CN108474042B - 一种评估幽门螺杆菌感染的试剂成分,试剂盒以及方法 - Google Patents
一种评估幽门螺杆菌感染的试剂成分,试剂盒以及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108474042B CN108474042B CN201580056070.1A CN201580056070A CN108474042B CN 108474042 B CN108474042 B CN 108474042B CN 201580056070 A CN201580056070 A CN 201580056070A CN 108474042 B CN108474042 B CN 108474042B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- gene
- helicobacter pylori
- kit
- caga
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Abstract
本发明提供评估幽门螺杆菌感染的方法,试剂盒以及试剂成分。所述方法,试剂盒以及试机成分可以诊断以及量化幽门螺杆菌感染的存在,以及评估相关的消化系统溃疡或癌症的危险,以及幽门螺杆菌感染,如果存在,是否对抗生素治疗敏感或者有耐药性。所有的参数可以通过使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)检测。
Description
相关的专利申请
本申请要求美国临时专利申请,申请号62/168,573,递交时间2015年5月29日,以及美国临时专利申请,申请号62/065,511,递交时间2014年10月17日,的优先权,这两个申请的所有内容被包括在本申请中。
政府利益声明
本发明是在政府资助下完成,资助号为国家卫生研究院颁发的资助5K01DK090103以及R01AI054423。政府对本发明具有一定的权利。
发明领域
本申请提供一种用于评估幽门螺杆菌感染的方法,试剂盒以及试剂成分。所述方法,试剂盒以及试剂成分可以检测以及确定幽门螺杆菌感染的数量,并评估其相关联的胃部疾病的风险,以及,如果感染存在,该病菌对抗生素治疗敏感还是有抗药性。所有的参数都可以使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)进行评估。
发明背景
全世界有多于一半的人胃部有幽门螺杆菌感染,美国人中的1/3也有这样的感染。幽门螺杆菌能引起从无症状的胃炎(胃部发炎)到消化性溃疡以及胃癌等一系列疾病,但同时也能免疫其他疾病,例如食道癌以及哮喘。人类和细菌的遗传变异性似乎能导致不同的疾病结果。幽门螺杆菌在感染过程中具有种间遗传多样性以及种内遗传多样化。
目前,诊断幽门螺杆菌的方法包括侵入性以及非侵入性测试。侵入性测试(通过对内窥镜检查获得的活体组织切片进行病理评估)具有高敏感度以及专一性,并且可以通过对活体组织切片进行培养获得幽门螺杆菌的基因型。但是,这些方法具有食道以及/或者胃部穿孔和流血的危险,对病人使用的镇静的药物也具有一定的危险性,并且,内窥镜检查以及对活体组织切片的病理分析的费用也相对比较昂贵。
对幽门螺杆菌的非侵入型测试包括血清测试,尿素呼气试验,以及粪便抗原试验。这些测试具有不同程度的敏感度和专一性,并且不能通过确定幽门螺杆菌的基因型来评估抗生素的耐药性,是否存在毒性基因或等位基因,也无法跟踪在人群中的传播。基于PCR的方法(多轮传统PCR或者实时PCR)用于粪便中的检测幽门螺杆菌的DNA,其中,对PCR产物进行测序从而确定幽门螺杆菌的基因型。这种方法测试幽门螺杆菌感染的敏感度在25%至92%之间(Falsafi et al.,World J.肠胃病学,15,484-488(2009);Hirai et al.,医用微生物学期刊,58,1149-1153(2009);Puz et al.,肠胃病学,135,1543-1551(2008);Sicinschi et al.,螺杆菌,17,96-106(2012);Sicinschi et al.螺杆菌,8,601-607(2003)).
发明内容
基于PCR的用于检测和测定幽门螺杆菌基因型的测试方法由于敏感度,重复性,以及由污染造成的假阳性等原因,没有被使用在传染病学研究或诊断中。本发明说所描述的是使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)的方法,试剂盒以及试剂成分来检测幽门螺杆菌感染以及其基因型。所述的方法,试剂盒以及试剂成分提供相对于目前的测试更好的敏感度,并加入了量化幽门螺杆菌负荷以及确定基因型比例的特征。本发明的方法,试剂盒以及试剂成分包括,检测幽门螺杆菌16S rRNA基因,检测幽门螺杆菌cagA毒性基因,确定cagA毒性基因的基因型,以及检测抗生素耐药性的幽门螺杆菌菌株。16S基因的存在证明存在幽门螺杆菌感染。检测出并确定cagA基因的基因型允许评估菌株的毒性,并对患者体内可能发展与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险进行分类。检测23S基因内的突变可以评估患者的感染是否对抗生素治疗具有敏感性或耐药性。在特定的实施范例中,每个参数通过spdPCR测试被评估。所描述的化验方法对幽门螺杆菌感染的符合/密度提供信息。本发明的方法能对每个样品中基因组的数量以及每个特定基因型的细菌的数量提供量化信息,是对之前所有测试方法的改进。
对说明图的描述
图1显示了该测序方法是样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)(这里,微滴数字TMPCR(ddPCRTM)(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA))的扩增图,幽门螺杆菌阴性的粪便样品中加入幽门螺杆菌阳性DNA基因组。图中每一点代表一滴。超过域值(设定在3000)的点表明含有幽门螺杆菌16S。域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌16S。每ul中的预期拷贝值显示在左方,每ul中测量获得的拷贝值(Ch2-Conc.)以及阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。
图2显示了复合16S和cagA基因试验spdPCR(这里,ddPCRTM)扩增图。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入两种含有cagA基因的幽门螺杆菌菌株(Oki573以及Em47-1)的基因组DNA。图中每一点代表一滴。左边图中(16S探针)超过域值(设定在3000)表明含有幽门螺杆菌16S rRNA基因。右边图(cagA探针)中超过域值(设定在6000)的点表明含有幽门螺杆菌cagA基因。域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌。每ul中测量获得的拷贝值(Ch2-Conc.,Ch1-Conc.)以及阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。16S拷贝的浓度被期望是cagA基因拷贝的两倍,因为在幽门螺杆菌基因组中含有两份的16S基因以及一份的cagA基因。
图3显示了cagA EPIYA基因分型试验spdPCR(这里,ddPCRTM)扩增图。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入两种幽门螺杆菌菌株的基因组DNA:含有东亚型cagA基因Oki573菌株,以及含有西方型cagA基因的Em47-1菌株。图中每一点代表一滴。左边图中(EPIYA-D探针)超过域值(设定在2000)表明含有cagA基因的东亚等位基因。右边图(EPIYA-C探针)中超过域值(设定在2000)的点表明含有幽门螺杆菌cagA基因的西方等位基因。域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌。每ul中测量获得的拷贝值(Ch2-Conc.,Ch1-Conc.)以及阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。
图4显示了克拉霉素耐药性试验的spdPCR(这里,ddPCRTM)扩增图。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入不同比例的克拉霉素敏感性幽门螺杆菌菌株的基因组DNA以及含有一个23S点突变的克拉霉素耐药性等基因幽门螺杆菌菌株的基因组DNA,所述的比例显示在图的左方。图中每一点代表一滴。左边图中(检测克拉霉素敏感性的探针)超过域值(设定在3000)表明含有克拉霉素敏感性幽门螺杆菌。右边图中(检测克拉霉素耐药性的探针)超过域值(设定在3500)表明含有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌。左图和右图中域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌。每ul中测量获得的拷贝值(Ch2-Conc.,Ch1-Conc.)以及阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。
图5显示了通过使用ddPCR检测克拉霉素敏感性和克拉霉素耐药性突变DNA比例范围的克拉霉素耐药性突变幽门螺杆菌DNA的丰度分数。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入不同比例的克拉霉素敏感性幽门螺杆菌菌株的基因组DNA以及克拉霉素耐药性等基因幽门螺杆菌菌株的基因组DNA,所述的比例显示在x轴上。克拉霉素敏感性和克拉霉素耐药性突变幽门螺杆菌的基因组拷贝数目使用ddPCRTM方法量化检测。图中的棒代表两次测试泊松95%信心值。
图6显示了幽门螺杆菌的16S ddPCR扩增图,幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入三种不同浓度的幽门螺杆菌基因组DNA。图中每一点代表一滴。图中超过域值(设定在4500)表明含有幽门螺杆菌16S基因。域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌16S基因。ddPCR反应每μl中所预期的幽门螺杆菌基因组拷贝数目以及ddPCR反应每μl中所测得的幽门螺杆菌16S基因数目被显示在扩增图上方,括号中显示泊松95%信心间隔。每个样品被测试两次,每次20μl,每个反应的结果被综合。
图7显示使用ddPCR量化每μg粪便DNA中幽门螺杆菌16S基因拷贝数量的幽门螺杆菌粪便中负荷的分析方法。A)50个哥斯达黎加粪便样品被分别使用ddPCR测试两次,比较这些样品中幽门螺杆菌16S拷贝数量。数据被配上走向线,并显示相应的线性方程和相关系数(R2)。B)cagA血清抗体测试显阳性的幽门螺杆菌阳性的哥斯达黎加志愿者的25个粪便样品中16S的拷贝数目,以及cagA血清抗体测试显阴性的幽门螺杆菌阳性的哥斯达黎加志愿者的12个粪便样品中16S的拷贝数目的箱行图(箱子代表百分位数以及中位数,胡须代表数据的最小以及最大值)。威尔科克森秩和检验(p=0.009)被用来比较每μg cagA抗体阳性以及cagA抗体阴性个体的粪便中DNA的幽门螺杆菌16S拷贝数量。
图8显示cagA基因检测测试(探针:cagA_FAM)以及cagA EPIYA基因分型试验(探针:EPIYA-C_HEX以及EPIYA-D_FAM)。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA中加入幽门螺杆菌基因组DNA。每μl ddPCR反应的幽门螺杆菌16S拷贝数量显示在每个被加入幽门螺杆菌基因组DNA的菌株后面的括号内。左侧的图是北美幽门螺杆菌菌株,Em47-1,的扩增图,其中,西方cagA基因编码EPIYA基序。右方的图是日本幽门螺杆菌菌株,Oki573,的扩增图,其中,东亚cagA基因编码EPIYA-D基序。图中每一点代表一滴。超过域值(cagA基因检测试验的域值设定在6500,cagA EPIYA基因分型测试的域值设定在2000)表明cagA基因阳性。不同图的y轴的大小不同。每微升ddPCR反应的cagA基因拷贝的数目显示在每个扩增图的右边。阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。每个样品被测试两次,每次20μl,每个反应的结果被综合。
图9显示了克拉霉素耐药性试验的扩增图。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入克拉霉素敏感性幽门螺杆菌野生型菌株的基因组DNA以及三个克拉霉素耐药性等基因幽门螺杆菌菌株的基因组DNA。图中每一点代表一滴。上方图中(检测野生型的探针)超过域值(设定在2000)表明含有克拉霉素敏感性幽门螺杆菌。下方图中(检测克拉霉素耐药性突变的探针)超过域值(设定在4000)表明含有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌。上图和下图中域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌。右边图标中显示测试样品A01至H01中所加入的幽门螺杆菌基因组DNA。
图10不同比例的野生型与克拉霉素耐药性突变DNA中,通过ddPCR检测获得的克拉霉素耐药性突变幽门螺杆菌DNA的丰度分数(实心标志)以及预期的丰度分数(空心标志)的图。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入克拉霉素敏感性幽门螺杆菌野生型菌株的基因组DNA以及三个克拉霉素耐药性等基因幽门螺杆菌菌株的基因组DNA(方形:A2143G突变,圆形:A2142G突变,三角形:A2142C突变),其中,所述比例现实在X轴上。每个加入DNA的菌株中通过ddPCR测量获得的23S拷贝数目备用来计算预期丰度分数。图中的棒代表两次测试泊松95%信心值。
图11显示支持本发明的其他序列。
发明内容详细描述
全世界有多于一半的人胃部有幽门螺杆菌感染,美国人中的1/3也有这样的感染。幽门螺杆菌能引起从无症状的胃炎(胃部发炎)到消化性溃疡以及胃癌等一系列疾病,但同时也能免疫其他疾病,例如食道癌以及哮喘。人类和细菌的遗传变异性似乎能导致不同的疾病结果。幽门螺杆菌在感染过程中具有种间遗传多样性以及种内遗传多样化。
对幽门螺杆菌的非侵入型测试包括血清测试,尿素呼气试验,以及粪便抗原试验。这些测试具有不同程度的敏感度和专一性,并且不能通过确定幽门螺杆菌的基因型来评估抗生素的耐药性,是否存在毒性基因或等位基因,也无法跟踪在人群中的传播。基于PCR的方法(多轮传统PCR或者实时PCR)用于粪便中的检测幽门螺杆菌的DNA,其中,对PCR产物进行测序从而确定幽门螺杆菌的基因型。这种方法测试幽门螺杆菌感染的敏感度在25%至92%之间(Falsafi et al.,World J.肠胃病学,15,484-488(2009);Hirai et al.,医用微生物学期刊,58,1149-1153(2009);Puz et al.,肠胃病学,135,1543-1551(2008);Sicinschi et al.,螺杆菌,17,96-106(2012);Sicinschi et al.螺杆菌,8,601-607(2003)).
基于PCR的用于检测和测定幽门螺杆菌基因型的测试方法由于敏感度,重复性,以及由污染造成的假阳性等原因,没有被使用在传染病学研究或诊断中。
商业可获得的用于粪便样品的测量克拉霉素耐药性的实时PCR测试,Ingenetix的幽门螺杆菌的ClariRes测试,是基于由Schabereiter-Gurtner等发展的测试方法(医用微生物学期刊,42(10),4512(2004))。该测试使用引物和一个探针检测导致克拉霉素耐药性的23S基因中的三个主要点突变,所述的一个探针匹配野生型(克拉霉素敏感性)核苷酸序列。熔解曲线分析法用于检测克拉霉素耐药性。混合感染的存在(克拉霉素耐药性以及克拉霉素敏感性幽门螺杆菌)导致两个融化温度,但只有当耐药性克拉霉素的存在量大于总体的10%时,才能检测出克拉霉素耐药性。该用于粪便样品的测试的敏感度是73%。
本发明说所描述的是使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)的方法,试剂盒以及试剂成分来非入侵地检测幽门螺杆菌感染以及其基因型。所述的方法,试剂盒以及试剂成分提供相对于目前的测试更好的敏感度,并加入了量化幽门螺杆菌负荷以及确定基因型比例的特征。本发明的方法,试剂盒以及试剂成分允许检测幽门螺杆菌16S rRNA基因,检测幽门螺杆菌cagA毒性基因,确定cagA毒性基因的基因型,以及通过检测23S基因中的突变来检测抗生素耐药性的幽门螺杆菌菌株。
所述的方法,试剂盒以及试剂成分提供基于spdPCR的测试方法用来扩增,检测,量化,以及/或者确定粪便中幽门螺杆菌的基因型。本发明相对于多轮传统的PCR或者实时PCR方法具有更高的敏感度以及重复性。所述的方法,试剂盒以及试剂成分也并加入了量化幽门螺杆菌负荷以及确定基因型比例的特征。在设计以及优化这些方法,试剂盒以及试剂成分时,非侵入检测以及确定幽门螺杆菌的基因型方法的至少两种困难被克服:粪便样品中低含量的幽门螺杆菌,以及幽门螺杆菌菌株间核苷酸的变异性。如所述,以及重要的是,所述化验方法提供幽门螺杆菌感染的负荷/密度。本发明在每个样品中能获得基因组数量的信息,从而能获得指定基因型的细菌的数量的信息相对于之前的测试有长足的改善。
所述的方法,试剂盒以及试剂成分不仅具有临床,同时也具有科研意义。幽门螺杆菌16S化验能在临床被用来作为幽门螺杆菌非侵入测试使用,同时,也能进行之前不可能进行的幽门螺杆菌感染的传染病学研究。所述cagA检测和cagA EPIYA基因分型测试可以被用来检测能增加病人患有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的幽门螺杆菌菌株,从而可以为所检验的人群量身制定相应的监控和治疗方案。所述的抗生素耐药性化验可以在临床被用来检测耐药性,从而帮助制定治疗方案件以及在人群中监控抗生素耐药性。
幽门螺杆菌的样品包括存放在美国模式培养物保藏所(ATCC)的菌株ATCC 43504;43571;43629;以及49053。因为幽门螺杆菌菌株在基因层面上具有高度多样性,(Fujimoto等,医用微生物学期刊,32,331-334(1994)),并且患者可以被多于一种的菌株感染,所以,重要的是根据多个菌株中保守的或一致的片断设计探针以及引物。
“探针”指的是有序列针对性的单链核苷酸,该单链核苷酸的序列和需要被检测的目标核苷酸序列(目标)互补。这里的互补指的是,探针的序列恰好能与目标序列杂交。
在特定的实施范例中,在一些情况下,本发明需要检测碱基对不匹配,可能需要非常严格的杂交条件,该条件只能允许完全互补的序列进行杂交。即使在这样的实施范例中,探针的长度可能有变化,需要注意的是,因为探针的中心部位对其杂交特性具有至关重要的作用,针对目标序列,当使用比较长的探针时候,可以允许探针在其头部和尾部有变化。这些变化,通过试验评估,可以导致相对于完全互补的探针可以接受的等同的杂交特性。“可以接受的等同的“指在杂交结果中没有统计学上有意义的区别。
探针一般可以有5至50个核苷酸,在一些实施范例中可以有10至25个核苷酸,或15至20个核苷酸。核苷酸包括核糖核苷酸,脱氧核糖核苷酸,以及修饰了的核苷酸,例如肌苷或含有修饰基团的核苷酸,这些基团基本不改变核苷酸的杂交特性。
“引物”在这里指的是寡核苷酸,该寡核苷酸用来启动核酸合成,例如,在四个核苷酸三磷酸,合适的酶以及合适的温度下,开始核酸合成。特定的长度和序列取决于目标DNA或RNA的复杂程度,以及引物使用时的条件,例如,温度和离子强度。在特定的实施范例中,一个引物的长度可以是5至50个核苷酸,在更特殊的实施范例中,一个引物的长度可以是10至25个核苷酸或15至20个核苷酸。相关文献中充分记载,引物不需要与相应的模板序列完全匹配才能达到扩增的目的。相关文献举例,Kwok et al.,核算研究,18(4),999-1005(1990).
“寡核苷酸”指的是含有两个或多个核苷酸的分子。寡核苷酸包括探针和引物。作为探针或引物的寡核苷酸也包括核苷酸类似物,例如,硫逐磷酸酯(Matsukura等.,美国国家科学院院刊84(21),7706-10(1987)),烃化硫逐磷酸酯(Miller等,生物化学18(23),5134-43,(1979)),肽核酸(Nielsen等,科学254(5037),1497-500(1991);Nielsen等.,抗癌药物设计8(1),53-63(1993))或插入剂(Asseline等,美国国家科学院院刊USA 81(11),3297-301(1984)).加入这些修饰的优势在于可以正面影响例如瓜核苷酸分子的杂交动力学,杂交形成可逆性,以及其生物稳定性等特征。
本发明中所指的寡核苷酸序列都是指从5′端至3′的单链DNA寡核苷酸。如同本发明的现有技术人员理解的是,每个这样的序列也包括其互补的形式和其RNA形式(T被U取代)。同时公布的是与本发明公布的寡核苷酸序列90%相同的序列,与本发明公布的寡核苷酸序列91%相同的序列,与本发明公布的寡核苷酸序列92%相同的序列,与本发明公布的寡核苷酸序列93%相同的序列,与本发明公布的寡核苷酸序列94%相同的序列,与本发明公布的寡核苷酸序列95%相同的序列,与本发明公布的寡核苷酸序列96%相同的序列,与本发明公布的寡核苷酸序列97%相同的序列,与本发明公布的寡核苷酸序列98%相同的序列,或与本发明公布的寡核苷酸序列99%相同的序列。
“%序列一致性”指的是通过比较两个或多个序列而决定出的这些序列之间的关系。在现有技术中,“一致性“代表寡核苷酸序列之间的关系,通过对比其的序列。“一致性“(通常指“相似性,,)可以通过已知的方法来计算,包括在如下文献中公布的方法:计算分子生物学(Lesk,A.M.,ed.)牛津大学出版社,纽约(1988);生物计算:信息学和基因组项目(Smith,D.W.,ed.)学术出版社,纽约(1994);计算机分析的序列数据,部分I(Griffin,A.M.,以及Griffin,H.G.,eds.)胡马纳出版社,新泽西(1994);分子生物学序列分析(VonHeijne,G.,ed.)学术出版社(1987);以及序列分析(Gribskov,M.以及Devereux,J.,eds.)牛津大学出版社,纽约(1992).优选的用于确定序列一致性的方法被设计出用于给出被测试的序列间最好的匹配。用于确定序列一致性和相似性的方法被编码在公众可获得的电脑程序中。序列对比和相同比例的计算使用LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序获得(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)。序列的多重对比可以使用Clustal对比方法进行(Higgins and Sharp CABIOS,5,151-153(1989),使用系统设定的参数(GAP PENALTY=10,GAP LENGTH PENALTY=10)。相关的程序也包括GC程序套件(Wisconsin Package版本9.0,遗传学电脑集团(GCG),麦迪逊,威斯康星州);BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul,等,分子生物学杂志.215,403-410(1990);DNASTAR(DNASTAR,Inc.,麦迪逊,威斯康星州);以及合并有Smith-Waterman算法的FASTA程序(Pearson,电脑方法基因组研究,[Proc.Int.Symp.](1994),Meeting Date 1992,111-20.Editor(s):Suhai,Sandor.出版商:Plenum,纽约,N.Y.)。需要说明的是,本发明中,当使用软件对序列进行分析时候,均使用“系统设定的参数”来获得分析结果。“系统设定的参数”指的是在软件一开始被启动时,系统具有的数值或参数。
本发明的公布还包括与已公布的序列在非常严格的条件下杂交的序列。非常严格的条件包括,例如,使用DIG标记的DNA探针在42℃,一种DigEasyHyb溶液中(德国罗氏诊断有限公司),或含有50%甲酰胺,5XSSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠),0.02%十二烷基硫酸钠,0.1%N-十二烷酰基肌氨酸以及2%阻滞剂的溶液中(德国罗氏诊断有限公司)下培养2小时至4天(使用DIG标记系统进行准备,德国罗氏诊断有限公司,68298,曼海姆,德国),接下来在室温下使用2XSSC以及0.1%SDS洗涤过滤器两次,一共5至15分钟,然后使用0.5XSSC以及0.1%SDS溶液或者0.1XSSC以及0.1%SDS溶液在65-68℃下洗涤两次,一共15至30分钟。
寡核苷酸可以通过任何适当的手段制成,包括,克隆含有相应核苷酸序列的插入片断的重组质粒,需要时,使用核酸酶将插入片断切出,并通过根据其不同分子质量的分离的方法,将起分离重新获得。寡核苷酸也可以通过化学合成的方法获得,例如传统的磷酸三酯方法。
幽门螺杆菌基因。一个“基因“指的是编码幽门螺杆菌蛋白的寡核苷酸序列,或者,一个不具有编码功能的但是具有多种功能的RNA,例如,tRNA,rRNA,asRNA。如果现有技术人员所理解的,该定义包含各种序列多态性,突变,以及/或者序列变化。在一些特殊的实施范例中,序列多态性,突变,以及/或者序列变化不影响其编码产品的功能。“基因“不仅仅包括编码序列,也包括调控区域,例如,启动子,增强子,以及终止区域。“基因“进一步包括内含子,以及从mRNA转录产物中拼接获得的其他DNA序列,以及从其他拼接点获得的其他序列。编码幽门螺杆菌蛋白的核酸序列可以是指导幽门螺杆菌蛋白或RNA表达的DNA或者RNA。这些核酸序列可以是转录成RNA的DNA序列,或者一个转译成蛋白的RNA序列。所述核酸序列包括全长核酸序列以及从全长蛋白或RNA获得的非全长序列。所述序列可以包括自身序列的简并密码子或被加入的用于提供密码子偏好性的序列。除了特殊的序列,本发明所叙述的编码幽门螺杆菌蛋白以及RNA的基因序列可在公开的数据库以及文献中获得,本发明也公开了这些文献。
16s rRNA基因。16S rDNA基因是在所有细菌中发现的原核DNA中的一部分。该基因高度保守,但同时也包括高变区,用于细菌鉴定。该基因编码rRNA,是核糖体的一部分。核糖体自身由两部分组成,大亚单位以及小亚单位(分别是LSU以及SSU)。在大多数的细菌中,16S rRNA基因编码SSU,23S rRNA编码LSU。
幽门螺杆菌的16S rRNA基因的序列信息可以在,例如,基因库中找到,号码如下:HM046432.1;HM046431.1;M86748.1;M55309.1;M55307.1;M55306.1;and M55305.1.
cagA毒性基因---检测以及基因型分型。幽门螺杆菌的cagA基因是表达细胞毒性相关蛋白A的基因。基因库中不同幽门螺杆菌菌株的编码cagA基因的序列的长度不同,但是平均长度为820个碱基对,主要从编码序列的3'端开始。60%的幽门螺杆菌菌株含有cagA基因。
根据免疫印迹研究显示,感染有cagA(+)-菌株的患者,相对于感染有cagA(+)-菌株的患者,具有更高度的胃炎以及上皮细胞损伤。另外,在感染有cagA(+)-菌株的患者体内含有相对于感染有cagA(+)-菌株的患者更多的细胞因子的表达(Huang等.,感染以及免疫63(5),1732-8(1995)).。因为炎症的程度以及上皮损伤的程度与胃癌的发病机制相关,所以,当确定幽门螺杆菌感染之后,检查cagA基因是否存在是很重要的。
cagA基因根据在蛋白C端的EPIYA氨基酸基序可被分为西方等位基因型,以及东亚等位基因型。西方cagA基因编码EPIYA-C基序,东亚cagA基因编码EPIYA-C基序。含有东亚cagA等位基因的菌株与增强的胃癌的风险相关联。
根据以上所述,cagA基因的存在以及种类对感染有幽门螺杆菌的患者是否会发展有胃部疾病进行分类很重要。这些胃部疾病包括慢性活动性胃炎,胃十二指肠溃疡,胃腺癌,粘膜相关淋巴组织(MA LT)型淋巴瘤,无症状的胃炎,消化性溃疡,以及其他胃癌。
幽门螺旋杆菌分离株的cagA编码序列的基因库号码包括:AB057096,AF222808,AB057098,AY330639,AB090088,AY330637,AF247651,AB057095,AB057072,AB057090,AB057094,AB057060,AB057070,AB057078,AB057065,AB057084,AB057075,AY330644,AB057064,AF222809,AF289439,AF289442,AF289460,AF479032,AB057074,AB057088,AB190940,AF289433,AF289433,AF289462,AF289462,AB090143,AF289457,AF289450,AF083352,AB057068,AB057085,AB057061,AF289444,AB057086,AB190956,AB190948,AB190942,AF289447,AF289447,DQ011620,AF289443,AF222807,AF289436,AB190941,AF289463,AB190951,AB090147,AB190950,AB057073,AF289458,AF289458,AF289448,AF289448,AB190953,AY330642,AY330642,AB090146,AF289461,AF289461,AF289440,AF289440,AB057089,AB057099,AF427099,AB057093,AF289452,AF289445,AF289445,AF289455,AF289455,AF289453,AF289453,DQ067454,AF282853,U60176,AF202973,AB015413,AB015416,AF001357,AB003397,AB057003,AB090090,AF289446,AB190947,AB090086,AF289434,AF289438,AF289451,AB110963,AB057071,AB015415,AB190949,AB090151,以及AB057069.
抗生素耐药性。在一些特定的实施范例中,本发明的方法,试剂盒以及试剂成分被用来确定可能对抗生素具有耐药性的患者。这些抗生素包括,阿米卡星,庆大霉素,卡那霉素,新霉素,乙基西梭霉素,链霉素,妥布霉素,氯碳头孢,厄他培南,亚胺培南,西司他丁,美罗培南,头孢羟氨苄,头孢唑啉,头孢氨苄,头孢克洛,头孢羟唑,头孢西丁,头孢罗齐,头孢呋辛,头孢克肟,头孢地尼,头孢托仑,头孢哌酮钠,头孢噻肟,头孢泊肟,头孢他啶,头孢布烯,头孢唑肟,头孢磺啶,头孢吡肟,替考拉宁,万古霉素,阿奇霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,氨曲南,阿莫西林,氨苄青霉素,阿洛西林,羧苄青霉素,氯洒西林,双氯青霉素,氟氯西林,美洛西林,萘夫西林,盘尼西林,哌拉西林,羟基噻吩青霉素,杆菌肽,粘菌素,多粘菌素B,环丙沙星,依诺沙星,加替沙星,左氧氟沙星,洛美沙星,莫西沙星,诺氟沙星,氧氟沙星,曲伐沙星,磺胺米隆,百浪多息,磺胺醋酰,磺胺甲二唑,磺胺,柳氮磺胺吡啶,磺胺异恶唑,甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲恶唑,磺胺甲基异恶唑,地美环素,强力霉素,二甲胺四环素,氧四环素,四环素,氯霉素,克林霉素,乙胺丁醇片,磷霉素,呋喃唑酮,异烟肼,利奈唑胺,甲硝哒唑,莫匹罗星,呋喃咀啶,平板霉素,吡嗪酰胺,奎奴普丁/达福普汀,利福平,壮观霉素,两性霉素B,氟康唑,氟嘧啶,庆大霉素,甲氧西林,苯甲异噁唑青霉素,以及克拉维酸。
抗生素的耐药性通过检测幽门螺旋杆菌23S基因的突变来评估。如上所述,幽门螺旋杆菌23S基因编码核糖体LSU。
下述表格1总结了由于幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变导致的抗生素耐药性
表1.幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变导致的抗生素耐药性
A=腺嘌呤;G=鸟嘌呤;C=胞嘧啶;U=尿嘧啶;R=耐药;Cla=克拉霉素;Azm=阿奇霉素;Ery=红霉素;Mac=大环内酯类;Lin=林可酰胺类抗生素;MLSB=大环内酯类,林可酰胺类抗生素以及链霉素B.
23S基因中的位置取决于相关的幽门螺旋杆菌的序列,该序列在Megraud,耐药性的更新4,178-186(2001)中有描述。
样本分区数字PCR(spdPCR).传统的PCR能使一个样品中的核酸序列(例如模板或目标核酸)指数扩增。通过测量达到扩增域值所需要的扩增周期的数量(例如实时PCR),可以计算核酸的起始浓度。但是,有很多因素能够影响PCR指数扩增过程的过程,例如,改变扩增效率,起始核酸的低拷贝数量,以及与背景污染核酸的竞争。
spdPCR一般是对这些因素不敏感的,因为它不基于指数扩增。在spdPCR中,核酸分子从原来的样品中被分离分隔,然后扩增至可以检测到的水平。每次分隔提供分隔内关于每个核酸目标分子是否存在的电子信息。当使用这种技术测量足够的分隔时,可以整合电子信息获得样品中相关的核酸目标的起始浓度。在多个目标核酸被分析的实施范例中,样本分区数字PCR提供多个目标核酸的比例或浓度绝对或相对值的统计相关的测量。表3中显示传统PCR和spdPCR的结果的比较。
一些实施范例中也使用定性spdPCR。基于定性spdPCR的分析判定在一个分隔的样品中是否存在一个目标,一般对目标没有定量。可以使用定性spdPCR来判定一个分隔的样品是否存在目标。在一些实施范例中,定性spdPCR被用来确定目标阳性的分隔样品的百分比。定性spdPCR用来判定在分隔样品组中是否存在至少域值百分比的阳性样品。
在一些实施范例中,spdPCR包括微滴式数位PCR(ddPCRTM)(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA).ddPCR技术使用微流体和表面活性剂化学的组合将PCR样品分成油包水的微滴。Hindson et al.,分析化学83(22):8604-8610(2011).微滴支持其所含的目标模板分子的PCR扩增,并且使用最常见的塔克曼探针化验中使用的试机以及工作流程。
PCR以后,每个微滴被分析或在一流式细胞分析仪中被读取,用来确定在原样品中PCR阳性的微滴的部分。这些数据通过泊松统计被分析确定在原来样品中的目标浓度。查照Bio-Rad微滴式数位PCR(ddPCRTM)技术。
ddPCRTM是优选的spdPCR技术,其他基于相同原理的样品分隔PCR方法可以被使用。这些方法现在被更广义地描述。
样品分割。大量的方法可以被用来将样品分割成不连续的单元(例如,微滴)。典型的分隔方法以及系统包括使用如下一种或多种方法:乳化,液滴驱动,微流体平台,连续流微流体,试剂的固定化,以及其组合。在一些实施范例中,分隔被用来将样品分成足够量的分隔体,每个分隔体含有一个或不含有核酸分子。在一些实施范例中,分隔体的数量和尺寸取决于大快样品的浓度和体积。
通过乳化将大块体积分隔成分隔体的方法和装置被公布在Nakano等.生物技术期刊102,117-124(2003)以及Margulies等.自然437,376-380(2005).用来产生油包水的微滴的系统和方法被描述在美国申请No.2010/0173394中。通过微流体系统和方法将大块体积分隔成分隔体被公布在美国申请Nos.2010/0236929;2010/0311599;以及2010/0163412,以及美国专利No.7,851,184中。通过微流体系统和方法产生单分散液滴被公布在Kiss等分析化学80(23),8975-8981(2008).进一步的通过管道,阀门,泵等用于操控以及/或者分隔样品的微流体系统和方法被公布在美国专利7,842,248中.连续流动微流体系统和方法被公布在Kopp等.,科学,280,1046-1048(1998).
分隔方法可以通过微滴操控技术被增强,这些技术包括电的(例如,静电驱动,双向电泳),磁的,热的(例如,热马朗戈尼效果,热毛细),机械的(例如,表面声波,微泵,蠕动泵),光学的(例如,光电润湿,光学镊子),以及化学方法(例如,化学梯度)。在一些实施范例中,一个液滴微驱动装置装备有一个微流体平台(例如,连续流组件)。
一些实施范例使用一个液滴微驱动装置。液滴微驱动装置可以操控微滴,例如调剂,分裂,转移,合并,混合,搅动等。微滴操控技术被公布在美国申请Nos.2006/0194331,和2006/0254933,和美国专利Nos.6,911,132;6,773,566;以及6,565,727.
扩增.样品中被分隔的核酸可以通过适当的PCR技术被扩增。典型的PCR技术包括等位基因特异性PCR,装配PCR,不对称PCR,端点PCR,热启动PCR,原位PCR,序列间特异性PCR,反向PCR,先指数后线性PCR,连接介导PCR,甲基化特异性PCR,小引物PCR,多重连接依赖性探针扩增,复合PCR,嵌套式PCR,重叠延伸PCR,聚合酶循环组装,定性PCR,定量PCR,实时PCR,单细胞PCR,固相PCR,温度不对称PCR,递减PCR,普遍快走PCR,等等.也可以使用连接酶链式反应(LCR)。
PCR可以通过使用耐热DNA聚合酶进行,例如Taq DNA聚合酶(例如,野生型酶,Stoffel片段,FastStart聚合酶等),Pfu DNA聚合酶,S-Tbr DNA聚合酶,Vent DNA聚合酶,或者其组合等。
PCR和LCR通过热循环被驱动。其他的等温扩增反应也可以被使用。典型的等温技术包括分支引物DNA分析,层叠RCA,解旋恒温基因扩增技术,环介导等温扩增法(LAMP),酸序列依赖性扩增(NASBA),切口酶扩增反应(NEAR),PAN-AC,Q-beta复制酶扩增反应,滚环复制(RCA),自我维持的序列复制,链置换扩增,等.
扩增反应可以通过合适的试机进行(例如,模板核酸(例如,DNA或RNA)),引物,探针,缓冲液,复制催化酶(例如,DNA聚合酶,RNA聚合酶;),核苷酸,盐(例如,MgCl2),等。在一些实施范例中,扩增混合物包括以下成分的任何组合,至少一个引物或引物对,至少一个探针,至少一个复制酶(例如,至少一个聚合酶),以及脱氧核苷酸(以及/或者核苷酸)三磷酸盐(dNTPs以及/或者NTPs),等。
扩增试剂可以在分隔前,分隔时,以及/或者分隔后加入样品中。在一些实施范例中,所有的分隔被置于扩增条件下(例如,试剂以及热循环),但是扩增只在含有目标核酸的分隔体中进行(例如,含有与加入样品中的引物互补序列的核酸)。模板核酸可以是一个分隔体中扩增反应的限定性反应物。在一些实施范例中,一个分隔体中含有一个或不含有目标(模板)核酸分子。
在一些实施范例中,核酸目标,引物,以及/或者探针被固定在一个界面上,例如,一个底物,盘子,阵列,珠子,颗粒,等等。对一个或多个反应试剂的固定能提供(帮助):分隔试剂(例如,目标核酸,引物,探针,等),控制每个分隔体中试剂的数量,以及/或者控制在每个分隔体中一个试剂和另一个试剂的比例。在一些实施范例中,测试的试剂以及/或者目标核酸被固定在界面上,但同时保留与其他试剂相互作用以及/或者反应的能力(例如,从一个微流体平台上分发的试剂,一个液滴微驱动装置,等)。在一些实施范例中,试剂被固定在底物和液滴上或者被分隔的试剂和固定的试剂接触。将核酸以及其他试剂固定在界面上的技术是本领域的技术人员熟知的。例如,美国专利No.5,472,881以及Taira等.Biotechnol.Bioeng.89(7),835-8(2005).
目标序列检测。可以使用检测方法确认含有被扩增的目标的样品分隔体。检测可以根据样品分隔体的一个或多个特征,例如,和扩增有关的物理的,化学的,发光的,或电方面的特征。
在一些实施范例中,使用荧光检测方法检测扩增的目标,以及/或者确认含有目标的样品分隔体。典型的荧光检测试剂包括TaqMan探针,SYBR绿色荧光探针,分子信标探针,蝎子探针,以及/或者LightUp(LightUp科技AB,胡丁格,瑞典).其他的检测试剂和方法被公布在,例如美国专利5,945,283;5,210,015;5,538,848;以及5,863,736;国际公布WO 97/22719;以及文献:Gibson等,基因组研究,6,995-1001(1996);Heid等.,基因组研究,6,986-994(1996);Holland等.,美国国家科学院院刊88,7276-7280,(1991);Livak等.,基因组研究,4,357-362(1995);Piatek等,自然,生物科技.16,359-63(1998);Neri等.,核酸和蛋白质的发展分析,3826,117-125(2000);Compton,自然350,91-92(1991);Thelwell etal.,核酸研究,28,3752-3761(2000);Tyagi以及Kramer,自然,生物科技.14,303-308(1996);Tyagi等,自然,生物科技.16,49-53(1998);以及Sohn et al.,美国国家科学院院刊97,10687-10690(2000)。
在一些实施范例中,检测试剂中包含加入到大块或分隔后的样品中的扩增试剂。在一些实施范例中,扩增试剂也被用作为检测试剂。在一些实施范例中,检测试剂在扩增以后被加入分隔体中。在一些实施范例中,根据含有扩增目标的样品分隔体的检测来测量样品中目标核酸的绝对拷贝数目和相对比例(例如,相对于其他目标核酸,相对于非目标核酸,相对于总共核酸)。
在一些实施范例中,在扩增以后,含有扩增目标的样品分隔体和不含有扩增目标的样品分隔体或含有其他扩增目标的样品分隔体被分离。在一些实施范例中,样品的分隔体在扩增以后根据样品分隔体的物理,化学,以及/或者光学特征,其含有的核酸(例如,浓度),以及/或者检测试剂的状态,被分类。在一些实施范例中,样品分隔体为之后的操控,处理以及/或者分析其中的扩增的目标被分离。在一些实施范例中,具有相似特征的样品分隔体(例如,相同的荧光标记,相似的核酸浓度,等等),被归在一起以备之后的操控,处理,以及/或者分析。
可以根据spdPCR结果与参考水平的对比结过来区分患者是否具有发展与幽门螺旋杆菌感染相关联的胃部疾病危险,以及/或者患者具有对一种抗生素有耐药性或敏感性的幽门螺旋杆菌感染。参考水平可以包括“正常“或者,,参考“或者参考值,定义根据,例如歧视限制或者定义域值的危险,从而能定义界值点以及/或者幽门螺旋杆菌负荷或者类型的不正常值。参考水平可以是在一个没有幽门螺旋杆菌感染的人中发现的标记水准。同义词包括"指标,""基线,""标准,""健康,""感染前,"等.根据所述标记是否单独使用或者在一个配方中与其他标记一起使用输出一个分数,所述的标准水平也会不同。或者,也可以从之前没有幽门螺旋杆菌感染,没有发展与之相关联的胃部疾病或抗生素耐药性的被测个体中获得分数的数据库中获得参考水平。参考水平也可以从,例如,参考个体,或者幽门螺旋杆菌状态已知的人群中获得,参考水平也可以也可以从一个或多个经历过幽门螺旋杆菌治疗的个体中获得,或者从治疗后有改善的幽门螺旋杆菌的患者中获得。在一些实施范例中,参考水平可以从一个或多个没有获得治疗的幽门螺旋杆菌患者中获得。参考水平也可以从幽门螺旋杆菌感染,与之相连的胃部疾病以及/或者抗生素耐药性算法或人群研究中的计算指数中获得。
在一些实施范例中,一个“参考水平“可以指幽门螺旋杆菌感染,胃部疾病风险或抗生素耐药性的标准化值,该标准化值代表一个与幽门螺旋杆菌感染不相关的水平;一个与胃部风险以及/或者与抗生素耐药性不相关的水平;一个与一种特定类型的幽门螺旋杆菌感染有关的,与其相关联的胃部疾病风险以及/或者抗生素耐药性相关的水平;一个与幽门螺旋杆菌感染程度,与其相关联的胃部分疾病以及/或者抗生素耐药性相关的水平;或者,诊断时与特定个体相关联的水平,在治疗开始,或者在治疗期间时的水平。所述的参考水准可以是一个试验内部的参考水平,一个试验之间的参考水平,或一个在不同测试点可以通用的参考水平,或者可以在一测试地点使用一个特定的化验方法检测幽门螺旋杆菌感染,其相关联的胃部疾病以及/或者抗生素耐药性的特定参考水准。在一些实施范例中,所述参考水准被分为(i)没有幽门螺旋杆菌感染,及相关联的胃部疾病以及/或者抗生素耐药性的个体;或者(ii)没有幽门螺旋杆菌感染,及相关联的胃部疾病以及/或者抗生素耐药性的一群人。参考水准也可以与个体经历治疗的时间点相关,用于监控幽门螺旋杆菌感染的进展或复原,以及其体内及相关联的胃部疾病以及/或者抗生素耐药性。
在一些实施范例中,参考水平可以从一个,,数据集,,中获得。一个数据库代表的是在一所需的条件下在一个样品(或者样品集)中获得的一套数字值。所述数据集中的数据值可以是,例如,通过实验方式从一个样品中获得测量值,并由这些测量值建立一个数据集,或者,从一个服务提供者,例如一个实验室中,或一个数据库或存数所述数据集的服务器中获得数据集。
被试者包括人类,兽医动物(狗,猫,两栖类动物,鸟,等),家禽(马,牛,羊,猪,鸡,等),以及研究动物(猴子,老鼠,鱼,等)。
被试者被归类为含有幽门螺杆菌感染,当其幽门螺杆菌所有的有机体,幽门螺杆菌基因,幽门螺杆菌蛋白,幽门螺杆菌蛋白活性(脲酶活性),或者幽门螺杆菌蛋白或脂质人体特异抗体在被测者器官(组织活检,血液,粪便,唾液,等)内被检测出。当幽门螺杆菌感染被检测出,并特定的毒性基因(例如,cagA)以及/或者其等位基因(例如,cagA EPIYA-D)被检测出时,一个被试者被归类为具有与幽门螺杆菌感染相关联的胃部疾病增加的风险。当一个被试者被归类为具有与幽门螺杆菌感染相关联的胃部疾病增加的风险时,该被试者可以被监控其胃部疾病的发展。或者或另外,该被试者可以在胃部疾病发生前被启动一预防治疗疗程。所谓“预防治疗疗程,,包括对一个没有显示与幽门螺杆菌感染相关联的胃部疾病症状或预兆的被试者进行治疗,或者对只显示出与幽门螺杆菌感染相关联的胃部疾病的早期症状或征兆的被试者进行治疗,该治疗只是为了减少,预防或降低进一步发展胃部疾病的风险。因此,预防治疗的作用在于预防与幽门螺杆菌感染相关联的胃部疾病的发展。对这些胃部疾病潜在的预防治疗的方法包括幽门螺杆菌疫苗或益生菌治疗。
在一些实施范例中,一些被试者由于存在cagA阳性幽门螺杆菌菌株而被归类为具有与幽门螺杆菌感染相关联的胃部疾病风险。在其他的实施范例中,如果被检测出含有cagA的等位基因是东亚cagA等位基因,那么被试者将被归类为具有更高的与幽门螺杆菌感染相关联的胃部疾病风险。该等位基因的存在可以将被试者被归类为具有发展胃癌的危险。
本发明中的方法,试剂盒以及试剂成分可以引导对幽门螺杆菌的治疗方式。“治疗方式”包括对具有幽门螺杆菌感染症状或征兆的被试者实施治疗,治疗的目的是减少,最好是消除,幽门螺杆菌感染。
如果以个被试者被归类为具有抗生素耐药性的幽门螺杆菌,该被试者可以被实施不同的治疗方案,例如一个不同的抗生素。例如,如果一个被试者被归类为含有克拉霉素耐药性的幽门螺杆菌,在一些情况下,该被试者可以用阿奇霉素或红霉素治疗。如果一个被试者被归类为含有阿奇霉素耐药性的幽门螺杆菌,在一些情况下,该被试者可以用克拉霉素或红霉素治疗。如果一个被试者被归类为含有红霉素耐药性的幽门螺杆菌,在一些情况下,该被试者可以用克拉霉素或阿奇霉素治疗。
本发明的所述的方法,试剂盒以及试剂成分提供比之前的方法有更高敏感度的spdPCR化验方法。这些使用本发明的方法,试剂盒以及试剂成分的化验方法可以提供至少84%的敏感度;至少85%的敏感度;至少86%的敏感度;至少87%的敏感度;至少88%的敏感度;至少89%的敏感度;至少90%的敏感度;至少91%的敏感度;至少92%的敏感度;至少93%的敏感度;至少94%的敏感度;至少95%的敏感度;至少96%的敏感度;至少97%的敏感度;至少99%的敏感度或者100%的敏感度.敏感度指的是能在若干个样品中检测出一特定的幽门螺杆菌基因是否存在的能力,其中,已知数量的样品中被加入特定的幽门螺杆菌基因。当化验方法评估存在有多于一个幽门螺杆菌基因时候,被化验的目标的敏感度可以为至少84%的敏感度;至少85%的敏感度;至少86%的敏感度;至少87%的敏感度;至少88%的敏感度;至少89%的敏感度;至少90%的敏感度;至少91%的敏感度;至少92%的敏感度;至少93%的敏感度;至少94%的敏感度;至少95%的敏感度;至少96%的敏感度;至少97%的敏感度;至少99%的敏感度或者100%的敏感度。在特别的实施范例中,测试幽门螺杆菌的16S基因,cagA存在以及EPIYA等位基因,以及幽门螺杆菌抗生素耐药性或者敏感性菌株的敏感度为:被化验的目标的敏感度可以为,所有四次测试中至少84%的敏感度;至少85%的敏感度;至少86%的敏感度;至少87%的敏感度;至少88%的敏感度;至少89%的敏感度;至少90%的敏感度;至少91%的敏感度;至少92%的敏感度;至少93%的敏感度;至少94%的敏感度;至少95%的敏感度;至少96%的敏感度;至少97%的敏感度;至少99%的敏感度或者100%的敏感度。
在特定的一些实施范例中,本发明的试剂盒含有引物,探针以及本发明中公布的用于扩增和检测的试剂。所述的引物和探针可以包括如下序列的多种组组合:序列ID NO:1;序列ID NO:2;序列ID NO:3;序列ID NO:4;序列ID NO:5;序列ID NO:6;序列ID NO:7;序列ID NO:8;序列ID NO:9;序列ID NO:10;序列ID NO:11;序列ID NO:12;序列ID NO:13;序列ID NO:14;序列ID NO:15;序列ID NO:16;序列ID NO:17;序列ID NO:18;序列ID NO:19;序列ID NO:20;序列ID NO:21;序列ID NO:22;序列ID NO:23;序列ID NO:24;以及/或者序列ID NO:25.在一个特定的实施范例中,所述试剂盒含有一种或多种的如下组合:序列IDNO:1;序列ID NO:20;以及序列ID NO:21;(ii)序列ID NO:4;序列ID NO:5;序列ID NO:6;以及序列ID NO:7;(iii)序列ID NO:8;序列ID NO:9;序列ID NO:10;序列ID NO:11;序列IDNO:12;以及序列ID NO:13;以及/或者(iv)序列ID NO:23;序列ID NO:15;序列ID NO:16;序列ID NO:25;序列ID NO:18;以及/或者序列ID NO:19.在一个特定的实施范例中,所述试剂盒含有一种或多种的如下组合:序列ID NO:1;以及序列ID NO:20;(ii)序列ID NO:4;以及序列ID NO:5(iii)序列ID NO:8;序列ID NO:9;序列ID NO:10;以及序列ID NO:11;以及/或者(iv)序列ID NO:23以及序列ID NO:15.在一个特定的实施范例中,所述试剂盒含有一种或多种的如下组合:序列ID NO:21;(ii)序列ID NO:6;以及序列ID NO:7(iii)序列ID NO:12;以及序列ID NO:13;以及/或者(iv)序列ID NO:16;序列ID NO:25;序列ID NO:18;以及序列ID NO:19.
在各种不同的实施范例中,所述试剂盒可以含有说明如何使用试剂盒中以及其中的方法的说明书。在不同的实施范例中,所述试剂盒可以包括关于如何准备引物以及/或者探针,使用引物以及/或者探针,如何正确处理相关垃圾以及类似的说明。该说明可以是打印的形式,放置在试剂盒的纸盒内。该说明页也可以打印在纸盒上或试剂盒的其他部位。说明书可以是一张纸,一本册子,宣传册,CD,或电脑可以读取的装置,或可以再一个遥远的地方给出说明书指令,例如一个网站。该说明书可以使英语,以及/或者任何一种国家或地区的语言。
在各种不同的实施范例中,这里描述的试剂盒包括需要使用试剂盒的一些货所有的供应,从而避免了搜集供应品的需要。所述供给品包括吸量管,吸管尖头,缓冲液,试剂,盘子,薄膜,试管,温度循环器,试管架,手套,消毒液体等等。本发明的试剂盒的成分可以有改动。
本发明的引物,探针,扩增试剂,检测试剂以及说明书可以提供能实施如下敏感度的试剂盒,其中,敏感度为被化验的目标的敏感度可以为至少84%的敏感度;至少85%的敏感度;至少86%的敏感度;至少87%的敏感度;至少88%的敏感度;至少89%的敏感度;至少90%的敏感度;至少91%的敏感度;至少92%的敏感度;至少93%的敏感度;至少94%的敏感度;至少95%的敏感度;至少96%的敏感度;至少97%的敏感度;至少99%的敏感度或者100%的敏感度。
本发明通过以下的实施范例被进一步说明。本领域的技术人员可以知道,对任何实施范例做的修改仍然属于本发明的精神和保护范围。
实施范例:
1.一种用于评估:(a)幽门螺杆菌感染,(b)幽门螺杆菌毒性,(c)与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,以及(d)幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性的方法,该方法包括:化验患者的粪便样品,检测16s幽门螺旋杆菌基因,用于判定幽门螺旋杆菌感染是否存;检测cagA幽门螺旋杆菌基因,用于评估幽门螺杆菌毒性;分析cagA EPIYA等位基因,用于评估与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险;以及分析幽门螺杆菌23s基因的序列,用于评估幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性,该测序方法是样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR),当样品中存在16S基因时证明患者中存在幽门螺杆菌感染,cagA基因的存在确定毒性幽门螺杆菌在患者中的感染,东亚cagA EPIYA等位基因的存在确认患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的提高,以及突变的23S基因的存在确认患者带有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌感染。
2.实施范例1中的方法,其中分析方法包括用序列ID NO:1以及序列ID NO:20扩增16s幽门螺旋杆菌。
3.实施范例1或2中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:21检测16s幽门螺旋杆菌。
4.实施范例1至3中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:4以及SEQ ID NO:5扩增cagA幽门螺旋杆菌基因。
5.实施范例1至4中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:6,序列ID NO:7,以及/或者序列ID NO:22检测cagA幽门螺旋杆菌基因。
6.实施范例1至5中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,以及序列ID NO:11扩增cagA EPIYA等位基因。
7.实施范例1至6中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:12以及序列ID NO:13检测cagA EPIYA等位基因。
8.实施范例1至7中的方法,其中分析方法包括使用使用序列ID NO:23以及序列IDNO:15扩增23S基因。
9.实施范例1至8中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19检测23S基因。
10.实施范例1至9中的方法,其中每个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少84%。
11.实施范例1至10中的方法,其中至少一个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少93%,至少99%或100%。
12.实施范例1至11中的方法,其中所述胃部疾病为一种或多种胃溃疡以及/或者胃癌。
13.实施范例1至12中的方法,其中所述胃部疾病是胃癌。
14.实施范例1至13中的方法,其中23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤突变为胞嘧啶(C),以及/或者位置2143的的腺嘌呤突变为鸟嘌呤。
15.一种用于评估:(a)幽门螺杆菌感染,(b)幽门螺杆菌毒性,(c)与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,以及/或者(d)幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性的方法,该方法包括:化验患者的粪便样品,检测16s幽门螺旋杆菌基因,用于判定幽门螺旋杆菌感染是否存;检测cagA幽门螺旋杆菌基因,用于评估幽门螺杆菌毒性;分析cagAEPIYA等位基因,用于评估与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险;以及分析幽门螺杆菌23s基因的序列,用于评估幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性,该测序方法是样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR),当样品中存在16S基因时证明患者中存在幽门螺杆菌感染,cagA基因的存在确定毒性幽门螺杆菌在患者中的感染,东亚cagA EPIYA等位基因的存在确认患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的提高,以及/或者突变的23S基因的存在确认患者带有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌感染。
16.实施范例15中的方法,其中分析方法包括用序列ID NO:1以及序列ID NO:20扩增16s幽门螺旋杆菌。
17.实施范例15或16中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:21检测16s幽门螺旋杆菌。
18.实施范例15至17中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:4以及SEQ IDNO:5扩增cagA幽门螺旋杆菌基因。
19.实施范例15至18中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:6,序列ID NO:7,以及/或者序列ID NO:22检测cagA幽门螺旋杆菌基因。
20.实施范例15至19中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,以及序列ID NO:11扩增cagA EPIYA等位基因。
21.实施范例15至20中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:12以及序列IDNO:13检测cagA EPIYA等位基因。
22.实施范例15至21中的方法,其中分析方法包括使用使用序列ID NO:23以及序列ID NO:15扩增23S基因。
23.实施范例15至22中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19检测23S基因。
24.实施范例15至23中的方法,其中每个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少84%。
25.实施范例15至24中的方法,其中至少一个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少93%,至少99%或100%。
26.实施范例15至25中的方法,其中所述胃部疾病为一种或多种胃溃疡以及/或者胃癌。
27.实施范例15至26中的方法,其中所述胃部疾病是胃癌。
28.实施范例15至27中的方法,其中23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤突变为胞嘧啶(C),以及/或者位置2143的的腺嘌呤突变为鸟嘌呤。
29.一种用于检测(a)与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,以及(b)幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性的方法,该方法包括检测从患者体内获得粪便样品用以检测(i)是否存在cagA EPIYA等位基因,用于评估与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,以及(ii)幽门螺杆菌23S基因序列用于检测幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性,其中,东亚cagA等位基因的存在确认患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的提高,以及/或者突变的23S基因的存在确认患者带有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌感染。
30.实施范例29中的方法,其中23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),以及/或者位置2143的的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)。
31.实施范例29或30中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,以及序列ID NO:11通过spdPCR扩增cagA EPIYA等位基因。
32.实施范例29至31中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:12以及序列IDNO:13检测cagA EPIYA等位基因。
33.实施范例29至32中的方法,其中分析方法包括使用序列ID NO:23以及序列IDNO:15通过spdPCR扩增23S基因序列。
34.实施范例29至33中的方法,其中分析方法包括通过使用序列ID NO:16,序列IDNO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19检测23S基因序列。
35.实施范例29至34中的方法,其中每个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少84%。
36.实施范例29至35中的方法,其中至少一个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少93%,至少99%或100%。
37.实施范例29至36中的方法,其中所述胃部疾病为一种或多种胃溃疡以及/或者胃癌。
38.实施范例29至37中的方法,其中其中所述胃部疾病是胃癌。
39.一种既能确认一患者具有患有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,又能指导抗生素治疗的方法,该方法包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)评估粪便样品中如下基因的核苷酸顺序,(i)幽门螺杆菌的16S基因,(ii)幽门螺杆菌的cagA基因,(iii)幽门螺杆菌的cagA EPIYA等位基因,以及/或者(iv)与克拉霉素的敏感性或耐药性相关的幽门螺杆菌的23S基因序列,其中幽门螺杆菌16S核苷酸序列的存在确认患者中存在幽门螺杆菌感染,幽门螺杆菌cagA核苷酸序列的存在表明患者具有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,东亚cagA EPIYA等位基因的存在表明,相对于仅仅存在有cagA核苷酸序列,患者具有更高的与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的提高,以及突变的23S基因的存在确认患者带有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌感染,并且,当患者被列为具有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险时,根据检测获得的23S基因序列实施预防性治疗。
40.实施范例39中的方法,其中23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),以及/或者位置2143的的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)。
41.实施范例39或40中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:21检测16S幽门螺杆菌基因。
42.实施范例39至41中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:6,序列IDNO:7,以及/或者序列ID NO:22检测cagA幽门螺旋杆菌基因。
43.实施范例39至42中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:12以及序列ID NO:13检测cagA EPIYA等位基因。
44.实施范例39至43中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:16,序列IDNO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19检测23S基因序列。
45.实施范例39至44中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:1以及序列ID NO:20扩增16S幽门螺杆菌基因。
46.实施范例39至45中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:4以及序列ID NO:5扩增cagA幽门螺杆菌基因。
47.实施范例39至46中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:8,序列IDNO:9,序列ID NO:10,以及/或者序列ID NO:11扩增cagA EPIYA基因。
48.实施范例39至47中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:23以及序列ID NO:15扩增23S基因序列。
49.实施范例39至48中的方法,该方法进一步含有,当检测发现存在东亚cagAEPIYA等位基因时,患者将被监控胃部疾病的发展。
50.实施范例49中的方法,其中监控指监控胃癌的发展。
51.实施范例39至50中的方法,包括,当检测发现与克拉霉素的敏感性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素。
52.实施范例39至51中的方法,包括,当检测发现与克拉霉素的耐药性相关的23S基因序列存在时,使用一种非克拉霉素抗生素。
53.实施范例52中的方法,其中所述非克拉霉素抗生素选自,阿米卡星,庆大霉素,卡那霉素,新霉素,乙基西梭霉素,链霉素,妥布霉素,氯碳头孢,厄他培南,亚胺培南,西司他丁,美罗培南,头孢羟氨苄,头孢唑啉,头孢氨苄,头孢克洛,头孢羟唑,头孢西丁,头孢罗齐,头孢呋辛,头孢克肟,头孢地尼,头孢托仑,头孢哌酮钠,头孢噻肟,头孢泊肟,头孢他啶,头孢布烯,头孢唑肟,头孢磺啶,头孢吡肟,替考拉宁,万古霉素,阿奇霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,氨曲南,阿莫西林,氨苄青霉素,阿洛西林,羧苄青霉素,氯洒西林,双氯青霉素,氟氯西林,美洛西林,萘夫西林,盘尼西林,哌拉西林,羟基噻吩青霉素,杆菌肽,粘菌素,多粘菌素B,环丙沙星,依诺沙星,加替沙星,左氧氟沙星,洛美沙星,莫西沙星,诺氟沙星,氧氟沙星,曲伐沙星,磺胺米隆,百浪多息,磺胺醋酰,磺胺甲二唑,磺胺,柳氮磺胺吡啶,磺胺异恶唑,甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲恶唑,磺胺甲基异恶唑,地美环素,强力霉素,二甲胺四环素,氧四环素,四环素,氯霉素,克林霉素,乙胺丁醇片,磷霉素,呋喃唑酮,异烟肼,利奈唑胺,甲硝哒唑,莫匹罗星,呋喃咀啶,平板霉素,吡嗪酰胺,奎奴普丁/达福普汀,利福平,壮观霉素,两性霉素B,氟康唑,氟嘧啶,庆大霉素,甲氧西林,苯甲异噁唑青霉素,以及克拉维酸。
54.实施范例39至52中的方法,其中,当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用一种非克拉霉素抗生素。
55.实施范例39至52中的方法,其中,当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素抗生素以及一种非克拉霉素抗生素。
56.一种用于检测患者体内是否存在克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的方法,该方法包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)在从患者中获得的样品中评估是否存在与克拉霉素耐药性相关的幽门螺杆菌突变23S基因,即使克拉霉素耐药菌株在总幽门螺杆菌中只占1%的比重,也能通过该方法被检测出。
57.实施范例56中的方法,其中所述样品为粪便样品。
58.实施范例56或57中的方法,其中23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),以及/或者位置2143的的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)。
59.实施范例56至58中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:23以及序列ID NO:15扩增23S基因序列。
60.实施范例56至59中的方法,其中所述评估方法包括使用序列ID NO:16,序列IDNO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19检测23S基因序列。
61.实施范例56至60中的方法,包括,当检测发现与克拉霉素的敏感性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素。
62.实施范例56至61中的方法,包括,当检测发现与克拉霉素的耐药性相关的23S基因序列存在时,使用一种非克拉霉素抗生素。
63.实施范例62中的方法,其中所述非克拉霉素抗生素选自,阿米卡星,庆大霉素,卡那霉素,新霉素,乙基西梭霉素,链霉素,妥布霉素,氯碳头孢,厄他培南,亚胺培南,西司他丁,美罗培南,头孢羟氨苄,头孢唑啉,头孢氨苄,头孢克洛,头孢羟唑,头孢西丁,头孢罗齐,头孢呋辛,头孢克肟,头孢地尼,头孢托仑,头孢哌酮钠,头孢噻肟,头孢泊肟,头孢他啶,头孢布烯,头孢唑肟,头孢磺啶,头孢吡肟,替考拉宁,万古霉素,阿奇霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,氨曲南,阿莫西林,氨苄青霉素,阿洛西林,羧苄青霉素,氯洒西林,双氯青霉素,氟氯西林,美洛西林,萘夫西林,盘尼西林,哌拉西林,羟基噻吩青霉素,杆菌肽,粘菌素,多粘菌素B,环丙沙星,依诺沙星,加替沙星,左氧氟沙星,洛美沙星,莫西沙星,诺氟沙星,氧氟沙星,曲伐沙星,磺胺米隆,百浪多息,磺胺醋酰,磺胺甲二唑,磺胺,柳氮磺胺吡啶,磺胺异恶唑,甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲恶唑,磺胺甲基异恶唑,地美环素,强力霉素,二甲胺四环素,氧四环素,四环素,氯霉素,克林霉素,乙胺丁醇片,磷霉素,呋喃唑酮,异烟肼,利奈唑胺,甲硝哒唑,莫匹罗星,呋喃咀啶,平板霉素,吡嗪酰胺,奎奴普丁/达福普汀,利福平,壮观霉素,两性霉素B,氟康唑,氟嘧啶,庆大霉素,甲氧西林,苯甲异噁唑青霉素,以及克拉维酸。
64.实施范例56至62中的方法,包括,当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用一种非克拉霉素抗生素。
65.实施范例56至62中的方法,包括,当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素抗生素以及一种非克拉霉素抗生素。
66.一种从一样品中获得幽门螺杆菌具体基因型数量的数量信息的方法,包括,使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增样品,其中,扩增使用的引物选自:(i)序列IDNO:1以及序列ID NO:20;(ii)序列ID NO:4以及序列ID NO:5;(iii)序列ID NO:8,序列IDNO:9,序列ID NO:10以及序列ID NO:11;或者(iv)序列ID NO:23以及序列ID NO:15,其中,扩增提供了幽门螺杆菌具体基因型数量的定量信息。
67.实施范例66中的方法,其中,扩增使用引物(i)序列ID NO:1以及序列ID NO:20获得幽门螺杆菌16S基因的数量信息,使用引物(ii)序列ID NO:4以及序列ID NO:5获得幽门螺杆菌cagA基因的数量信息,使用引物(iii)序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10以及序列ID NO:11获得幽门螺杆菌cagA EPIYA等位基因的数量信息,以及/或者使用(iv)序列ID NO:23以及序列ID NO:15获得幽门螺杆菌23S基因的数量信息.
68.实施范例66或67中的方法,进一步包括使用引物检测样品中扩增了的幽门螺杆菌具体基因型,所述引物选自(i)序列ID NO:21;(ii)序列ID NO:6,序列ID NO:7,以及/或者序列ID NO:22;(iii)序列ID NO:12以及SEQ ID NO:13;以及(iv)序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19.
69.实施范例66至68中的方法,其中所述数量信息用于评估样品中细菌负荷。
70.实施范例66至69中的方法,其中所获得的数量信息被用来划分患者时候具有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,当患者被划分为有风险时,将启动预防以及/或者治疗处理。
71.实施范例70中的方法,其中所述胃部疾病为一种或多种胃溃疡以及/或者胃癌。
72.实施范例66至71中的方法,其中所获得的数量信息用于评估幽门螺杆菌对一抗生素治疗的敏感性或者耐药性。
73.实施范例72中的方法,其中所述抗生素治疗为克拉霉素治疗。
74.实施范例66至73中的方法,其中spdPCR的敏感度为至少84%。
75.实施范例66至74的方法,其中spdPCR的敏感度为至少93%,至少99%或者100%。
76.一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,该试剂盒含有:引物和探针,所述引物和探针用于扩增和检测:(i)幽门螺杆菌的16S基因,其中所述引物和探针包括:序列IDNO:1,序列ID NO:20,以及序列ID NO:21;(ii)幽门螺杆菌cagA的EPIYA等位基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13,以及(iii)与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:23,序列ID NO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
77.实施范例76中的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
78.实施范例77中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
79.实施范例77中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%,99%,或者100%。
80.实施范例77至79中的试剂盒,其中,试机盒所引导的治疗或者预防处理是基于检测出的16S,cagA的EPIYA等位基因,以及/或者23S基因序列。
81.实施范例80中的试剂盒,其中,检测出16S基因时,引导使用治疗型抗生素进行治疗。
82.实施范例80或81中的试剂盒,其中检测出东亚cagA等位基因时,引导监控患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病的发展,并开始对患者施行治疗性以及预防性抗生素治疗。
83.实施范例80至82中的试剂盒,其中,检测出与克拉霉素敏感性或耐药性相关的23S基因序列时,引导一种抗生素治疗方案。
84.一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,该试剂盒含有:引物和探针,所述引物和探针用于扩增和检测:(i)幽门螺杆菌的16S基因,其中所述引物和探针包括:序列IDNO:1,序列ID NO:20,以及序列ID NO:21;(ii)幽门螺杆菌的cagA基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:4,序列ID NO:5,序列ID NO:6,以及序列ID NO:7,以及(iii)与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:23,序列ID NO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
85.实施范例84中的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
86.实施范例85中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
87.实施范例85中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%,99%,或者100%。
88.实施范例85至87中的试剂盒,其中,试机盒所引导的治疗或者预防处理是基于检测出的16S,cagA的EPIYA等位基因,以及/或者23S基因序列。
89.实施范例88中的试剂盒,其中,检测出16S基因时,引导使用治疗型抗生素进行治疗。
90.实施范例88或89中的试剂盒,其中,检测出cagA基因时,引导监控患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病的发展,并开始对患者施行治疗性以及预防性抗生素治疗。
91.实施范例88至90中的试剂盒,其中,检测出与克拉霉素敏感性或耐药性相关的23S基因序列时,引导一种抗生素治疗方案。
92.实施范例84至91中的试剂盒,该试剂盒进一步包括用于检测幽门螺杆菌cagA基因的EPIYA等位基因的引物和探针,其中所述探针包括:序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13.
93.一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,该试剂盒含有:引物和探针,所述引物和探针用于扩增和检测:(i)幽门螺杆菌的16S基因,其中所述引物和探针包括:序列IDNO:1,序列ID NO:20,以及序列ID NO:21;(ii)幽门螺杆菌cagA的EPIYA等位基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及/或者序列ID NO:13,以及/或者(iii)与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:23,序列ID NO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19。
94.实施范例93中的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
95.实施范例94中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
96.实施范例94中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%,99%,或者100%。
97.实施范例93至96中的试剂盒,其中,该试机盒所引导的治疗或者预防处理是基于检测出的16S,cagA的EPIYA等位基因,以及/或者23S基因序列。
98.实施范例97中的试剂盒,其中,检测出16S基因时,引导使用治疗型抗生素进行治疗。
99.实施范例97或98中的试剂盒,其中,检测出东亚cagA等位基因时,引导监控患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病的发展,并开始对患者施行治疗性以及预防性抗生素治疗。
100.实施范例97至99中的试剂盒,其中,检测出与克拉霉素敏感性或耐药性相关的23S基因序列时,引导一种抗生素治疗方案。
101.一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,该试剂盒含有:引物和探针,所述引物和探针用于扩增和检测:(i)幽门螺杆菌的16S基因,其中所述引物和探针包括:序列IDNO:1,序列ID NO:20,以及序列ID NO:21;(ii)幽门螺杆菌的cagA基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:4,序列ID NO:5,序列ID NO:6,以及/或者序列ID NO:7,以及(iii)与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:23,序列IDNO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19。
102.实施范例101中的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
103.实施范例101或102中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
104.实施范例101或102中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%,99%,或者100%。
105.实施范例102至105中的试剂盒,其中,试机盒所引导的治疗或者预防处理是基于检测出的16S,cagA的EPIYA等位基因,以及/或者23S基因序列。
106.实施范例105中的试剂盒,其中,检测出16S基因时,引导使用治疗型抗生素进行治疗。
107.实施范例105或106中的试剂盒,其中检测出东亚cagA等位基因时,引导监控患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病的发展,并开始对患者施行治疗性以及预防性抗生素治疗。
108.实施范例105中至107的试剂盒,其中,检测出与克拉霉素敏感性或耐药性相关的23S基因序列时,引导一种抗生素治疗方案。
109.实施范例101至108中的试剂盒,其中,该试剂盒进一步含有扩增和检测幽门螺杆菌cagA基因EPIYA等位基因的引物和探针,其中,所述引物和探针包括:序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及/或者序列ID NO:13.
110.一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其中,即使克拉霉素耐药菌株在总幽门螺杆菌中只占1%的比重,也能使用该试剂盒被检测出,其中,该试剂盒中的引物选自序列ID NO:23以及序列ID NO:15,用于扩增幽门螺杆菌23S基因序列,同时,该试剂盒含有使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
111.实施范例110中的试剂盒,其中,该试剂盒进一步含有选自序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19.
112.实施范例111中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
113.实施范例111中的试剂盒,其中,所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%,99%,或者100%。
114.实施范例110至113中的试剂盒,其中,当检测出与克拉霉素敏感性相关的23S基因序列时,进行克拉霉素治疗。
115.实施范例110至114中的试剂盒,其中,当检测出与克拉霉素耐药性相关的23S基因序列时,实施一种非克拉霉素抗生素治疗。
116.实施范例115中的试剂盒,其中所述非克拉霉素抗生素选自,阿米卡星,庆大霉素,卡那霉素,新霉素,乙基西梭霉素,链霉素,妥布霉素,氯碳头孢,厄他培南,亚胺培南,西司他丁,美罗培南,头孢羟氨苄,头孢唑啉,头孢氨苄,头孢克洛,头孢羟唑,头孢西丁,头孢罗齐,头孢呋辛,头孢克肟,头孢地尼,头孢托仑,头孢哌酮钠,头孢噻肟,头孢泊肟,头孢他啶,头孢布烯,头孢唑肟,头孢磺啶,头孢吡肟,替考拉宁,万古霉素,阿奇霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,氨曲南,阿莫西林,氨苄青霉素,阿洛西林,羧苄青霉素,氯洒西林,双氯青霉素,氟氯西林,美洛西林,萘夫西林,盘尼西林,哌拉西林,羟基噻吩青霉素,杆菌肽,粘菌素,多粘菌素B,环丙沙星,依诺沙星,加替沙星,左氧氟沙星,洛美沙星,莫西沙星,诺氟沙星,氧氟沙星,曲伐沙星,磺胺米隆,百浪多息,磺胺醋酰,磺胺甲二唑,磺胺,柳氮磺胺吡啶,磺胺异恶唑,甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲恶唑,磺胺甲基异恶唑,地美环素,强力霉素,二甲胺四环素,氧四环素,四环素,氯霉素,克林霉素,乙胺丁醇片,磷霉素,呋喃唑酮,异烟肼,利奈唑胺,甲硝哒唑,莫匹罗星,呋喃咀啶,平板霉素,吡嗪酰胺,奎奴普丁/达福普汀,利福平,壮观霉素,两性霉素B,氟康唑,氟嘧啶,庆大霉素,甲氧西林,苯甲异噁唑青霉素,以及克拉维酸。
117.实施范例110至116中的试剂盒,其中,检测出与克拉霉素敏感性以及耐药性相关的23S基因序列时,使用一种非克拉霉素抗生素。
118.实施范例110至117中的试剂盒,其中,当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素抗生素以及一种非克拉霉素抗生素。
119.一种成分,该成分含有序列ID NO:1,序列ID NO:2,序列ID NO:3,序列ID NO:4,序列ID NO:5,序列ID NO:6,序列ID NO:7,序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,序列ID NO:13,序列ID NO:14,序列ID NO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:17,序列ID NO:18,序列ID NO:19,序列ID NO:20,序列ID NO:21,序列ID NO:22,序列ID NO:23,序列ID NO:24,以及/或者序列ID NO:25.
在上述任何一个引用一个样品的实施范例中,所述样品可以是从一个测试者中获得的任何组织或材料,包括基因序列(例如,基因,等位基因,基因序列,寡核苷酸,等),并且可以包括例如,新鲜,冰冻或固定的胃部组织,血液,唾液,粪便等,这些都是本领域技术人员已知的。
在任何一个至今描述的实施范例中,优选使用序列ID NO:20(5’–CGTTAGCTGCATTACTGGAGA–3’),但是序列ID NO:2也可以被使用;优先使用序列ID NO:21(5'HEX-AAGCCCTCCAACAACTAGCATCCAT-BHQ1 3'),但是序列ID NO:3也可以被使用;序列ID NO:6以及/或者7可以被序列ID NO:22(5’FAM–CTTCCYACATTATGYGCAACKATC–BHQ1 3’,其中Y=C或T以及K=G或T)取代或补充;优选使用序列ID NO:23(5’–TCCCGTTAGCAGTGCTAA–3’),但是序列ID NO:14也可以被使用;优选序列ID NO:16,但是可以被序列ID NO:24(5'HEX-AAGACGGAAAGACCCCGT-BHQ1 3')取代。优选使用序列ID NO:25(5’FAM–AAGACGGGAAGACCCCGT–BHQ1 3’),但是序列ID NO:17也可以被使用。HEX:六氯丁二烯荧光,FAM:羧基荧光素,BHQ:黑洞冷却器.
实施范例1.搜集粪便以及提炼DNA。粪便样品杯搜集至RNAlater(Ambion)中,并加入核酸防腐剂,存放在-20℃中。样品然后被解冻,震动,并被倒入一离心管中,然后在离心器中旋转,并除去RNAlater.在除去RNAlater以后,粪便DNA通过使用QIAamp DNA粪便小试剂盒(Qiagen)被提炼,根据厂家说明,使用95℃下的裂解步骤。
样本分区PCR.1μg粪便DNA在每个ddPCR反应中被使用。反应的设立根据BioRad的微滴数字PCR说明进行。
引物和探针。幽门螺杆菌16S化验。该化验用来检测幽门螺杆菌感染是否存在。
正向引物:5’–GCGACCTGCTGGAACATTAC–3’(序列ID NO:1)
反向引物:5’–ATGCGTTAGCTGCATTACTGG–3’(序列ID NO:2)
探针:5’HEX-ACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGA-BHQ1 3’(序列ID NO:3).
在本发明优先的实施范例中,序列ID NO:2应该被序列SEQ ID NO:20取代,以及序列ID NO:3应该被序列ID NO:21取代。
引物(序列ID NO:1以及序列ID NO:2)基于在如下文献中的公布MacKay等.,临床微生物学.,41(10),4589(2003)).反向引物(序列ID NO:2)向左移动了3个碱基对,用于除去多态位点。
cagA检测试验。该试验主要检测一被试者是否被感染了含有cagA毒性基因的幽门螺杆菌菌株。含有cagA基因的菌株与溃疡以及胃癌的风险的提高有关联。
正向引物:5’–TGGCTCAAGCTCGTGAAT–3’(序列ID NO:4)
反向引物:5’–TGGAAAACTTGAACGAATCAGA–3’(序列ID NO:5)
探针1:5’FAM–CTTCCCACATTATGCGCAACTATC–BHQ1 3’(序列ID NO:6)
探针2:5’FAM–CTTCCTACATTATGCGCAACGATC–BHQ1 3’(SEQ ID NO:7)
序列ID NO.6以及/或者序列ID NO:7可以被序列ID NO:22取代或补充。
这些引物和探针(序列ID NO:4-7)被设计用来在不同的幽门螺杆菌菌株中使用,虽然在该基因中存在核苷酸多样性。简单说明,88个幽门螺杆菌菌株的cagA基因被排列并手工检测保守区域用来使用引物和探针。因为所选的区域在幽门螺杆菌菌株中不完全保守,所述引物和探针在ddPCR试验中通过在幽门螺杆菌阴性的粪便DNA中加入不同幽门螺杆菌菌株的基因组DNA来测试。加入的菌株选择的标准是能代表本试验中的引物和探针的位置的多态性的范围。该试验可以复合使用在幽门螺杆菌16S化验中,用于在一个反应中检测幽门螺杆菌盒cagA。
cagA EPIYA基因型分型测试。cagA基因可以可以蛋白C端的EPIYA氨基酸基序被分为西方等位基因型和东亚等位基因型。西方cagA等位基因含有EPIYA-C基序,东亚cagA等位基因含有EPIYA-C基序。含有东亚cagA等位基因的菌株与胃癌增加的风险相关。该试验是用来将幽门螺杆菌cagA毒性基因分为西方型或东亚型的测试。
正向引物1:5’–TCAGTTAGCCCTGAACC–3’(序列ID NO:8)
正向引物2:5’–TCAACTAGCCCTGAACC–3’(序列ID NO:9)
反向引物1:5’–GCCCTACCTTACTGAGAT–3’(序列ID NO:10)
反向引物2:5’–GAAAGCCCTACTTTACTGAG–3’(序列ID NO:11)
探针1:5’HEX–TCCGCCGAGATCATCAATCGTAGC-BHQ1 3’(序列ID NO:12)
探针2:5’FAM–AAGCCTGCTTGATTTGCCTCATCAAA–BHQ1 3’(序列ID NO:13)
被设计用来在不同的幽门螺杆菌菌株中使用,虽然在该基因中存在核苷酸多样性。简单说明,88个幽门螺杆菌菌株的cagA基因(包括13个含有东亚cagA基因的菌株)被排列并手工检测保守区域用来使用引物,这些引物能用来扩增cagA基因中的EPIYA-C以及EPIYA-D区域。所述的对齐也被手工检测一个区域用来放置EPIYA-C探针,该区域对EPIYA-C基序有特异性,但在西方cagA中具有保守性,同时,所述的对齐也被手工检测一个区域用来放置EPIYA-D探针,该区域对EPIYA-D基序有特异性,但在东亚cagA中具有保守性。试验的该部分比较难,因为区分EPIYA-C基序以及EPIYA-D基序的核苷酸序列只有24个碱基对的长度,所以探针的位置受限制。因为所选的区域在幽门螺杆菌菌株中不完全保守,所述引物和探针在ddPCR试验中通过在幽门螺杆菌阴性的粪便DNA中加入不同幽门螺杆菌菌株的基因组DNA来测试。加入的菌株选择的标准是能代表本试验中的引物和探针的位置的多态性的范围。
克拉霉素耐药性测试。该测试被用来检测是否存在克拉霉素耐药性的幽门螺杆菌。克拉霉素耐药性主要是源于在23S基因中的三个点突变。本发明公布的方法,试剂盒以及试剂成分确认如下23S基因突变位置:位置2142腺嘌呤(A)突变至鸟嘌呤(G)或者A突变至胞嘧啶(C);以及/或者位置2143A突变至G。
该测试量化了在一个样品中克拉霉素敏感以及克拉霉素耐药的幽门螺杆菌的数量以及比例。
正向引物:5’–TATTCCCGTTAGCAGTGCT–3’(序列ID NO:14)
反向引物:5’–AGATGGGAGCTGTCTCAAC–3’(序列ID NO:15)
探针1:5’HEX-AAGACGGAAAGACCCCGTG–BHQ1 3’(序列ID NO:16)
探针2:5’FAM–ACGGGAAGACCCCGT–BHQ1 3’(序列ID NO:17)
探针3:5’FAM–AAGACGGAGAGACCCCGT–BHQ1 3’(序列ID NO:18)
探针4:5’FAM–AAGACGGCAAGACCCCGT–BHQ1 3’(序列ID NO:19)
在优化的范例中,序列ID NO:14应该被序列ID NO:23取代;以及序列ID NO:17应该被序列ID NO:25取代。
反向引物所在的位置应该和Schabereiter-Gurtner等.(临床微生物学期刊,42(10),4512(2004))发明的在粪便中使用的克拉霉素耐药性测试一样,但是短了三个碱基对,用于适应熔化问题。正向引物(序列ID NO:14)用于队列23S基因中的一个区域,该区域相对于之前使用的区域对幽门螺杆菌更有特异性。
结果:幽门螺杆菌16S测试。幽门螺杆菌16S测试中,将幽门螺杆菌基因组DNA加入至幽门螺杆菌阴性的粪便DNA中(图1)以及测试从港景医疗中心中获取的13个幽门螺杆菌阳性粪便样品(表2)。港景医疗中心的粪便样品通过使用幽门螺杆菌粪便抗原测试来检测幽门螺杆菌。
图1显示在幽门螺杆菌阴性的粪便样品中加入幽门螺杆菌阳性的基因组DNA的16SddPCR扩增图。图中每一点代表一滴。超过域值(设定在3000)的点表明含有幽门螺杆菌16S。域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌16S。每ul中的预期拷贝值显示在左方,每ul中测量获得的拷贝值(Ch2-Conc.)以及阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。
所述的新ddPCR方法相对于传统PCR方法对于幽门螺杆菌的检测更敏感以及更有重复性,并且在量化方面也有优势(表2)。
表2。使用粪便抗原测试检测13个幽门螺杆菌阳性的粪便样品从而检测幽门螺杆菌16S基因并比较结果。在传统PCR试验中,PCR阳性结果被标记为X.
cagA检测以及cagA EPIYA基因型分型测试。该测试是将6个北美幽门螺杆菌和8个日本幽门螺杆菌菌株的基因组DNA加入幽门螺杆菌阴性粪便DNA中。所述6个北美菌株通过对cagA基因的测序被确定带有西方cagA基因型,所述8个日本菌株被确定带有东亚cagA基因型。被加入的菌株代表在引物和探针区域的多态性范围。所有的14个菌株通过cagAddPCR化验被正确确认含有cagA毒性基因,并且其中的13个菌株(93%)被正确地通过cagAEPIYA ddPCR化验确定为含有西方cagA基因或者含有东亚cagA基因。一个东亚cagA菌株被检测出不含有这两个等位基因中的任何一个基因。(表3)。
表3.使用以粪便为基础的ddPCR测试检测cagA毒性基因并确定其基因型。X代表被ddPCR测试检测到。
图2显示了复合16S和cagA基因试验spdPCR(这里,ddPCRTM)扩增图。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入两种含有cagA基因的幽门螺杆菌菌株(Oki573以及Em47-1)的基因组DNA。图中每一点代表一滴。左边图中(16S探针)超过域值(设定在3000)表明含有幽门螺杆菌16S rRNA基因。右边图(cagA探针)中超过域值(设定在6000)的点表明含有幽门螺杆菌cagA基因。域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌。每ul中测量获得的拷贝值(Ch2-Conc.,Ch1-Conc.)以及阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。16S拷贝的浓度被期望是cagA基因拷贝的两倍,因为在幽门螺杆菌基因组中含有两份的16S基因以及一份的cagA基因。
图3显示了cagA EPIYA基因分型试验spdPCR(这里,ddPCRTM)扩增图。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入两种幽门螺杆菌菌株的基因组DNA:含有东亚型cagA基因Oki573菌株,以及含有西方型cagA基因的Em47-1菌株。图中每一点代表一滴。左边图中(EPIYA-D探针)超过域值(设定在2000)表明含有cagA基因的东亚等位基因。右边图(EPIYA-C探针)中超过域值(设定在2000)的点表明含有幽门螺杆菌cagA基因的西方等位基因。域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌。每ul中测量获得的拷贝值(Ch2-Conc.,Ch1-Conc.)以及阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。
克拉霉素耐药性测试。该测试是在幽门螺杆菌阴性的粪便DNA中加入克拉霉素敏感菌株和含有一个23S点突变的等基因的克拉霉素耐药性菌株的幽门螺杆菌的基因组DNA。所述两种菌株的基因组DNA以不同的比例被加入,用来测试该试验的敏感度,从而测试克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的亚种群。现今可获得的以粪便为基础的检测克拉霉素耐药性的实时PCR方法,在突变种群在总种群内占10%或少于10%时,未能检测克拉霉素耐药性的变异菌株,这可能是这些测试敏感度(73%敏感度)不尽如人意的原因。然而,本发明的基于粪便的ddPCR方法可以在突变菌株含量少至1%时检测出克拉霉素耐药性突变菌株。
图4显示了克拉霉素耐药性试验的spdPCR(这里,ddPCRTM)扩增图。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入不同比例的克拉霉素敏感性幽门螺杆菌菌株的基因组DNA以及含有一个23S点突变的克拉霉素耐药性等基因幽门螺杆菌菌株的基因组DNA,所述的比例显示在图的左方。图中每一点代表一滴。左边图中(检测克拉霉素敏感性的探针)超过域值(设定在3000)表明含有克拉霉素敏感性幽门螺杆菌。右边图中(检测克拉霉素耐药性的探针)超过域值(设定在3500)表明含有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌。左图和右图中域值以下的点代表不含有幽门螺杆菌。每ul中测量获得的拷贝值(Ch2-Conc.,Ch1-Conc.)以及阳性(pos.)和阴性(neg.)微滴的绝对数量显示在每个图的标题部分。
图5显示了通过使用ddPCR检测克拉霉素敏感性和克拉霉素耐药性突变DNA比例范围的克拉霉素耐药性突变幽门螺杆菌DNA的丰度分数。幽门螺杆菌阴性的粪便DNA样品中加入不同比例的克拉霉素敏感性幽门螺杆菌菌株的基因组DNA以及克拉霉素耐药性等基因幽门螺杆菌菌株的基因组DNA,所述的比例显示在x轴上。克拉霉素敏感性和克拉霉素耐药性突变幽门螺杆菌的基因组拷贝数目使用ddPCRTM方法量化检测。图中的棒代表两次测试泊松95%信心值。
范例2。使用微滴数字PCR量化检测幽门螺杆菌以及对幽门螺杆菌进行基因分型揭示在一哥斯达黎加无症状人群中不同的细菌量与细菌带有的毒性基因的关联。
发展一种使用ddPCR对粪便样品进行新的检测,量化以及对cagA进行基因分型的不侵入的方法。该方法的测试对象是对哥斯达黎加的无症状的志愿者的匹配血清和粪便样品。哥斯达黎加是一个幽门螺杆菌患者比例高达78%的国家,其胃癌的发生率以及死亡率是全世界最高的之一。非侵入性的方法对幽门螺杆菌进行基因型分类促进了之前较难的分子流行病学研究,这些研究包括跟踪特殊幽门螺杆菌菌株在一人群中的传播,并检测在疾病进展过程中幽门螺杆菌和寄主之间的基因相互作用。
材料和方法。研究人群和样品收集。作为具有150名志愿者的人类微生物区中的一部分,50个哥斯达黎加志愿者的粪便和血清被收集。这150名志愿者通过户口普查资料被随机选取并邀请参加研究。本发明研究的50个志愿者包括男人和女人。粪便样品被收集至RNAlater核酸防腐剂中(Ambion),并在送入研究前被装入一放有干冰的保温瓶中。血液被采集,分离,并被分批冷冻。样品每隔24小时被采集,并只有当被测者在至少6周内没有受抗生素治疗。研究步骤受美国国家癌症研究所的机构审查委员会批准,并获得参与者或参与者监护人同意。
在港景医疗中心因为不同原因就诊的29个门诊病人的粪便样品被搜集。检测粪便幽门螺杆菌抗原,剩余的样品用于本研究。病人的年龄为1至68岁(中位数27)。样品在被分成大约1ml的等分时被存储在4℃,1ml的等分被冰冻在-75℃。粪便被足够的分子级水中乳化,以便等分。
幽门螺杆菌和CagA免疫球蛋白G酶联免疫吸附测定。哥斯达黎加被测者的血清样品被检测幽门螺杆菌抗体,使用Wampole幽门螺杆菌IgG ELISA II测试系统,以及使用CagAIgG ELISA试剂盒(Alpco)检测CagA抗体。
提取粪便DNA。在提取DNA之前,粪便样品被存储在-20℃。在提取粪便DNA之前,样品被解冻,震荡,并被转移至一离心管中,然后离心除去RNAlater。除非另有说明,使用QIAamp粪便DNA小试剂盒(Qiagen)提取粪便DNA,根据厂家说明,裂解步骤在95℃下进行。其他的DNA提取方法被使用在幽门螺杆菌阳性志愿者的粪便样品中,用于确定哪种方法产出最多的幽门螺杆菌DNA。所述的其他方法包括1)QIAamp粪便DNA小试机盒,根据厂家的指示,裂解反应的温度是70℃。2)QIAamp粪便DNA小试机盒,根据厂家的指示,在95℃的培养期前,在裂解液中加入0.1mm硅土/氧化锆珠子,对粪便样品进行1分钟的珠打。3)在珠打时使用苯酚/氯仿/异戊醇进行抽取(Moeller et al.,Gut Microbes,4:403-8,2013).
引物和探针的设计。所有试验的引物和探针的序列列在表4中。
表4.在微滴数字PCR(ddPCR)中使用的引物和探针,用来检测粪便中幽门螺杆菌及其基因型
微滴数字PCR。根据厂家的说明进行微滴数字PCR,其中每个20μl的反应中含有1xddPCR Supermix探针(BioRad),900nM每个引物(表4),250nM每个探针(表4),以及10μl粪便DNA。对于哥斯达黎加的粪便DNA样品,在ddPCR反应前,浓度被调节至100ng/μl,这样每个反应中能分析1μg粪便DNA。使用QX200微滴产生器(BioRad)产生微滴。反应经历热循环,条件如下:95℃10分钟,94℃30秒,55℃1分钟,循环45个循环,然后98℃10分钟。然后通过荧光扩增分析微滴,使用QX200微滴读取器(BioRad)。使用QuantaSoft软件版本1.6.6(BioRad)分析数据,人工设立域值。每个粪便样品检测两次,每次20μl,反应结果被合并。
统计检测。幽门螺杆菌16S ddPCR试验检测的幽门螺杆菌的不同,通过Wilcoxonrank-sum测试比较。使用SAS版本9.4进行统计分析(SAS Institute Inc)。
结果。基于粪便的ddPCR测试的发展和优化用于检测幽门螺杆菌。虽然粪便DNA中的幽门螺杆菌DNA可以通过多轮传统PCR被扩增,但是对于一个样品来说,结果往往是没有重复性的,从而导致不一致的结果。通过适应之前报道的幽门螺杆菌16S引物,用于ddPCR试验中,用于在复杂的粪便DNA背景中检测幽门螺杆菌16S基因,已知数量的幽门螺杆菌G27基因组DNA的10倍稀释被加入至一幽门螺杆菌阴性的志愿者的粪便DNA中,其中,所述的两通过一NanoDrop分光光度计确定获得。如在图6中显示,含有幽门螺杆菌16S的微滴以及不含有幽门螺杆菌16S的微滴有明显的区分,并且,本试验正确地量化了测试的最低的加入的幽门螺杆菌基因组的量(每μg粪便DNA中含有一个幽门螺杆菌基因组)。
因为幽门螺杆菌在粪便中的含量少,不同的粪便DNA提取方法被测试,用来确定能获取最大量幽门螺杆菌DNA的方法。四个不同的方法被用在一个幽门螺杆菌阳性的志愿者的粪便样品中,并且,样品中的幽门螺杆菌DNA的量通过幽门螺杆菌16S ddPCR试验被量化(表5)。使用珠打的方法所获得的每克粪便DNA中的幽门螺杆菌DNA比不使用珠打的方法少。裂解的温度不影响幽门螺杆菌DNA的产量。幽门螺杆菌16S ddPCR测试运用在储存在RNAlater核酸防腐剂中的样品中,然后在常温下放置数日,之后经过多轮冷冻和解冻循环(表5)。冷冻和解冻循环不影响幽门螺杆菌DNA的产量。在RNAlater核酸防腐剂中在室温下保存两至三天导致轻微的,但统计学上不重要的,幽门螺杆菌负荷的减少。
表5.对一幽门螺杆菌阳性的志愿者使用多种不同的DNA提取方法,储存条件下,以及收集的时间点时的总共DNA以及幽门螺杆菌DNA产量。
发展基于粪便的ddPCR测试,用于检测以及对幽门螺杆菌cagA基因进行EPIYA基因型分类。各种菌株内不同的cagA基因以及cagA基因等位变化与增加的消化性溃疡和胃癌的危险相关联,使之成为分子流行病学重要的目标。与幽门螺杆菌16S基因不同,cagA基因在幽门螺杆菌菌株中具有广泛的核苷酸多样性,使对其设计的广谱的引物和探针具有挑战性。为了评估cagA ddPCR引物和探针与具有广谱代表的幽门螺杆菌菌株的兼容性,在Olbermann等(PLoS Genet,6:e1001069,2010)中描述的37个幽门螺杆菌菌株的引物和探针中的多态性被检测,并且,cagA ddPCR在具有这些多态性的菌株中测试检测cagA基因以及区分EPIYA类型的能力被检测。六个北美菌株的基因组DNA(EPIYA-C)(Talarico等,临床生物学期刊,47:1680-8,2009)以及8个日本幽门螺杆菌菌株(EPIYA-D)(Matsunari等,临床生物学期刊,50:876-83,2012),以及两个全部测序的欧洲菌株(EPIYA-C),26695(Tomb等,自然,388:539-47,1997)以及G27(Baltrus等,细菌学杂志,191:447-8,2009)被加入至幽门螺杆菌阴性的粪便DNA中。cagA检测ddPCR测试在16个菌株中的15个菌株中检测出了cagA基因(94%)。Em7-1菌株中没有被检测出cagA基因,虽然该菌株与菌株26695一样具有cagA引物和探针的序列,被在cagA ddPCR测试中显示阳性(表6)。16个菌株中15个菌株的(94%)cagAEPIYA型号(EPIYA-C或EPIYA-D)被准确确认。在日本菌株Oki633中没有检测到EPIYA基序。这可能是因为在EPIYA-D的探针位置有两个多态点(表6)。图8中显示cagA检测和EPIYA基因分型的ddPCR扩增图,使用的是两个菌株Em47-1(EPIYA-C)以及Oki573(EPIYA-D)。
表6.基于粪便的幽门螺杆菌测试结果,幽门螺杆菌负荷结果,与幽门螺杆菌血清测试结果(50个哥斯达黎加志愿者样品)和幽门螺杆菌粪便抗原测试结果(美国医院里29个病人的样品)的ddPCR比较结果.
a阳性=幽门螺杆菌或CagA血清抗体测试阳性,阴性=两者均阴性
使用基于人群和临床样品的ddPCR测试确认。使用50个从50个哥斯达黎加志愿者中收集的50个相匹配的血清和粪便样品进行基于粪便的ddPCR测试。其中,32个(64%)根据检测幽门螺杆菌抗体的血清测试为幽门螺杆菌阳性,25个(50%)根据检测cagA抗体的血清测试为幽门螺杆菌阳性并带有cagA基因。其中的5个志愿者为幽门螺杆菌抗体阴性,但是CagA抗体阳性。所述基于粪便的幽门螺杆菌16S ddPCR测试在27个幽门螺杆菌抗体血清测试阳性的参与者的粪便中检测出幽门螺杆菌,并在37个幽门螺杆菌抗体或CagA抗体血清测试阳性的参与者的粪便中检测出幽门螺杆菌。在18个幽门螺杆菌抗体血清测试阴性的参与者中,14个(78%)在幽门螺杆菌16S ddPCR化验中为阴性,4个为阳性。这4个幽门螺杆菌16SddPCR化验呈阳性的参与者在CagA血清抗体化验中也呈阳性,证明他们确实有在幽门螺杆菌感染(表6)。
在CagA抗体呈阳性的25个参与者中,21个(84%)在ddPCR试验中为cagA阳性,22个(88%)为cagA EPIYA分型ddPCR阳性,所有的样品都含有编码EPIYA-C基序的cagA基因。在25个CagA抗体阴性的参与者中,16个(64%)为cagA检测ddPCR测试阴性,以及21个(84%)为cagA EPIYA分型ddPCR assay阴性(表7)。25个CagA抗体血清阳性的参与者的粪便样品中,5个为cagA ddPCR测试一种或两种均为阴性(表7)。其中的4个样品的ddPCR阴性结果很可能是由于粪便中的低幽门螺杆菌负荷导致。其他的样品含有高幽门螺杆菌负荷(每μg粪便DNA中有452幽门螺杆菌16S拷贝),并在cagA EPIYA ddPCR测试中呈阳性。该样品显示在阴性微滴上方但是在域值下方具有明显的微滴群。当域值被降低来包括这些中间荧光微滴时,cagA拷贝数目为每μg粪便DNA中0至76cagA拷贝,类似于使用cagA EPIYA分型ddPCR测试在该样品中检测出的每μg粪便DNA中92拷贝。三个血清CagA抗体阴性的参与者的样品在两个cagA ddPCR测试中均呈阳性,说明这些样品为cagA基因阳性。
表7. 50个哥斯达黎加志愿者的粪便cagA基因ddPCR测试以及CagA血清抗体测试比较
基于粪便的幽门螺杆菌16S ddPCR测试进一步被使用用来测试美国医院中的29个病人的粪便样品,这些样品也被用来测试幽门螺杆菌抗原。在该29个粪便样品中,12个为粪便抗原测试幽门螺杆菌阳性,17个为幽门螺杆菌阴性。在这12个幽门螺杆菌阳性的样品中,所有的2个(100%)为幽门螺杆菌16S ddPCR测试阳性。在这17个幽门螺杆菌粪便测试阴性的样品中,12个(71%)为幽门螺杆菌16S ddPCR测试阴性,5个为阳性(表6)。5个为幽门螺杆菌16S ddPCR测试阳性但是为幽门螺杆菌粪便抗原测试阴性的样品中,为幽门螺杆菌含量在区域的下班部分,这可能导致其没有达到粪便抗原测试的检测域值。另外,这5个中的3个病人具有为幽门螺杆菌感染历史。
幽门螺杆菌在粪便中的含量不同,与血清中CagA抗体的状态有关。在31个幽门螺杆菌ddPCR阳性的哥斯达黎加样品中,在粪便中具有两个日志范围的幽门螺杆菌符合(中位8.4,每μg粪便DNA中含有1-452幽门螺杆菌拷贝)。在17个幽门螺杆菌16S ddPCR测试阳性的美国粪便样品中,粪便中幽门螺杆菌的含量为每μg粪便DNA中含有0.5至120.9拷贝幽门螺杆菌16S,中位值为13.6(表6)。幽门螺杆菌16S ddPCR测试被第二次使用用来检测50个哥斯达黎加样品,所获得的拷贝数具有高度重复型,其相关系数为0.98(图7A)。为了评估个体内的粪便中幽门螺杆菌的变化,一名幽门螺杆菌阳性的志愿者的粪便样品被收集,两次收集的时间相隔20个月,并使用幽门螺杆菌16S ddPCR测试量化检测幽门螺杆菌含量。在第二次收集的时候,幽门螺杆菌含量有略微的上升(表5)。
未知的是,粪便中的含量是否与胃中的含量,或者其他因素,例如发炎程度,急病状态,或细菌基因因此,有关。为了评估cagA毒性基因在粪便中幽门螺杆菌含量中的作用,CagA抗体阳性以及CagA抗体阴性的哥斯达黎加志愿者每μg粪便DNA中的幽门螺杆菌16S拷贝数被比较。CagA抗体阳性的哥斯达黎加志愿者的粪便中,相对于CagA抗体阴性的志愿者,含有增多的幽门螺杆菌,这种增加在统计学上是有意义的[中位每μg粪便DNA中幽门螺杆菌16S拷贝数目(范围)CagA阳性:11.2(0–443),CagA阴性:1.6(0–30);威尔科克森秩和检验p-值:0.009](图7B).
讨论。环境,寄主的基因型,以及导致很多不同疾病结果,例如,无症状的胃炎,消化性溃疡以及胃癌,的幽门螺杆菌菌株的不同相互之间的影响,以及其对食道癌和哮喘的保护作用不被人十分理解。非侵入性的方法用来检测和基因分型幽门螺杆菌有利于推动之前困难的流行病学研究,用于检测特定流行病学研究特定幽门螺杆菌基因及等位基因在人群中的分布,以及其在疾病结果中不同的作用。虽然现在有很多公认的用来检测幽门螺杆菌感染的非侵入性测试方法(尿素呼气试验,血清学测试,粪便抗原测试),这些测试并不提供关于幽门螺杆菌菌株基因型的信息。幽门螺杆菌DNA可以从被感染的个体的粪便中获得,但是由于其在粪便中的低含量以及粪便中的PCR抑制剂的存在,使得幽门螺杆菌检测以及其基因型分型在技术上很困难。本发明描述的是一种非侵入性的检测,量化以及对幽门螺杆菌基因分型的方法,该方法使用粪便样品以及ddPCR方法,具有敏感性和重复型,并且不使用多轮传统PCR从而避免假阳性的产生。这些检测方法能量化粪便中幽门螺杆菌的含量,并检测cagA毒性基因,以及分辨该基因的西方和东亚等位基因。
基于粪便的检测幽门螺杆菌感染的ddPCR测试的敏感性和特异性取决于用于比较的幽门螺杆菌测试,血清学或粪便抗原测试。这两种测试检测不同的幽门螺杆菌感染的生物步骤(粪便中的幽门螺杆菌以及其脱落物的抗体反应),所以基于粪便的幽门螺杆菌ddPCR测试对这两个测试有不同的比较便不足为奇。对于哥斯达黎加样品,幽门螺杆菌16SddPCR测试被用来和幽门螺杆菌血清测试想比较,并有84%的敏感性和78%的特异性。但是,对幽门螺杆菌的血清测试可以有假阳性,因为感染消除之后抗体可能依然存在,也可以有假阴性,因为被测者可能对测试中使用的幽门螺杆菌抗原没有强烈的抗体反应。5个CagA抗体阳性但是幽门螺杆菌抗体阴性的血清样品可以证实这点。当同时考虑幽门螺杆菌和CagA血清结果时,本试验的特异性确实为100%。在幽门螺杆菌或者CagA抗体阳性,但是粪便幽门螺杆菌16S ddPCR测试为阴性的个体中,两名在重复测试时现实ddPCR粪便测试阳性,并且两者都具有幽门螺杆菌16S低拷贝数,说明他们接近测试检测极限。对于美国医院的样品,幽门螺杆菌16S ddPCR测试与粪便抗原测试相比较,具有敏感度100%,特异性71%。对于该样品的较高的敏感度源于两种测试均能检测幽门螺杆菌的脱落物。幽门螺杆菌16S ddPCR测试阳性但是幽门螺杆菌粪便抗原测试阴性的5个样品的幽门螺杆菌含量低,可能低于粪便抗原测试的检测极限。该5个病人中的3个有幽门螺杆菌感染历史,支持幽门螺杆菌16S ddPCR测试阳性的结果。
所述ddPCR检测也被用来量化评估不同粪便DNA提取方法以及粪便样品存储条件。经发现,幽门螺杆菌DNA可以经历冷冻和解冻的循环,并在室温下储存在RNAlater防腐剂中,使其可以用于进行不能直接冷冻样品的流行病学研究。经发现,使用珠打裂解细菌细胞的粪便DNA提取方法产生的每μg粪便DNA中的幽门螺杆菌16S拷贝数量少于没有使用珠子大的方法。幽门螺杆菌很容易被裂解,所以经历珠打的样品中幽门螺杆菌相对含量的减少可能是由于粪便中难于裂解的细菌的DNA的增加。
除了检测幽门螺杆菌感染,用于检测幽门螺杆菌cagA基因以及区别该基因不同的等位基因ddRCR测试被发展,所述不同的等位基因与胃癌相关联。所述cagA检测ddPCR测试和cagA EPIYA分型ddPCR测试含有对cagA基因相似的检测敏感度(分别是84%和88%),但是,cagA EPIYA分型ddPCR测试的特异性较高(84%,cagA检测ddPCR测试为64%)。cagAEPIYA分型ddPCR测试可以被用于测试以及cagA等位基因分型,虽然该测试不能检测出不编码EPIYA-C或EPIYA-D基序的cagA等位基因。但是,这些等位基因只构成不到3%的所有cagA等位基因型。
所有cagA EPIYA分型ddPCR测试检测出的cagA基因阳性的26个哥斯达黎加粪便样品中含有编码EPIYA-C基序的西方基因型。虽然该记过不能被血清cagA抗体测试证实,因为该测试不能区分cagA等位基因型。这是可以想见的,根据哥斯达黎加的33个幽门螺杆菌菌株的cagA等位基因的分析,所有这些菌株含有西方类型的cagA基因(Xia等,PLoS One,4:e7736,2009)。进一步,一个对来自哥斯达黎加24个幽门螺杆菌菌株的分析显示其中的21个属于hp欧洲组,3个属于hsp非洲组,(Molina-Castro等,肠道细菌,5:517-21,2014),这些幽门螺杆菌被期望含有编码EPIYA-C基序的cagA基因。美洲印第安人起源的幽门螺杆菌含有EPIYA-DC基序,该基系列含有EPIYA-C以及EPIYA-D基序(Duncan等.,细菌学,194:1593-604,2012)。cagA EPIYA基因型测试确定这些菌株的cagA基因编码EPIYA-C基序列。
使用微滴数字PCR检测粪便中的幽门螺杆菌也能对粪便中幽门螺杆菌的含量进行绝对的量化,这样的信息是不能从其他基于粪便的方法中获得的。因为这些方法给出量化结果,所以,可以在感染者中观察到两个幽门螺杆菌的对数区域,以及在具有cagA毒性基因感染的患者的粪便中有更高的幽门螺杆菌的含量。胃中的幽门螺杆菌感染的密度在不同的患者中不同,之前有报道公布在cagA阳性菌株感染的个体中,其胃部的幽门螺杆菌含量增多(Belda等,临床微生物学及感染,18:E251-3,2012)。
结论,本发明公布的是一个用于检测和对粪便样品中幽门螺杆菌基因分型,以及在粪便样品中测量细菌含量的敏感及有重复型的非侵入性方法。该对有症状和无症状的个体的幽门螺杆菌进行基因分型的非侵入性方法允许今后对幽门螺杆菌生物指标的传送和发病机理的研究。对于与幽门螺杆菌的疾病发展中相关的寄主与细菌因素的理解可以影响治疗决定,从而减少疾病痛苦。这些部分与幽门螺杆菌相关,因为幽门螺杆菌感染可以导致某些疾病,也能预防其他疾病。
范例3。克拉霉素耐药性试验。设计一种用于检测三个幽门螺杆菌23基因中最常见的导致抗生素克拉霉素耐药性的突变的测试。该测试被用来使用在粪便样品中以及福尔马林固定,以及石蜡包埋(FFPE)的胃部组织。
所述粪便为基础的克拉霉素耐药性测试通过在幽门螺杆菌阴性的粪便DNA中加入克拉霉素敏感型野生型以及三个同基因的克拉霉素耐药性菌株的基因组DNA进行。每个菌株的基因组DNA分别被加入,并加入不同的比例,从而对检测克拉霉素耐药性的幽门螺杆菌的测试的敏感性进行测试。分别检测的菌株的扩增图(图9)显示克拉霉素耐药性测试正确地区分了野生型以及耐药性突变体。在本发明公布之前,现有技术中的基于粪便的用于检测克拉霉素耐药性的实时PCR方法,在突变体的数量为10%或少于10%时,不能检测到克拉霉素突变体,这可能是不能达到所期望的敏感度(73%敏感度)的原因。但是,本发明的基于粪便的ddPCR测试可以在其含量在1%时检测出克拉霉素耐药性突变体(图10)。
克拉霉素耐药性测试首先被用于FFPE老鼠胃部组织中。简单地说,未被感染的C57BL/6老鼠的胃被收集,沿着胃小弯将胃一切为二。每半个胃的内腔中加入大约107在液体介质中的幽门螺杆菌,并在固定之前培养30分钟。一个克拉霉素敏感型的野生型菌株和三个等基因型的克拉霉素耐药性的菌株被分别以及不同比例地加入至老鼠的胃中。所述的克拉霉素耐药性测试(范例1,序列替换:序列ID NO:14→23;以及序列ID NO:17→25)在所有测试条件下正确区分野生型以及突变体,并且检测野生型和突变细菌的正确比例。克拉霉素耐药性测试检测出的每μl中的23S拷贝与ddPCR测试出的每μl中的16S拷贝相符(表8)。
表8.ddPCR测试出的福尔马林固定,以及石蜡包埋(FFPE)的胃部组织中每μl中野生型和突变23S DNA中的拷贝数与每μl中幽门螺杆菌16S DNA的比较
所述克拉霉素耐药性测试被进一步使用在从一当地医院的9位幽门螺杆菌阳性病人中获得的储存的胃部组织中。所述克拉霉素耐药性测试在9个中的7个样品中检测出幽门螺杆菌23S基因。克拉霉素耐药性测试检测出的每μl中的23S拷贝与ddPCR测试出的每μl中的16S拷贝相符,表明,克拉霉素耐药性测试特异检测幽门螺杆菌23S基因(表9)。
表9.ddPCR测试出的福尔马林固定,以及石蜡包埋(FFPE)的从当地医院个获得的幽门螺杆菌阳性病人胃部组织中每μl中野生型和突变23S DNA中的拷贝数与每μl中幽门螺杆菌16S DNA比较。
正如该领域中的技术人员会理解的,本发明中的每个实施范例可以包括,主要包括,或只包括其特殊的元素,步骤,配方或成分。因此,所谓“包括“指的是包含,主要包含,只包含。“包含“指的是包含,并允许添加未明确的元素,步骤,配方或成分,甚至是主要含量。“只包含“排除其他任意没有说明的元素,步骤,配方或成分。“主要包含,,将实施范例限制在说明的元素,步骤,配方或成分,以及那些不主要影响范例的部分。主要影响指的是在确定幽门螺杆菌cagA EPIYA等位基因以及/或者幽门螺杆菌抗体耐药性的测试中对结果有统计学意义的降低。
除非特殊说明,所有的数字代表成分的数量,使用在说明书以及权利要求中的例如分子量,反应条件等的性质可以被“大约“修饰。相应的,除非另外说明,本发明说明书以及权利要求中描述的数字参数可以根据本发明需要达到的条件而变动。至少,而且根据等同原则不限制本发明权利要求的保护范围,每个数字参数至少根据所显示的有效数字被理解,并遵循常规的四舍五入原则。当需要进一步解释时,词语“大约“,当其与一数字或一范围一起使用时,具有本领域技术人员合理赋予的意义,例如,表示比所述的数字或范围多一些或少一些,多少的范围是所述数值的±20%,所述数值的±19%,所述数值的±18%;所述数值的±17%;所述数值的±16%;所述数值的±15%;所述数值的±14%;所述数值的±13%;所述数值的±12%;所述数值的±11%;所述数值的±10%;所述数值的±9%;所述数值的±8%;所述数值的±7%;所述数值的±6%;所述数值的±5%;所述数值的±4%;所述数值的±3%;所述数值的±2%;或者所述数值的±1%。
尽管确定本发明保护范围的数字范围和参数是近似值,本发明中确切的实施范例中的数字值是尽量精确的。任何数字值含有不可避免的误差,该误差出自其相应的测试测量的标准偏差。
本发明中的词语“一个“,以及“这个“以及类似的指示物(尤其在以下权利要求的上下文中),被理解为包含单数以及复数,除非另外说明。使用数值的范围是包括该范围内所有单个数值的快速方法。除非另外说明,每个个别数值都被包括在说明书中,就象这些数值分别在说明书中被列举一样。本发明所有的方法都可以用适合的顺序实施,除非另外说明,或者与上下文明显相悖。本发明中使用的任何实施范例,或举例语言(例如,“例如“),都只是为进一步地说明本发明,而不是限制本发明的保护范围。本发明中的任何语言都不应该代表本发明不要求的元素。
本发明可供选择的元素或范例的组合不能被理解为对本发明的限制。每个组合成员可以被单独涉及,要求,或和组合中的其他成员或元素组合。可以预见的是,出于方便或专利性的原因,组合中的一个或多个成员可以被加入或删除。当加入或删除发生时,说明书被理解为包含被修饰的组合,从而符合在附加权利要求中使用的所有组合。
本发明公布了一些实施范例,包括发明人知道的最好的本发明的实施方案。当然,对这些实施范例作出的修改对本领域的技术人员是显而易见的。发明人期待的是,本领域的技术人员能正确使用这些修改。相应的,本发明包括在权利要求中以及在相应法律允许的范围内所有的修改以及等同的技术元素。另外,所有上述元素的组合及其可能的变异都包含在本发明中,除非另有说明或者与上下文相悖。
另外,本发明引证了大量专利,文件,期刊以及其他书面文章。每个引证的文献的所有参考信息被分别加入至引证的位置以便参阅。
最后要说明的是,本发明的实施范例对本发明的原理有描述作用,因此,不具有限制作用。本发明的其他可替代的实施范例可以根据本发明的描述被使用。相应的,本发明并不仅仅限于这里所描述的。
本发明中通过实施范例和讨论所描述的细节只是代表最有用和最容易被理解的本发明的原理的范例。所以,在描述本发明做了最基础的理解说明以后,没有再过多的另外多做说明。通过本发明的说明书附图以及/或者范例,本领域的技术人员应该知道如何实施本发明。
本发明中的定义和解释也适用于未来,除非另有说明或者对一些定义的使用将导致词汇没有意义或基本没有意义。如果词语被认为没有意义或基本没有意义,那么该定义应该从韦氏字典,第三版中,或其他本领域技术人员熟知的词典中,例如生物化学以及分子生物学牛津字典(Ed.Anthony Smith,牛津出版社,牛津,2004),被删除。
Claims (118)
1.引物和探针在制备用于通过下述方法评估幽门螺杆菌感染、幽门螺杆菌毒性与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,以及幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性的试剂盒中的用途,其特征在于,所述方法包括:化验患者的粪便样品,检测16s幽门螺旋杆菌基因,用于判定幽门螺旋杆菌感染是否存;检测cagA幽门螺旋杆菌基因,用于评估幽门螺杆菌毒性;
分析cagA EPIYA等位基因,用于评估与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险;以及分析幽门螺杆菌23s基因的序列,用于评估幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性,该测序方法是样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR),当样品中存在16S基因时证明患者中存在幽门螺杆菌感染,cagA基因的存在确定毒性幽门螺杆菌在患者中的感染,东亚cagA EPIYA等位基因的存在确认患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的提高,以及突变的23S基因的存在确认患者带有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌感染;
其中所述引物和探针包括:
用于扩增和检测幽门螺杆菌的16S基因的序列ID NO:1,序列ID NO:20,以及序列IDNO:21;
用于扩增和检测幽门螺杆菌cagA的EPIYA等位基因的序列,其包括选自序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13的序列;
用于扩增和检测与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列的序列ID NO:23,序列IDNO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
2.根据权利要求1所述用途,其特征在于:用于扩增16s幽门螺旋杆菌的序列为序列IDNO:1以及序列ID NO:20。
3.根据权利要求1所述用途,其特征在于:用于检测16s幽门螺旋杆菌的序列为序列IDNO:21。
4.根据权利要求1所述用途,其特征在于:进一步包括用于扩增cagA幽门螺旋杆菌基因的序列,其为序列ID NO:4以及SEQ ID NO:5。
5.根据权利要求1所述用途,其特征在于:进一步包括用于检测cagA幽门螺旋杆菌基因的序列,其为序列ID NO:6,序列ID NO:7,以及/或者序列ID NO:22。
6.根据权利要求1所述用途,其特征在于:用于扩增cagA EPIYA等位基因的序列为序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,以及序列ID NO:11。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:用于检测cagA EPIYA等位基因的序列为序列ID NO:12以及序列ID NO:13。
8.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:用于扩增23S基因的序列为序列ID NO:23以及序列ID NO:15。
9.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:用于检测23S基因的序列为序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及/或者序列ID NO:19。
10.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:每个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少84%。
11.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:至少一个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少93%。
12.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述胃部疾病为一种或多种胃溃疡以及/或者胃癌。
13.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述胃部疾病是胃癌。
14.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤突变为胞嘧啶(C),以及位置2143的腺嘌呤突变为鸟嘌呤。
15.引物和探针在制备用于通过下述评估幽门螺杆菌感染、幽门螺杆菌毒性与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,或者幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性的试剂盒中的用途,其特征在于:所述方法包括:
化验患者的粪便样品,检测16s幽门螺旋杆菌基因,用于判定幽门螺旋杆菌感染是否存;检测cagA幽门螺旋杆菌基因,用于评估幽门螺杆菌毒性;
分析cagA EPIYA等位基因,用于评估与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险;以及分析幽门螺杆菌23s基因的序列,用于评估幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性,该测序方法是样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR),当样品中存在16S基因时证明患者中存在幽门螺杆菌感染,cagA基因的存在确定毒性幽门螺杆菌在患者中的感染,东亚cagA EPIYA等位基因的存在确认患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的提高,或者突变的23S基因的存在确认患者带有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌感染
其中所述引物和探针包括:
用于扩增和检测幽门螺杆菌的16S基因的序列ID NO:1,序列ID NO:20,以及序列IDNO:21;
用于扩增和检测幽门螺杆菌cagA的EPIYA等位基因的序列,其包括选自序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13的序列;
用于扩增和检测与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列的序列ID NO:23,序列IDNO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
16.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:用于扩增16s幽门螺旋杆菌的序列为序列ID NO:1以及序列ID NO:20。
17.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:用于检测16s幽门螺旋杆菌的序列为序列ID NO:21。
18.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:进一步包括用于扩增cagA幽门螺旋杆菌基因的序列,其为序列ID NO:4以及SEQ ID NO:5。
19.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:检测cagA幽门螺旋杆菌基因的序列为序列ID NO:6,序列ID NO:7,以及序列ID NO:22。
20.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:所述扩增cagA EPIYA等位基因的序列为序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,以及序列ID NO:11。
21.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:所述检测cagA EPIYA等位基因的序列为序列ID NO:12以及序列ID NO:13。
22.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:用于扩增23S基因的序列为序列ID NO:23以及序列ID NO:15。
23.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:用于检测23S基因的序列为序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
24.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:所述每个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少84%。
25.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:至少一个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少93%%。
26.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:所述胃部疾病为一种或多种胃溃疡以及/或者胃癌。
27.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:所述胃部疾病是胃癌。
28.根据权利要求15所述的用途,其特征在于:所述23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤突变为胞嘧啶(C),以及位置2143的腺嘌呤突变为鸟嘌呤。
29.引物和探针在制备用于通过下述方法检测与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,以及幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性的试剂盒中的用途,其特征在于:所述方法包括:检测从患者体内获得粪便样品用以检测(i)是否存在cagA EPIYA等位基因,用于评估与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,以及(ii)幽门螺杆菌23S基因序列用于检测幽门螺杆菌在患者体内的克拉霉素的敏感性或耐药性,其中,东亚cagA等位基因的存在确认患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的提高,以及突变的23S基因的存在确认患者带有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌感染;
其中所述引物和探针包括:
用于扩增和检测幽门螺杆菌cagA的EPIYA等位基因的序列,其包括选自序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13的序列;
用于扩增和检测与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列的序列ID NO:23,序列IDNO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
30.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:所述23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),以及位置2143的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)。
31.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:用于扩增cagA EPIYA等位基因的序列为用于spdPCR的序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,以及序列ID NO:11。
32.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:用于检测cagA EPIYA等位基因的序列为序列ID NO:12以及序列ID NO:13。
33.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:用于扩增23S基因序列的序列为用于spdPCR的序列ID NO:23以及序列ID NO:15。
34.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:用于检测23S基因序列的序列为序列IDNO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
35.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:每个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少84%。
36.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:所述权利要求29中的方法,其中至少一个测试的基因,等位基因或者基因序列的分析的敏感度为至少93%。
37.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:所述胃部疾病为一种或多种胃溃疡以及/或者胃癌。
38.根据权利要求29所述的用途,其特征在于:所述胃部疾病是胃癌。
39.引物和探针在制备通过下述方法既能确认一患者具有患有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,又能指导抗生素治疗的试剂盒中的用途,其特征在于;所述方法包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)评估粪便样品中如下基因的核苷酸顺序,(i)幽门螺杆菌的16S基因,(ii)幽门螺杆菌的cagA基因,(iii)幽门螺杆菌的cagA EPIYA等位基因,以及(iv)与克拉霉素的敏感性或耐药性相关的幽门螺杆菌的23S基因序列,其中幽门螺杆菌16S核苷酸序列的存在确认患者中存在幽门螺杆菌感染,幽门螺杆菌cagA核苷酸序列的存在表明患者具有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,东亚cagA EPIYA等位基因的存在表明,相对于仅仅存在有cagA核苷酸序列,患者具有更高的与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险的提高,以及突变的23S基因的存在确认患者带有克拉霉素耐药性幽门螺杆菌感染,并且当患者被列为具有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险时,根据检测获得的23S基因序列实施预防性治疗;
其中所述引物和探针包括:
用于扩增和检测幽门螺杆菌的16S基因的序列ID NO:1,序列ID NO:20,以及序列IDNO:21;
用于扩增和检测幽门螺杆菌cagA的EPIYA等位基因的序列,其包括选自序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13的序列;
用于扩增和检测与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列的序列ID NO:23,序列IDNO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
40.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;其中23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),以及位置2143的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)。
41.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;用于检测16S幽门螺杆菌基因的序列为序列ID NO:21。
42.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;用于检测cagA幽门螺旋杆菌基因的序列为序列ID NO:6,序列ID NO:7,以及序列ID NO:22。
43.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;用于检测cagA EPIYA等位基因的序列为序列ID NO:12以及序列ID NO:13。
44.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;用于检测23S基因序列的序列为序列IDNO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
45.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;用于扩增16S幽门螺杆菌基因的序列为序列ID NO:1以及序列ID NO:20。
46.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;用于扩增cagA幽门螺杆菌基因的序列为序列ID NO:4以及序列ID NO:5。
47.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;用于扩增cagA EPIYA基因的序列为序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,以及序列ID NO:11。
48.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;用于扩增23S基因序列的序列为序列IDNO:23以及序列ID NO:15。
49.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;所述的方法进一步含有当检测发现存在东亚cagA EPIYA等位基因时,患者将被监控胃部疾病的发展。
50.根据权利要求49所述的用途,其特征在于;所述的监控指监控胃癌的发展。
51.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;包括当检测发现与克拉霉素的敏感性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素。
52.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;包括当检测发现与克拉霉素的耐药性相关的23S基因序列存在时,使用一种非克拉霉素抗生素。
53.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;所述非克拉霉素抗生素选自,阿米卡星,庆大霉素,卡那霉素,新霉素,乙基西梭霉素,链霉素,妥布霉素,氯碳头孢,厄他培南,亚胺培南,西司他丁,美罗培南,头孢羟氨苄,头孢唑啉,头孢氨苄,头孢克洛,头孢羟唑,头孢西丁,头孢罗齐,头孢呋辛,头孢克肟,头孢地尼,头孢托仑,头孢哌酮钠,头孢噻肟,头孢泊肟,头孢他啶,头孢布烯,头孢唑肟,头孢磺啶,头孢吡肟,替考拉宁,万古霉素,阿奇霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,氨曲南,阿莫西林,氨苄青霉素,阿洛西林,羧苄青霉素,氯洒西林,双氯青霉素,氟氯西林,美洛西林,萘夫西林,盘尼西林,哌拉西林,羟基噻吩青霉素,杆菌肽,粘菌素,多粘菌素B,环丙沙星,依诺沙星,加替沙星,左氧氟沙星,洛美沙星,莫西沙星,诺氟沙星,氧氟沙星,曲伐沙星,磺胺米隆,百浪多息,磺胺醋酰,磺胺甲二唑,磺胺,柳氮磺胺吡啶,磺胺异恶唑,甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲恶唑,磺胺甲基异恶唑,地美环素,强力霉素,二甲胺四环素,氧四环素,四环素,氯霉素,克林霉素,乙胺丁醇片,磷霉素,呋喃唑酮,异烟肼,利奈唑胺,甲硝哒唑,莫匹罗星,呋喃咀啶,平板霉素,吡嗪酰胺,奎奴普丁/达福普汀,利福平,壮观霉素,两性霉素B,氟康唑,氟嘧啶,庆大霉素,甲氧西林,苯甲异噁唑青霉素,以及克拉维酸。
54.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用一种非克拉霉素抗生素。
55.根据权利要求39所述的用途,其特征在于;当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素抗生素以及一种非克拉霉素抗生素。
56.序列在制备用于通过下述方法检测患者体内是否存在克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒中的用途,其特征在于:所述方法包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)在从患者中获得的样品中评估是否存在与克拉霉素耐药性相关的幽门螺杆菌突变23S基因,即使克拉霉素耐药菌株在总幽门螺杆菌中只占1%的比重,也能通过该方法被检测出;
所述序列包括:
用于扩增23S基因序列的序列ID NO:23以及序列ID NO:15;和
用于检测23S基因序列的序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列IDNO:19。
57.根据权利要求56所述的用途,其特征在于:所述样品为粪便样品。
58.根据权利要求56所述的用途,其特征在于:所述23S基因的突变是位置2142的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),或者腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),以及位置2143的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)。
59.根据权利要求56所述的用途,其特征在于:当检测发现与克拉霉素的敏感性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素。
60.根据权利要求56所述的用途,其特征在于:当检测发现与克拉霉素的耐药性相关的23S基因序列存在时,使用一种非克拉霉素抗生素。
61.根据权利要求56所述的用途,其特征在于:所述非克拉霉素抗生素选自,阿米卡星,庆大霉素,卡那霉素,新霉素,乙基西梭霉素,链霉素,妥布霉素,氯碳头孢,厄他培南,亚胺培南,西司他丁,美罗培南,头孢羟氨苄,头孢唑啉,头孢氨苄,头孢克洛,头孢羟唑,头孢西丁,头孢罗齐,头孢呋辛,头孢克肟,头孢地尼,头孢托仑,头孢哌酮钠,头孢噻肟,头孢泊肟,头孢他啶,头孢布烯,头孢唑肟,头孢磺啶,头孢吡肟,替考拉宁,万古霉素,阿奇霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,氨曲南,阿莫西林,氨苄青霉素,阿洛西林,羧苄青霉素,氯洒西林,双氯青霉素,氟氯西林,美洛西林,萘夫西林,盘尼西林,哌拉西林,羟基噻吩青霉素,杆菌肽,粘菌素,多粘菌素B,环丙沙星,依诺沙星,加替沙星,左氧氟沙星,洛美沙星,莫西沙星,诺氟沙星,氧氟沙星,曲伐沙星,磺胺米降,百浪多息,磺胺醋酰,磺胺甲二唑,磺胺,柳氮磺胺吡啶,磺胺异恶唑,甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲恶唑,磺胺甲基异恶唑,地美环素,强力霉素,二甲胺四环索,氧四环索,四环索,氯霉索,克林霉索,乙胺丁醇片,磷霉索,呋喃唑酮,异烟肼,利奈唑胺,甲硝哒唑,莫匹罗星,呋喃咀啶,平板霉素,吡嗪酰胺,奎奴普丁/达福普汀,利福平,壮观霉素,两性霉素B,氟康唑,氟嘧啶,庆大霉素,甲氧西林,苯甲异噁唑青霉索,以及克拉维酸。
62.根据权利要求56所述的用途,其特征在于:当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用一种非克拉霉素抗生素。
63.根据权利要求56所述的用途,其特征在于:当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素抗生素以及一种非克拉霉素抗生素。
64.引物在制备用于通过下述方法从一样品中获得幽门螺杆菌具体基因型数量的数量信息的试剂盒中的用途,其特征在于:所述方法包括,使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增样品;
其中,扩增使用的引物选自:(i)序列ID NO:1以及序列ID NO:20;(ii)序列ID NO:4以及序列ID NO:5;(iii)序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10以及序列ID NO:11;或者(iv)序列ID NO:23以及序列ID NO:15,其中,扩增提供了幽门螺杆菌具体基因型数量的定量信息。
65.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:所述扩增使用引物(i)序列ID NO:1以及序列ID NO:20获得幽门螺杆菌16S基因的数量信息,使用引物(ii)序列ID NO:4以及序列IDNO:5获得幽门螺杆菌cagA基因的数量信息,使用引物(iii)序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10以及序列ID NO:11获得幽门螺杆菌cagA EPIYA等位基因的数量信息,以及,或者使用(iv)序列ID NO:23以及序列ID NO:15获得幽门螺杆菌23S基因的数量信息。
66.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:进一步包括检测样品中扩增了的幽门螺杆菌具体基因型的引物,所述引物选自(i)序列ID NO:21;(ii)序列ID NO:6,序列ID NO:7,以及序列ID NO:22;(iii)序列ID NO:12以及SEQ ID NO:13;以及(iv)序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
67.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:所述数量信息用于评估样品中细菌负荷。
68.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:所述所获得的数量信息被用来划分患者时候具有与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病风险,当患者被划分为有风险时,将启动预防以及,或者治疗处理。
69.根据权利要求68所述的用途,其特征在于:所述胃部疾病为一种或多种胃溃疡以及/或者胃癌。
70.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:所述所获得的数量信息用于评估幽门螺杆菌对一抗生素治疗的敏感性或者耐药性。
71.根据权利要求70所述的用途,其特征在于:所述抗生素治疗为克拉霉素治疗。
72.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:所述spdPCR的敏感度为至少84%。
73.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:所述spdPCR的敏感度为至少93%。
74.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:所述spdPCR的敏感度为至少99%。
75.根据权利要求64所述的用途,其特征在于:所述spdPCR的敏感度为100%。
76.一种基于样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)利用粪便化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒含有引物和探针,所述引物和探针用于扩增和检测:
(i)幽门螺杆菌的16S基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:1,序列ID NO:20,以及序列ID NO:21;
(ii)幽门螺杆菌cagA的EPIYA等位基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13,以及
(iii)与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列,其中所述引物和探针包括:序列IDNO:23,序列ID NO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
77.根据权利要求76所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
78.根据权利要求76所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%。
79.根据权利要求76所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为100%。
80.根据权利要求77所述的的试剂盒,其特征在于:所述试机盒所引导的治疗或者预防处理是基于检测出的16S,cagA的EPIYA等位基因,以及23S基因序列。
81.根据权利要求80所述的试剂盒,其特征在于:所述检测出16S基因时,引导使用治疗型抗生素进行治疗。
82.根据权利要求80所述的试剂盒,其特征在于:所述检测出东亚cagA等位基因时,引导监控患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病的发展,并开始对患者施行治疗性以及预防性抗生素治疗。
83.根据权利要求80所述的试剂盒,其特征在于:所述检测出与克拉霉素敏感性或耐药性相关的23S基因序列时,引导一种抗生素治疗方案。
84.一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述该试剂盒含有:引物和探针,所述引物和探针用于扩增和检测:(i)幽门螺杆菌的16S基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:1,序列ID NO:20,以及序列ID NO:21;(ii)幽门螺杆菌的cagA基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:4,序列ID NO:5,序列ID NO:6,以及序列ID NO:7,以及(iii)与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:23,序列ID NO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
85.根据权利要求84所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒进一步包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
86.根据权利要求85所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
87.根据权利要求85所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%。
88.根据权利要求85所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试机盒所引导的治疗或者预防处理是基于检测出的16S,cagA的EPIYA等位基因,以及23S基因序列。
89.根据权利要求88所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:检测出16S基因时,引导使用治疗型抗生素进行治疗。
90.根据权利要求88所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述检测出cagA基因时,引导监控患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病的发展,并开始对患者施行治疗性以及预防性抗生素治疗。
91.根据权利要求88所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:检测出与克拉霉素敏感性或耐药性相关的23S基因序列时,引导一种抗生素治疗方案。
92.根据权利要求84所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒进一步包括用于检测幽门螺杆菌cagA基因的EPIYA等位基因的引物和探针,其中所述探针包括:序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13。
93.一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述该试剂盒含有:引物和探针,所述引物和探针用于扩增和检测:(i)幽门螺杆菌的16S基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:1,序列ID NO:20,以及序列ID NO:21;(ii)幽门螺杆菌cagA的EPIYA等位基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13,以及(iii)与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:23,序列ID NO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
94.根据权利要求93所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒进一步包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
95.根据权利要求94所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
96.根据权利要求94所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%。
97.根据权利要求93所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试机盒所引导的治疗或者预防处理是基于检测出的16S,cagA的EPIYA等位基因,以及23S基因序列。
98.根据权利要求97所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:检测出16S基因时,引导使用治疗型抗生素进行治疗。
99.根据权利要求97所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:检测出东亚cagA等位基因时,引导监控患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病的发展,并开始对患者施行治疗性以及预防性抗生素治疗。
100.根据权利要求97所述的一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:检测出与克拉霉素敏感性或耐药性相关的23S基因序列时,引导一种抗生素治疗方案。
101.一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒含有:引物和探针,所述引物和探针用于扩增和检测:(i)幽门螺杆菌的16S基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:1,序列ID NO:20,以及序列ID NO:21;(ii)幽门螺杆菌的cagA基因,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:4,序列ID NO:5,序列ID NO:6,以及序列ID NO:7,以及(iii)与克拉霉素耐药性相关联的23S基因序列,其中所述引物和探针包括:序列ID NO:23,序列ID NO:15,序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
102.根据权利要求101一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒进一步包括使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
103.根据权利要求102一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
104.根据权利要求102一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%,99%,或者100%。
105.根据权利要求102一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试机盒所引导的治疗或者预防处理是基于检测出的16S,cagA的EPIYA等位基因,以及23S基因序列。
106.根据权利要求105一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述检测出16S基因时,引导使用治疗型抗生素进行治疗。
107.根据权利要求105一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:检测出东亚cagA等位基因时,引导监控患者与幽门螺杆菌感染相关的胃部疾病的发展,并开始对患者施行治疗性以及预防性抗生素治疗。
108.根据权利要求105一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:检测出与克拉霉素敏感性或耐药性相关的23S基因序列时,引导一种抗生素治疗方案。
109.根据权利要求101一种用于粪便中化验幽门螺杆菌的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒进一步含有扩增和检测幽门螺杆菌cagA基因EPIYA等位基因的引物和探针,其中,所述引物和探针包括:序列ID NO:8,序列ID NO:9,序列ID NO:10,序列ID NO:11,序列ID NO:12,以及序列ID NO:13。
110.一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其特征在于:即使克拉霉素耐药菌株在总幽门螺杆菌中只占1%的比重,也能使用该试剂盒被检测出,所述试剂盒中的引物选自序列ID NO:23以及序列ID NO:15,用于扩增幽门螺杆菌23S基因序列,同时,该试剂盒含有使用样本分区数字聚合酶链反应(spdPCR)扩增和检测的使用说明。
111.根据权利要求110所述的一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其特征在于:所述该试剂盒进一步含有选自序列ID NO:16,序列ID NO:25,序列ID NO:18,以及序列ID NO:19。
112.根据权利要求111所述的一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,具特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少84%。
113.根据权利要求111所述的一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其特征在于:所述引物,探针以使用说明对所有测试的基因序列的化验敏感度为至少93%,99%,或者100%。
114.根据权利要求110所述的一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其特征在于:当检测出与克拉霉素敏感性相关的23S基因序列时,进行克拉霉素治疗。
115.根据权利要求110所述的一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其特征在于:检测出与克拉霉素耐药性相关的23S基因序列时,实施一种非克拉霉素抗生素治疗。
116.根据权利要求115所述的一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其特征在于:所述非克拉霉素抗生素选自,阿米卡星,庆大霉素,卡那霉素,新霉素,乙基两梭霉素,链霉素,妥布霉素,氯碳头孢,厄他培南,亚胺培南,西司他丁,美罗培南,头孢羟氨苄,头孢唑啉,头孢氨苄,头孢克洛,头孢羟唑,头孢西丁,头孢罗齐,头孢呋辛,头孢克肟,头孢地尼,头孢托仑,头孢哌酮钠,头孢噻肟,头孢泊肟,头孢他啶,头孢布烯,头孢唑肟,头孢磺啶,头孢吡肟,替考拉宁,万古霉素,阿奇霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,氨曲南,阿莫两林,氨苄青霉素,阿洛两林,羧苄青霉素,氯洒西林,双氯青霉素,氟氯西林,美洛西林,萘夫西林,盘尼西林,哌拉西林,羟基噻吩青霉素,杆菌肽,粘菌素,多粘菌素B,环丙沙星,依诺沙星,加替沙星,左氧氟沙星,洛美沙星,莫西沙星,诺氟沙星,氧氟沙星,曲伐沙星,磺胺米隆,百浪多息,磺胺醋酰,磺胺甲二唑,磺胺,柳氮磺胺吡啶,磺胺异恶唑,甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲氧苄氨嘧啶,磺胺甲恶唑,磺胺甲基异恶唑,地美环素,强力霉素,二甲胺四环素,氧四环素,四环素,氯霉素,克林霉素,乙胺丁醇片,磷霉素,呋喃唑酮,异烟肼,利奈唑胺,甲硝哒唑,莫匹罗星,呋喃咀啶,平板霉素,吡嗪酰胺,奎奴普丁/达福普汀,利福平,壮观霉素,两性霉素B,氟康唑,氟嘧啶,庆人霉素,甲氧西林,苯甲异噁唑青霉素,以及克拉维酸。
117.根据权利要求110所述的一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其特征在于:检测出与克拉霉素敏感性以及耐药性相关的23S基冈序列时,使用一种非克拉霉素抗生素。
118.根据权利要求110所述的一种用于检测患者体内克拉霉素耐药性幽门螺杆菌菌株的试剂盒,其特征在于:当检测发现与克拉霉素的敏感性和耐药性相关的23S基因序列存在时,使用克拉霉素抗生素以及一种非克拉霉素抗生素。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462065511P | 2014-10-17 | 2014-10-17 | |
US62/065,511 | 2014-10-17 | ||
US201562168573P | 2015-05-29 | 2015-05-29 | |
US62/168,573 | 2015-05-29 | ||
PCT/US2015/055810 WO2016061398A1 (en) | 2014-10-17 | 2015-10-15 | Methods, kits & compositions to assess helicobacter pylori infection |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108474042A CN108474042A (zh) | 2018-08-31 |
CN108474042B true CN108474042B (zh) | 2022-02-11 |
Family
ID=55747367
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580056070.1A Active CN108474042B (zh) | 2014-10-17 | 2015-10-15 | 一种评估幽门螺杆菌感染的试剂成分,试剂盒以及方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108474042B (zh) |
WO (1) | WO2016061398A1 (zh) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109182569A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-01-11 | 济南市中心医院 | 高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒 |
KR20220012896A (ko) * | 2019-05-23 | 2022-02-04 | 아메리칸 몰레큘라 래보러토리즈, 인크. | 배설물 시료 내 희귀 dna 서열의 검출 방법 |
CA3141664A1 (en) * | 2019-05-23 | 2020-11-26 | American Molecular Laboratories, Inc. | Methods for detecting a level of h. pylori in a fecal sample |
CN110184331A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-30 | 深圳前海大井医疗股份有限公司 | 幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法 |
CN112342306A (zh) * | 2019-08-09 | 2021-02-09 | 沈阳祥伴科技有限公司 | 用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物组合物以及试剂盒 |
CN110982881A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-10 | 宁波美康盛德医学检验所有限公司 | 检测幽门螺杆菌的分子信标探针、试剂盒及其检测方法 |
CN111184867A (zh) * | 2020-03-19 | 2020-05-22 | 龚跃明 | 治疗幽门螺杆菌感染的化学药物组合物 |
AU2021308095A1 (en) * | 2020-07-17 | 2023-03-09 | Gen-Probe Incorporated | Detection of macrolide-resistant mycoplasma genitalium |
CN111850154B (zh) * | 2020-09-24 | 2021-01-01 | 上海芯超生物科技有限公司 | 多重荧光pcr熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒 |
CN113024667B (zh) * | 2021-05-27 | 2021-11-30 | 湖南艾科瑞生物工程有限公司 | 核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒 |
CN113604589B (zh) * | 2021-06-18 | 2024-03-29 | 江苏康为世纪生物科技股份有限公司 | 同时检测幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因分型及质子泵抑制剂代谢基因分型的试剂盒 |
CN113667767B (zh) * | 2021-08-17 | 2023-11-03 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法 |
CN116004875A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-04-25 | 华南理工大学 | 基于ddPCR法检测幽门螺杆菌的特异性引物、探针和方法 |
CN117625818A (zh) * | 2023-11-30 | 2024-03-01 | 南京市第一医院 | 一种基于raa-lfd法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5403924A (en) * | 1992-10-13 | 1995-04-04 | Vanderbilt University | Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration |
US20030138813A1 (en) * | 2001-09-24 | 2003-07-24 | Lars Engstrand | Method of diagnosis and disease risk assessment |
US20040052799A1 (en) * | 1996-11-15 | 2004-03-18 | Astra Aktiebolag | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics |
US20040137485A1 (en) * | 1999-11-29 | 2004-07-15 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antibacterial method and composition |
US20140274786A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with associated targets |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU9336701A (en) * | 2000-04-19 | 2001-10-30 | Ribotargets Limited | Assay for identification of a test compound |
WO2012027302A2 (en) * | 2010-08-21 | 2012-03-01 | The Regents Of The University Of California | Systems and methods for detecting antibiotic resistance |
WO2013136818A1 (ja) * | 2012-03-15 | 2013-09-19 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法及び検出キット |
-
2015
- 2015-10-15 WO PCT/US2015/055810 patent/WO2016061398A1/en active Application Filing
- 2015-10-15 CN CN201580056070.1A patent/CN108474042B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5403924A (en) * | 1992-10-13 | 1995-04-04 | Vanderbilt University | Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration |
US20040052799A1 (en) * | 1996-11-15 | 2004-03-18 | Astra Aktiebolag | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics |
US20040137485A1 (en) * | 1999-11-29 | 2004-07-15 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antibacterial method and composition |
US20030138813A1 (en) * | 2001-09-24 | 2003-07-24 | Lars Engstrand | Method of diagnosis and disease risk assessment |
US20140274786A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with associated targets |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Association between Helicobacter pylori Virulence Factors and Gastroduodenal Diseases in Okinawa, Japan;Matsunari O.等;《JCM》;20121231;第50卷(第3期);第876-883页 * |
Association of Helicobacter species with hepatitis C cirrhosis with or without hepatocellular carcinoma;M Rocha等;《GUT》;20050301;第54卷;第396-401页 * |
NF-KB activation and potentiation of proinflammatory responses by the Helicobacter pylor CagA protein;Sabine Brandt等;《PNAS》;20050628;第102卷(第26期);第9300-9305页 * |
Tyrosine Phosphorylation of CagA from Chinese Helicobacter pylori Isolates in AGS Gastric Epithelial Cells;Youli Zhang等;《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》;20050228;第43卷(第2期);786–790页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108474042A (zh) | 2018-08-31 |
WO2016061398A1 (en) | 2016-04-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108474042B (zh) | 一种评估幽门螺杆菌感染的试剂成分,试剂盒以及方法 | |
Bell et al. | Detection of Bacillus anthracis DNA by LightCycler PCR | |
Blessmann et al. | Real-time PCR for detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in fecal samples | |
Boman et al. | Molecular diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection | |
Jensen | Protocol for the detection of Mycoplasma genitalium by PCR from clinical specimens and subsequent detection of macrolide resistance-mediating mutations in region V of the 23S rRNA gene | |
Fitri et al. | Malaria diagnostic update: From conventional to advanced method | |
WO2017009693A1 (en) | 16s ribosomal rna universal primers and use thereof in microbiological analysis and diagnostics | |
JP2006516193A (ja) | ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法 | |
CN105463071A (zh) | 诊断细菌性阴道炎的方法 | |
Aguilera-Arreola et al. | Highly specific and efficient primers for in-house multiplex PCR detection of Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum | |
Sanjuan-Jimenez et al. | Lessons learned with molecular methods targeting the BCSP-31 membrane protein for diagnosis of human brucellosis | |
Liveris et al. | Quantitation of cell-associated borrelial DNA in the blood of Lyme disease patients with erythema migrans | |
WO2021112673A1 (en) | Methods for identifying microbes in a clinical and non-clinical setting. | |
ZA200607878B (en) | Neisseria gonorrhoeae detection | |
CN110157823A (zh) | Raa荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用 | |
Tatti et al. | Utilization of multiple real-time PCR assays for the diagnosis of Bordetella spp. in clinical specimens | |
Shipitsyna et al. | Evaluation of six nucleic acid amplification tests used for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia compared with an international strictly validated real-time porA pseudogene polymerase chain reaction. | |
JP2012531908A (ja) | 結核菌を検出するための方法および/またはプライマー | |
KR20090100950A (ko) | 실시간 pcr을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법 | |
Loens et al. | Development of conventional and real-time NASBA® for the detection of Legionella species in respiratory specimens | |
Trajano-Silva et al. | Standardization and evaluation of a duplex real-time quantitative PCR for the detection of Leishmania infantum DNA: a sample quality control approach | |
TWI658048B (zh) | 檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種之特異性引子及其使用方法 | |
US11898210B2 (en) | Tools for assessing FimH blockers therapeutic efficiency | |
KR102238561B1 (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 | |
WO2021094661A1 (en) | Method for determining the presence of intestinal parasites |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |