CN109303923B - 一种制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,先将氯金酸溶液和腺嘌呤核苷酸系列混合反应1‑60min后,加入柠檬酸缓冲液,避光静置0.5‑24h,加入无水乙醇混匀,离心制得沉淀,将制备的沉淀配制成浓度为0.1‑10000μg/mL的腺嘌呤核苷酸外壳纳米簇,加入金属离子后制得沉聚物,将该沉聚物分散于去离子水中,即可。本发明通过以腺嘌呤核苷酸系列为配体的荧光金纳米簇与金属离子反应获得聚集诱导荧光型纳米簇凝胶,金属‑磷酸盐结构的聚集达到荧光增强作用,且纳米簇凝胶中金与腺嘌呤结合力稍弱,能够在细胞内谷胱甘肽等分子存在时发生解离,可降解性优,制法操作简单、产量高,成本低。
Description
技术领域
本发明属于凝胶制备领域,尤其涉及一种制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法。
背景技术
近年来,金纳米材料凭借其自身优越的特性在新型生物传感器开发、生物的体内或体外成像、疾病的早期诊断和治疗等多个领域得到广泛的应用。以天然生物小分子为前驱材料,应用绿色化学手段合成金属纳米材料具有突出优势。腺嘌呤核苷酸系列源于生物体,具有化学性质稳定、生物相容性好等特点,在生物医学等领域备受青睐。其可用于宏量制备金属纳米结构,具有良好的产业化前景。这其中,尺寸超小(直径2nm及以下)的荧光金纳米簇表现出了许多和分子非常类似的光学性质,同时具有表面易修饰,比表面积大,荧光发射波长可调等重要特性,适用于重金属离子、生物小分子、药物小分子、蛋白质等的生物检测。相对于荧光蛋白、半导体量子点、有机荧光分子等其它传统荧光材料,金纳米簇具有尺寸小、合成相对简单、生物毒性低等优点,因此具有非常广阔的应用前景。
而目前现有的荧光凝胶制备步骤较繁杂、生物相容性不佳、成本偏高。
发明内容
发明目的:本发明的目的是提供一种工艺简单、生物相容性优,且成本低的类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的制备方法。
技术方案:本发明类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(1)将氯金酸溶液和腺嘌呤核苷酸系列混合,加入柠檬酸缓冲液避光静置后,制得混合溶液,加入与该混合液等体积的无水乙醇混匀,离心制得沉淀;其中,氯金酸溶液中金与腺嘌呤核苷酸系列的摩尔比为1:0.5-10,柠檬酸缓冲液中柠檬酸与氯金酸溶液中金的摩尔比为1-100:1;
(2)将上述沉淀超声分散,配制成浓度为0.5-10000μg/mL的腺嘌呤核苷酸外壳纳米簇,加入等体积的0.005-100mmol/L的金属离子制得沉聚物,将该沉聚物分散于去离子水中,即制得类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶。
本发明制备的纳米簇凝胶为类羟基磷灰石成分,该结构含有Ca2+、磷酸和羟基(来自腺嘌呤核苷酸的核糖),其主要通过腺嘌呤核苷酸外壳上富含磷酸基团,可以与Ca2+、Mg2+或Zn2+结合,而一个Ca2+、Mg2+或Zn2+可以与多个纳米簇上的磷酸基团同时结合,因此能够以Ca2+、Mg2+或Zn2+为连接剂形成凝胶网络结构。
进一步说,本发明的类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶为网状结构,其网孔直径为20-100nm。步骤(1)中,氯金酸溶液和腺嘌呤核苷酸系列混合反应1-60min。氯金酸溶液的浓度可为0.1μmol/L-0.1mol/L。腺嘌呤核苷酸系列可包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。
再进一步说,柠檬酸缓冲液的的浓度可为0.005-0.2mol/L,pH值为3.0-8.0。柠檬酸缓冲液可包括体积比为0.02-100:1的柠檬酸钠和柠檬酸,两者的浓度均为0.005-0.2mol/L。加入柠檬酸溶液避光静置10-15h。离心的转速可为500-15000rpm,离心10-15min。
更进一步说,步骤(2)中,所述金属离子可为Ca2+、Mg2+或Zn2+。
有益效果:与现有技术相比,本发明的显著优点为:通过以腺嘌呤核苷酸系列为配体的荧光金纳米簇与金属离子反应获得聚集诱导荧光型纳米簇凝胶,金属-磷酸盐结构的聚集达到荧光增强作用,且纳米簇凝胶中金与腺嘌呤结合力稍弱,能够在细胞内谷胱甘肽等分子存在时发生解离,具有优良的可降解特性,进而在靶向荧光成像、靶向释药等方面具有一定应用价值;同时制备方法操作简单、产量高,成本低。
附图说明
图1为AuATP放大50万倍的透射电子显微图片;
图2为AuATP放大100万倍的透射电子显微图片;
图3为AuATP-Ca放大20万倍的透射电子显微图片;
图4为AuATP-Ca放大50万倍的透射电子显微图片;
图5是AuATP-Ca的高分辨透射电子显微图片和实物图;
图6是AuAMP-Ca对人肝癌HepG2细胞的细胞毒性结果图;
图7是AuADP-Ca对人肝癌HepG2细胞的细胞毒性结果图;
图8是AuATP-Ca对人肝癌HepG2细胞的细胞毒性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
本发明采用的单磷酸腺苷(AMP),三磷酸腺苷(ATP)购于美国aladdin公司,二磷酸腺苷(ADP)购于美国Sigma-Aldrich公司,氯金酸(HAuCl4·4H2O)和其它试剂购于中国上海国药集团化学试剂有限公司,去离子水由Millipore公司Milli-Q集成纯水系统制造。
实施例1 AuATP-Ca
(1)AuATP凝胶的前驱金簇的制备:称取0.1mol/L的氯金酸溶液200μL、10mmol/L的三磷酸腺苷4mL,将两者充分混合摇匀,使之充分反应15min(两者混合后溶液颜色为淡黄色到近无色),金与腺嘌呤核苷酸系列的比例为1:2;随后向该混合溶液中加入超纯水,定容到15mL,0.5h后,加入0.2M柠檬酸缓冲液5mL,柠檬酸与金的摩尔比为50:1;将制得的溶液先采取避光处理,静置12h,第二天观察到溶液中有蓝色荧光产生,之后再加入与上述反应液同体积的20mL的无水乙醇并充分混合摇匀;最后将40mL的浑浊液在离心机内8000rpm下离心15min沉淀,取出沉淀并干燥过夜,并将过夜干燥后的样品称重,按照比例加入超纯水混合,配比成10μg/mL的溶液,分装后于-20℃条件下冻存备用;
(2)Ca2+聚集诱导荧光型纳米簇凝胶的制备:向浓度10μg/mL三磷酸腺苷外壳纳米簇中注入等体积的0.1mmol/L Ca2+离子,制得不溶物,随后离心除去未结合的金属离子,再将沉聚物重新分散至去离子水中,制得类羟基磷灰石成分的金属离子聚集诱导荧光型纳米簇凝胶。
该实施例中柠檬酸缓冲液包括体积比为50:1的柠檬酸钠和柠檬酸,两者的浓度均为0.2mol/L。柠檬酸缓冲液的浓度为0.2mol/L,pH值为5.0。
将该实施例制备的凝胶进行结构表征,获得的结果如图1至图5所示。通过图1和图2可知,在加入Ca2+前,AuATP金纳米簇呈分散状态。通过图3和图4可知,加入Ca2+后,得到的凝胶为网状结构,纳米簇被限制在凝胶内部,其网孔直径在20-100nm。通过图5显示晶格衍射条纹可知,晶格间距0.52nm,与羟基磷灰石(101)面相近,因此其具备类羟基磷灰石结构。
实施例2 AuAMP-Ca
基本步骤与实施例1相同,不同之处在于腺嘌呤核苷酸系列采用单磷酸腺苷。
实施例3 AuADP-Ca
基本步骤与实施例1相同,不同之处在于腺嘌呤核苷酸系列采用二磷酸腺苷。
细胞毒性检测
选取处于快速生长的对数期的HepG2细胞和正常肝细胞L02,胰蛋白酶消化之后收集,在96孔板中各孔加100μL培养基,按10000个细胞/孔的密度进行接种。将细胞放置在37℃,5%二氧化碳浓度的恒温培养箱中培养10h完成贴壁。加入含有10个梯度浓度(分别为1250,625,312,156,78,39,20,10,5,0μg/mL,每个浓度均设置5个复孔)的AuAMP-Ca,AuADP-Ca及AuATP-Ca的培养基100μL,继续培养24h后,在各孔中分别加入5mg/mL MTT溶液20μL,继续培养4h,弃去孔内上清液,在各孔中分别加入150μL二甲亚砜,水平震荡15min,彻底溶解孔内MTT产物晶体。用酶标仪在测定490nm波长处各孔的光吸收值,扣除空白组的光吸收值后结果取平均值,以0μg/mL组为100%,计算各组活性百分比,获得的结果如图6至图8所示。通过图6至图8可知,使用浓度低于10μg/mL金纳米簇处理HepG2细胞24h之后,细胞生存率均在90%以上;即便金纳米簇浓度高达1250μg/mL时,细胞生存率仍为75%左右,并参照《美国药典》毒性分级法,细胞毒性等级为0或1级。
实施例4 AuADP-Mg
基本步骤与实施例1相同,不同之处在于金属离子采用Mg2+。
实施例5 AuADP-Zn
基本步骤与实施例1相同,不同之处在于金属离子采用Zn2+。
实施例6氯金酸溶液中金与腺嘌呤核苷酸系列的摩尔比的单因次试验
基本制备步骤与实施例1相同,不同之处在于氯金酸溶液中金与腺嘌呤核苷酸系列的摩尔比,具体如下表1所示。
表1氯金酸溶液中金与腺嘌呤核苷酸系列的不同摩尔比
组号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
摩尔比 | 1:0.1 | 1:0.5 | 1:1 | 1:3 | 1:5 | 1:8 | 1:10 | 1:12 |
将表1中不同的摩尔比制备的纳米簇凝胶进行性能检测可知,第2-7组制备的纳米簇凝胶网状结构,其网孔直径为20-100nm,且具有良好的生物相容性,而第1组和第8组则因产生过多的大尺寸金颗粒等副产品,凝胶的产率很低。
实施例7柠檬酸缓冲液中柠檬酸与氯金酸溶液中金的摩尔比的单因次试验
基本制备步骤与实施例1相同,不同之处在于柠檬酸缓冲液中柠檬酸与氯金酸溶液中金的摩尔比,具体如下表2所示。
表2柠檬酸缓冲液中柠檬酸与氯金酸溶液中金的不同摩尔比
组号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
摩尔比 | 0.5:1 | 1:1 | 10:1 | 30:1 | 50:1 | 80:1 | 100:1 | 120:1 |
将表1中不同的摩尔比制备的纳米簇凝胶进行性能检测可知,第2-7组制备的纳米簇凝胶网状结构,其网孔直径为20-100nm,且具有良好的生物相容性,而第1组和第8组制备的凝胶则因产生过多的大尺寸金颗粒等副产品,凝胶的产率很低。
实施例8配制的腺嘌呤核苷酸外壳纳米簇的浓度单因次试验
基本制备步骤与实施例1相同,不同之处在于配制不同浓度的腺嘌呤核苷酸外壳纳米簇,具体如下表3所示。
表3腺嘌呤核苷酸外壳纳米簇的不同浓度
组号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
浓度/μg/mL | 0.1 | 0.5 | 10 | 100 | 1000 | 5000 | 10000 | 12000 |
将表3中不同的浓度制备的纳米簇凝胶进行性能检测可知,第2-7组制备的纳米簇凝胶网状结构,其网孔直径为20-100nm,且具有良好的生物相容性,而第1组因为纳米簇原料的投料量过低,凝胶产量很少,无法有效收集。第8组则因纳米簇原料的浓度过高而不能完全溶解,最终造成凝胶产率的下降。
该实施例8中,对应的加入的金属离子的浓度如下表4所示。
表4加入的金属离子的浓度
组号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
浓度/mmol/L | 0.001 | 0.005 | 0.1 | 1 | 10 | 50 | 100 | 120 |
实施例9
(1)AuATP凝胶的前驱金簇的制备:称取0.1μmol/L的氯金酸溶液200μL、10nmol/L的三磷酸腺苷4mL,将两者充分混合摇匀,使之充分反应60min(两者混合后溶液颜色为淡黄色到近无色),金与腺嘌呤核苷酸系列的比例为1:2;随后向该混合溶液中加入超纯水,定容到20mL,0.5h后,加入0.005mol/L柠檬酸缓冲液0.2μL,柠檬酸与金的摩尔比为50:1;将制得的溶液先采取避光处理,静置10h,第二天观察到溶液中有蓝色荧光产生,之后再加入与上述反应液同体积的20mL的无水乙醇并充分混合摇匀;最后将40mL的浑浊液在离心机内15000rpm下离心1min沉淀,取出沉淀并干燥过夜,并将过夜干燥后的样品称重,按照比例加入超纯水混合,配比成10μg/mL的溶液,分装后于-20℃条件下冻存备用;
(2)Ca2+聚集诱导荧光型纳米簇凝胶的制备:向浓度10μg/mL三磷酸腺苷外壳纳米簇中注入等体积的0.1mmol/L Ca2+离子,制得不溶物,随后离心除去未结合的金属离子,再将沉聚物重新分散至去离子水中,制得类羟基磷灰石成分的金属离子聚集诱导荧光型纳米簇凝胶。
该实施例中柠檬酸缓冲液的pH值为8,其包括体积比为100:1的柠檬酸钠和柠檬酸,两者的浓度均为0.005mol/L。
实施例10
(1)AuATP凝胶的前驱金簇的制备:称取0.1mmol/L的氯金酸溶液200μL、0.01mmol/L的三磷酸腺苷4mL,将两者充分混合摇匀,使之充分反应1min(两者混合后溶液颜色为淡黄色到近无色),金与腺嘌呤核苷酸系列的比例为1:2;随后向该混合溶液中加入超纯水,定容到19.9mL,0.5h后,加入0.01mol/L柠檬酸缓冲液0.1mL,柠檬酸与金的摩尔比为50:1;将制得的溶液先采取避光处理,静置15h,第二天观察到溶液中有蓝色荧光产生,之后再加入与上述反应液同体积的20mL的无水乙醇并充分混合摇匀;最后将40mL的浑浊液在离心机内500rpm下离心7min沉淀,取出沉淀并干燥过夜,并将过夜干燥后的样品称重,按照比例加入超纯水混合,配比成10μg/mL的溶液,分装后于-20℃条件下冻存备用;
(2)Ca2+聚集诱导荧光型纳米簇凝胶的制备:向浓度10μg/mL三磷酸腺苷外壳纳米簇中注入等体积的0.1mmol/L Ca2+离子,制得不溶物,随后离心除去未结合的金属离子,再将沉聚物重新分散至去离子水中,制得类羟基磷灰石成分的金属离子聚集诱导荧光型纳米簇凝胶。
该实施例中柠檬酸缓冲液的pH值为3,其包括体积比为0.02:1的柠檬酸钠和柠檬酸,两者的浓度均为0.01mol/L。
Claims (8)
1.一种制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将氯金酸溶液和腺嘌呤核苷酸系列混合,加入柠檬酸缓冲液避光静置后,制得混合溶液,加入与该混合液等体积的无水乙醇混匀,离心制得沉淀;其中,氯金酸溶液中金与腺嘌呤核苷酸系列的摩尔比为1:0.5-10,柠檬酸缓冲液中柠檬酸与氯金酸溶液中金的摩尔比为1-100:1;
(2)将上述沉淀超声分散,配制成浓度为0.5-10000 mg/mL的腺嘌呤核苷酸外壳纳米簇,加入等体积的0.005-100 mmol/L的金属离子制得沉聚物,将该沉聚物分散于去离子水中,即制得类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶;
所述金属离子为Ca2+;
所述腺嘌呤核苷酸系列为三磷酸腺苷。
2.根据权利要求1所述的制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述将氯金酸溶液和腺嘌呤核苷酸系列混合为混合反应1-60 min。
3.根据权利要求1所述的制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述氯金酸溶液的浓度为0.1 mmol/L-0.1 mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.005-0.2 mol/L,pH值为3.0-8.0。
5.根据权利要求4所述的制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,其特征在于:所述柠檬酸缓冲液包括体积比为0.02-100:1的柠檬酸钠和柠檬酸,两者的浓度均为0.005-0.2 mol/L。
6.根据权利要求1所述的制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述避光静置10-15 h。
7.根据权利要求1所述的制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述离心的转速为500-15000 rpm,离心1-15 min。
8.根据权利要求1所述的制备类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶的方法,其特征在于:步骤(2)中,所述制备的类羟基磷灰石成分的纳米簇凝胶为网状结构,其网孔直径为20-100nm。
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