CN111956661A - 二氧化氯在防治非洲猪瘟中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二氧化氯在防治非洲猪瘟中的应用。本发明首次通过各个层面、各个阶段的实验证明了二氧化氯对非洲猪瘟病毒具有显著的抗病毒、杀病毒作用，为研制抗非洲猪瘟的新型药物奠定了基础；而且，本发明使用的二氧化氯是指纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液，安全、无毒，无三致效应，可口服或注射，对机体无刺激、无毒性，不会引起药物残留，有望成为新型的防治非洲猪瘟的生物活性物质，为二氧化氯在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物的研发提供了先决条件，在非洲猪瘟的防治方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于兽用医药技术领域。更具体地，涉及二氧化氯在防治非洲猪瘟中的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染家猪和野猪引起的急性、热性、高度接触性传染病，急性型表现为高热、精神沉郁、厌食、皮肤发绀、脾脏肿大出血，发病率和死亡率高达100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。1921年，ASF最初发现于肯尼亚，上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲流行。自2018年8月非洲猪瘟进入中国以来，该病迅速席卷全国，造成巨大的经济损失，全国能繁母猪急剧下降，促使我国养猪业及动保相关企业发生颠覆性改变。
ASFV对环境的抵抗力极强，病毒存活时间与其所处的介质、温度和湿度密切相关。在自然条件下，ASFV在感染猪的污染物中可存活1个月，在腐败的血液或冷鲜肉中可存活近4个月，在冷藏的猪血液中可存活18个月，在冰冻猪肉或肉制品中可以存活数年至数十年，在未熟的肉品、腌肉、泔水中可长时间存活。ASF的潜伏期一般为3-19天，急性型一般3-4天，OIE法典规定的潜伏期为15天。人工接种ASFV强毒株的潜伏期为1-5天，潜伏期的长短还与病毒的感染量、病毒的毒力、病毒侵入的途径、猪自身的耐受力等因素有关。根据毒力和临床表现差异，可将ASF分为最急性型(强毒株)、急性型(强毒株)、亚急性型(中等毒力毒株)和慢性型(弱毒株)。最急性型和急性型发病率和死亡率可达100％。感染ASFV的家猪(感染猪、发病猪、耐过猪)及其产品、野猪、软蜱均为重要的传染源。ASF主要通过接触传播，包括猪与猪、猪与人、猪与污染的物品(饲料、水源、运猪车、工具等)的直接或间接接触。当病毒量足够高时(急性感染ASFV的猪)，可通过空气传播病毒。但是，目前ASFV感染机制、免疫应答尚不清楚。
现有技术公开了非洲猪瘟防控消毒技术要点，该技术中提到了在猪瘟防控时，二氧化氯产品消毒剂是高水平消毒剂(https://wenku.baidu.com/view/736aabb5fe00bed5b9f3f90f76c66137ef064f31.html；《非洲猪瘟防控清洁消毒技术要点》，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所牵头编制，2019年9月)。但是，市面上的二氧化氯产品主要是以亚氯酸盐的形式存在，经活化剂活化后，才能产生含有次氯酸钠的二氧化氯，而且活化后生成的二氧化氯含量不稳定，杀菌消毒能力与纯二氧化氯溶液有很大差距；更重要的是，这种类型的产品二氧化氯纯度低，含有大量的次氯酸钠与氯气，具有致癌、致畸、致突变的三致效应。因此，亟需提供一种安全、无毒，无三致效应的非洲猪瘟防控方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有非洲猪瘟防治技术的缺陷和不足，提供二氧化氯在防治非洲猪瘟中的应用。本发明提供了一种新的能够防治非洲猪瘟的物质-二氧化氯，研究发现二氧化氯能够明显抑制ASFV p30蛋白表达，二氧化氯前处理(先加二氧化氯后接毒)、共处理(二氧化氯与ASFV同时加入)以及后处理(先接毒后加二氧化氯)均能够显著抑制ASFV感染和复制，具有直接杀ASFV的作用，对非洲猪瘟病毒有很好的抗病毒作用，在非洲猪瘟的防治方面具有很好的应用前景。
本发明的目的是提供二氧化氯在抗非洲猪瘟病毒或防治非洲猪瘟中的应用。
本发明另一目的是提供二氧化氯在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先通过ASFV不同感染复数、浓度分析二氧化氯对ASFV抗病毒作用，然后通过荧光定量PCR、免疫荧光方法研究二氧化氯与ASFV在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)上不同处理顺序二氧化氯抗病毒作用，接着分析二氧化氯对ASFV直接杀病毒作用，最后通过研究其在病毒吸附过程中作用阐述其抗病毒机制；通过各个层面、各个阶段的实验，证明了本发明使用的二氧化氯能够显著抑制ASFV感染和复制，有望成为新型的防治非洲猪瘟的生物活性物质。因此，以下应用均应在本发明保护范围之内：
二氧化氯在抗非洲猪瘟病毒或防治非洲猪瘟中的应用；所述二氧化氯是指纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
二氧化氯在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的应用；所述二氧化氯是指纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
与其他市面上的二氧化氯产品(市面上其他的二氧化氯产品主要是以亚氯酸盐的形式存在，经活化剂活化后，才能产生含有次氯酸钠的二氧化氯，而且活化后生成的二氧化氯含量不稳定，杀菌消毒能力与纯二氧化氯溶液有很大差距；更重要的是，这种类型的产品二氧化氯纯度低，含有大量的次氯酸钠与氯气，具有致癌、致畸、致突变的三致效应)相比，本发明使用的纯度为95％～99.9％二氧化氯溶液具有显著的优势，无三致效应(致癌、致畸、致突变)，高效、安全。
更优选地，所述二氧化氯是指纯度为98％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。目前生产二氧化氯最大的瓶颈是纯度不够，现在市面上的二氧化氯纯度一般为70％左右，含有太多杂质对杀灭病毒有很大的干扰作用，造成消毒效果大大下降；更重要的是，二氧化氯纯度为70％左右时会有一定的毒副作用，不能口服。因此，纯度越高的二氧化氯杀灭非洲猪瘟病毒的效果越好，毒副作用越小。
更进一步优选地，所述二氧化氯是指纯度为99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为20％～60％。二氧化氯溶液的质量浓度是指二氧化氯气体溶于水后，溶液中二氧化氯气体的质量浓度。
更优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24％～48％。
更进一步优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24％～36％。
再进一步优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为30％。
另外，本发明还提供了一种预防和/或治疗非洲猪瘟的药物，含有有效量的二氧化氯；所述二氧化氯是指纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
优选地，所述二氧化氯是指纯度为98％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
更优选地，所述二氧化氯是指纯度为99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为20％～60％。
更优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24％～48％。
更进一步优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24％～36％。
再进一步优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为30％。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
所述药物的剂型可以制备成不同的所需剂型。优选地，所述药物的剂型为注射制剂或口服制剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次证明了二氧化氯的抗ASFV作用，本发明通过多种方法研究发现了二氧化氯对ASFV有很好的抗病毒效果，并通过前处理(先加二氧化氯后接毒)、共处理(二氧化氯与ASFV同时加入)以及后处理(先接毒后加二氧化氯)实验充分证明了二氧化氯抗ASFV活性，为研制抗非洲猪瘟的新型药物奠定了基础，在非洲猪瘟的防治方面具有很好的应用前景。
本发明还对二氧化氯抗ASFV作用的机制进行了研究，在病毒吸附过程阐述了二氧化氯抗病毒机制，为二氧化氯在抗非洲猪瘟病毒或防治非洲猪瘟中的应用奠定了坚实的基础。
另外，本发明使用的二氧化氯是指纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液，安全、无毒，无三致效应，可口服或注射，对机体无刺激、无毒性，不会引起药物残留，有望成为新型的防治非洲猪瘟的生物活性物质，为二氧化氯在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物的研发提供了先决条件，而且为二氧化氯的推广应用提供了理论基础。
附图说明
图1为AlamarBlue检测二氧化氯对PAMs毒性结果图。
图2为ASFV不同感染复数MOI的PAMs经二氧化氯作用36h后的免疫荧光检测ASFVp30蛋白表达水平结果图。
图3为ASFV感染的PAMs经不同浓度的二氧化氯作用36h后的免疫荧光检测ASFVp30蛋白表达水平结果图。
图4为二氧化氯前处理、共处理、后处理对ASFV p30mRNA表达影响结果图。
图5为二氧化氯前处理、共处理、后处理对ASFV p30蛋白表达影响结果图。
图6为ASFV与二氧化氯在37℃培养箱中分别孵育1h、4h加到PAMs上培养24h后免疫荧光检测ASFV p30蛋白表达水平结果图。
图7为ASFV与二氧化氯在37℃培养箱中分别孵育1h、4h加到PAMs上培养24h后荧光定量PCR检测ASFV p30mRNA表达水平结果图。
图8为ASFV与不同浓度二氧化氯在37℃培养箱中孵育2h加到PAMs上培养24h后免疫荧光检测ASFV p30蛋白表达水平结果图。
图9为ASFV与不同浓度二氧化氯在37℃培养箱中孵育2h加到PAMs上培养24h后荧光定量PCR检测ASFV p30mRNA表达水平结果图。
图10为ASFV吸附抑制实验中免疫荧光检测ASFV p30蛋白表达水平结果图。
图11为ASFV吸附抑制实验中荧光定量PCR检测ASFV p30mRNA表达水平结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明以下实施例的统计学分析：所有实验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
实施例1二氧化氯的细胞毒性
1、材料
二氧化氯溶液(纯度为99.9％的二氧化氯气体溶于水)，由广州远华生物科技有限公司提供)。
AlamarBlue(购自Invitrogen公司)作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。
2、实验方法
用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养PAMs细胞至60％～70％，弃去培养液，分别加入含二氧化氯倍比稀释的营养液(0、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml)作用36h，设定PBS对照组，然后加入10％(v/v)比例AlamarBlue继续培养3h，使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作二氧化氯细胞毒性图。
以PBS对照组细胞活性作为100％，倍比稀释的二氧化氯处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下二氧化氯相对细胞活性。
3、结果
AlamarBlue检测二氧化氯对PAMs毒性结果如图1所示，可以看出，当二氧化氯浓度为80μg/ml及以下时，其对PAMs没有毒性，细胞活性100％；因此，后续实验二氧化氯浓度不高于80μg/ml。
实施例2不同感染复数二氧化氯抗病毒实验
1、实验方法
在含10％胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养PAMs至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同感染复数MOI(1、1.5、2)接毒ASFV，同时加入二氧化氯(40μg/ml)培养36h(ASFV组)，并设不加二氧化氯对照组(DAPI组)，PBS洗3遍，免疫荧光检测。
2、实验结果
ASFV不同感染复数MOI的PAMs经二氧化氯作用36h后的免疫荧光检测ASFV p30蛋白表达水平结果如图2所示，可以看出，二氧化氯能够明显抑制ASFV p30蛋白表达，且随着感染复数MOI升高，也具有显著抑制效果；表明二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。
实施例3不同浓度二氧化氯抗病毒实验
1、实验方法
在含10％胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养PAMs至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝1接毒ASFV，同时加入不同浓度二氧化氯(20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)培养24h，PBS洗3遍，免疫荧光检测。
2、实验结果
ASFV感染的PAMs经不同浓度的二氧化氯作用36h后的免疫荧光检测ASFV p30蛋白表达水平结果如图3所示，可以看出，二氧化氯能够明显抑制ASFV p30蛋白表达，且随着二氧化氯浓度升高，抑制效果更显著；表明二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达，且二氧化氯的浓度会影响其抑制效果。
实施例4二氧化氯前处理、共处理、后处理抗病毒实验
1、前处理实验
在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养PAMs至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，二氧化氯加入细胞培养3h，然后以感染复数MOI＝1接毒ASFV，在2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36h，PBS洗3遍，收集细胞免疫荧光和荧光定量PCR检测二氧化氯抗病毒效果。
2、共处理实验
在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养PAMs至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，二氧化氯加入细胞，同时以感染复数MOI＝1接毒ASFV，在2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃培养36h，PBS洗3遍，收集细胞免疫荧光和荧光定量PCR检测二氧化氯抗病毒效果。
3、后处理实验
在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养PAMs至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝1接毒ASFV培养3h，然后二氧化氯加入细胞，在2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36h，PBS洗3遍，收集细胞免疫荧光和荧光定量PCR检测二氧化氯抗病毒效果。
4、实验结果
二氧化氯前处理、共处理、后处理对ASFV p30mRNA表达影响结果如图4所示，二氧化氯前处理、共处理、后处理对ASFV p30蛋白表达影响结果如图5所示，从图4和图5可以看出，二氧化氯能够明显抑制ASFV感染和p30蛋白表达；表明二氧化氯前处理、共处理、后处理均能够显著抑制ASFV感染和复制。
实施例5二氧化氯直接杀病毒活性
1、实验方法
在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养PAMs至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次。ASFV分别与不同浓度二氧化氯(40μg/ml、80μg/ml)在37℃培养箱中孵育2h后，将孵育后的混合液体加入PAMs，在2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养24h，PBS洗3遍；或将ASFV与二氧化氯孵育1h或4h，然后将混合液加入PAMs，继续培养24h，PBS洗3遍；最终收集细胞做免疫荧光和荧光定量PCR检测二氧化氯抗病毒效果。
2、实验结果
ASFV与二氧化氯在37℃培养箱中分别孵育1h、4h加到PAMs上培养24h后免疫荧光检测ASFV p30蛋白表达水平结果和荧光定量PCR检测ASFV p30mRNA表达水平结果分别如图6和图7所示，ASFV与不同浓度二氧化氯在37℃培养箱中孵育2h加到PAMs上培养24h后免疫荧光检测ASFV p30蛋白表达水平结果和荧光定量PCR检测ASFV p30mRNA表达水平结果分别如图8和图9所示，从图6-9可以看出，二氧化氯能够明显抑制ASFV感染和p30蛋白表达；表明二氧化氯具有直接杀非洲猪瘟病毒的作用。
实施例6二氧化氯的抗病毒机制研究-ASFV吸附抑制实验
本实施例的目的是研究二氧化氯是否通过影响ASFV吸附PAMs从而达到抗ASFV目的。
1、实验方法
在PAMs汇合度70％的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI＝1接毒ASFV，并加入二氧化氯，4℃孵育2h。孵育完后，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5％CO2、37℃培养箱中继续培养24h，弃去培养液，PBS洗3次，收集细胞荧光定量PCR和免疫荧光检测二氧化氯抗病毒效果。
2、实验结果
ASFV吸附抑制实验中免疫荧光检测ASFV p30蛋白表达水平结果和荧光定量PCR检测ASFV p30mRNA表达水平结果分别如图10和图11所示，从图10和图11可以看出，二氧化氯能够明显抑制ASFV感染和p30蛋白表达；表明二氧化氯能够显著抑制ASFV复制，说明在病毒吸附过程中，二氧化氯能够显著地抑制其吸附于细胞表面。
本发明还做了安全性测试实验，结果显示：给猪灌服二氧化氯溶液(纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得)3个月后，与对照组相比，猪的毛色、精神状态和采食量均表现正常；将猪屠宰供人食用7天后，人也无明显毒副作用。说明本发明所用的二氧化氯溶液安全，无明显的毒副作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.二氧化氯在抗非洲猪瘟病毒或防治非洲猪瘟中的应用；所述二氧化氯是指纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
2.二氧化氯在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的应用；所述二氧化氯是指纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述二氧化氯是指纯度为98％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为20％～60％。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24％～48％。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24％～36％。
7.一种预防和/或治疗非洲猪瘟的药物，其特征在于，含有有效量的二氧化氯；所述二氧化氯是指纯度为95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为20％～60％。
9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
10.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射制剂或口服制剂。
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