CN116356057A - 基于数字crispr的细菌检测方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于数字CRISPR的细菌检测方法及系统，该方法为：将待测细菌样本、用于对待测细菌样本的细胞进行裂解的细胞裂解子体系、用于对靶基因进行扩增的恒温扩增子体系以及针对靶基因进行CRISPR‑Cas12a检测的Cas12a检测子体系整合于同一反应体系中；将该反应体系通过微滴生成方法形成微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；借助对体系的荧光信号进行测量，通过CRISPR‑Cas12a检测确定含有靶基因的细胞的绝对含量，实现待测细菌样本的检测。本发明不需要对待测样品进行核酸提取，将核酸提取、核酸扩增和核酸检测在同一管内同步进行，避免了繁琐而又耗时的核酸提取过程，节省了大量的人力物力。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种基于数字CRISPR的细菌检测方法及系统。
背景技术
目前临床分子诊断技术方法主要有实时荧光定量PCR反应(Quantitative Real-time PCR，qPCR)、数字PCR(Digital PCR)、全基因组测序和基因芯片技术等。实时荧光定量PCR反应是目前临床最常用的分子诊断技术，但是其需要昂贵的专业仪器，样本要求高，检测成本昂贵；数字PCR虽然能够实现对DNA或RNA等核酸分子的绝对定量，但其本质仍是一种PCR技术，依旧存在和荧光定量PCR一样的缺陷：全基因组测序和基因芯片技术耗时长、仪器设备要求高、样本要求高、费用较高，绝大部分地区未普及。目前缺乏检测灵敏度高、检测成本低、检测时间短的分子诊断技术。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白在与外来核酸互补的向导RNA的引导下与外来核酸特异性结合，进而利用其核酸酶活性对外来核酸进行特异性切割。其中，CRISPR-Cas12a(Cpf1)属于Cas酶第二家族，可以在向导RNA的引导下对双链DNA进行特异性切割。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine,T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，在CRISPR RNA(crRNA)的引导下，切割与crRNA互补配对的双链DNA(dsDNA)。当Cas12a蛋白特异性的识别并切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性，能够随机切割周围的非特异性单链DNA。这一特性可以用于核酸的分子检测
目前有一些关于利用CRISPR-Cas12系统对细菌进行检测的相关文献和专利，例如专利CN111778318B公开了一种基于CRISPR/Cas系统检测核酸分子的方法及系统；但现有此类方案都需要先提取基因组DNA，再以基因组DNA为检测对象进行检测。这种方法需要提取基因组DNA，容易产生气溶胶污染，造成假阳性的情况出现，导致检测结果的可靠性不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于数字CRISPR的细菌检测方法及系统。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于数字CRISPR的细菌检测方法，该方法为：
将待测细菌样本、用于对待测细菌样本的细胞进行裂解的细胞裂解子体系、用于对靶基因进行扩增的恒温扩增子体系以及针对靶基因进行CRISPR-Cas12a检测的Cas12a检测子体系整合于同一反应体系中；
将该反应体系通过微滴生成方法形成若干微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
借助对体系的荧光信号进行测量，通过CRISPR-Cas12a检测确定含有靶基因的细胞的绝对含量，实现待测细菌样本的检测。
优选的是，其中，所述细胞裂解子体系包括裂解酶。
优选的是，所述恒温扩增子体系包括扩增引物PF、扩增引物PR。
优选的是，所述Cas12a检测子体系包括Cas12a、crRNA和ssDNA，其中：
crRNA为与靶基因互补配对的向导RNA，ssDNA为非特异性单链DNA，且ssDNA的两端分别连接有荧光基团和荧光猝灭基团；
存在靶基因时，在crRNA的引导下，Cas12a会随机切割周围的ssDNA，使得ssDNA上的荧光猝灭基团与荧光基团分离，荧光基团的荧光信号恢复。
优选的是，所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法的步骤为：
S1、配制反应体系，该反应体系中含有待测细菌样本；
S2、将反应体系通过微滴生成方法形成若干微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
S3、使微滴单元在37℃反应30-90min，然后通过荧光检测设备获取每个微滴单元的荧光强度，统计所有微滴单元的荧光强度检测结果，从而计算得到待测细菌样本中靶细菌的浓度。
优选的是，所述ssDNA两端分别修饰有6-羧基荧光素和荧光淬灭基团BHQ1，所述ssDNA的序列为：5'-6FAM-TTATT-BHQ1-3'。
优选的是，待测细菌样本为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；
crRNA为针对靶基因mecA基因设计，crRNA的序列如SEQ NO.1所示。优选的是，温扩增子系统为ERA恒温扩增系统，其包括的引物序列为：
PF引物的序列如SEQ NO.2所示，PR引物的序列如SEQ NO.3所示。
优选的是，所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行检测，包括以下步骤：
S1、配制反应体系：
将待测细菌样本、葡萄球菌裂解酶lysin ClyH、扩增引物PF、扩增引物PR、Cas12a、crRNA、ssDNA、溶解剂、激活剂和RNase-free水混合，得到反应体系
S2、将反应体系通过微滴生成设备形成若干微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
S3、使微滴单元在37℃反应45min，然后通过荧光检测设备获取每个微滴单元的荧光强度，统计所有微滴单元的荧光强度检测结果，从而计算得到待测细菌样本中靶细菌的浓度。
本发明还提供一种基于数字CRISPR的细菌检测系统，其采用如上所述的方法进行细菌检测，该系统包括微滴生成子系统、荧光检测子系统以及如上所述的方法中的反应体系；
所述微滴生成子系统用于将所述反应体系成分微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
所述荧光检测子系统用于对微滴单元进行荧光检测与分析，从而实现待测细菌样本的定量检测。
本发明的有益效果是：
本发明提供的基于数字CRISPR的细菌检测方法中，将细胞的裂解、特异性基因的恒温扩增和特异性基因的CRISPR-Cas12a检测整合至同一反应体系内进行，并且通过微滴生成系统，将该反应体系分成上万份，使每个微滴单元至多包含一个细胞，进而通过对CRISPR-Cas12a剪切信号的统计，能计算得到初始细胞的绝对含量；本发明提供的通过统计微滴单元内CRISPR-Cas12a剪切信号有无，从而计算初始细细胞含量数字CRISPR相较于传统的CRISPR方法，其灵敏度更高，可以对初始样本细胞数量进行绝对定量，且不需要先提取基因组DNA，再以基因组DNA为检测对象进行检测，简化了检测步骤，提高了检测效率；
本发明提供的基于数字CRISPR的细菌检测方法与荧光定量PCR、数字PCR等基于PCR反应的方法相比，不需要昂贵的基因扩增仪，检测成本低；与ERA、LAMP等单独的恒温扩增检测方法相比，灵敏度更高，可以对待检样品中的初始细胞数量进行绝对定量；特异性更强，能有效避免假阳性；
本发明不需要对待测样品进行核酸提取，而是利用ERA核酸恒温扩增和CRISPR-Cas12a核酸检测对环境耐受性高的这一特性，将核酸提取、核酸扩增和核酸检测在同一管内同步进行，避免了繁琐而又耗时的核酸提取过程，节省了大量的人力物力。
附图说明
图1为本发明的基于数字CRISPR的细菌检测方法的原理示意图；
图2为本发明的实施例1的方法检测43300细菌的结果；
图3为本发明的对照例1的方法检测43300基因组DNA的结果；
图4为本发明的对照例2的方法检测43300基因组DNA的结果；
图5为本发明的对照例3的方法中不同浓度的Lysin ClyH对43300的裂解效率检测结果；
图6为本发明的对照例3的方法检测43300细菌的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中，革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，葡萄球菌裂解酶(lysin ClyH)购自武汉赛思锐微生物技术有限公司，基础型核酸扩增试剂盒(ERA法)购自苏州先达基因科技有限公司，扩增引物由苏州泓迅生物公司合成；crRNA和ssDNA-FQ由苏州金唯智生物科技有限公司合成；LbCas12a蛋白及反应缓冲液购自吐露港生物科技有限公司。RNase-free水(DEPC水)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明提供了一种基于数字CRISPR的细菌检测方法，该方法为：
将待测细菌样本、用于对待测细菌样本的细胞进行裂解的细胞裂解子体系、用于对靶基因进行扩增的恒温扩增子体系以及针对靶基因进行CRISPR-Cas12a检测的Cas12a检测子体系整合于同一反应体系中；
将该反应体系通过微滴生成方法形成若干微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
借助对体系的荧光信号进行测量，通过CRISPR-Cas12a检测确定含有靶基因的细胞的绝对含量，实现待测细菌样本的检测。
其中，细胞裂解子体系包括裂解酶，恒温扩增子体系包括扩增引物PF、扩增引物PR。
其中，Cas12a检测子体系包括Cas12a、crRNA和ssDNA，其中：
crRNA为与靶基因互补配对的向导RNA，ssDNA为非特异性单链DNA，且ssDNA的两端分别连接有荧光基团和荧光猝灭基团；
存在靶基因时，在crRNA的引导下，Cas12a会随机切割周围的ssDNA，使得ssDNA上的荧光猝灭基团与荧光基团分离，荧光基团的荧光信号恢复。
其中，反应体系还包括RNase-free水。
参照图1，为本发明的基于数字CRISPR的细菌检测方法的原理示意图，其中，DNAploymerase为DNA聚合酶，DNA recombinase为DNA重组酶，SSB为单链dna结合蛋白，Forwardprimer即引物PF，Reverse primer即引物PR，MRSA bacteria为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明中，该基于数字CRISPR的细菌检测方法的步骤为：
S1、配制反应体系，该反应体系中含有待测细菌样本；
S2、将反应体系通过微滴生成方法形成若干微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
S3、使微滴单元在37℃反应30-90min，然后通过荧光检测设备获取每个微滴单元的荧光强度，统计所有微滴单元的荧光强度检测结果，从而计算得到待测细菌样本中靶细菌的浓度。
本发明还提供一种基于数字CRISPR的细菌检测系统，其采用如上的方法进行细菌检测，该系统包括微滴生成子系统、荧光检测子系统以及如上的反应体系；
微滴生成子系统用于将反应体系成分微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
荧光检测子系统用于对微滴单元进行荧光检测与分析，从而实现待测细菌样本的定量检测。
以下提供详细的实施例和对照例，以对本发明做进一步说明，在以下实施例中，以针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测为例进行说明，但需要理解的是，本发明的检测对象不限于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。其中所用的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为标准株ATCC＝43300。
实施例1：基于数字CRISPR的细菌检测方法
S1、配制反应体系：
将待测细菌样本、葡萄球菌裂解酶lysin ClyH、扩增引物PF、扩增引物PR、Cas12a、crRNA、ssDNA、溶解剂、激活剂和RNase-free水混合，得到反应体系；具体配比如下表1所示：
表1
其中，Lysin ClyH的浓度为40ug/mL。
其中，ssDNA两端分别修饰有6-羧基荧光素和荧光淬灭基团BHQ1，ssDNA的序列为：5'-6FAM-TTATT-BHQ1-3'(SEQ NO.4)；由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
crRNA为针对靶基因mecA基因设计，crRNA的序列如SEQ NO.1所示，如下表2，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。温扩增子系统为ERA恒温扩增系统，其包括的引物序列为：PF引物(mecA-ERA-PF)的序列如SEQ NO.2所示，PR引物(mecA-ERA-PR)的序列如SEQNO.3所示，如下表3，由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。
表2
表3
S2、将反应体系通过微滴生成芯片形成3万个左右的微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
S3、使微滴单元在37℃反应45min，然后通过荧光显微镜对微滴生成芯片进行扫描，获取每个微滴单元的荧光强度，统计所有微滴单元的荧光强度检测结果，从而计算得到待测细菌样本中靶细菌的浓度。不同细菌浓度所得到的所有微滴中有荧光的微滴(即阳性微滴)的比例如图2所示。结果表明，利用本发明的细菌数字CRISPR的方法可以检测到低至1CFU/反应的43300细菌，即0.25CFU/uL。
验证例1：利用CRISPR-Cas12a系统检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA
1、利用革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒对37℃过夜培养的43300进行基因组DNA提取。
2、合成crRNA(SEQ NO.1)。
3、合成ssDNA(SEQ NO.4)。
4、利用CRISPR-Cas12a系统检测43300基因组DNA：采用20μL体系，成分如下表4所示：
表4
| 成分 | 用量 |
| DNA | 10μL |
| 10×TOLO Buffer 3 | 2μL |
| LaCas12a(1μM) | 1μL |
| crRNA(1μM) | 1μL |
| ssDNA-FQ(5μM) | 1μL |
| H20(RNase free) | 5μL |
5、全波长酶标仪荧光检测
酶标仪荧光检测中，CRISPR-Cas12a对目的基因检测体系依次加入2μL10×TOLOBuffer 3、1μL LaCas12a(1μM)、1μL mecA-crRNA(1μM)、1μL ssDNA-FQ(5μM)、10μL 43300基因组DNA和5μL H20(RNase free)。各组分混合均匀后于37℃反应30min。使用全波长酶标仪Synergy H1用于测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取反应30min时的荧光数值为反应值。针对43300基因组DNA的不同浓度，其反应检测结果如图3所示。结果表明，CRISPR-Cas12a系统对43300基因组DNA的检测灵敏度可以达到10-11M级别。
验证例2：利用ERA扩增和CRISPR-Cas12a系统一步法检测43300基因组DNA
1、合成ERA核酸恒温扩增引物：mecA-ERA-PF(SEQ NO.2)、mecA-ERA-PR(SEQNO.3)。
2、利用ERA扩增和CRISPR-Cas12a系统一步法检测43300基因组DNA
采用20μL反应体系，具体成分及用量如下表5所示。各组分混合均匀后于37℃反应45min。
表5
| 成分 | 用量(uL) |
| PF(10uM) | 1 |
| PF(10uM) | 1 |
| 溶解剂 | 8 |
| 激活剂 | 0.8 |
| Cas12a(1uM) | 1 |
| crRNA(1uM) | 1 |
| ssDNA-FQ(5uM) | 1 |
| 43300DNA | 4 |
| H20(RNase free) | 2.2 |
使用全波长酶标仪Synergy H1用于测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取反应45min时的荧光数值为反应值。针对43300基因组DNA的不同浓度，其反应检测结果如图4所示。结果表明，ERA扩增和CRISPR-Cas12a检测一步法检测43300基因组DNA的检测灵敏度都可以达到10-17M级别。
验证例3：利用ERA扩增和CRISPR-Cas12a系统检测一步法检测43300细菌
1、检测葡萄球菌裂解酶(lysin ClyH)在ERA扩增和CRISPR-Cas12a检测一步法反应体系内对43300细菌的裂解效果
将过夜培养的新鲜43300菌液稀释至浓度大约为1X106CFU/mL，按如下表6所示反应比例配置反应体系。
表6
| 成分 | 用量(uL) |
| PF(10uM) | 1 |
| PF(10uM) | 1 |
| 溶解剂 | 8 |
| 激活剂 | 0.8 |
| lysin ClyH | 1.6 |
| Cas12a(1uM) | 1 |
| crRNA(1uM) | 1 |
| ssDNA-FQ(5uM) | 1 |
| 43300DNA | 4 |
| H20(RNase free) | 0.6 |
其中，Lysin ClyH的浓度分别为0、20ug/mL和40ug/mL。37℃，反应45分钟。取5uL反应产物，加入495uL灭菌水，混匀，取100uL涂于无抗性的LB平板，37℃，培养15小时，统计各个平板的菌落数量，计算反应结束后反应体系内的细菌总数和Lysin ClyH的裂解效果。针对不同浓度的Lysin ClyH，反应结束后反应体系内的细菌总数和裂解效果如图5所示。结果表明，40ug/mL的Lysin ClyH对43300的裂解效果最好，裂解效率可达到95％以上。
2、测试利用ERA扩增和CRISPR-Cas12a系统检测一步法检测43300细菌的灵敏度
以不同浓度的43300细菌为检测对象，按照3.1的反应比例配置反应体系(LysinClyH的浓度为40ug/mL)。37℃，反应45min，使用全波长酶标仪Synergy H1用于测量检测反应的荧光。不同浓度的43300细菌的相对荧光强度如图6所示。结果表明，ERA扩增和CRISPR-Cas12a检测一步法直接检测43300细菌的灵敏度可以达到40CFU/反应，即10CFU/uL。
通过验证例1-3可以验证本发明方法的可行性，本发明能够为临床病原菌的快速准确检测提供了一种新的方案。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，该方法为：
将待测细菌样本、用于对待测细菌样本的细胞进行裂解的细胞裂解子体系、用于对靶基因进行扩增的恒温扩增子体系以及针对靶基因进行CRISPR-Cas12a检测的Cas12a检测子体系整合于同一反应体系中；
将该反应体系通过微滴生成方法形成若干微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
借助对体系的荧光信号进行测量，通过CRISPR-Cas12a检测确定含有靶基因的细胞的绝对含量，实现待测细菌样本的检测。
2.根据权利要求1所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，其中，所述细胞裂解子体系包括裂解酶。
3.根据权利要求2所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，所述恒温扩增子体系包括扩增引物PF、扩增引物PR。
4.根据权利要求2所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，所述Cas12a检测子体系包括Cas12a、crRNA和ssDNA，其中：
crRNA为与靶基因互补配对的向导RNA，ssDNA为非特异性单链DNA，且ssDNA的两端分别连接有荧光基团和荧光猝灭基团；
存在靶基因时，在crRNA的引导下，Cas12a会随机切割周围的ssDNA，使得ssDNA上的荧光猝灭基团与荧光基团分离，荧光基团的荧光信号恢复。
5.根据权利要求4所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，该方法的步骤为：
S1、配制反应体系，该反应体系中含有待测细菌样本；
S2、将反应体系通过微滴生成方法形成若干微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
S3、使微滴单元在37℃反应30-90min，然后通过荧光检测设备获取每个微滴单元的荧光强度，统计所有微滴单元的荧光强度检测结果，从而计算得到待测细菌样本中靶细菌的浓度。
6.根据权利要求5所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，所述ssDNA两端分别修饰有6-羧基荧光素和荧光淬灭基团BHQ1，所述ssDNA的序列为：5'-6FAM-TTATT-BHQ1-3'。
7.根据权利要求6所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，待测细菌样本为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；
crRNA为针对靶基因mecA基因设计，crRNA的序列如SEQ NO.1所示。
8.根据权利要求7所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，温扩增子系统为ERA恒温扩增系统，其包括的引物序列为：
PF引物的序列如SEQ NO.2所示，PR引物的序列如SEQ NO.3所示。
9.根据权利要求8所述的基于数字CRISPR的细菌检测方法，其特征在于，该方法针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行检测，包括以下步骤：
S1、配制反应体系：
将待测细菌样本、葡萄球菌裂解酶lysin ClyH、扩增引物PF、扩增引物PR、Cas12a、crRNA、ssDNA、溶解剂、激活剂和RNase-free水混合，得到反应体系；
S2、将反应体系通过微滴生成设备形成若干微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
S3、使微滴单元在37℃反应45min，然后通过荧光检测设备获取每个微滴单元的荧光强度，统计所有微滴单元的荧光强度检测结果，从而计算得到待测细菌样本中靶细菌的浓度。
10.一种基于数字CRISPR的细菌检测系统，其特征在于，其采用如权利要求1-9中任意一项所述的方法进行细菌检测，该系统包括微滴生成子系统、荧光检测子系统以及如权利要求1-9中任意一项所述的方法中的反应体系；
所述微滴生成子系统用于将所述反应体系成分微滴单元，每个微滴单元中至多含有1个细胞；
所述荧光检测子系统用于对微滴单元进行荧光检测与分析，从而实现待测细菌样本的定量检测。
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