CN109745556A - 一种疫苗佐剂及其应用及猪繁殖与呼吸综合征疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物医药领域，提供了一种疫苗佐剂及其应用及猪繁殖与呼吸综合征疫苗，该疫苗佐剂为将小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖、氢氧化铝胶和稳定剂加入去离子水中得到的水溶性悬液；所述水溶性悬液中的小分子肽的浓度为0.5~2.5mg/mL，二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为1~2.5g/mL，稳定剂的浓度为0.5~1.5g/mL；所述氢氧化铝胶占所述水溶性悬液的质量份数为10%~20%。本发明的疫苗佐剂可以诱导巨噬细胞中M1和M2分化比例，可以杀灭不同类型的PRRSV毒株；联合猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）灭活抗原可以提高机体的细胞免疫，诱导干扰素，减少PRRSV产生的免疫抑制。从而，较快的产生高含量的中和抗体，维持时间长，并能减少不同毒株的病毒血症。

Description

一种疫苗佐剂及其应用及猪繁殖与呼吸综合征疫苗

技术领域

本发明属于医药生物领域，尤其涉及一种疫苗佐剂及其应用及猪繁殖与呼吸综合征疫苗。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS，Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome)是一种猪群中的高度接触性传染病，病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒，该病毒的主要宿主是自然界中的家猪和野猪。不同年龄、品种、性别的猪都可以感染PRRSV(PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus)，其中妊娠母猪和哺乳仔猪受害比较严重。除了感染动物以外，公猪的精液也已经被确认为PRRSV的普遍感染源。

目前预防和控制PRRS的常用方法是免疫接种疫苗。世界上常用的PRRS疫苗主要有减毒活疫苗和灭活疫苗。PRRSV减毒活疫苗保护效果明显，但因为PRRSV变异频繁导致了疫苗具有很强的毒株特异性，且存在基因重组和毒力返强的风险。减毒活疫苗在免疫的早期阶段(感染后7～9d)可以检测到强烈的抗PRRSV抗体反应，但早期产生的抗体是非中和性抗体，它们不但不能阻止病毒的感染，还会引起病毒的抗体依赖性增强，而PRRSV特异性中和性抗体在病毒感染后28d才可被检测到，且始终维持在一个较低的水平。减毒活疫苗诱导的细胞免疫反应在14d出现，水平低、增长慢。PRRSV弱毒活疫苗可有效抵御同源野毒株的感染，降低临床疾病的发生率，但其对异源野毒株的保护效果较差。

有研究报道，分别比较了3种商品化疫苗对不同强毒株的保护效力，结果表明弱毒活疫苗免疫后攻毒机体虽不表现明显的临床症状，但并不能阻止病毒在体内增殖扩散；进一步研究表明，选用的3种疫苗均来自于单一的PRRSV毒株，对遗传多样性的野毒株不具保护作用或保护作用有限。对PRRSV致弱活疫苗在控制PRRSV感染猪只的传播散毒和持续性感染等方面的研究表明，即“治疗性疫苗干预”，疫苗免疫后不能阻止野毒株的持续性感染，但对持续性感染同源毒株的猪只数量可显著地降低，对异源毒株感染的保护作用有限。

猪感染PRRSV后表现出发病缓慢、持续时间长的特点，感染数月后的猪体内仍然能够分离到传染性的毒株(Allende et al 2000)。推测病毒持续感染的原因，是因为病毒能在体内不断变异，或者与被感染个体的年龄和遗传因素有关，也与病毒的免疫逃避机制相关。但是研究表明PRRSV在体内变异的发生频率非常低，而病毒的免疫逃避影响宿主对PRRS的体液和细胞免疫应答无效性，导致血液中病毒与抗体长期存在和病毒的持续感染。

PRRSV感染PAM以后，通过抑制I型干扰素介导的免疫应答，将PAM变成适合自身生存的场所。PRRSV利用细胞内的氨基酸核苷酸完成子代病毒的复制，待子代病毒成熟后，通过促进细胞凋亡等方式释放病毒，继续感染其他细胞和器官，造成其他系统和器官的病变，例如病毒血症、淋巴结炎等。PRRSV除了能够通过促进肺泡巨噬细胞凋亡的方式导致细胞数量显著降低，也能够对肺泡巨噬细胞产生的I型干扰素促进分泌的抗病毒因子产生抑制作用，除此以外，PRRSV也能够增强细胞中的炎症细胞因子(IL-1和肿瘤坏死因子)的活性。许多研究发现，PRRSV感染可以增加IL-10基因mRNA和蛋白表达，并通过调节IL-10表达来抑制宿主的免疫应答。因此，肺泡巨噬细胞杀死病毒的能力受到抑制，淋巴结细胞被破坏，黏膜损伤，对疾病的易感性增强。同时，感染的肺泡巨噬细胞或外周血单核细胞调节细胞表面的抗原表达的能力减弱，影响细胞的抗原递呈功能，导致感染猪的血液中的抗体不能及时将病毒从机体中清除，继而导致抗体依赖性增强作用以及病毒血症和持续感染的长期存在。更多关于大群和大龄猪长时间持续感染的试验表明，持续感染的时问甚至能延长至半年。例如，用PRRSV分离株MN-30-100人工感染80只4个月龄猪，感染30-100天后进行PCR检测，结果表明，98％的猪的组织样品，包括扁桃体和机体部分淋巴结都呈现阳性。感染110、120和135天的猪分别有80％、30％和20％呈现阳性结果。另一个相似的试验中，用PRRSV分离株VR-2332人工感染109只两周龄小猪，感染189天后检测，仍有大约10％-30％猪的组织检测呈阳性。由于PRRSV长期潜伏在猪体内的肺泡巨噬细胞，因此采用早期诊断的方法很难检测到病毒。更为严重的是，病毒对机体的免疫抑制反应导致细菌性继发性感染。例如，通过检测221个感染PRRSV的猪样本，结果显示，58％的患病猪在肺部除了PRRSV感染以外，还存在其他细菌感染，主要包括猪链球菌、副猪嗜血杆菌。而且，PRRSV感染可以促进其他病毒例如圆环病毒2型(PCV-2)的增殖，造成多种病原同时感染，增加病情的严重性。PRRSV不仅能够抑制抗PRRSV的特异性抗体的产生，还能抑制其他病毒的特异性抗体产生。例如，仔猪首先感染PRRSV BJ-4毒株，然后接种猪瘟弱毒(PRV)疫苗，那么仔猪产生的猪瘟弱病毒的特异性抗体水平很显著低于单独接种猪瘟疫苗的仔猪阻。

PRRS灭活疫苗虽然安全性好，但仅诱导极微弱的细胞免疫反应，其免疫保护效果不理想。PRRSV免疫逃避，造成猪体的长时间持续带毒感染，是由于PRRSV主要侵蚀机体的巨噬细胞，感染后巨噬细胞当中的M1和M2类型的发生改变，使偏向于M2型细胞分化，该细胞不能杀灭PRRSV，又由于巨噬细胞有“回巢现象”，没有杀灭的PRRSV就回巢到淋巴组织，造成其他淋巴细胞的感染。因此，如何减少PRRSV产生的免疫抑制，从而，较快的产生高含量的中和抗体，维持时间长，并能减少不同毒株的病毒血症，增强疫苗的安全性是PRRS疫苗发展的重要方向。

发明内容

本发明实施例提供一种疫苗佐剂，旨在解决如何减少PRRSV产生的免疫抑制，从而，较快的产生高含量的中和抗体，维持时间长，并能减少不同毒株的病毒血症，增强疫苗的安全性的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种疫苗佐剂，所述疫苗佐剂为将小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖、氢氧化铝胶和稳定剂加入去离子水中得到的水溶性悬液；

所述水溶性悬液中的小分子肽的浓度为0.5～2.5mg/mL，二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为1～2.5g/mL，稳定剂的浓度为0.5～1.5g/mL；

所述氢氧化铝胶占所述水溶性悬液的质量份数为10％～20％。

本发明实施例还提供一种疫苗佐剂的制备方法，包括如下步骤：

按照上述疫苗佐剂的配方称取各组分，备用；

将所述小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖和稳定剂依次加入去离子水中，搅拌混合均匀后，加入所述氢氧化铝胶，搅拌均匀得到所述疫苗佐剂。

本发明实施例还提供一种疫苗佐剂在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。

本发明实施例还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗，所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗由上述的疫苗佐剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原按照预设重量比例混合制备而成。

本发明实施例提供的疫苗佐剂的各组分的功效/作用如下：

小分子肽：尤其是天蚕抗菌肽，具有独特的杀菌、免疫和促生长作用。天蚕抗菌肽是37个氨基酸残基组成的抗菌活性多肽，分子量3.8KD。在免疫功能上，天蚕抗菌肽可以促使巨噬细胞当中的M1和M2类型的发生改变，使偏向于M1型细胞分化，该细胞能快速的杀灭PRRSV，在巨噬细胞“回巢”到淋巴组织，就不会再造成其他淋巴细胞的感染。

氢氧化铝胶：有“储存库效应”和“免疫刺激效应”两种主要机制。铝佐剂吸附抗原后，增加抗原的表面积，并且改变活性基因的构型，从而增强抗原的免疫原性。对小分子量可溶性抗原或半抗原，经胶体颗粒吸附后,可提高抗体产量。此时在接种区域形成了一个抗原贮存库，一方面该处强烈吸引巨噬细胞、树突状细胞、郎罕氏细胞等抗原提呈细胞的识别与内吞，促进T细胞免疫力，并加强T细胞与B细胞的协同作用；另一方面,佐剂可引起注射局部肉芽肿，使抗原在局部组织内的贮存，缓慢释放抗原，延长了抗原递呈细胞APC与T淋巴细胞相互作用的时间，从而提高抗体应答，增强体液免疫。此外，氢氧化铝可活化补体，补体C3b成分不能被EDTA抑制，提示补体活化并不发生在经典或选择性旁路。活化依赖于血纤维与解酶原。

补体因子在B细胞应答中起重要作用，也影响1型和2型免疫应答的平衡。另外氢氧化铝胶的吸附能力和铝的含量有关，优选铝的含量以三氧化二铝计算在1.8％～2.2％。

二乙胺基乙基葡萄糖：作为靶向诱导剂，可以提高抗原递呈细胞的识别和递呈能力。不但可以增强对联合抗原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的识别递呈能力，而且可以增强对双链核酸的识别递呈能力，进一步提升了诱导细胞免疫的能力。

稳定剂：是保持各组分的稳定性，为了保持各组分的微环境稳定。

本发明实施例提供的疫苗佐剂，可调控巨噬细胞M1和M2型细胞的比例，而且使M2型细胞逆转化为M1细胞，M1类型细胞具有较强的杀灭PRRSV能力，从而减少了回巢的巨噬细胞对其他淋巴细胞的感染，而且对所有类型的PRRSV毒株都有杀灭作用，并且联合猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活抗原可以提高机体的细胞免疫，诱导干扰素，减少PRRSV产生的免疫抑制。从而，较快的产生高含量的中和抗体，维持时间长，并能减少不同毒株的病毒血症。

附图说明

图1是本发明实施例1的疫苗佐剂试验组中的组1在攻毒后第3日病毒血症PCR结果；

图2是本发明实施例提供的本发明实施例2的疫苗佐剂试验组中的组1在攻毒后第3日病毒血症PCR结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的疫苗佐剂，可调控巨噬细胞M1和M2型细胞的比例，而且使M2型细胞逆转化为M1细胞，M1类型细胞具有较强的杀灭PRRSV能力，从而减少了回巢的巨噬细胞对其他淋巴细胞的感染，而且对所有类型的PRRSV毒株都有杀灭作用，并且联合猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活抗原可以提高机体的细胞免疫，诱导干扰素，减少PRRSV产生的免疫抑制。从而，较快的产生高含量的中和抗体，维持时间长，并能减少不同毒株的病毒血症。

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步的说明。

实施例1：

一种疫苗佐剂，将小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖和稳定剂依次加入去离子水中，以最大转速搅拌不起泡为宜，混匀后再加入氢氧化铝胶，得到的水溶性悬液(体积为2mL)，该水溶性悬液中的小分子肽的浓度为1.5mg/mL，二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为1.5g/mL，稳定剂的浓度为1g/mL；氢氧化铝胶占所述水溶性悬液的质量份数为10％。

本实施例的疫苗佐剂pH值为6.8。

本实施例的猪繁殖与呼吸综合征疫苗是由上述疫苗佐剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原按照1:1比例混合制备而成。

实施例2：

一种疫苗佐剂，将小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖和稳定剂依次加入去离子水中，以最大转速搅拌不起泡为宜，混匀后再加入氢氧化铝胶，得到的水溶性悬液(体积为2mL)，该水溶性悬液中的小分子肽的浓度为0.5mg/mL，二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为2.5g/mL，稳定剂的浓度为0.5g/mL；氢氧化铝胶占所述水溶性悬液的质量份数为10％。

本实施例的疫苗佐剂pH值为7.8。

本实施例的猪繁殖与呼吸综合征疫苗是由上述疫苗佐剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原按照1:1比例混合制备而成。

实施例3：

一种疫苗佐剂，将小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖和稳定剂依次加入去离子水中，以最大转速搅拌不起泡为宜，混匀后再加入氢氧化铝胶，得到的水溶性悬液(体积为2mL)，该水溶性悬液中的小分子肽的浓度为2.5mg/mL，二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为1g/mL，稳定剂的浓度为1.5g/mL；氢氧化铝胶占所述水溶性悬液的质量份数为20％。

本实施例的疫苗佐剂pH值为7.8。

本实施例的猪繁殖与呼吸综合征疫苗是由上述疫苗佐剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原按照1:1比例混合制备而成。

实施例4：

一种疫苗佐剂，将小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖和稳定剂依次加入去离子水中，以最大转速搅拌不起泡为宜，混匀后再加入氢氧化铝胶，得到的水溶性悬液(体积为2mL)，该水溶性悬液中的小分子肽的浓度为2mg/mL，二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为2g/mL，稳定剂的浓度为1.25g/mL；氢氧化铝胶占所述水溶性悬液的质量份数为15％。

本实施例的疫苗佐剂pH值为7.2。

本实施例的猪繁殖与呼吸综合征疫苗是由上述疫苗佐剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原按照1:1比例混合制备而成。

实施例5：

一种疫苗佐剂，将小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖和稳定剂加入去离子水中，以最大转速搅拌不起泡为宜，混匀后再加入氢氧化铝胶，得到的水溶性悬液(体积为2mL)，该水溶性悬液中的小分子肽的浓度为1mg/mL，二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为1.25g/mL，稳定剂的浓度为0.75g/mL；氢氧化铝胶占该水溶性悬液的质量份数为12％。

本实施例的疫苗佐剂pH值为6.8。

本实施例的猪繁殖与呼吸综合征疫苗是由上述疫苗佐剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原按照1:1比例混合制备而成。

为进一步说明本发明的技术效果，以下对本发明实施例提供的疫苗佐剂的使用方法、性能评价进行详细说明：

一、使用方法

将本发明实施例提供的疫苗佐剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原按照重量比例为1:1进行混合后，形成猪繁殖与呼吸综合征疫苗使用。

二、性能评价

对本发明实施例1～5提供的疫苗佐剂进行下述性能评价：

1、安全性试验：

随机选择健康的35～45日龄的断奶仔猪25头，平均分为5组，每组5头，分别给每组仔猪注射采用本发明实施例1～5提供的疫苗佐剂(4mL/头)(正常使用剂量为2mL/头)和PRRSV抗原1:1比例混合液，注射后将各组仔猪置于相同的管理环境下进行饲养管理，每天定时测量仔猪的体温状况并记录，连续观察14天完成实验。

实验结果：在受试期间，各组仔猪的体温均没有出现体温升高(体温超过40℃)的情况，即没有明显的临床症状，各组疫苗佐剂的安全性好。

2、理化性试验：

按照“猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗(CH-la株)制造及检验试行规程”和《中华人民共和国兽药典》(2010版)相关要求对本发明实施例1～5提供的疫苗佐剂与灭活的PRRSV抗原1:1比例制成猪繁殖与呼吸综合征疫苗进行相关检验，检验结果详见下表1：

表1

从上表1的检验结果可以得出，本发明实施例1～5提供的猪繁殖与呼吸综合征疫苗符合《中华人民共和国兽药典》(2010版)的相关要求，安全性良好。

3、稳定性试验：

随机选取本发明实施例1制得的疫苗佐剂9份，并分为3组，并且将这3组试样分别放置在2～8℃、室温、37℃条件下1个月，观察各组试样是否有分层现象，如果没有分层即为稳定性良好。

需要说明的是，本发明实施例2～5制得的疫苗佐剂均参照上述实施例1的分层试验方法进行稳定性测试，测试结果显示，本发明实施例1～5提供的疫苗佐剂在2～8℃、室温、37℃条件下1个月后均无出现分层现象，即稳定性良好。

4、攻毒试验：

随机选择35～45日龄的健康仔猪75头，平均分为3组，每组各15头，并编号为1～3组，其中组1为免疫添加本发明实施例1提供的疫苗佐剂的PRRSV疫苗试验组，组2为免疫不添加疫苗佐剂的PRRSV疫苗试验组，组3为不免疫作为空白对照组。

组1在免疫后5日后用高致病性PRRSV强毒株(10^6.0TCID₅₀/ml)进行攻毒，每头肌肉注射3mL，同时滴鼻3mL。攻毒后第3日采集血液用RT-PCR的方法测定病毒血症，试验结果详见图1，从图1中可以看出，攻毒后组1试验猪的病毒血症测试结果没有出现476bp的目标条带，均为阴性。该试验结果显示，本发明实施例1提供的疫苗佐剂联合猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活抗原可以提高机体的细胞免疫，诱导干扰素，减少PRRSV产生的免疫抑制。

各组在免疫21日采完血液后进行攻毒，用高致病性PRRSV强毒株(10^6.0TCID₅₀/ml)和NADC30毒株(10^6.0TCID₅₀/ml)同时进行攻毒，每种病毒分别肌肉注射3mL，滴鼻3mL。每天进行测温和临床观察。至少连续3天体温在40℃以上，同时出现精神沉郁，采食下降等临床症状，判为发病，统计发病情况结果详见下表2。

参照上述实施例1的攻毒试验方法对于本发明实施例2～5提供的疫苗佐剂进行测试，不同之处在于将上述组1中的实施例1的疫苗佐剂分别换成本发明实施例2～5的疫苗佐剂进行测试，测试结果详见表2。

图2是本发明实施例2中的组1的攻毒后各头试验猪的病毒血症测试结果，从图2的结果显示，攻毒后实施例2中的组1试验猪的病毒血症测试结果没有出现476bp的目标条带，均为阴性。该试验结果显示，本发明实施例2提供的疫苗佐剂联合猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活抗原可以提高机体的细胞免疫，诱导干扰素，减少PRRSV产生的免疫抑制。

需要说明的是，本发明实施例3～5中的组1在攻毒后，采集各试验猪的血液用RT-PCR的方法测定病毒血症，各头试验猪的病毒血症测试结果均为阴性。该试验结果显示，本发明实施例3～5提供的疫苗佐剂联合猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活抗原可以提高机体的细胞免疫，诱导干扰素，减少PRRSV产生的免疫抑制。

表2

从上表2的试验结果可以得出，本发发明实施例提供的疫苗佐剂能够增强PRRSV疫苗特异性细胞免疫反应，提高中和抗体的滴度，缩短中和抗体的产生时间，安全性好。

本发明的疫苗佐剂联合猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活抗原可以提高机体的细胞免疫，诱导干扰素，减少PRRSV产生的免疫抑制。从而，较快的产生高含量的中和抗体，维持时间长，并能减少不同毒株的病毒血症，增强了疫苗的安全性和有效性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂为将小分子肽、二乙胺基乙基葡萄糖、氢氧化铝胶和稳定剂加入去离子水中得到的水溶性悬液；

所述水溶性悬液中的小分子肽的浓度为0.5~2.5mg/mL，二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为1~2.5g/mL，稳定剂的浓度为0.5~1.5 g/mL；

所述氢氧化铝胶占所述水溶性悬液的质量份数为10%~20%。

2.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述小分子肽为天蚕抗菌肽。

3.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述氢氧化铝胶，铝的含量以三氧化二铝计算在1.8%～2.2%。

4.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述水溶性悬液中二乙胺基乙基葡萄糖的浓度为1.5~2g/mL。

5.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述稳定剂为磷酸缓冲盐。

6.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂的pH值为6.8~7.8。

7.如权利要求1~6任意一项所述疫苗佐剂在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。

8.一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗由如权利要求1~6任意一项所述的疫苗佐剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原按照预设重量比例混合制备而成。