CN113702460B - 一种基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于Co‑MOF和血红素‑G‑DNA协同催化的电化学传感器及其制备方法和应用，属于电化学传感器制备和肉制品质量检测技术领域；在本发明中，制备了基于Co‑MOF和血红素‑G‑DNA协同催化的电化学传感器，所述电化学传感器中增敏材料为氮掺杂有序介孔碳，探针的固体支持物为Co‑MOF，通过记录信号探针中Co‑MOF和hemin‑G‑DNA协同双催化还原过氧化氢所产生的电化学信号，实现肉制品中Pb2+的定量检测。

Description

一种基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于电化学传感器制备和肉制品质量检测技术领域，具体涉及一种基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
腌制肉制品营养丰富、香气浓郁、口感独特，但是在其生产加工过程中，会与众多金属加工设备接触，被重金属污染。其中，铅离子（Pb2+）是毒性最高的污染物之一，即使摄入低浓度也会威胁人体的健康，影响人体软组织和器官，引起神经系统功能障碍和生殖功能障碍等，并且，当婴幼儿的血铅水平达到10~15 μg/dL（483~724 nM）时，就会导致认知和行为障碍。由于铅的高毒性，铅的超灵敏的痕量检测有着很高的要求。因此，建立一种超灵敏，快速，准确的Pb2+分析方法，对于保障公众的健康和腌制肉制品的安全都具有重要意义。
目前，已经报道了多种方法用于Pb2+的检测，例如电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），原子吸收光谱法，比色法和电化学方法。尽管大多方法如ICP-MS、原子吸收光谱法和比色法检测重金属离子有着检测灵敏、结果可靠等优点，但是检测流程繁琐耗时、检测成本较高，难以实现检测设备小型化，限制了在实际检测中的应用。相比之下，电化学方法具有操作简单、灵敏度高、成本低和响应速度快等优点，并且不同重金属溶液表现出的电化学性质也不同，因此电化学技术被广泛用于重金属检测。为了提高传感器对Pb2+的检测特异性，常采用Pb2+依赖性DNA酶（DNAzyme）作为特异性识别元件。随着传感器的发展，对Pb2+检测的线性范围越来越大，检测限越来越低，但检测的特异性和稳定性仍然较低，制约了传感器的发展。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器及其制备方法和应用。在本发明中，制备了基于Co-MOF和血红素-G-DNA（hemin-G-DNA）协同催化的电化学传感器，所述电化学传感器中增敏材料为氮掺杂有序介孔碳（N-CMK3），探针的固体支持物为Co-MOF，通过记录信号探针中Co-MOF和hemin-G-DNA协同双催化还原过氧化氢所产生的电化学信号，实现肉制品中Pb2+的定量检测。
本发明中是首先提供了一种基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器，所述电化学传感器中工作电极为涂覆了纳米金-钴-金属有机框架复合材料-血红素-G-DNA信号探针AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA的寡核苷酸探针-纳米金-氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE，对电极为碳，参比电极为银/氯化银电极。
本发明中还提供了上述基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）寡核苷酸探针-纳米金-氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极的制备：
将N-CMK3材料于纯水中超声分散，滴涂在丝网印刷碳电极SPCE表面，干燥得氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极，记为N-CMK3/SPCE；
然后用含有四氯金酸HAuCl4·4H2O和浓硫酸的聚合液在N-CMK3/SPCE表面电聚合，得到纳米金-氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极，记为Au-N-CMK3/SPCE；
接着将激活后的DNAzyme滴加在Au-N-CMK3/SPCE表面，孵育后洗涤，然后滴加牛血清白蛋白BSA，洗涤，干燥，得到寡核苷酸探针-纳米金-氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极，记为DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE。
其中，所述N-CMK3的制备流程为：将尿素、蔗糖和SBA-15溶解于水和乙醇的混合溶液中，搅拌均匀后，干燥，然后煅烧热解反应，反应结束后冷却至室温，随后用HF溶液蚀刻，蚀刻结束后离心，洗涤，干燥，得N-CMK3。
所述N-CMK3和纯水的用量比为5 mg:1 mL，滴涂用量为20 μL。
所述聚合液的用量为10 mL，聚合液中HAuCl4·4H2O的浓度为5 mM，H2SO4的浓度为0.1 M；所述电聚合的条件为电压为-0.3 V，电聚合时间为100 s。
所述DNAzyme的激活操作为：用三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP将DNAzyme避光激活，激活后溶于Tris-HCl缓冲液中；所述DNAzyme的浓度为0.5~3.0 μM，用量为10 μL。
所述孵育的条件为在4 ℃下孵育3 h；所述BSA的质量分数为1%，用量为50 μL。
（2）纳米金-钴-金属有机框架复合材料-血红素-G-DNA复合信号探针的制备：
将硝酸钴和2-甲基咪唑分别溶解于甲醇/乙醇溶液中，在剧烈搅拌下将2-甲基咪唑溶液缓慢加入硝酸钴溶液中，得到混合溶液，对其进行老化，然后离心，洗涤，干燥，重新分散于纯水中，得到钴-金属有机框架分散液，记为Co-MOF分散液；
然后向Co-MOF分散液中加入AuNPs分散液，搅拌反应，反应结束后静置，离心，洗涤，继续离心取沉淀，得到纳米金-钴-金属有机框架复合材料，记为AuNPs-Co-MOF，将其分散于纯水中，得到AuNPs-Co-MOF分散液；
然后向AuNPs-Co-MOF分散液中加入激活的G-DNA溶液，温和搅拌，得到纳米金-钴-金属有机框架复合材料-G-DNA，记为AuNPs-Co-MOF-G-DNA；
向AuNPs-Co-MOF-G-DNA中加入BSA钝化，接着加入血红素hemin，室温下孵育60~120 min，形成AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA信号探针，离心洗涤，分散于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCL缓冲液中，得到纳米金-钴-金属有机框架复合材料-血红素-G-DNA复合信号探针，记为AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA。
其中，所述甲醇/乙醇溶液中甲醇和乙醇的体积比为1：1，用量为80 mL；所述混合溶液中，硝酸钴的终浓度为0.375 M，2-甲基咪唑的终浓度为1.56 M，老化的条件为室温下老化24 h。
所述Co-MOF分散液和AuNPs分散液的体积比为1：2~1：8，其中，Co-MOF分散液的浓度为6 mg/mL，AuNPs分散液中AuNPs与纯水的比例为1~5g：1mL；搅拌反应的时间为2 h。
所述BSA溶液、G-DNA溶液、AuNPs-CO-MOF分散液和血红素hemin溶液的体积比为50μL：100 μL：1 mL：100 μL；其中，所述BSA溶液的质量分数为1%；
所述血红素hemin的浓度为1~4 μM；
所述G-DNA溶液的浓度为2 μM；
所述AuNPs-Co-MOF分散液中AuNPs-Co-MOF离心沉淀物与纯水的比例为1~6 g：1mL。（3）基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备：
将AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA涂覆在DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE上，并将其作为工作电极，以铂丝为对电极，银/氯化银电极为参比电极组装得到基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器。
其中，步骤（1）和（2）不分先后顺序。
本发明中还提供了上述基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器在检测Pb2+中的应用，其中所述应用为检测肉制品中的Pb2+。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中，采用氮掺杂有序介孔碳来修饰电极，氮掺杂有序介孔碳N-CMK3材料比表面积大、导电性强、具有可调节的规则孔道和良好的生物相容性，其中氮原子的掺杂进一步引入了大量活性位点以提高电导率。本发明中还将具有较高的比表面积、丰富的活性位点和可调节的功能性的金属有机框架（MOFs）作为生物分子固载基底来构建双催化电化学传感器，并将其用于Pb2+的检测，解决了生物大分子通常存在着固载不牢、易失活的问题，并且能够形成信号探针放大电化学信号。
本发明中，采用G-DNA修饰的纳米复合材料AuNPs-Co-MOF作为探针分子，加入hemin后富含鸟嘌呤碱基G的直链G-DNA经过氢键和π-π键作用自组装折叠形成G-四链体结构，并将hemin包裹其中，具有类过氧化物酶的性质，达到双催化效果，实现电化学信号放大并增强传感器的灵敏度。并且，本发明中所用丝网印刷碳电极SPCE传感器小型化且方便携带，检测便捷、高效快捷。
由于Pb2+的存在能够使DNAzyme在“rA”位点被裂解为两个自由片段，本发明中制备得到的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器能够特异性识别Pb2+，大大提高了低含量Pb2+测定的时间效率和抗干扰能力。并且，该电化学传感器在1.0 pM至10 μMPb2+的范围内显示出宽线性响应，检测限低至0.32 pM，并成功地用于肉制品产品的分析，为Pb2+检测提供了有希望的工具。
本发明中制备得到的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器有效地提高了Pb2+检测过程中的灵敏度和稳定性，缩短检测时间，1 min内即可得到由纳米复合材料Co-MOF和hemin-G-DNA类过氧化物仿生酶协同催化还原过氧化氢（H2O2，30%）所产生的电化学信号，实现Pb2+浓度的精确测量，并且操作简单，对检测人员无特殊要求，可达到对Pb2+快速、痕量检测。
附图说明
图1为Co-MOF材料的表征图；其中，A为Co-MOF材料的SEM图像；B为Co-MOF材料的XPS光谱图。
图2为复合材料AuNPs-Co-MOF的SEM-ED元素分布图。
图3为AuNPs，Co-MOF和AuNPs-Co-MOF的UV-Vis图。
图4为信号探针AuNPs-Co-MOF/hemin-G-DNA的制备流程。
图5为N-CMK3材料的表征图；其中，A为N-CMK3材料的TEM图像；B为为N-CMK3材料的氮气吸附-解吸等温线，插图为相应的孔径分布图；C为材料N-CMK3的SAXD图谱；D为材料N-CMK3的XPS光谱图。
图6中A为不同修饰电极在10 mM [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的CV图；B为不同修饰电极在10 mM [Fe(CN)6]3-/4-溶液中EIS图；其中，裸SPCE(a)，Au/SPCE(b)，N-CMK3/SPCE(c)，Au-N-CMK3/SPCE(d)，DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE(e)，AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA-DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE（f）。
图7中A为基于DNAzyme的传感器对不同浓度Pb2+（0、1 pM，10 pM，100 pM，1 nM，10nM，100 nM，1 μM，10 μM）的i-t曲线图；B为相应的标准曲线。
图8为对肉制品中Pb2+进行电化学检测的示意图。
图9中A为传感器基底材料分别为N-CMK3（a），Au（b）和Au-N-CMK3（c）修饰传感器信号放大策略的比较图；B为信号探针分别为AuNPs-hemin-G-DNA（a）和AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA（b）修饰传感器信号放大策略的比较图；C为信号探针分别为AuNPs-Co-MOF-G-DNA（a）和AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA（b）修饰传感器信号放大策略的比较图。
图10中A为Co-MOF与AuNPs的体积比例条件优化图；B为DNAzyme的浓度条件优化图；C为Pb2+的切割时间条件优化图；D为信号探针的孵育时间条件优化图；E为hemin的浓度条件优化图；F为检测液的pH值条件优化图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1. 信号探针AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA的制备：
（1）Co-MOF的合成：
将0.06 M硝酸钴和0.25 M 2-甲基咪唑分别溶解于80 mL甲醇/乙醇（1：1）溶液中，在剧烈搅拌下将2-甲基咪唑溶液缓慢加入硝酸钴溶液中，所得混合溶液在室温下进行24 h老化；将得到的紫色产物在10,000 rpm下离心10分钟并用乙醇洗涤，随后在60 ℃下真空干燥12 h得到紫色粉末Co-MOF。取6 mg Co-MOF超声分散在1 mL纯水中得到Co-MOF分散液，并将其在4 ℃条件下保存。
图1为Co-MOF材料的表征图；其中，A为Co-MOF材料的SEM图像；B为Co-MOF材料的XPS光谱图。图1A的SEM图像显示纳米材料Co-MOF呈规则的菱形十二面体状。XPS结果（图1B）进一步证明Co-MOF的成功制备。
（2）金纳米粒子AuNPs的制备：
取100 mL 0.01% HAuCl4·4H2O加入250 mL圆底烧瓶中，加热至剧烈沸腾，在剧烈搅拌下快速加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠水溶液；期间溶液从淡黄色快速变为灰色，继而转为蓝、紫、黑色，随后逐渐稳定成酒红色，持续加热搅拌15 min；静置至室温后，进行离心纯化并重新分散在1 ml水中。
（3）AuNPs-Co-MOF的制备：
将上述步骤（2）制得的Co-MOF材料加入步骤（3）制得的AuNPs中混合搅拌一段时间，然后将两者的混合物静置后用纯水离心清洗，将离心后收集得到的沉淀物分散在纯水中，即得到纳米金-钴-金属有机框架复合材料，即AuNPs-Co-MOF。
图2为复合材料AuNPs-Co-MOF的SEM-ED元素分布图，从图2中可明显观察到复合材料中含有C，Au和Co元素，表明AuNPs成功固载到了Co-MOF上。
图3为AuNPs，Co-MOF和AuNPs-Co-MOF的UV-Vis图，从图3的UV-Vis中观察到在约520 nm处有AuNPs的特征峰，Co-MOF在590 nm处有明显的峰，而复合材料AuNPs-Co-MOF在520 nm和590 nm处均有峰，证明AuNPs-Co-MOF的成功合成。
（4）AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA的制备：
AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA的制备流程如图4所示，具体步骤为：
用10 μL的5 mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）将10 μL的100 μM G-DNA激活2 h以还原二硫键，用Tris-HCl缓冲液配制成2 μM G-DNA。
取100 μL 2μM G-DNA加入到1 mL AuNPs-Co-MOF中，随后在4 ℃条件下温和搅拌12 h，使G-DNA通过Au-S键与AuNPs-CO-MOF连接，获得AuNPs-Co-MOF-G-DNA。为了封闭非特异性吸附位点，向AuNPs-Co-MOF-G-DNA中加入50 μL 1% BSA钝化30 min，随后向其中加入100 μL 2.5 μM hemin，并在室温下孵育30 min，使富含鸟嘌呤（G）的直链G-DNA自组装形成G-四链体结构，并将hemin包裹其中，离心洗涤，得到信号探针AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA，并将其分散在1 mL Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中，在4 ℃条件下储存备用。
实施例2. DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE的制备：
（1）N-CMK3粉末的制备：
取2.0 g尿素，2.5 g蔗糖和1 g SBA-15溶解于20 mL体积比为1：1的水和乙醇的混合溶液中，连续搅拌2 h后，将混合物置于80 ℃的烘箱中加热12 h，随后，将干燥的粉末转移至管式炉内，以10 ℃/min的速度升温至800 ℃，在氮气下进行4 h热解，待热解产物冷却至室温后，用质量分数为10% HF溶液蚀刻24 h以去除二氧化硅模板，然后以10,000 rpm离心10分钟，再用纯水和乙醇洗涤并在80 ℃下干燥得到N-CMK3粉末。
（2）Au-N-CMK3/SPCE的制备：
将5 mg N-CMK3于1 mL纯水中超声分散1 h，取20 μL分散液滴涂在SPCE表面，用红外灯干燥得到N-CMK3/SPCE。然后采用电聚合的方法，将10 mL含有5 mM HAuCl4·4H2O和0.1M H2SO4作为聚合液，采用计时电流分析法（i-t）在电极表面形成一层纳米金薄膜（Au）；其中电压为-0.3 V，电聚合时间为100 s，得到修饰电极Au-N-CMK3/SPCE，用纯水洗涤并干燥。
（3）DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE的制备：
用10 μL的5 mM TCEP将20 μL的100 μM DNAzyme避光激活2 h，使得将二硫键断开以形成巯基，然后溶解在10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中，获得浓度为2.0 μM的DNAzyme。取10 μL激活后的DNAzyme滴加在Au-N-CMK3/SPCE表面，并在4 ℃条件下孵育3 h，使DNAzyme通过Au-S键与Au充分结合；用0.1 M PBS（pH 6.8）彻底清洗电极以除去未充分结合的DNAzyme。取质量分数为1% BSA溶液在电极表面封闭30 min以阻断非特异性吸附位点，随后用PBS缓冲液冲洗干净，最后在氮气下干燥以获得DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE。
图5为N-CMK3材料的表征图；其中，A为N-CMK3材料的TEM图像；B为为N-CMK3材料的氮气吸附-解吸等温线，插图为相应的孔径分布图；C为材料N-CMK3的SAXD图谱；D为材料N-CMK3的XPS光谱图。从图中可以看出，图5A的TEM图像描绘了N-CMK3材料的形貌及内部结构，放大插图更清晰的显示出所制备的N-CMK3具有均匀的条纹状孔道结构。N-CMK3的氮气吸附-解吸等温线（图5B）表现为典型的Langmuir IV型，并且在相对压力约为0.40~0.98下观察到了H1型迟滞环，说明纳米材料中具有介孔的存在。
此外，通过Brunauer-Emmett-Telle（r BET）模型计算出N-CMK3的比表面积为462m2/g，Barrett-Joyner-Halenda（BJH）模型得到的孔径约4 nm。从图5C角度在0.5°~6.0º范围的SAXD观察到N-CMK3具有（100）、（110）、（200）晶面的衍射峰，表明N-CMK3成功复制了介孔硅模板SBA-15的二维六方结构。图5D的XPS图谱中清楚地获得C1s、N1s和O1s的核心能级区域的特征峰，进一步表明N-CMK3的成功合成。
图6中A为不同修饰电极在10 mM [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的CV图；B为不同修饰电极在10 mM [Fe(CN)6]3-/4-溶液中EIS图。在图6A和6B中，a为裸SPCE，b为Au/SPCE，c为N-CMK3/SPCE，d为Au-N-CMK3/SPCE，e为DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE，f为组装完成的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器（AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA-DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE）。
如图6A的CV曲线所示，在裸SPCE表面（曲线a）可以清楚的观察到[Fe(CN)6]3-/4-的一对氧化还原峰（+178.4 μA；-164.1 μA）。当在电极表面分别修饰Au（曲线b）和N-CMK3（曲线c）时，CV峰值电流均明显增加，表明两种纳米材料都具有良好的导电性。当将复合材料Au-N-CMK3（曲线d）固定到电极表面上时，由于两者的协同作用加速电子转移，因此获得了最大的峰值电流（+374.8 μA；-369.0 μA），表明该复合材料能够起到很好的信号放大作用。随后，在电极表面进一步涂覆Pb2+依赖性DNAzyme（曲线e），由于DNAzyme的导电性较差，峰值电流急剧下降（+258.6 μA；-249.5 μA）。在Pb2+裂解DNAzyme形成两条DNA片段后，将信号探针AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA（曲线f）固定在DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE上，可以清晰地观察到峰值电流持续降低（+206.3 μA；-189.7 μA），这是因为在电极上保留的DNAzyme与G-DNA形成的双链DNA阻碍了电子传输，表明依赖性DNAzyme特异性的识别出了Pb2+，另外hemin的导电性较差也是导致电流降低的原因之一。CV结果表明在构建传感器的过程中每个步骤都是成功的。
此外，采用EIS进一步验证电极的逐步修饰过程。从图6B看出，分别修饰了Au（曲线b）和N-CMK3（曲线c）的Ret与裸SPCE（曲线a）相比明显减小，并且当修饰Au-N-CMK3（曲线d）时获得最小的Ret值，此时的EIS曲线近乎于一条直线，表明Au与N-CMK3具有协同增加电子转移的能力。在固定导电性较差的DNAzyme后，半圆直径明显增大（曲线e）。进一步在传感器上固定信号探针hemin-G-DNA-AuNPs-Co-MOF（曲线f），由于带负电荷的双链DNA与铁氰化物离子的电阻之间存在静电排斥，并且hemin的导电性较差，因此导致电阻急剧增加。上述从EIS获得的结果与从CV获得的结果非常一致，均证明了传感器的成功构建。
实施例3.基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备：
取10 μL不同浓度的Pb2+标准溶液滴加到实施例2中已制备的传感器DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE上，在室温下反应80分钟。其中，Pb2+的存在能够使DNAzyme在“rA”位点被裂解为两个自由片段，从而使Pb2+被特异性识别。为实现电化学信号放大，用PBS洗涤电极后，将10 μL实施例1得到的信号探针AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA涂覆到传感器上并孵育60~120min，根据碱基互补配对原理，使未形成四链体结构的G-DNA部分与裂解后固定在基底表面的DNAzyme形成互补链结合，最后用PBS清洗电极表面。将AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA涂覆在DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE上，并将其作为工作电极，以碳作为对电极，银/氯化银电极为参比电极组装得到基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的三电极电化学传感器。
实施例4：
（1）信号探针AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA的制备：
Co-MOF的制备：将0.06 M硝酸钴和0.25 M 2-甲基咪唑分别溶解于80 mL甲醇/乙醇（1：1）溶液中，在剧烈搅拌下将2-甲基咪唑溶液缓慢加入硝酸钴溶液中，所得混合溶液在室温下进行24 h老化；将得到的紫色产物在10,000 rpm下离心10分钟并用乙醇洗涤，随后在60 ℃下真空干燥12 h得到紫色粉末Co-MOF。取6 mg Co-MOF超声分散在1 mL纯水中得到Co-MOF分散液，并将其在4 ℃条件下保存。
金纳米粒子AuNPs的制备：取100 mL 0.01% HAuCl4·4H2O 加入250 mL圆底烧瓶中，加热至剧烈沸腾，在剧烈搅拌下快速加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠水溶液；期间溶液从淡黄色快速变为灰色，继而转为蓝、紫、黑色，随后逐渐稳定成酒红色，持续加热搅拌15 min；静置至室温后，进行离心纯化并重新分散在1 ml水中。
AuNPs-Co-MOF的制备：将Co-MOF材料加入AuNPs中混合搅拌一段时间，然后将两者的混合物静置后用纯水离心清洗，将离心后收集得到的沉淀物分散在纯水中，即得到纳米金-钴-金属有机框架复合材料，即AuNPs-Co-MOF。
AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA的制备：用10 μL的5 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）将10 μL的100 μM G-DNA激活2 h，用Tris-HCl缓冲液配制成2 μM G-DNA。取100μL 2μM G-DNA加入到1 mL AuNPs-Co-MOF中，随后在4 ℃条件下温和搅拌12 h，获得AuNPs-Co-MOF-G-DNA。向AuNPs-Co-MOF-G-DNA中加入50 μL 1% BSA钝化30 min，随后加入100μL 2.5μM hemin，并在室温下孵育30min，离心洗涤后，得到信号探针AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA，并将其分散在1 mL Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中，在4 ℃条件下储存备用。
（2）DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE的制备：
N-CMK3粉末的制备：取2.0 g尿素，2.5 g蔗糖和1 g SBA-15溶解于20 mL体积比为1：1的水和乙醇的混合溶液中，连续搅拌2 h后，将混合物置于80 ℃的烘箱中加热12 h，随后，将干燥的粉末转移至管式炉内，以10 ℃/min的速度升温至800 ℃，在氮气下进行4 h热解，待热解产物冷却至室温后，用10% HF溶液蚀刻24 h以去除二氧化硅模板，然后以10,000rpm离心10分钟，再用纯水和乙醇洗涤并在80 ℃下干燥得到N-CMK3粉末。
Au-N-CMK3/SPCE的制备：将5 mg N-CMK3于1 mL纯水中超声分散1 h，取20 μL分散液滴涂在SPCE表面，用红外灯干燥得到N-CMK3/SPCE。然后采用电聚合的方法，将10 mL含有5 mM HAuCl4·4H2O和0.1 M H2SO4作为聚合液，采用计时电流分析法（i-t）在电极表面形成一层纳米金薄膜（Au）；其中电压为-0.3 V，电聚合时间为100 s，得到修饰电极Au-N-CMK3/SPCE，用纯水洗涤并干燥。
DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE的制备：用10 μL的5 mM TCEP将20 μL的100 μMDNAzyme避光激活2 h，然后溶解在10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中，获得浓度为2.0 μM的DNAzyme。取10 μL激活后的DNAzyme滴加在Au-N-CMK3/SPCE表面，并在4 ℃条件下孵育3h，然后用0.1 M PBS（pH 6.8）彻底清洗电极，取1% BSA溶液在电极表面封闭30 min，随后用PBS缓冲液冲洗干净，最后在氮气下干燥以获得DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE。
（3）基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备：
将AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA涂覆在DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE上，并将其作为工作电极，以碳为对电极，银/氯化银电极为参比电极组装得到基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器。
其中，步骤（1）和（2）不分先后顺序。
实施例5：
本实施例中考察了本发明制备得到的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器对Pb2+的检测能力，具体检测方法如下所示。
（1）标准曲线的绘制：
在最优的实验条件下，传感器特异性识别不同浓度的Pb2+，通过记录在含0.1 MH2O2的PBS缓冲液（pH 6.8）中的i-t曲线，得到相应Pb2+的浓度。配制浓度为0、1pM，10pM，100pM，1nM，10nM，100nM，1μM，10μM的Pb2+标准液，采用计时电流分析法（i-t）检测不同浓度Pb2+标准液，得到i-t曲线，并将得到的Pb2+浓度的Log值与相应的电化学信号变化差值之间建立函数关系即Pb2+检测的标准曲线。
图7中A为基于DNAzyme的传感器对不同浓度Pb2+（0、1pM，10pM，100pM，1nM，10nM，100nM，1μM，10μM）的i-t曲线图；B为相应的标准曲线。从图中可以看出，得到的不同浓度Pb2+Log值与相应的响应电流差值ΔI之间的函数关系，并得到标准曲线y=37.45x+242.97，且电流响应的差值（ΔI）与Pb2+浓度的对数（log）值在1 pM至10 μM之间呈现良好的线性关系。所得到的检测限（LOD）低至0.32 pM（相当于8.91 pg/kg），能够满足肉制品中Pb2+含量的限制要求（低于0.5 mg/kg，相当于2.4 μM）。
（2）基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器用于肉制品中Pb2+含量的检测。
本实施例中还考察了制备得到的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器用于肉制品中Pb2+含量的检测能力，所述肉制品为镇江肴肉（（购自江苏省镇江市宴春食品有限公司），具体检测方法如下所示。
采用四等分法获得肉制品样品，并用绞肉机进行搅碎均质，精确称量5.0 g样品匀浆于瓷坩埚中，先小火炭化至无烟，然后转移至马弗炉中以500 °C灰化8 h；随后，将样品用1 mL 0.5 M的HNO3在电炉上小火加热12 h，待样品消化完全并冷却至室温后，加入5 mLHNO3即得到检测液。取10 μL检测液滴加到DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE上反应80 min，用PBS洗涤后将10 μL信号探针涂覆到传感器表面并孵育90 min。
采用步骤（1）中所述检测方法对每个样品重复测量3次，并通过记录的i-t曲线计算其回收率，检测结果如表1所示。
表1 实际样品中Pb2+的含量分析( n=3)
如表1所示，所有样品的平均回收率在97%至103%之间，且相对标准偏差（RSD）低于5%，说明所提出的传感器对肉制品样品中Pb2+的快速检测是可行的。
图8为对肉制品中Pb2+进行电化学检测的示意图，如图8所示，在Pb2+存在的情况下，具有高裂解活性的Pb2+依赖DNAzyme被激活，并且在特定4“rA”位点被切割为两个片段，从而使Pb2+被特异性识别。
实施例6：
本实施例中采用i-t曲线比较不同材料修饰传感器的电化学性能来验证信号放大策略，具体验证方法如下所示：
N-CMK3修饰传感器的制备：
取2.0 g尿素，2.5 g蔗糖和1 g SBA-15溶解于20 mL体积比为1：1的水和乙醇的混合溶液中，连续搅拌2 h后，将混合物置于80 ℃的烘箱中加热12 h，随后，将干燥的粉末转移至管式炉内，以10 ℃/min的速度升温至800 ℃，在氮气下进行4 h热解，待热解产物冷却至室温后，用质量分数为10%的HF溶液蚀刻24 h以去除二氧化硅模板，然后以10,000 rpm离心10分钟，再用纯水和乙醇洗涤并在80 ℃下干燥得到N-CMK3粉末。将5 mg N-CMK3于1 mL纯水中超声分散1 h，取20 μL分散液滴涂在SPCE表面，用红外灯干燥得到N-CMK3-SPCE。
Au修饰传感器的制备：
采用电聚合的方法，将10 mL含有5 mM HAuCl4·4H2O和0.1 M H2SO4作为聚合液，采用计时电流分析法（i-t）在裸电极表面形成一层纳米金薄膜（Au），得到Au-SPCE。
Au-N-CMK3修饰传感器的制备：
取5 mg合成好的N-CMK3于1 mL纯水中超声分散1 h，取20 μL分散液滴涂在SPCE表面，用红外灯干燥得到N-CMK3-SPCE，采用电聚合的方法，将10 mL含有5 mM HAuCl4·4H2O和0.1 M H2SO4作为聚合液，采用计时电流分析法（i-t）在N-CMK3-SPCE电极表面形成一层纳米金薄膜（Au），得到Au-N-CMK3-SPCE。
AuNPs-hemin-G-DNA信号探针的制备：
金纳米粒子AuNPs的制备：取100 mL 0.01% HAuCl4·4H2O 加入250 mL圆底烧瓶中，加热至剧烈沸腾，在剧烈搅拌下快速加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠水溶液；期间溶液从淡黄色快速变为灰色，继而转为蓝、紫、黑色，随后逐渐稳定成酒红色，持续加热搅拌15 min；静置至室温后，进行离心纯化并重新分散在1 mL水中。
AuNPs-hemin-G-DNA的制备：用10 μL的5 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）将10μL的100 μM G-DNA激活2 h，用Tris-HCl缓冲液配制成2 μM G-DNA。取100 μL 2μM G-DNA加入到1 mL AuNPs中，随后在4 ℃条件下温和搅拌12 h，获得AuNPs-G-DNA。向AuNPs-G-DNA中加入50 μL 1% BSA钝化30 min，随后加入100μL 1~4 μM hemin，并在室温下孵育30min，离心洗涤后，得到信号探针AuNPs-hemin-G-DNA，并将其分散在1 mL Tris-HCl缓冲液（pH7.4）中，在4 ℃条件下储存备用。
图9中A为传感器基底材料分别为N-CMK3（a），Au（b）和Au-N-CMK3（c）修饰传感器信号放大策略的比较图；B为信号探针分别为AuNPs-hemin-G-DNA（a）和AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA（b）修饰传感器信号放大策略的比较图；C为信号探针分别为AuNPs-Co-MOF-G-DNA（a）和AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA（b）修饰传感器信号放大策略的比较图。如图9A所示，传感器的基底材料为Au（b）时，与N-CMK3（a）相比的电化学信号明显增加。由于N-CMK3和Au都具有优异的电子传递能力，因此采用结合两者优势的复合材料Au-N-CMK3做基底材料时的电化学信号明显大于单独使用时的信号。为了验证纳米复合材料Co-MOF对H2O2的催化还原性能，分别制备含有Co-MOF和没有Co-MOF的信号探针固定在传感器上，如图9B所示，含有Co-MOF作为探针的传感器表现出更大的电催化电流响应，表明Co-MOF具有催化还原H2O2的能力。而当使用hemin-G-DNA标记复合材料AuNPs-Co-MOF作为信号探针时，得到相应的电化学信号比没有加入hemin时要大得多（图9C），证明了随着hemin的加入，单链G-DNA成功形成G-四链体结构并包裹hemin，使其具有类过氧化物酶的能力。
可见，采用hemin-G-DNA-AuNPs-Co-MOF作为信号探针获得的催化响应信号明显强于单独使用hemin-G-DNA-AuNPs或G-DNA-AuNPs-Co-MOF的信号。
实施例8：
为了提高电化学传感器的性能，本实施例中对基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器制备流程进行优化。
（1）Co-MOF与AuNPs的体积比的优化：
为了提高电子传输速率和G-DNA的固定，本实施例首先对Co-MOF与AuNPs的体积比进行优化来增强探针的性能从而获得最大的响应电流，优化范围为1：2~1：8，V/V。如图10A所示，响应电流的变化首先随AuNPs含量的增大而增加，当比例为1：6时电流响应达到最大值，然而随着AuNPs的含量进一步增大后响应电流逐渐平稳，这是由于AuNPs在Co-MOF上的固载量达到饱和。因此，选择Co-MOF与AuNPs的体积比为1：6来制备复合材料AuNPs-Co-MOF。
（2）DNAzyme浓度范围的优化：
为了提高信号探针的固定和传感器性能，本实施例中选择浓度范围在0.5~3.0 μM的DNAzyme构建的传感器DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE进行测量。根据图10B可以看出，随着DNAzyme浓度在0.5~2.0 μM范围内增加，电化学信号逐渐降低，表明固定在电极表面的DNAzyme含量在不断增加。在浓度为2.0 μM时电化学信号达到最低且随后趋于平稳，说明DNAzyme的固载量达到了最大。因此，选择2.0 μM作为DNAzyme的最优浓度。
（3）Pb2+的切割时间的优化：
DNAzyme特异性识别Pb2+并被其裂解为两条片段是整个传感过程中的关键步骤，因此，Pb2+的切割时间是影响传感器性能的一个至关重要的因素。如图10C所示，电化学信号随着Pb2+切割时间从60到80 min的增加而逐渐增大，表明信号探针的结合数量在持续上升。当时间约为80 min时信号达到最大值，而随着时间的延长信号保持稳定，说明Pb2+已经对依赖性DNAzyme进行完全切割。因此，选择80 min作为Pb2+的最佳切割时间。
（4）孵育时间的优化：
DNAzyme与G-DNA形成互补链的结合时间是影响信号探针固定在传感器上的重要参数，因此探究信号探针的最优孵育时间以期能够实现两者的完全结合。由图10D可得，电化学信号在探针孵育时间为60~90 min内持续增大，随后处于平稳期，这表明在传感器表面保留的DNAzyme片段与未形成四链体结构的G-DNA片段之间的结合几乎达到饱和。因此，选择90 min作为信号探针的最佳孵育时间。
（5）hemin的浓度的优化：
图10E显示了hemin的浓度对形成类过氧化物仿生酶hemin-G-DNA的影响。由图可以看出，电化学信号随着hemin浓度从1 μM增加到2.5 μM而增加。当hemin的浓度为2.5 μM时，电化学响应达到最大并随着浓度的进一步增大保持基本不变，这表明hemin与G-DNA形成四链体结构的仿生酶达到饱和。因此，选择浓度为2.5 μM的hemin构建传感器。
（6）电化学检测液的优化：
本研究为了提高传感器中的生物蛋白、DNA以及信号探针的催化能力，优化探究不同pH值的PBS缓冲液作为电化学检测液对传感器性能的影响。如图10F所示，起初电化学响应信号随着pH从6.0增加到6.8而明显增大，并在pH为6.8时达到最大值。然而当pH值进一步增加时，相应的电化学信号迅速下降，这是因为酸性或碱性介质会对DNA及生物蛋白造成一定破坏，从而导致传感器性能降低。因此，选择pH 6.8的PBS缓冲液作为最佳检测液。
综上，在基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器制备过程中，最佳反应条件是：Co-MOF与AuNPs的体积比为1：6，DNAzyme浓度为2.0 μM，Pb2+的切割时间为80min，信号探针的孵育时间为90min，hemin浓度为2.5 μM，电化学检测液为pH 6.8的PBS缓冲液。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器，其特征在于，所述电化学传感器中工作电极为涂覆了纳米金-钴-金属有机框架复合材料-血红素-G-DNA信号探针AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA的寡核苷酸探针-纳米金-氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE，对电极为碳，参比电极为银/氯化银电极。
2.一种如权利要求1所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括：
（1）寡核苷酸探针-纳米金-氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极的制备：
将N-CMK3材料于纯水中超声分散，滴涂在丝网印刷碳电极SPCE表面，干燥得氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极，记为N-CMK3/SPCE；
然后用含有四氯金酸HAuCl4·4H2O和浓硫酸的聚合液在N-CMK3/SPCE表面电聚合，得到纳米金-氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极，记为Au-N-CMK3/SPCE；
接着将激活后的DNAzyme滴加在Au-N-CMK3/SPCE表面，孵育后洗涤，然后滴加牛血清白蛋白BSA，洗涤，干燥，得到寡核苷酸探针-纳米金-氮掺杂有序介孔碳材料修饰丝网印刷碳电极，记为DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE；
（2）纳米金-钴-金属有机框架复合材料-血红素-G-DNA复合信号探针的制备：
将硝酸钴和2-甲基咪唑分别溶解于甲醇/乙醇溶液中，在剧烈搅拌下将2-甲基咪唑溶液缓慢加入硝酸钴溶液中，得到混合溶液，对其进行老化，然后离心，洗涤，干燥，重新分散于纯水中，得到钴-金属有机框架分散液，记为Co-MOF分散液；
然后向Co-MOF分散液中加入AuNPs分散液，搅拌反应，反应结束后静置，离心，洗涤，继续离心取沉淀，得到纳米金-钴-金属有机框架复合材料，记为AuNPs-Co-MOF，将其分散于纯水中，得到AuNPs-Co-MOF分散液；
然后向AuNPs-Co-MOF分散液中加入激活的G-DNA溶液，温和搅拌，得到纳米金-钴-金属有机框架复合材料-G-DNA，记为AuNPs-Co-MOF-G-DNA；
向AuNPs-Co-MOF-G-DNA中加入BSA钝化，接着加入血红素hemin，室温下孵育60~120min，形成AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA信号探针，离心洗涤，分散于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCL缓冲液中，得到纳米金-钴-金属有机框架复合材料-血红素-G-DNA复合信号探针，记为AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA；
（3）基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备：
将AuNPs-Co-MOF-hemin-G-DNA涂覆在DNAzyme-Au-N-CMK3/SPCE上，并将其作为工作电极，以碳为对电极，银/氯化银电极为参比电极组装得到基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器；
其中，步骤（1）和（2）不分先后顺序。
3. 根据权利要求2所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述N-CMK3和纯水的用量比为5 mg:1 mL，滴涂用量为20μL；
所述聚合液的用量为10 mL，聚合液中HAuCl4·4H2O的浓度为5 mM，H2SO4的浓度为0.1M；所述电聚合的条件为电压为-0.3 V，电聚合时间为100 s。
4.根据权利要求2所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNAzyme的激活操作为：
用三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP将DNAzyme避光激活，激活后溶于Tris-HCl缓冲液中；
所述DNAzyme的浓度为0.5~3.0 μM，用量为10 μL。
5. 根据权利要求2所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述孵育的条件为在4 ℃下孵育3 h；所述BSA的质量分数为1%，用量为50 μL。
6. 根据权利要求2所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述甲醇/乙醇溶液中甲醇和乙醇的体积比为1：1，用量为80 mL；
所述混合溶液中，硝酸钴的终浓度为0.375 M，2-甲基咪唑的终浓度为1.56 M，老化的条件为室温下老化24 h。
7.根据权利要求2所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述Co-MOF分散液和AuNPs分散液的体积比为1：2~1：8；
其中，Co-MOF分散液的浓度为6 mg/mL，AuNPs分散液中AuNPs与纯水的比例为1~5g：1mL；搅拌反应的时间为2 h。
8. 根据权利要求2所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述 BSA溶液、G-DNA溶液、AuNPs-CO-MOF分散液和血红素hemin溶液的体积比为50 μL：100 μL：1 mL：100 μL。
9.根据权利要求8所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述BSA溶液的质量分数为1%；
所述血红素hemin的浓度为1~4 μM；
所述G-DNA溶液的浓度为2 μM；
所述AuNPs-Co-MOF分散液中AuNPs-Co-MOF离心沉淀物与纯水的比例为1~6g：1mL。
10.权利要求1所述的基于Co-MOF和血红素-G-DNA协同催化的电化学传感器在检测肉制品中Pb2+的应用。
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