CN111871378B

CN111871378B - 可变色沸石咪唑酯骨架材料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111871378B
Application number: CN202010651210.2A
Authority: CN
Inventors: 王怀松; 王星宇; 王一辉; 张洁
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2040-07-08
Also published as: CN111871378A

Abstract

本发明公开了可变色沸石咪唑酯骨架材料及其制备方法和应用，属于金属框架材料技术领域。通过超声‑搅拌法将淀粉和单宁酸分别嵌入ZIFs中制备得到淀粉嵌入型ZIFs复合纳米材料和单宁酸嵌入型ZIFs复合纳米材料，然后核酸适配体通过π‑π相互作用或静电作用吸附到ZIFs复合纳米材料上，覆盖ZIFs表面的孔穴结构，得到的材料与目标核酸分子结合后，吸附在ZIFs表面的核酸适配体脱吸附，碘（或Fe³⁺）进入到ZIFs表面的孔穴中，与嵌入的淀粉（或单宁酸）作用而显色，从而实现对目标核酸的可视化检测。本发明材料制备条件简单、操作方便，无需荧光分子标记和酶的参与即可用于核酸检测，使用成本低、选择性和灵敏性高。

Description

可变色沸石咪唑酯骨架材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于金属有机框架材料技术领域，具体涉及一种可变色沸石咪唑酯骨架材料及其制备方法和应用。

背景技术

沸石咪唑酯骨架材料（Zeolitic Imidazole Frameworks，ZIFs）属于金属有机框架材料中一类特殊的子类，是由Zn²⁺、Co²⁺等金属离子与咪唑类有机分子配位形成，其拓扑结构与沸石类似，故命名为沸石咪唑酯骨架。由于ZIFs在合成过程中使用的金属离子（Zn²⁺或 Co²⁺）、咪唑类配体（苯并咪唑或 2-甲基咪唑）和溶剂类型（水、二甲基甲酰胺、甲醇等）不同，导致了ZIFs材料结构的差别。鉴于ZIFs具有优异的生物相容性、更低的毒副作用和适宜的体内代谢速率，ZIFs通常被用于开发新的药物递送系统以及生物体内生物标志物的检测。

人在病理状态下，体内的某些蛋白或细胞因子等会出现异常表达，而这些蛋白高表达的背后，是由核酸分子如microRNA的异常表达引起。因此，在疾病早期对患者体内的某些核酸分子进行检测，可达到疾病预警，或对于疾病的定性和分期等是十分重要。ZIFs 中的有机配体通常含有共轭π-π系统，允许通过π-π相互作用与核酸适体结合，这种机制类似于氧化石墨烯（GO）和生物分子之间的相互作用，因此，ZIFs具有核酸检测的潜力。到目前为止，已有将ZIFs应用于检测领域的相关报道，目前的研究主要集中在荧光生物传感器和电化学生物传感器这两大类。但是在这两种方法当中，由于需要荧光分子标记或酶的参与，以及复杂的材料制备方法，对检测设备的高要求等而受限。因此，利用ZIFs材料去寻求新的，更加简便且低成本的技术方法去检测核酸分子是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种可变色沸石咪唑酯骨架材料及其制备方法和应用，通过在沸石咪唑酯骨架材料中嵌入淀粉或单宁酸，然后在表面吸附核酸适配体得到，该复合纳米材料可实现核酸分子的可见光吸收检测与可视化检测。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种可变色沸石咪唑酯骨架材料，包括沸石咪唑酯骨架、显色分子和核酸适配体，所述显色分子嵌在沸石咪唑酯骨架内，所述核酸适配体通过π-π 相互作用或通过与材料表面金属离子的静电作用吸附在沸石咪唑酯骨架表面；

所述显色分子为淀粉或单宁酸。

上述可变色沸石咪唑酯骨架材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在蒸馏水中，加入0.05 ~ 0.50 g咪唑类分子，通过搅拌及超声辅助溶解，再加入0.01 ~ 0.05 g聚乙烯吡咯烷酮，搅拌5 ~ 15 min ，然后加入0.1 ~ 1 mL 0.01wt.%~ 1 wt.%的淀粉溶液或单宁酸溶液，搅拌混合；

步骤2，称取 0.01 ~ 0.20 g 硝酸锌溶解在1 ~ 20 mL 叔丁醇中，然后加至步骤1的混合液中，在10 ~ 50 ℃、超声条件下，搅拌反应5 ~ 30 min，反应产物离心后，即可得到淀粉嵌入型沸石咪唑酯骨架材料或单宁酸嵌入型沸石咪唑酯骨架材料；

步骤3，将步骤2制得的材料分散在磷酸缓冲液中，加入10 ~ 200 μL 浓度为0.1 ~5.0 μg•mL^-1的聚乙烯亚胺溶液，在25℃孵育2 ~ 30 min，离心后收集沉淀，并重新分散在磷酸缓冲液中，然后加入核酸适配体，在25℃孵育2 ~ 30 min，离心后收集沉淀，即可得到可变色沸石咪唑酯骨架材料。

进一步地，所述淀粉选自支链淀粉、直链淀粉或糊精。

上述可变色沸石咪唑酯骨架材料在核酸分子检测中的应用。

进一步地，所述应用具体是向待测核酸分子中先加入可变色沸石咪唑酯骨架材料，再加入I₂/KI试液或FeCl₃试液，通过I₂/KI试液与淀粉分子的显色反应，或FeCl₃试液与单宁酸分子的显色反应，即可检测核酸分子。

进一步地，所述待测核酸分子为miR-21，可变色沸石咪唑酯骨架材料中的核酸适配体为miR-21适配体。

本发明提出的可用于核酸分子检测的ZIFs复合纳米材料，是通过将淀粉（包括支链淀粉、糊精和直链淀粉）或单宁酸，与Zn²⁺和咪唑类有机分子混合，通过“超声-搅拌法”一步制备得到ZIFs复合纳米材料（Starch@ZIFs或Tan@ZIFs）。核酸适配体通过π-π 相互作用吸附到复合材料上，覆盖ZIFs表面的孔穴结构，与目标核酸分子通过碱基互补配对原则结合后，吸附在ZIFs表面的适配体脱吸附，碘（或Fe³⁺）可进入到孔穴中，利用“淀粉遇碘变色”和“单宁酸遇铁离子变色”的高灵敏、快速显色反应，实现核酸分子的可见光吸收检测，以及可视化检测。

在本发明的一个实施例中，选用适配体Ap-miR-21吸附在ZIFs复合纳米材料（Starch@ZIFs或Tan@ZIFs）表面，当目标核酸分子与Ap-starch@ZIFs或Ap-tan@ZIFs相互作用后，分别加入I₂/KI试液或FeCl₃试液，然后通过可见光吸收法或可视化进行检测，检测原理如图1所示。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明的ZIFs复合纳米材料制备方法简单，不需要严格的合成条件，且成本低。

（2）本发明的ZIFs复合纳米材料，在吸附适配体前，可对I₂/KI试液或FeCl₃试液具有快速、灵敏的显色特点，且具有不同颜色。

（3）采用本发明的ZIFs复合纳米材料对目标核酸分子进行检测，无需荧光标记和酶的参与，即可实现可见光吸收和可视化进行检查，成本低、灵敏且快速。

附图说明

图1 为本发明中ZIFs复合纳米材料检测miR-21的检测原理。

图2 为实施例1和实施例2中ZIFs复合纳米材料的扫描电镜图。其中：a为Starch1@ZIFs，b为Starch2@ZIFs，c为Starch3@ZIFs，d为Tan@ZIFs。

图3 为实施例1和实施例2中ZIFs复合纳米材料的可见光吸收光谱图。其中：a为Starch1@ZIFs，b为Starch2@ZIFs，c为Starch3@ZIFs，d为Tan@ZIFs。

图4 为实施例3中Ap-starch3@ZIFs对microRNA响应可见光吸收光谱图，与可视化检测图片。

图5 为实施例3中Ap-starch1@ZIFs对microRNA响应可见光吸收光谱图，与可视化检测图片。

图6 为实施例3中Ap-starch1@ZIFs对microRNA响应的选择性。

图7为实施例4中 Ap-starch1@ZIFs对microRNA响应的线性关系。

具体实施方式

下面就本发明的技术方案做详细说明。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

1. ZIFs复合纳米材料Starch@ZIFs的制备

称取 0.1200 g 咪唑-2-甲醛，加至9 mL 蒸馏水中，通过搅拌及超声辅助溶解；再加入一定量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）进行保护，搅拌7 min；然后分别加入1 mL的 1wt.%支链淀粉溶液、糊精饱和溶液、1 wt.%直链淀粉溶液，继续搅拌 3 min。准确称取 0.0062 g硝酸锌，溶于 10 mL 叔丁醇中，搅拌并使其溶解，硝酸锌溶解后加入到上述混合物中进行合成反应，温度大约保持在 30℃，在超声的环境下搅拌 10 min，停止反应，将反应产物在8000 r/min 的条件下离心2 min 后，所得沉淀用无水甲醇洗涤，重复三次，得到纳米级的产物：支链淀粉@ZIFs（Starch1@ZIFs）、糊精@ZIFs（Starch2@ZIFs）和直链淀粉@ZIFs（Starch3@ZIFs）。

图2（a, b和c）为Starch1@ZIFs、Starch2@ZIFs和Starch3@ZIFs的扫描电镜图，由电镜图可知ZIFs复合纳米材料的形貌保持了ZIFs材料的多边形特征。

图3（a, b和c）为Starch1@ZIFs、Starch2@ZIFs和Starch3@ZIFs与I₂/KI 试液反应后的可见光吸收光谱图。

2. 核酸适配体修饰Starch@ZIFs

分别将Starch1@ZIF-90、Starch2@ZIF-90和Starch3@ZIF-90 混悬于PBS中，加入100 μL PEI溶液（1.0 μg•mL^-1），在室温下孵育10 min后，离心收集，并重新分散于PBS中。再将75 μL miR-21的适配体Ap-miR-21溶液加入上述混悬液中，室温下孵育15 min。离心，得到Ap-starch@ZIFs（包括Ap-starch1@ZIFs，Ap-starch2@ZIFs和Ap-starch3@ZIFs）。

实施例2

1. ZIFs复合纳米材料Tan@ZIFs的制备

首先称取一定量的咪唑-2-甲醛（ICA）于烧杯，加入10 mL蒸馏水超声溶解，在超声环境下将上述溶液倒入三颈圆底烧瓶中，开始机械搅拌，再向三颈圆底烧瓶中加入一定量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），搅拌10 min。然后加入1 mL的 1 wt.% 单宁酸 (CAS号：1401-55-4)，继续搅拌 3 min。在此期间，称取一定量硝酸锌加入10 mL叔丁醇，搅拌使其溶解后将其加入到三颈圆底烧瓶中反应，在室温及超声环境中搅拌10 min后，停止搅拌。将三颈圆底烧瓶中的悬浮溶液分装到离心管中，以10000 r/min的速度离心，甲醇洗涤3次，最后得到Tan@ZIFs。

图2d为Tan@ZIFs的扫描电镜图，由电镜图可知ZIFs复合纳米材料的形貌保持了ZIFs材料的多边形特征。

图3d为Tan@ZIFs与FeCl₃试液反应后的可见光吸收光谱图。

2. 核酸适配体修饰Tan@ZIFs

将Tan@ZIFs混悬于PBS中，加入100 μL PEI溶液（1.0 μg•mL^-1），在室温下孵育10min后，离心收集，并重新分散于PBS中。再将75 μL miR-21的适配体Ap-miR-21溶液加入上述混悬液中，室温下孵育15 min。离心，得到Ap-tan@ZIFs。

实施例3

利用Ap-starch@ZIFs对核酸分子检测

将Ap-starch3@ZIFs和Ap-starch1@ZIFs分别分散于PBS中（1.0 mg·mL^-1），然后加入不同浓度的miR-21。室温下孵育15 min，然后加入5.0 μL I₂/KI 试液（5 mmol·L^-1），并进行可见光吸收检测和可视化检测。从图4和图5可以看出，随着待测物miR-21浓度的增加，检测产物的吸光度越来越大、可视化程度越越来越强。

由图6可知，Ap-starch1@ZIFs对miR-21的检测具有较好的线性关系。

实施例4

检测方法的选择性

将Ap-starch1@ZIFs分散于PBS中（1.0 mg·mL^-1），然后加入miR-21 (SEQ IDNO.1)、miR-21’ (SEQIDNO.2)、let-7a (SEQ ID NO.3)，三磷酸腺苷（ATP）、三磷酸尿苷（UTP）、三磷酸鸟苷（GTP）、三磷酸胞苷（CTP）和牛血清白蛋白（BSA）等分子。室温下孵育15min，然后加入5.0 μL I₂/KI 试液（5 mmol·L^-1），并进行可见光吸收检测。

由图7可知，表面吸附有miR-21适配体的Ap-starch1@ZIFs对miR-21具有专一性。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 可变色沸石咪唑酯骨架材料及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uagcuaauca guccgauguu ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ugagguagua gguuguauag uu 22

Claims

1.一种可变色沸石咪唑酯骨架材料，其特征在于：包括沸石咪唑酯骨架、显色分子和核酸适配体，所述显色分子嵌在沸石咪唑酯骨架内，所述核酸适配体通过π-π 相互作用或静电作用吸附在沸石咪唑酯骨架表面，覆盖沸石咪唑酯骨架表面的孔穴；

所述显色分子为淀粉或单宁酸；

通过将淀粉或单宁酸，与锌盐和咪唑类有机分子混合经过“超声-搅拌法”一步制得显色分子嵌入型沸石咪唑酯骨架材料。

2.权利要求1所述的可变色沸石咪唑酯骨架材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，在蒸馏水中，加入0.05 ~ 0.50 g咪唑类分子，通过搅拌及超声辅助溶解，再加入0.01 ~ 0.05 g聚乙烯吡咯烷酮，搅拌5 ~ 15 min ，然后加入0.1 ~ 1 mL 显色分子溶液，搅拌混合；

步骤2，称取 0.01 ~ 0.20 g 硝酸锌溶解在1 ~ 20 mL 叔丁醇中，然后加至步骤1的混合液中，在10 ~ 50 ℃、超声条件下，搅拌反应5 ~ 30 min，反应产物离心后，即可得到显色分子嵌入型沸石咪唑酯骨架材料；

步骤3，将步骤2制得的材料分散在磷酸缓冲液中，加入10 ~ 200 μL 浓度为0.1 ~ 5.0μg•mL^-1的聚乙烯亚胺溶液，在25℃孵育2 ~ 30 min，离心后收集沉淀，并重新分散在磷酸缓冲液中，然后加入核酸适配体，在25℃孵育2 ~ 30 min，离心后收集沉淀，即可得到可变色沸石咪唑酯骨架材料。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述显色分子溶液为0.01 wt.% ~ 1wt. %淀粉溶液或0.01 wt.% ~ 1 wt.%单宁酸溶液。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述淀粉选自支链淀粉、直链淀粉或糊精。

5.权利要求1所述的可变色沸石咪唑酯骨架材料或权利要求2-4任一项所述的制备方法制备得到的可变色沸石咪唑酯骨架材料在核酸分子检测中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：向待测核酸分子中先加入可变色沸石咪唑酯骨架材料，再加入I₂/KI试液或FeCl₃试液，通过I₂/KI试液与淀粉分子的显色反应，或FeCl₃试液与单宁酸分子的显色反应，即可检测核酸分子。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述待测核酸分子为miR-21，可变色沸石咪唑酯骨架材料中的核酸适配体为miR-21适配体。