CN109010331B

CN109010331B - 茶多酚在防治蓝耳病中的应用

Info

Publication number: CN109010331B
Application number: CN201810764713.3A
Authority: CN
Inventors: 周海鹏; 郭春和; 刘湘川; 姚康; 白杨
Original assignee: Guangzhou Zhongnongda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Zhongnongda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2038-07-12
Also published as: CN109010331A

Abstract

本发明公开了茶多酚在防治蓝耳病中的应用。本发明首次通过各个层面的实验研究证明了茶多酚对蓝耳病病毒，包括对高致病型毒株HP‑PRRSV，具有显著的抗病毒作用，为研制抗蓝耳病的新型药物奠定了基础。而且，已验证茶多酚在细胞水平上对细胞无毒性，且具有强抗氧化能力，无毒副作用，无异味等特点，可口服，对机体无刺激、安全无毒性，无三致效应，不会引起药物残留，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子，为茶多酚对蓝耳病病毒的抗病毒药物的研发提供了先决条件，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景，且茶多酚具有诸多的优点，应用基础广泛，为其在畜牧业使用奠定了安全基础。

Description

茶多酚在防治蓝耳病中的应用

技术领域

本发明属于兽用医药技术领域。更具体地，涉及茶多酚在防治蓝耳病中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse，PRRSV）引起，PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。

2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome viruse，HP-PRRSV），目前，高致病性蓝耳病（Highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS）是对养猪业损害最大的疾病之一，由于该病毒具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、病毒血症维持时间长等特点，目前尚没有很好的疫苗和药物可以防控蓝耳病。

PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。目前PRRS防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点：（1）需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；（2）不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；（3）产生完全免疫力需要2～3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；（4）存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有猪蓝耳病防治技术的缺陷和不足，提供一种新的能够防治蓝耳病的物质选择，即茶多酚。本发明研究发现，茶多酚对PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是针对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

本发明的目的是提供茶多酚在制备抗PRRSV病毒药物中的应用。

本发明另一目的是提供茶多酚在制备防治蓝耳病药物中的应用。

本发明的再一目的是提供一种防治蓝耳病的药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首次研究发现茶多酚对蓝耳病病毒具有显著的抗病毒作用，具体地本发明通过HP-PRRSV不同感染复数、感染时间分析茶多酚对HP-PRRSV抗病毒作用，利用Western-Blot、qRT-PCR、免疫荧光等技术通过各个层面的实验证明了，茶多酚能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制，具有显著的抗HP-PRRSV病毒作用，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

因此，以下应用及药物均应在本发明的保护范围之内：

茶多酚在制备抗PRRSV病毒的药物中的应用。

茶多酚在制备抗高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV的药物中的应用。

茶多酚在制备预防和/或治疗蓝耳病的药物中的应用。

茶多酚在制备预防和/或治疗由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的蓝耳病的药物中的应用。

一种抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病的药物，含有有效量的茶多酚。

优选地，所述药物中茶多酚的质量占比为20%～60%。

更优选地，所述药物中茶多酚的质量占比为24%～48%。

更优选地，所述药物中茶多酚的质量占比为24%～36%。

具体地，所述药物中茶多酚由6种成分组成，分别为表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表儿茶素（EC）、DL-C、EGCG 的表型异构体（GCG）。为了提高茶多酚抗PRRSV活性，本发明所用茶多酚由高纯度的多种成分组成，安全、无毒，无三致效应，可口服，对机体无刺激、无毒性，不会引起药物残留。

进一步地，所述茶多酚的各组分质量比为EGCG：EGC：ECG：EC：DL-C：GCG = 30～60：10～20：5～12：3～8：0.1～1：0.5～2。

更进一步地，所述茶多酚的各组分质量比为EGCG：EGC：ECG：EC：DL-C：GCG = 40～45：15～18：8～9：4.5～5：0.5～0.8：1～1.5。

更具体地，实施例中所用茶多酚的各组分质量比为EGCG：EGC：ECG：EC：DL-C：GCG =42.7：16.5：8.5：4.7：0.6：1.3。

另外，上述药物还可包含药学上可接受的载体。该药物可制备成不同的所需剂型，如注射制剂或口服制剂等。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次证明了茶多酚的抗PRRSV病毒的作用。本发明通过多种方法研究证实了茶多酚对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，尤其是对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，为研制抗蓝耳病的新型药物奠定了基础，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

而且，茶多酚具有以下优点：抗癌、抗血栓、抗衰老、防治脑中风、提高免疫力，美容护肤、降脂助消化等作用，已在糕点、乳制品、饮料生产、水果蔬菜保鲜、畜肉制品、食用油贮藏等方面广泛应用，为其在畜牧业使用奠定了安全基础。另外，已验证茶多酚在细胞水平上对细胞无毒性，且其具有强抗氧化能力，无毒副作用，无异味等特点，可口服，对机体无刺激、安全无毒性，无三致效应，不会引起药物残留，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子，为茶多酚对蓝耳病病毒的抗病毒药物的研发提供了先决条件，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景，而且为茶多酚的推广应用提供了理论基础。

附图说明

图1为AlamarBlue检测茶多酚对Marc-145细胞毒性。

图2为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞，经50 μg/ml 茶多酚作用36 h后，Western blot检测N蛋白表达水平。

图3为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞，经50 μg/ml 茶多酚作用36 h后，qRT-PCR检测N蛋白表达水平。

图4为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞，经50 μg/ml 茶多酚作用36 h后，免疫荧光检测N蛋白表达水平。

图5为HP-PRRSV不同感染时间的Marc-145细胞，经50 μg/ml 茶多酚作用36 h后，Western blot检测N蛋白表达水平。

图6为HP-PRRSV不同感染时间的Marc-145细胞，经50 μg/ml 茶多酚作用36 h后，qRT-PCR检测N蛋白表达水平。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。

实施例1 茶多酚的细胞毒性

1、材料

（1）茶多酚：由广州中农大生物科技有限公司提供。

该茶多酚产品由EGCG、EGC、ECG、EC、DL-C、GCG组成，各组分配比为42.7：16.5：8.5：4.7：0.6：1.3。

（2）AlamarBlue（购自Invitrogen公司）作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。

2、试验方法

用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞或者PAMs细胞至60～70%，弃去培养液，分别加入含茶多酚倍比稀释的营养液作用36 h，设定PBS对照组，然后加入10%（v/v）比例AlamarBlue继续培养3 h，使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作茶多酚细胞毒性图（如附图1所示）。

以PBS对照组细胞活性作为100%，倍比稀释的茶多酚处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值，即为不同浓度下茶多酚相对细胞活性。

3、结果

由附图1可知，当茶多酚浓度为100 μg/ml及以下时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100%。故后续实验茶多酚浓度不高于100 μg/ml。

实施例2 不同感染复数、感染时间茶多酚抗病毒试验

以HP-PRRSV病毒为例研究茶多酚的抗蓝耳病病毒作用。

1、HP-PRRSV不同感染复数茶多酚抗病毒试验

（1）Western blot检测

在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同感染复数MOI接毒HP-PRRSV，同时加入茶多酚（终浓度50 μg/ml）培养36 h，并设不加茶多酚对照组，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot。

结果如附图2、图3所示：茶多酚能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白及N基因表达，且随着感染复数MOI升高，也具有显著抑制效果。表明茶多酚能够明显抑制病毒蛋白表达。

（2）免疫荧光检测

在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同感染复数MOI接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养5 h，PBS洗3遍，将茶多酚（终浓度50 μg/ml）加入细胞37℃培养36 h，并设PBS对照组，PBS洗3遍，在荧光显微镜下观察茶多酚抗病毒效果。

结果如附图4所示：茶多酚能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着感染复数MOI升高，也具有显著抑制效果。进一步表明了茶多酚能够明显抑制病毒蛋白表达。

2、HP-PRRSV不同感染时间茶多酚抗病毒试验

在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI = 0.1接毒HP-PRRSV，同时加入茶多酚（终浓度50 μg/ml）培养0、6、12、24、36、48 h，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测。结果如附图5、图6所示：茶多酚能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白和N基因表达，且随着感染时间升高，也具有显著抑制效果。表明茶多酚能够明显抑制病毒蛋白表达。

以上结果表明，茶多酚具有显著的抗HP-PRRSV病毒作用，能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.茶多酚在制备抗高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV的药物中的应用，其特征在于，所述茶多酚由EGCG、EGC、ECG、EC、DL-C、GCG组成，各组分质量比为EGCG：EGC：ECG：EC：DL-C：GCG＝30～60：10～20：5～12：3～8：0.1～1：0.5～2。

2.茶多酚在制备预防和/或治疗由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的蓝耳病的药物中的应用，其特征在于，所述茶多酚由EGCG、EGC、ECG、EC、DL-C、GCG组成，各组分质量比为EGCG：EGC：ECG：EC：DL-C：GCG＝30～60：10～20：5～12：3～8：0.1～1：0.5～2。

3.一种抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病的药物，其特征在于，含有有效量的茶多酚，所述茶多酚由EGCG、EGC、ECG、EC、DL-C、GCG组成，各组分质量比为EGCG：EGC：ECG：EC：DL-C：GCG＝30～60：10～20：5～12：3～8：0.1～1：0.5～2。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述茶多酚的质量占比为20％～60％。