CN101972473A - 小鹅瘟活疫苗的制备方法及其制备的活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鹅瘟活疫苗的制备方法及其制备的活疫苗。该小鹅瘟活疫苗的制备方法包括小鹅瘟种毒SYG61的筛选，将小鹅瘟病毒种毒用灭菌PBS作1:100稀释，接种12日龄发育良好的鹅胚，每胚绒尿腔0.2ml，将48~144小时死亡的鹅胚，置2~8℃冰箱冷却4~24小时。分别将经冷却的鹅胚侵入于5%新洁尔灭消毒液5~10分钟，擦干后放置无菌室内，先以5%碘酊消毒气室蛋壳部，以无菌手续打开蛋壳，拨除蛋膜及撕破绒尿膜，吸出尿囊液和羊水，加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加入青霉素、链霉素各1000单位/ml，充分摇匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。本发明的小鹅瘟活疫苗的制备方法，步骤少，易操作，所制备出的小鹅瘟活疫苗，产量高、稳定性好、成本低，免疫保护效果好。

Description

小鹅瘟活疫苗的制备方法及其制备的活疫苗

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及小鹅瘟活疫苗的制备方法及其制备的活疫苗。 

背景技术

鹅瘟是由小鹅瘟病毒引起的20日龄以内的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病，其发病率和死亡率可高达90~100％，对养鹅业造成巨大经济损失的疫病。1956年方定一教授首先在扬州发现此病，1961年方定一、王永坤等在扬州再次发现本病，并分离到病毒，命名为小鹅瘟，其病原为小鹅瘟病毒。此病在全国各省份和世界养鹅国家均有暴发流行。 

根据国际兽医局（OIE）国际委员会通过的由OIE标准委员会编的哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病“诊断试验和疫苗标准手册”（第三版，1996年）中未见有“小鹅瘟诊断试验和疫苗”方面的内容及标准。 

八十年代末由广东省佛山兽医专科学校制订的“鸭胚化小鹅瘟弱毒苗”通过部规程委员会。九十年代初有福建兽医生药厂和广东兽医生药厂生产供应。据了解，毒种接种鸭胚死亡仅为70~80％；鸭胚含毒量低；每ml苗免疫羽份仅为鹅胚化疫苗的1/10~1/100；免疫效果差。本申请人于80年中期将已经研制的“鸭胚化小鹅瘟活疫苗”淘汰，其主要原因包括：在鸭胚传25代，毒种最高仅能使鸭胚死亡80％，不稳定；鸭胚死亡时间没有规律，时间太长；鸭胚胚液少，产量低，成本高。 

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种小鹅瘟活疫苗的制备方法，以实现用最简单的制备方法制备出产量高、稳定性好、成本低的疫苗。本发明的另一目的是提供由上述方法制备得到的疫苗。 

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种制备小鹅瘟活疫苗的方法，将接种了小鹅瘟种毒的鹅胚孵化，收集48~144h内死亡鹅胚的胚液，经冷冻真空干燥得到小鹅瘟活疫苗。

所述的小鹅瘟病毒的毒株为SYG61毒株的26~35代毒或41~50代毒，SYG61为扬州大学（原苏北农学院）方定一、王永坤教授在1961年在国际上首次报道、分离的小鹅瘟毒株。 

所述的小鹅瘟病毒的毒株的接种量为将毒种用生理盐水作1:100倍稀释，0.2ml/胚。 

所述的鹅胚为无小鹅瘟抗体易感鹅胚。 

所述鹅胚为12~14日龄，接种途径为尿囊腔接种，孵化温度为37.5℃ 

收集48~144h内死亡鹅胚的胚液，病毒含量应≧10^7.0ELD₅₀/1.0ml，即可用于制苗。

先将检验合格的胚液过滤于灭菌容器内，加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加入青霉素、链霉素各1000单位/ml，充分摇匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。 

上述的制备小鹅瘟活疫苗的方法所制得的活疫苗。 

本发明的小鹅瘟活疫苗的制备方法，包括小鹅瘟种毒SYG61的筛选，将小鹅瘟病毒种毒用灭菌PBS作1:100稀释，接种12日龄发育良好的鹅胚，每胚绒尿腔0.2ml，将48~144小时死亡的鹅胚，置2~8℃冰箱冷却4~24小时。分别将经冷却的鹅胚侵入于5%新洁尔灭消毒液5~10分钟，擦干后放置无菌室内，先以5%碘酊消毒气室蛋壳部，以无菌手续打开蛋壳，拨除蛋膜及撕破绒尿膜，吸出尿囊液和羊水，加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加入青霉素、链霉素各1000单位/ml，充分摇匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。 

本发明的小鹅瘟活疫苗的制备方法，包括种鹅用小鹅瘟活疫苗和雏鹅用小鹅瘟活疫苗制造，所述小鹅瘟活疫苗是将接种小鹅瘟种毒的鹅胚孵化，收集48~144小时内死亡鹅胚的胚液，经冷冻真空干燥得到小鹅瘟活疫苗。种鹅用的活疫苗的种毒为SYG61毒株的26~35代毒，代号为SYG26~35；制造雏鹅和雏鹅用的活疫苗的种毒为SYG61毒株的41~50代毒，代号为SYG41~50。 

本发明的小鹅瘟活疫苗的制备方法，步骤少，易操作，所制备出的小鹅瘟活疫苗，产量高、稳定性好、成本低，免疫保护效果好。种鹅在产蛋前15天左右用1∶100稀释的鹅胚化种鹅弱毒苗进行皮下或肌肉注射。在免疫12天后至100天左右，鹅群所产蛋孵化的雏鹅群能抵抗人工及自然病毒的感染。未经免疫的种鹅群，或种鹅群免疫100天以上的所产蛋孵化的雏鹅群，在出炕48小时内应用鹅胚化雏鹅弱毒疫苗进行免疫，免疫后7天内严格隔离饲养，防止强毒感染，保护率达95％左右。在已被污染的雏鹅群作紧急预防，保护率达70％～80％。 

图1是小鹅瘟病毒攻毒结果表。 

图2是安全试验结果表。 

图3是攻毒试验结果表。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。 

实施例1  毒种研究 

一  种毒的分离

病料：1961年从扬州发生小鹅瘟的患病雏鹅的肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、脑、血液病毒分离。

病料处理：无菌采集患病雏鹅的肝、脾、胰、脑等内脏器官病料和无菌采集患病雏鹅的肝、胰、脾等病料，分别剪碎、磨细，用灭菌PBS液作1:5稀释，经3000转/分离心30分钟，取离心的上清液按4:1加入分析纯氯仿充分混匀后放置37℃温箱作用60分钟，或4℃冰箱过夜，经3000转/分离心30分钟，取上清液加入抗菌素，使之每毫升含有青霉素、链霉素各1000单位，于37℃温箱作用30分钟，经细菌检验为阴性者，冻结保存作为病毒分离材料。 

该方法因经氯仿处理后可清除其他病毒，尤其是清除囊膜病毒在病毒分离过程中的干扰，可获较为可靠的小鹅瘟病毒。 

病毒分离接种：将病毒组织上清液材料接种12日龄易感鹅胚，每胚绒尿腔接种0.2ml。收获72小时以后死亡鹅胚绒尿液，经细菌检验合格，低温保存作为传代毒种。患病雏鹅分离的毒种简称为SYG₆₁毒株， 

传代：将SYG₆₁毒株鹅胚绒尿液分别在12日龄易感鹅胚绒尿腔传代。

鉴定：除了作细菌、霉菌和支原体常规检验外，外源病毒检验以鸡胚接种和红细胞凝集试验。 

鸡胚接种：鹅胚绒尿液毒分别接种10日龄SPF鸡胚和12日龄易感鹅胚，每枚绒尿控接种0.2ml，观察10天。 

红细胞凝集试验：鹅胚绒尿液毒与1.0%鸡红细胞试管或50孔板凝集反应。 

SYG₆₁毒株初次分离时，仅能引起部分鹅胚在5~7天死亡。在易感鹅胚传10代后能使12~14日龄易感鹅胚死亡，死亡率达95%左右。鹅胚死亡时间在48~120小时，大多数在72~96小时之间。经细菌、霉菌、支原体检验证明不带细菌。经鸡胚接种不引起鸡胚死亡，鸡胚无病变，绒尿液不凝集鸡红细胞。鹅胚绒尿液无凝集红细胞现象。 

雏鹅的小鹅瘟病毒的分离和传代所用的鹅胚必须未经免疫，琼扩抗体为阴性的健康种鹅群，发育良好的12日龄。免疫过或琼扩阳性的种鹅群的胚胎对病毒不易感，不能作为分离和传代用。 

制造种鹅用的活疫苗的种毒为SYG61毒株的26~35代毒，代号为SYG_26~35；制造雏鹅和雏鹅用的活疫苗的种毒为SYG61毒株的41~50代毒，代号为SYG_41~50。 

二  种毒毒力返强试验 

种毒：SYG₂₆代鹅胚绒尿液毒、SYG ₄₁代鹅胚绒尿液毒 。

雏鹅：非疫区、未经免疫、琼扩检验抗体阴性的健康种鹅群后代的雏鹅。 

鹅胚：非疫区、未经免疫、琼扩检验抗体阴性的健康种鹅群的胚胎。 

毒力返强试验： 

将SYG₂₆和SYG₄₁代制备的鹅胚绒尿液毒分别皮下注射5只5日龄健康雏鹅，每雏鹅注射0.5ml。72小时任取其中2只雏鹅扑杀，按无菌手续采取肝、脾组织，称重后混合置灭菌研磨器中磨碎，用灭菌Hanks液作1:5稀释，每ml加入青霉素和链霉素各1000单位，置37℃温箱作用30分钟。取上清液接种5只5日龄同一来源的易感雏鹅，每只皮下0.1ml。72小时任取其中2只雏鹅扑杀，按此方法，SYG₂₆连续传4代，SYG₄₁连续传5代。每代未扑杀的雏鹅均隔离饲养观察10天。

SYG₂₆代制备的鹅胚绒尿液毒，经易感雏鹅连续传4代和SYG₄₁代制备的鹅胚绒尿液毒，经易感雏鹅连续传5代，每代扑杀的雏鹅内脏器官无肉眼可见病变，也无小鹅瘟组织学显微病理变化，未扑杀的雏鹅未发生死亡，生长情况良好，无任何不良反应。上述结果说明弱毒株对雏鹅具有安全可靠，无毒力返强现象。 

将SYG₂₆代制备的鹅胚绒尿液毒皮下注射6只5日龄雏鹅，每雏鹅0.5ml。72小时任取其中3只雏鹅扑杀，按无菌手续采取肝、脾组织，称重后混合置灭菌研磨器中磨细，用灭菌生理盐水作1:5稀释，每ml加青霉素和链霉素各1000单位，置37℃温箱作用30分钟。取上清液接种6只5日龄同一来源的易感雏鹅，每只皮下0.1ml。72小时任取其中3只雏鹅扑杀，按此方法连续传5代。每代未扑杀的3只雏鹅均分别隔离饲养观察10天。 

SYG₄₁代制备的鹅胚绒尿液毒，经易感雏鹅连续传5代，每代扑杀的雏鹅内脏器官无肉眼可见的病变，也无组织学显微病理变化。未扑杀的雏鹅未发生死亡，生长良好，无任何不良反应。上述结果说明本弱毒株对雏鹅具有安全可靠，无毒力返强现象。 

病毒在鹅体内存留的测定： 

50只试验鹅，每只胸部肌肉注射1:10，0.1ml SYG₂₆代制备的鹅胚绒尿液毒。注射24、48、72、144和240小时5个不同时间杀死，每批扑杀5只。用无菌手续分别等量取5只鹅肝、脾混合磨细，肠内容物和十二指肠肠管剪碎磨细，置~15℃冰箱内冻结保存。将被检材料分别用灭菌生理盐水作1:5稀释，经离心取上清液每ml加入各1000单位青霉素和链霉素，于37℃温箱作用1小时。每个被检材料接种5枚13日龄鹅胚，每胚绒尿腔0.2ml。在48~144小时内死亡的鹅胚经无菌检验、血凝检测及病变检查，符合本病毒特性者为准。观察10天。

从SYG₂₆代制备的鹅胚绒尿液毒注射24小时后首先在十二指肠组织检测到病毒，48小时在十二指肠、肠内容物均可检测到病毒，96小时在十二指肠、肠内容物和肝、脾组织均可检测到病毒，而144小时和240小时均没有检测到病毒。从上述结果，本弱毒株注射鹅体后24~96小时病毒在十二指肠出现，96小时在肠内容物及肝脾组织出现，而144上时没能检测到病毒。说明本病毒在鹅体内存留96小时左右；96小时肠内容物检测仅引起20%鹅胚死亡，因此小鹅瘟弱毒株种鹅免疫注射后，对饲养场地污染是暂时，在产蛋前二周注射，病毒对蛋壳的污染机会基本没有。 

从SYG₂₆代和SYG₄₁代制备的病毒液在易感雏鹅体内连续传4代和5代，经饲养观察以及肉眼和显微病理学检查结果，证明无毒力返强现象。从SYG₂₆代制备的病毒液在鹅体内存留的测定结果，病毒在体内及肠内容物存留96小时左右，144小时已检测不到病毒。 

从SYG₂₆代制备的病毒液在易感雏鹅体内连续传5代，经饲养观察以及肉眼和显微病理学检查结果，证明无毒力返强现象。试验结果，说明具有可靠的安全性。 

实施例2  小鹅瘟活疫苗的制备 

本发明所使用的SYG61为扬州大学（原苏北农学院）方定一、王永坤教授在1961年在国际上首次报道、分离的小鹅瘟毒株

毒种的繁殖：

小鹅瘟病毒的毒种为在易感鹅胚连续传代的鹅胚绒尿液。制造种鹅用的活疫苗的种毒为SYG26~35；制造雏鹅和雏鹅用的活疫苗的种毒为SYG41~50。将冻干毒种先加少许灭菌PBS液乳化，吸出再稀释使其达1:100稀释。或将保存于~15℃的鹅胚绒尿液毒种用灭菌PBS液作1:100稀释。将经稀释的毒种接种10~20枚12日龄易感鹅胚，每胚绒尿腔0.2ml。选取接种48~120小时内死亡，病变典型的鹅胚，分别收获鹅胚液（尿囊液和羊水），装于灭菌容器内。将经检验无菌的胚液混合，定量分装，冷冻保存。注射收获日期、毒种代次等。

毒种鉴定：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》，应符合规定。 

毒种保存：在~15℃，使用期应不超过1年。 

毒种继代：应不超过10代。 

制苗材料选择： 

制苗用的种鹅蛋，为非疫区、未经小鹅瘟疫苗免疫、小鹅瘟病毒琼扩诊断抗原检验抗体阴性的和经鹅副粘病毒病灭活苗及禽流感灭活苗免疫的健康种鹅群。种蛋要新鲜和85%以上受精率。经消毒后立即置37~38℃孵卵箱内孵化，相对温度为60~70%之间。选择发育良好的12日龄鹅胚作为小鹅瘟制苗材料。

制苗毒液的繁殖： 

取生产用小鹅瘟病毒种鹅用和雏鹅用毒种，分别用灭菌生理盐水作1:100倍稀释，接种12日龄鹅胚，每胚绒尿腔0.2ml。接种后置37~38℃温室（孵化箱）继续孵化，不必翻蛋。

小鹅瘟病毒接种的鹅胚，接种后每天照蛋一次，将48小时前死亡胚弃去，48~144小时间，每8小时照蛋一次，随时取出死亡鹅胚，置2~8℃冰箱冷却4~24小时。 

分别将冷却后的鹅胚浸泡于5%新洁尔灭消毒液5~10分钟，用消毒纱巾擦干后放置无菌室内。先以5%碘酊消毒气室蛋壳部位，以无菌手续打开蛋壳，拔除蛋膜及撕破绒尿膜，吸出尿液和羊水。每若干个胚的绒尿液（250~500ml）混合为一组，置于灭菌瓶中，并加入适量抗菌素，放2~8℃冰库处理，留样后，结冻保存。在收获过程中同时逐个观察胚体病变，如胎儿腐败、液体混浊及有任何污染可疑的胚弃去不用。 

半成品检验： 

将每组留样按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001）附录301页进行，应无细菌生长。

病毒含量测定：每ml含量，小鹅瘟病毒≥10^7.0。 

配苗及分装： 

先将检验合格的同一毒株的绒尿液混合。将雏鹅细小病毒液和小鹅瘟病毒液分别过滤于两个灭菌容器内。再将两种病毒液等量混合后加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加入适量抗菌素，充分摇匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。冻干完毕压塞、加盖、贴签，置低温保存。

成品检验： 

物理性状：冻干苗为微黄色或白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

无菌检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》2001版附录301页进行，应无细菌生长。 

支原体检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》2001版附录305页进行，应无支原体生长。 

鉴别检验：本品用抗小鹅瘟病毒血清等量混合进行中和后，尿囊腔接种10日龄易感鹅胚6枚，每枚尿囊腔接种0.2ml，应不发生感染死亡。 

外源病毒检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001）二版附录306页检验外，2.1.1法进行。但在用SPF鸡胚检验的同时应加30个10日龄的鹅胚，同时分组试验，观察判定。应无外源病毒污染。 

安全检验：按瓶签注明羽份，疫苗用灭菌生理盐水稀释成每毫升含20羽份，皮下注射5日龄雏鹅5只，每只皮下注射1ml，观察14天，应无临床反应。 

效力检验：用2日龄健康易感雏鹅10只，每只皮下接种疫苗0.1ml（相当于1个使用剂量），免疫后9天，第一组连同条件相同的未免疫对照雏鹅10只，另一组连同条件相同的未免疫对照雏鹅10只，各皮下注射小鹅瘟SYG61强毒1:50，0.5ml。攻毒后均观察14天，对照组至少8只发病死亡，各免疫组至少9只保护为合格。 

实施例3  小鹅瘟活疫苗的效力检验 

雏鹅疫苗保护效力检验：

疫苗：0607、0608、0609、0901、0902等5批冻干苗，每瓶苗为500羽剂量，保存于~15℃冰箱备用。

雏鹅：非疫区、未经免疫、琼扩抗体阴性的种鹅群的2日龄雏鹅。 

攻毒毒种：小鹅瘟病毒SYG61强毒株。对一日龄雏鹅毒力，每ml应≥10⁶LD50。 

0607、0608、0609等3批冻干苗，每批任取5瓶，每瓶加1.0ml灭菌生理盐水溶解，抽取等量苗液作混合样。共免疫三群13010只，每只于出壳后48小时内用1:50稀释苗液，皮下注射0.1ml，隔离饲养9天。176只用SYG61毒株攻击，另设10只同日龄雏鹅作对照组，每只皮下注射1:50稀释0.5ml，10只作空白对照组，隔离饲养观察14天。 

0901、0902等2批冻干苗，每批任取5瓶，每瓶加1.0ml灭菌生理盐水溶解，抽取等量苗液作混合样。免疫两群各800余只雏鹅，每只于出壳后48小时内用1:50稀释苗液，皮下注射0.1ml，隔离饲养9天。每群任取 50只用SYG61毒株攻击，另设10只同日龄雏鹅作对照组，每只皮下注射1:50稀释0.5ml，10只空白对照组，隔离饲养观察14天。 

0607、0608、0609等3批冻干苗免疫后生长良好，无不良反应。免疫后9天用强毒株攻击。小鹅瘟病毒SYG61毒株攻击结果，0607批冻干苗免疫的59只，存活56只，保护率为94.92%；0608批冻干苗免疫的59只，存活55只，保护率为93.22%；0609批冻干苗免疫的58只，存活54只，保护率为93.10%；而10只对照组雏鹅攻毒后死亡9只，死亡率为90%；10只空白对照组全部健活。 

0901、0902等2批冻干苗免疫后生长良好，无不良反应。免疫后9天分别强毒攻击。小鹅瘟病毒SYG61毒株攻击结果，9901批冻干苗免疫的50只，存活49只，保护率为98%；0902批冻干苗免疫的50只存活47只，保护率为94%；而10只对照组雏鹅攻毒后死亡9只，死亡率为90%。详细结果如图1所示。 

应用小鹅瘟SYG₆₁弱毒株制备的5批冻干苗，每只2日龄雏鹅注射1:50，0.1ml苗液，免疫9天后分别用1:50，0.5ml强毒攻击。结果；用小鹅瘟病毒攻击的276只雏鹅，保护261只，保护率为94.57%，而20只对照组雏鹅死亡18只，死亡率为90%，20只空白对照雏鹅全部健活。上述结果表明雏鹅出壳后48小时内用雏鹅用活疫苗免疫，免疫后9天有94%左右保护率。 

小鹅瘟病毒SYG41~50弱毒株制备的0607、0901等5批冻干苗，共免疫14610只2日龄雏鹅。免疫后9天；任取276只雏鹅用小鹅瘟病毒SYG₆₁强毒攻击，每只皮下1:50，0.5ml。结果，保护261只，保护率为94.57%，而20只对照组死亡18只，死亡率为90%，40只空白对照组雏鹅全部健活。 

种鹅疫苗保护效力检验： 

抗小鹅瘟母源抗体是由种母鹅经卵传递给雏鹅，具有抵抗小鹅瘟病毒侵袭，保护雏鹅不受感染发病的作用。本试验通过免疫监测及攻毒试验，测定由小鹅瘟活疫苗免疫后种鹅后代雏鹅母源抗体的消长规律和对强毒攻击的保护效果。

种鹅：选一养鹅户饲养种鹅20只 ，供小鹅瘟疫苗免疫。其中10只隔离饲养，作为安全性试验组。 

雏鹅：来源于免疫鹅种蛋孵化鹅雏24只，为母源抗体检测组，供采血测定母源抗体，另选无母源抗体雏鹅15只，隔离饲养，作为对照组。 

小鹅瘟活疫苗：试验用疫苗为小鹅瘟活苗实验室试产品批号为0804，0806，0902。 

攻毒毒种：小鹅瘟病毒SYG61强毒株。对一日龄雏鹅毒力，每ml应≥10⁶LD50。 

抗体检测：以常规琼脂免疫扩散试验法检测种鹅及雏鹅血清沉淀抗体。 

安全性试验组：用制备好的活接种10只健康鹅，每只注射10羽份，隔离器内饲养，观察15天。 

种鹅免疫：种鹅以小鹅瘟活苗注射1羽份，两周后翅下静脉采血分离血清，检测抗体滴度，同时开始集种蛋孵化。 

雏鹅分别于1，3，5，7，10，13，16， 20日龄，随机经心脏采血5份，分离血清检测母源抗体。 

攻毒试验：分别于1，8，16日龄每组随机选取雏鹅只，隔离饲养，以小鹅瘟强毒0.2mL/只皮下注射攻毒，连续观察20d 。 

安全性试验结果见图2。从图2可以看出，将制品以10倍使用剂量接种80日龄鹅，在注射部位及全身均无不良反应，证明疫苗安全性良好。 

血清抗体检测 

种母鹅血清抗体 种母鹅小鹅瘟疫苗免疫前血清抗体为阴性，免疫后两周血清抗体转阳性，抗体变化， 种母鹅血清抗体滴度检测结果见表1。

表1  种母鹅血清抗体滴度检测结果 

血清号	1	2	3	4	5
						免疫前	0	0	0	0	0
免疫二周后	24．0	24．0	25．0	24．0	23．0

雏鹅血清母源抗体变化，见表2。 

表2 雏鹅血清母源抗体滴度平均值 

日龄	1	3	5	7	10	13	16	20
									抗体量	23．2	23．2	23．0	22．8	22．0	21．8	21．2	20．8
阳性率	100	100	100	100	100	100	80	40

攻毒试验结果，见图3。

从疫苗的免疫试验结果来看，小鹅瘟油乳剂疫苗在免疫后第14天即产生较高水平抗体。从免疫攻毒试验来看，未免疫组全部发病，而免疫组完全健活。因此进一步证明了该疫苗能有效地控制小鹅瘟病毒的流行和发生。 

Claims (8)

1.一种制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于：将接种了小鹅瘟种毒的鹅胚孵化，收集48-144h内死亡鹅胚的胚液，经冷冻真空干燥得到小鹅瘟活疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于：所述的小鹅瘟病毒的毒株为SYG61毒株的26-35代毒或41-50代毒。

3.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于：所述的小鹅瘟病毒的毒株的接种量为将毒种用生理盐水作1:100倍稀释，0.2ml/胚。

4.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于：所述的鹅胚为无小鹅瘟抗体易感鹅胚。

5.根据权利要求1或4所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于：所述鹅胚为12-14日龄，接种途径为尿囊腔接种，孵化温度为37.5℃。

6.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于：收集48-144h内死亡鹅胚的胚液，病毒含量应≧10^7.0ELD₅₀/1.0ml，即可用于制苗。

7.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于：先将检验合格的胚液过滤于灭菌容器内，加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加入青霉素、链霉素各1000单位/ml，充分摇匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。

8.权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法所制得的活疫苗。

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