4所示，除阴性对照组外，在其他各组小鼠回肠隐窝中均检测到LI定植，但以Passage 10和Passage 20攻毒组小鼠回肠中LI定植数量最多，Passage80攻毒组小鼠回肠中LI定植含量最低，而阴性对照组小鼠回肠组织中未检测出LI。以上结果说明，高代次的LJS19051(第40、60和80代)会降低小鼠回肠组织中LI细菌载量。
生物材料保藏信息
上述所得第80代胞内劳森菌弱毒疫苗菌株，命名为LJS19051-P80，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点中国武汉武汉大学，保藏日期为2022年5月12日，保藏编号为CCTCC NO：V202239。
实施例3猪增生性回肠炎弱毒疫苗(PPEV)的制备
研究表明，LI强毒株经体外传代致弱后可用于研制PPE弱毒疫苗。本研究分别对第10代和第80代LJS19051进行大量培养，随后将收获的第80代LJS19051菌液进行含量测定后，用含5％胎牛血清的DMEM将菌液浓度调整至2×106个/mL，作为PPE弱毒疫苗(PPEV)，4℃冰箱保存，备用。
实施例4 PPE弱毒疫苗免疫保护效果评价
(1)小鼠免疫及攻毒
将40只雌性SPF级ICR小鼠随机分为4组，10只/组。小鼠分组情况如下：阴性对照组(Sentinel组：不免疫也不攻毒)；阳性攻毒对照组(Control组：不免疫但攻毒)；勃林格商品化疫苗对照组(免疫+攻毒)和LJS19051弱毒疫苗试验组(PPEV免疫+攻毒)。Sentinel组和Control组小鼠灌服0.5mL含5％胎牛血清的DMEM；PPEV组每只小鼠人工灌服0.5mL LJS19051(Passage 80)，/>组小鼠灌服等量的商品化弱毒疫苗。免疫后第21天，Control、/>和PPEV组每只小鼠人工灌服0.5mL第10代的LJS19051，Sentinel组灌服等体积含5％胎牛血清的DMEM，攻毒后每天观察小鼠的健康状态，每隔3天对小鼠进行称重，并记录小鼠体重。结果如图5所示，与Control相比，PPEV组和/>组均可提高小鼠生长速度，且PPEV组小鼠生长速度显著高于商品化疫苗/>组，以上结果说明本发明研制的PPEV疫苗在一定程度上可提高小鼠生长速度。
(3)粪便排菌量检测
本研究分别采集攻毒后第0、7、14和21天各组小鼠粪便，采用荧光定量PCR法检测各组小鼠粪便排菌水平。结果如图6所示，与攻毒对照组相比，PPEV和免疫后均可显著降低小鼠粪便排菌量，且PPEV组粪便中LI含量显著低于/>商品化疫苗组，该结果说明PPEV能够降低攻毒小鼠粪便中LI细菌载量。
(4)血清抗体水平检测
为评估PPEV疫苗免疫后对免疫小鼠体液免疫应答水平的影响，本研究采用间接ELISA法对攻毒后第0,7,14和21天各组小鼠血清中LI抗体水平进行检测。结果如图7所示，与Control组相比，攻毒后PPEV和免疫组小鼠血清中血清中LI抗体水平显著升高。上述结果说明，LI弱毒疫苗PPEV能够刺激小鼠产生IgG。
(5)H&E染色
攻毒后第21天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，将回肠组织经福尔马林固定后委托武汉皮诺飞生物科技有限公司进行H&E染色，并根据肠上皮细胞增生严重程度对各组小鼠回肠组织进行评分：0-无增生；1-轻度增生；2-中度增生；3-严重增生。结果发现，攻毒后第21天，阳性攻毒对照组小鼠回肠隐窝肠上皮细胞严重增生，形成多个细胞层，而PPEV疫苗和疫苗免疫组小鼠回肠组织无明显病变，上述结果说明，PPEV能够抵抗LI的感染，使小鼠回肠组织免受病理损伤(图8)。
(6)小鼠回肠组织细菌载量测定
攻毒后第21天，采用颈椎脱臼法无菌取各组小鼠回肠组织，经福尔马林固定后以LI Omp2蛋白单克隆抗体4D9为一抗，委托武汉皮诺飞生物科技有限公司进行免疫荧光染色，分析各组小鼠回肠组织中细菌载菌。结果显示，在阳性攻毒对照组、PPEV免疫组和免疫组小鼠回肠隐窝肠上皮细胞胞质中均可检测到LI，但发现PPEV和/>免疫组小鼠回肠组织中LI含量显著减少(图9)，该结果说明本研究研制的PPEV疫苗和商品化疫苗/>均能够显著降低回肠组织中LI载量。
(7)分泌型IgA含量测定
IgA在抵御肠道病原体感染、调节共生菌以及维持肠道免疫稳态方面发挥重要作用。为进一步评价本发明制备的弱毒疫苗免疫小鼠后能否刺激sIgA产生。攻毒后第21天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，3只/组。取小鼠回肠，按小鼠sIgA ELISA检测试剂盒说明书操作，对各组小鼠回肠黏膜中分泌型IgA含量进行检测。结果如图10所示，与阳性攻毒对照组(Control)相比，PPEV和疫苗免疫组小鼠回肠组织中sIgA含量显著升高，该结果说明和/>疫苗一样，PPEV弱毒疫苗也能够诱导小鼠产生黏膜免疫应答。
(8)小鼠血清中IFN-γ含量测定
IFN-γ是由Th-1型T细胞介导的重要细胞因子，它可由肠黏膜中的多种细胞分泌，包括CD4+或CD8+T细胞。细胞免疫在LI感染过程中起重要作用。分别于攻毒后第0、7、14和21天制备各组小鼠血清。使用小鼠γ干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中IFN-γ含量，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。研究发现，与Sentinel组相比，和PPEV免疫攻毒后均能够显著提高小鼠血清中IFN-γ含量，且在攻毒后第21天含量达到峰值，而阳性攻毒对照组(Control)攻毒后第14天和第21天血清中IFN-γ含量虽有所升高，但均低于疫苗免疫组。上述结果说明，与德国勃林格商品化弱毒疫苗一样，PPEV也能够诱导小鼠产生细胞免疫应答(图11)。
(9)肠上皮屏障通透性分析
为评价PPEV疫苗对小鼠肠上皮屏障通透性的影响，在攻毒后第21天，给小鼠灌服400mg/kg bw的4kDa FITC标记的葡聚糖，4h后采集抗凝血，离心收集血浆，加入等体积PBS后，100μL/孔加入全黑96孔细胞培养板中，使用荧光酶标仪判读结果。吸光值越大，说明小鼠肠黏膜屏障通透性越大，肠黏膜屏障受损越严重。研究发现，与阳性攻毒对照组(Control)相比，PPEV免疫攻毒后对FITC-葡聚糖(4kDa)的渗透性显著下降(图12A)；进一步研究发现，PPEV组小鼠回肠组织中紧密链接蛋白ZO-1和Occludin转录水平显著上调(图12B)；蛋白免疫印迹分析发现，PPEV免疫攻毒后小鼠回肠组织中紧密连接蛋白Occludin以及杯状细胞标志物MUC2蛋白表达水平显著上调(图12C)，以上结果说明PPEV免疫后对LI感染引起的小鼠肠黏膜屏障功能破坏具有保护作用。
(10)PPEV对小鼠肠道抗氧化水平的影响
攻毒后第21天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取新鲜回肠组织，分别按超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化(MDA)检测试剂盒说明书操作，检测各组小鼠回肠组织中SOD活性及MDA含量。本研究通过检测攻毒后第21天小鼠回肠组织中SOD活性和MDA含量评价疫苗对小鼠肠组织抗氧化能力的影响。结果如图13所示，与阳性攻毒对照组(Control)相比，PPEV免疫攻毒后小鼠肠组织中SOD活性显著升高(图13A)，丙二醛MDA含量显著下降(图13B)，与商品化弱毒疫苗免疫攻毒后无显著差异，以上结果表明PPEV免疫后对LI感染引起的肠道氧化应激具有缓解作用。
(11)消化吸收酶活性测定
本发明通过检测攻毒后第21天各组小鼠回肠组织中与消化(α-AMS和LPS)、吸收(AKP)相关酶活性来反应PPEV免疫攻毒后对小鼠肠道消化与吸收功能的影响。结果如图14所示，与阳性攻毒对照组(Control)相比，PPEV免疫攻毒后小鼠回肠组织中α-AMS和AKP活性显著升高，而LPS活性也显著高于Control组；商品化弱毒疫苗免疫组和PPEV疫苗免疫组中3种酶活性无显著差异，以上结果说明PPEV疫苗在一定程度上能够改善由LI感染引起的小鼠肠道消化与吸收功能的下降。
综上所述，本发明所提出的一种猪回肠炎弱毒疫苗，安全性高，本发明制备的疫苗将为PPE的有效防控提供新的有效手段。
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (8)

1.一种胞内劳森菌弱毒疫苗菌株，其特征在于，所述胞内劳森菌弱毒疫苗菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，命名为LJS19051-P80，保藏日期为2022年5月12日，保藏编号为CCTCC NO：V202239。
2.权利要求1所述的胞内劳森菌弱毒疫苗菌株在制备预防动物感染胞内劳森菌的药物中的应用。
3.权利要求1所述的胞内劳森菌弱毒疫苗菌株在制备预防猪感染胞内劳森菌的药物中的应用。
4.权利要求1所述的胞内劳森菌弱毒疫苗菌株在制备预防猪增生性回肠炎的药物中的应用。
5.一种胞内劳森菌弱毒疫苗，其特征在于，其有效成分为权利要求1所述的胞内劳森菌弱毒疫苗菌株。
6.权利要求5所述的胞内劳森菌弱毒疫苗在制备预防动物感染胞内劳森菌的药物中的应用。
7.权利要求5所述的胞内劳森菌弱毒疫苗在制备预防猪感染胞内劳森菌的药物中的应用。
8.权利要求5所述的胞内劳森菌弱毒疫苗在制备预防猪增生性回肠炎的药物中的应用。
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