CN103060469B - 一种刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及嗜皮菌分子诊断的荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒。所述引物序列如SEQIDNO.1、2、3所示，所述探针为SEQIDNO.4和5。将上述引物和探针与PCR反应液组成荧光定量PCR检测试剂盒。用本发明的引物和探针能对刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌进行分型。本发明用于检测嗜皮菌时，具有快速、更特异、更灵敏的优点。

Description

一种刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及嗜皮菌分子诊断的荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒。

背景技术

嗜皮菌病是一种以渗出性和增生性皮炎、浅表上有皮坏死并有痂块形成为特征的皮肤病。此病主要感染牛、绵羊、马；也可以影响山羊、猫、狗、许多野生动物以及爬行动物。最近，世界各地有很多人感染此病的报道。

嗜皮菌病的实验室诊断主要依赖于观察嗜皮菌培养后的特征性菌落和显微镜下出现的革兰氏阳性的分枝菌丝或火车道型成行排列的孢子。然而，培养和其它传统的实验室诊断方法的特异性和灵敏度不够，且耗时长。因此，建立嗜皮菌病诊断的新技术，尤其是早期、快速、高特异性和高灵敏度的检测技术就显得尤为重要和迫切。此外，传统的观点认为,龟型嗜皮菌仅存在于爬行动物,而刚果嗜皮菌存在于人和其他哺乳动物。我们成功地从患嗜皮菌病牛的皮肤分离出龟型嗜皮菌，本发明可以同时扩增而且分辨刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌。

发明内容

发明的目的在于提供一种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的定量PCR检测嗜皮菌的引物、探针及试剂盒，同时方便的区分刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌。

本发明的原理和核心是科学地设计扩增和检测嗜皮菌的特异、高效的引物和探针。在保证设计的引物高效扩增嗜皮菌、设计的探针特异检测嗜皮菌的同时，确保此引物和探针不扩增和检测其它类似的微生物。此外，设计的探针和刚果嗜皮菌的基因序列完全吻合，而和龟型嗜皮菌有3个碱基的差异；因此，高分辨率熔点曲线技术会显示刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的不同熔解温度，这可以方便的用于基因分型。从GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取如下嗜皮菌和相关细菌的16SrDNA的序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行对齐：刚果嗜皮菌（基因序列号：AB550800，AJ243918，FJ708634，HM590697），龟型嗜皮菌（AB550801），放线菌（HQ891175，JF499686，JF820789），棒状杆菌（FR874223），Kytococcus sedentarius(EU443746)和Tossilophilus sp.(AB096085)。引物和探针的选择基于对齐序列的保守区和变异区。附图1显示设计的引物和探针：

上游引物扩增嗜皮菌：5’-TTAACACATGCAAGTCGAACGATGAA-3’（SEQ ID NO.1）；

下游引物-1扩增刚果嗜皮菌：5’-ATGCGAGGAAAGGTCATATT-3’（SEQ ID NO.2）；

下游引物-2扩增龟型嗜皮菌5’-ATGCGGAGAAAGGTCATAGG-3’（SEQ ID NO.3）；

探针-1：5’-TCCCAAAGTGARGGGYAGATTACTCAC-6FAM-3’（SEQ ID NO.4）；

探针-2：5‘-LCRed-640-TGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATC-phos（磷酸）-3’（SEQID NO.5）。

本发明还公开了刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的荧光定量PCR检测试剂盒，包括5倍定量PCR反应液22μl,以及22μl的5倍的引物探针混合液含浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物-1、5μM下游引物-2、1μM的探针-1、1μM的探针-2）

本发明进一步公开了刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌分型鉴别方法，包括以下步骤：

（1）用上述引物和探针PCR扩增待测菌，扩增出145bp条带，且荧光检测在640nm波长增强的为阳性样本；

（2）PCR完成后，对步骤（1）阳性样本扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据熔解温度对嗜皮菌进行分型，刚果嗜皮菌的熔解温度是－63℃，比龟型嗜皮菌的熔解温度－55℃。

与现有技术相比，本发明的引物、探针及试剂盒用于检测嗜皮菌时，具有快速、更特异、更灵敏的优点。i）经典的培养和染色方法鉴定嗜皮菌需要3-7天，本发明仅需2-4个小时（包括DNA提取约90分钟、PCR约60分钟、高分辨率熔解曲线分析5分钟、结果判定10分钟）；ii）PCR的分子诊断基于嗜皮菌的核酸序列，因而具有很高的特异性；iii）本发明可以有效地扩增10个拷贝的嗜皮菌核酸，具有极高的灵敏度；iv）由于本发明的高灵敏度，本发明可用于嗜皮菌病的早期诊断和疗效判定;v)传统的观点认为,龟型嗜皮菌存在于爬行动物,而刚果嗜皮菌存在于人和其他哺乳动物。我们的研究成功的从牛的皮肤分类出龟型嗜皮菌。此发明的优点还包括，可以同时扩增而且分辨刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌。本发明以经过科学的优化，和现有的技术相比，具有很多优点，可以方便的用于兽医诊所、人民医院的嗜皮菌病的分子诊断。

附图说明

图1：嗜皮菌荧光定量PCR的引物和探针

刚果嗜皮菌、龟型嗜皮菌、放线菌、棒状杆菌的16S rDNA的PCR扩增子的序列对齐，方框内显示引物和探针的序列。“.”表示基因序列和刚果嗜皮菌的序列一致,“-”表示碱基的缺失。上游引物的序列如图所示，而下游引物和二个探针的序列和显示的序列成反义关系。

图2：刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的熔解温度

PCR完成后，对刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，观察刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的熔解温度。由于设计的引物扩增刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌，而设计的探针和刚果嗜皮菌的基因序列完全吻合、同龟型嗜皮菌有3个碱基的差异，这样刚果嗜皮菌比龟型嗜皮菌有更高的熔解温度，从而可以方便的用于基因分型。高分辨率熔解曲线分析结果显示，刚果嗜皮菌的熔解温度是～63℃（上图），比龟型嗜皮菌的熔解温度（～55℃）高约8℃（下图）。

图3：刚果嗜皮菌的培养菌落

刚果嗜皮菌在37℃和5%培养CO₂的条件下的血平皿培养3-5天后，呈现粗糙、干燥、金黄色、嵌入培养基的、直径约5mm的特征型的菌落。

图4：刚果嗜皮菌的革兰氏染色

刚果嗜皮菌的革兰氏染色呈现具有诊断意义的分枝菌丝或成行排列火车道似的孢子的结构。

具体实施方式

本发明的技术方案通过以下步骤建立：

（1）嗜皮菌PCR的特异性的确定：此PCR的特异性从三个方面得到保证。i）由Intergrated DNA Technology合成嗜皮菌及相关细菌的16S rDNA的序列，此序列涵盖PCR的扩增区域。设计的PCR系统（含一个上游引物、二个下游引物、二个探针的混合物）对合成的嗜皮菌及相关细菌的16S rDNA序列和对照刚果嗜皮菌的DNA进行扩增；ii）观察各个扩增对象在PCR过程中荧光强度（640nm）的变化，和PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。荧光在640nm波长出现或增强，显示阳性；嗜皮菌的16S rDNA的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示预期的145bp的条带；iii）对扩增的PCR产物进行进行测序，测序的结果和GenBank的序列进行比较。结果显示，设计的嗜皮菌PCR特异的扩增刚果和龟型嗜皮菌，而不扩增其他类似的细菌。

（2）嗜皮菌PCR的灵敏度的确定：由Intergrated DNA Technology合成嗜皮菌及相关细菌的16S rDNA的序列。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含的16S rDNA的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的16S rDNA。用上述的PCR系统扩增含不同浓度16S rDNA嗜皮菌和相关细菌的合成物，依此确定本发明检测嗜皮菌的灵敏度。结果显示，此发明可以扩增反应系统10拷贝的嗜皮菌16S rDNA。

（3）分型鉴别：PCR完成后，对刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，观察刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的熔解温度。由于设计的引物扩增刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌，而设计的探针和刚果嗜皮菌的基因序列完全吻合、同龟型嗜皮菌有3个碱基的差异，这样刚果嗜皮菌比龟型嗜皮菌有更高的熔解温度，而方便的用于基因分型。高分辨率熔解曲线分析显示，刚果嗜皮菌的熔解温度是63℃，比龟型嗜皮菌的熔解温度55℃，高约8℃（图2）。

用发明引物、探针及试剂盒检测的过程如下：

1.制备PCR用的标准定量试剂（standard）。由Intergrated DNA Technology合成嗜皮菌及相关细菌的16S rDNA的序列，此序列涵盖PCR的扩增区域。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含的16S rDNA的基因拷贝数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含1000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的16S rDNA，作为PCR用的标准定量试剂。

2.制备待检样品的DNA模板。皮肤或者皮肤结痂样品（1g）转入Eppendorf管，加入1ml TE缓冲液并经过组织匀浆充分破碎后，取400μl用于DNA提取。纯化的DNA洗脱在100μl T₁₀E_0.1（含10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA，pH8.5）用于PCR模板。

3.PCR扩增体系。20μl的扩增体系包含10μl的样品DNA模板或者定量标准试剂（standard）、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、0.7μM下游引物-1和下游引物-2、0.2μM的探针-1和探针-2、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。

4.PCR扩增循环参数。PCR扩增包括18个温度递减的高严谨循环（high-stringency step-down）和25个欠严谨的荧光获得循环（relaxed-stringency fluorescence acquisition）。18个温度递减的高严谨循环：6x15sec95℃,60sec74℃;9x15sec95℃,60sec72℃;3x15sec95℃,10sec70℃,15sec72℃.25个欠严谨的荧光获得循环：25x15sec95℃,8sec58℃,10sec65℃,and15sec72℃。

5.高分辨率熔解曲线分析。PCR扩增结束后，立即实施高分辨率熔解曲线分析，温度从38℃上升到80℃，以每秒0.2℃递增。数据分析是分析640nm:530nm(F2/F1)的荧光强度的比例。F2/F1的第一衍生值(-d(F2/F1)/dt)被读为该DNA的熔解温度。

6.PCR结果的判定和定量分析。DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照，随后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、DNA提取的阴性和阳性对照、定量的标准试剂（每10μl standard含10⁴，10³，10²，10¹拷贝的嗜皮菌16S rDNA）。本发明的PCR扩增效率高，有效地扩增含10¹拷贝的嗜皮菌16SrDNA的standard。

实施例1：刚果嗜皮菌标准株的鉴定

实验室从患嗜皮菌病的羊的皮肤分离出刚果嗜皮菌。本研究复苏该细菌，进行培养和染色，细菌表现特征性的菌落（图3）和染色（图4）特性。纯化的细菌，提取DNA，用本发明技术进行PCR扩增以及高分辨率熔解曲线分析（具体技术细节如上所述）。结果显示，PCR能特异高效的扩增刚果嗜皮菌的DNA，且出现63℃的熔解温度。

实施例2：临床分离株的PCR扩增和分型鉴定

从12头患嗜皮菌病的牛，采集34份皮肤结痂；每个皮肤结痂的样品分成二份，一份用于细菌培养和染色鉴定，另一份直接用于DNA提取和PCR扩增。结果显示，培养和染色确定14皮肤结痂样品为阳性（14/34，42%），而PCR技术发现的阳性率为100%。高分辨率熔解曲线显示，其中34个嗜皮菌株中，有一株为龟型嗜皮菌，其余均为刚果嗜皮菌。基因测序证实高分辨率熔解曲线的结论。

Claims (3)

1.一种刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的荧光定量PCR检测引物及探针，其特征在于检测引物为：

上游引物：5’-TTAACACATGCAAGTCGAACGATGAA-3’；

下游引物-1：5’-ATGCGAGGAAAGGTCATATT-3’；

下游引物-25’-ATGCGGAGAAAGGTCATAGG-3’；

探针-1：5’-TCCCAAAGTGARGGGYAGATTACTCAC-6FAM-3’；

探针-2：5‘-LCRed-640-TGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATC-phos-3’。

2.一种刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌的荧光定量PCR检测试剂盒，包括5倍定量PCR反应液22μl,以及22μl的5倍引物探针混合液；所述的引物探针混合液含浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物-1、5μM下游引物-2、1μM的探针-1、1μM的探针-2。

3.一种刚果嗜皮菌和龟型嗜皮菌分型鉴别方法，用于非诊断目的，包括以下步骤：

（1）用权利要求1所述述引物和探针PCR扩增待测菌，扩增出145bp条带，且荧光检测在640nm波长增强的为阳性样本；

（2）PCR完成后，对步骤（1）阳性样本扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据熔解温度对嗜皮菌进行分型，刚果嗜皮菌的熔解温度是－63℃，比龟型嗜皮菌的熔解温度－55℃。

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