CN115430468B - 一种用于检测有机磷农药的串联3d比率荧光微流控装置和方法 - Google Patents

一种用于检测有机磷农药的串联3d比率荧光微流控装置和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置和方法，属于生化分析与生物传感器技术领域，所述装置包括四层2DμPAD和连接装置；每一层2DμPAD都可以负载和添加试剂，触发检测OPs的级联反应；每层2DμPAD根据反应顺序命名为1‑4层，1st层负载BChE，2nd层负载溶解ATCh，3rd层负载溶解MnO2纳米片与RCDs，4th层负载OPD；所述连接装置将四层2DμPAD按照参加反应的先后次序串联起来。T‑3DμPAD串联3D比率荧光微流控装置具有响应准确、操作简单和无背景干扰检测OPs的优点，为现场检测农药残留提供了可选择的方法。

Description

一种用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置和 方法
技术领域
本发明属于生化分析与生物传感器技术领域，涉及一种用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和方法。
背景技术
农药，尤其是有机磷农药(organophosphoruspesticides,OPs)，作为杀虫剂被广泛用于农业生产中，提高农作物的产量。残留在农产品、水体和土壤中的农药，通过食物链进入人体并累积，对人体健康和生态系统造成严重威胁。在检测农药残留之前，样品前处理是降低复杂基质干扰，富集农药浓度的重要步骤。Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe(QuEChERS)法作为应用广泛的提取农药的方法，主要包括：粗提取、分离、除杂。在提取步骤中，由于农药的水溶性较差，使用有机溶剂(如：甲醇、乙腈)可获得更高的提取效率。同时，农产品的色素及其他物质，如：叶绿素、胡萝卜素等也一同被提取出来，对比色或荧光检测农药产生干扰。由于样品基质复杂性高，盐分离和吸附剂除杂是非常必要的，多步处理导致农药富集因子降低和实验误差升高。因此，开发简便操作、高效和无背景干扰的方法对样品预处理和农残检测仍然是一个很大的挑战。
常见的检测农药的方法主要基于高效液相色谱、气相色谱以及质谱等技术。这些检测方法高效、准确，但是样品处理时间长，需要精密的仪器设备，不适合快速和现场检测。
μPAD是将探针和相关的传感器件整合存储到纸芯片中，代替传统的分析检测技术，是有前景的微型实验室分析方法。2DμPAD通过折叠、弯曲、堆叠等形成3DμPAD。3DμPAD可以进行更复杂的过程，包括过滤、提取、混合以及发生化学反应，为多步分析和同时检测提供了用户友好型操作方法。3DμPAD已经被应用于医疗即时检测、食品安全、环境监测和可穿戴技术等领域，与电化学、化学发光传感器兼容，用于农药检测。但是荧光法与3DμPAD结合用于农药分析中还尚未报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和方法，本发明提供的T-3DμPAD由4层2DμPAD组成，每一层都可以负载和添加试剂，触发检测OPs的级联反应，当敌敌畏浓度从2.5μg L-1到120μg L-1时，荧光图像从红色变为黄色，LOD为1.0μg L-1。在实际样的检测，T-3DμPAD可以消除样品的荧光信号的背景干扰。本发明的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD具有响应准确、操作简单和无背景干扰检测OPs的优点，为现场检测农药残留提供了可选择的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一方面，一种用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD，包括四层2DμPAD和连接装置；每层2DμPAD包括两层疏水材料，一层亲水材料，疏水材料在亲水材料正反面形成疏水屏障；两层疏水材料相同位置处设有通孔，亲水材料的尺寸介于通孔尺寸与疏水材料尺寸之间，且通过通孔在2DμPAD的上下表面裸露；每层2DμPAD根据反应顺序命名为1-4层，1st层负载BChE，2nd层负载溶解ATCh的Tris-HCl缓冲液，3rd层负载溶解MnO2纳米片的Tris-HCl缓冲液与RCDs，4th层负载OPD；连接装置将四层2DμPAD按照参加反应的先后次序串联起来。
本发明的第二方面，一种用于检测有机磷农药的检测系统，包括串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD，其包括四层2DμPAD和连接装置；每层2DμPAD包括两层疏水材料，一层亲水材料，疏水材料在亲水材料正反面形成疏水屏障；两层疏水材料相同位置处设有通孔，亲水材料的尺寸介于通孔尺寸与疏水材料尺寸之间，且通过通孔在2DμPAD的上下表面裸露；每层2DμPAD根据反应顺序命名为1-4层，1st层负载BChE，2nd层负载溶解ATCh，3rd层负载溶解MnO2纳米片与RCDs，4th层负载OPD；连接装置将四层2DμPAD按照参加反应的先后次序串联起来；还包括载玻片，在反应过程中，载玻片将两层2DμPAD夹住。
本发明的第三方面，一种检测有机磷农药的检测方法，所述检测方法基于用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和/或用于检测有机磷浓农药的检测系统。
本发明的第四方面，一种可视化现场即时检测平台，所述检测平台包括所述的用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和/或所述的用于检测有机磷农药的检测系统。
本发明的有益效果为：
本发明构建T-3DμPAD实现高灵敏度、准确、快速、可视化的现场检测实际样品中的OPs。OPs通过不可逆的抑制BChE的活性进而触发MnO2纳米片氧化OPD为oxOPD，oxOPD通过IFE猝灭RCDs的荧光，基于以上原理设计比率荧光传感器检测OPs。随着OPs浓度的增加，通过智能手机中颜色识别器应用软件和自制可携带装置观察到T-3DμPAD检测层的颜色从红色到黄色明显的变化。
与2DμPAD相比，本发明的T-3DμPAD的多层结构避免了来自真实样品的比色和荧光的背景干扰，实现直接检测有机溶剂提取液中的OPs。
本发明拓宽了荧光法在检测农药残留方面的应用，同时多样化的3DμPAD设计为基于纸基平台实现低成本检测食品中的农药残留提供有力的指导和工具。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明T-3DμPAD结合RCDs比率荧光法检测OPs示意图；
图2中(A)为2DμPAD的制作示意图；(B)为紫外灯照射下，RCDs、oxOPD和罗丹明B溶液在2DμPAD正面和背面的荧光图像；(C)为T-3DμPAD的组成示意图；
图3为本发明实施例1.7中智能手机采集荧光图像便携式设备示意图；
图4为本发明实施例1.2不同合成条件下制备的RCDs的荧光强度图，(A)横坐标为香菜的质量，(B)横坐标为反应温度，(C)横坐标为合成时间；
图5为本发明实施例1.2制备的RCDs形貌大小和结构特征图，(A)为RCDs的TEM图(插图：RCDs的HR-TEM图)；(B)为RCDs的粒径分布图；(C)为RCDs的XRD谱图；(D)为RCDs的FT-IR图；
图6为本发明实施例1.2制备的RCDsXPS谱图，(A)为RCDs全扫描XPS谱图；(B)为RCDs的O1sHR-XPS谱图,(C)为N1sHR-XPS谱图和(D)C 1sHR-XPS谱图；
图7为本发明实施例1.2制备的RCDs的UV-vis光谱图，其中(A)为RCDs的UV-vis吸收光谱、激发和发射光谱(插图：RCDs在日光灯和365nm紫外灯照射下的图像)；(B)为不同激发波长下，RCDs的荧光发射光谱；
图8为本发明实施例1.3制备的MnO2纳米片结构表征图，其中(A)为MnO2纳米片的TEM图(插图：MnO2纳米片的HR-TEM图)；(B)为MnO2纳米片的XRD谱图；(C)为MnO2纳米片的XPS全扫描谱图；(D)为Mn2p的HR-XPS谱图；(E)为MnO2纳米片的FT-IR谱图；(F)为MnO2纳米片的UV-vis吸收光谱图(插图：MnO2纳米片在日光灯下的图像)；
图9为实施例2.2OPs的荧光传感机理检测图；其中(A)为比率荧光传感器检测OPs示意图；(B)为MnO2纳米片、BChE+ATCh+MnO2纳米片、BChE+ATCh+MnO2纳米片+OPD、MnO2纳米片+OPD和oxOPD的UV-vis紫外吸收光谱；(C)为RCDs的荧光激发和发射光谱，oxOPD的UV-vis吸收光谱；(D)为RCDs和RCDs+oxOPD的荧光寿命曲线；(E)为RCDs、oxOPD、RCDs+oxOPD、RCDs和oxOPD加和的UV-vis吸收光谱；
图10中(A)为不同RCDs浓度的荧光强度对MnO2纳米片/OPD/RCDs体系荧光的影响示意图；(B)为MnO2纳米片浓度对MnO2纳米片/OPD/RCDs体系荧光的影响示意图，(C)为OPD浓度对MnO2纳米片/OPD/RCDs体系荧光的影响示意图；
图11为优化荧光法检测BChE活性条件(A)ATCh浓度、(B)孵育时间、(C)pH、(D)温度数据图；
图12中(A)为加入不同活性BChE后，RCDs的荧光光谱图；(B)为I570/I680比值与BChE活性的线性关系图；
图13中(A)为加入不同浓度DDVP后，RCDs的荧光光谱图；(B)为I570/I680比值与DDVP浓度对数值的线性关系图；
图14中(A)为罗丹明B水溶液(6μL)滴加到Whatman 5号滤纸(a)、定量滤纸(快速)(b)、Whatman 4号滤纸(c)和定量滤纸(中速)(d)在紫外灯照射下的荧光图像；(B)为罗丹明B水溶液(12μL)滴加到4种滤纸1st层和2nd层，在紫外灯照射下的荧光图像；(C)为罗丹明B水溶液的体积对单层μPAD的影响示意图；(D)为罗丹明B水溶液的体积对双层μPAD的影响示意图；
图15为(A)RCDs的浓度、(B)MnO2纳米片浓度和(C)OPD浓度对MnO2纳米片/OPD/RCDs体系的影响示意图；
图16为优化T-3DμPAD检测BChE活性的条件(A)ATCh浓度、(B)孵育时间、(C)pH、(D)温度数据图；
图17为G/R比值与BChE活性(50-400UL-1)的校正曲线图(插图：T-3DμPAD检测BChE活性(50-400UL-1)的图像)；
图18为G/R比值与DDVP浓度(2.5-120μgL-1)对数值的校正曲线图(插图：T-3DμPAD检测层检测DDVP浓度(2.5-120μgL-1)的图像)；
图19中(A)为加入干扰物质后，T-3DμPAD检测体系G/R-G/R值和对应的图片；(B)为干扰物质和DDVP一起反应，T-3DμPAD检测体系G/R比值和对应的图片；
图20为不同(A)pH、(B)NaCl浓度、(C)UV灯(365nm)照射时间对RCDs荧光强度影响示意图；
图21(A)为未喷洒DDVP溶液，菠菜提取液不同稀释倍数(0,2,5,10,30,100,200)的紫外光谱图；(B)为未喷洒DDVP溶液，菠菜提取液不同稀释倍数(0,2,5,10,30,100,200)的荧光光谱图；(C)为不同稀释倍数下菠菜提取液的图像，以及对应溶液滴加在2DμPAD在日光灯(上)和365nm紫外灯照射(下)的图像；(D)为T-3DμPAD体系中加入Tris-HCl缓冲液(上)和菠菜提取液(下)后，1st，2nd和3rd层在日光灯(左)和紫外灯(右)照射下的图像；(E)为T-3DμPAD体系分析菠菜提取液(左)、Tris-HCl缓冲液(中)的DDVP浓度和2DμPAD(右)分析菠菜提取液DDVP浓度的图像。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
目前，3DμPADs已经被应用于医疗即时检测、食品安全、环境监测和可穿戴技术等领域，与电化学、化学发光传感器兼容，用于农药检测，但是荧光法与3DμPADs结合用于农药分析中还尚未报道。为此，本发明提供了一种用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和方法。
在本发明的一种或多种实施例中，一种用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD，包括四层2DμPAD和连接装置；每层2DμPAD包括两层疏水材料，一层亲水材料，疏水材料在亲水材料正反面形成疏水屏障；两层疏水材料相同位置处设有通孔，亲水材料的尺寸介于通孔尺寸与疏水材料尺寸之间，且通过通孔在2DμPAD的上下表面裸露；每层2DμPAD根据反应顺序命名为1-4层，1st层负载BChE，2nd层负载溶解ATCh的Tris-HCl缓冲液，3rd层负载溶解MnO2纳米片的Tris-HCl缓冲液与RCDs，4th层负载OPD；所述连接装置将四层2DμPAD按照参加反应的先后次序串联起来。
所述串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD是一种响应准确、操作简单和无背景干扰检测OPs的串联3D纸基比率荧光微流控，可用于使用联级催化反应及荧光信号指示检测有机磷农药，为现场检测农药残留提供了可选择的方法。
进一步的，所述疏水材料尺寸为10mm×10mm；所述通孔直径为4-8mm，优选为6mm；所述亲水材料直径为6-10mm，优选为8mm。
在本发明的一种或多种实施例中，一种用于检测有机磷农药的检测系统，所述检测系统包括所述的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD；每层2DμPAD根据反应顺序命名为1-4层，1st层负载BChE，2nd层负载溶解ATCh的Tris-HCl缓冲液，3rd层负载MnO2纳米片的Tris-HCl缓冲液与RCDs，4th层负载OPD；还包括载玻片，在反应过程中，载玻片将两层2DμPAD夹住。
进一步地，所述Tris-HCl缓冲液浓度为8-12mM，优选为10mM；缓冲液的pH值为7.0-9.0，优选为8.0；缓冲液的体积为4-8μL，优选为6μL；所述BChE的生物活性为300-500UL-1，优选的为400UL-1；所述BChE的体积为4-8μL，优选为6μL；所述ATCh的浓度为13-17mM，优选为15mM；所述MnO2纳米片的浓度为0.2-0.4mgmL-1，优选为0.3mgmL-1；所述RCDs的浓度为0.1-0.3mgmL-1，优选为0.2mgmL-1；所述RCDs的体积为4-8μL，优选为6μL；所述OPD的浓度为0.1M，体积为4-8μL，优选为6μL。
进一步地，所述RCDs的制备方法为:将原料洗净烘干，采用乙醇进行80-100℃加热回流；将上清液过滤后，浓缩离心；将离心所得材料干燥并与H2N-PEG-NH2乙醇溶液混合，75℃下反应4h；冷却至室温后，将反应液置于透析袋中，透析得RCDs。
进一步地，所述原料为茄子、黄瓜、香菜、菠菜、西红柿、猕猴桃、韭菜、空心菜；优选为香菜；所述过滤以0.22μm膜进行过滤，收集滤液；所述透析为：用透析袋将滤液透析2-4天，得到的RCDs冷却干燥，低温储存，备用。
在本发明的一种或多种实施例中，一种检测有机磷农药的检测方法，所述检测方法基于所述的用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和/或所述的用于检测有机磷浓农药的检测系统。
进一步地，所述检测方法包括:每一步反应过程中，两层2DμPAD的顶部和底部均覆盖载玻片，提高T-3DμPAD体系的稳定性和重现性，避免溶剂的蒸发效应带来的干扰。
第一步，在1st层2DμPAD的亲水材料上滴加不同浓度的OPs，干燥有机溶剂挥发后，在1st层的背面滴加BChE，30-40℃孵育10-20min，优选的，37℃下孵育15min；
第二步，将1st层堆叠在含有ATCh的2nd层上方，并在1st层上滴加超纯水，30-40℃孵育10-20min，优选的，37℃下孵育15min；
第三层，将2nd层堆叠在含有MnO2纳米片与RCDs的3rd层上方，并在2nd层上滴加超纯水，30-40℃孵育10-20min触发TCh和MnO2纳米片的反应，优选的，37℃下孵育10min；
第四层，将3rd层堆叠在含有OPD的4th层上方，并在4th层背面滴加超纯水，30-40℃孵育10-20min，优选的，37℃下孵育10min；
第五步，将3rd层作为检测层，放置于便携式装置中，使用智能手机拍摄荧光图像，通过颜色识别器应用软件分析得RGB值。
进一步地，所述便携式装置包括365nm的UV灯、暗箱和智能手机，暗箱上部设有拍照孔；UV灯位于暗箱内部，处于拍照孔的下方；3rd层置于暗箱底部，拍照孔、UV灯与3rd层位于同一竖直方向；智能手机的摄像头通过拍照孔拍摄荧光图像。
具有荧光信号指示的级联催化反应被合理设计用于比率荧光检测，具体原理：丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase，BChE)水解乙酰胆碱生成硫代胆碱(thiocholine,TCh)，TCh还原MnO2纳米片为Mn2+。由于OPs对BChE不可逆的抑制作用，减少了TCh的生成和MnO2纳米片分解，触发MnO2纳米片氧化邻苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)生成发黄色荧光的2,3-二氨基吩嗪(2,3-diaminophenazine,oxOPD)，oxOPD通过内滤效应猝灭红光CDs(red-emission CDs，RCDs)的荧光。
基于以上原理，采用亲水材料与疏水材料以及连接装置设计制作了由4层2DμPAD组成构的T-3DμPAD，每一层都可以负载和添加试剂，触发检测OPs的级联反应。当敌敌畏浓度从2.5μgL-1到120μgL-1时，荧光图像从红色变为黄色，LOD为1.0μgL-1。在实际样的检测，T-3DμPAD可以消除样品的荧光信号的背景干扰，具有响应准确、操作简单和无背景干扰检测OPs的优点，为现场检测农药残留提供了可选择的方法。
在本发明的一种或多种实施例中，一种可视化现场即时检测平台，所述检测平台包括所述的用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和/或所述的用于检测有机磷农药的检测系统。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1实验部分
1.1实验试剂与仪器
表1主要实验试剂一览表
Figure BDA0003756197060000101
Figure BDA0003756197060000111
表2主要实验仪器一览表
Figure BDA0003756197060000112
实验中用到的ALP和BChE购自上海源叶生物科技有限公司。实验中所有分析纯化学品均从上海阿拉丁试剂有限公司购买。Whatman 5号滤纸、Whatman 4号滤纸、定量滤纸(中速)、定量滤纸(快速)从GE Healthcare Life Sciences China公司购买，聚氯乙烯(Polyvinyl chloride，PVC)标签纸从汉唐公司(中国，青岛)购买，载玻片从帆船公司(中国，盐城)购买。
1.2RCDs的制备
以香菜为原料制备RCDs。香菜用超纯水清洗干净，60℃过夜烘干。在N2保护下，干燥的香菜(0.1g)和乙醇(10mL)于90℃条件下，回流15h。将上清液过滤(0.22μm)后，真空旋转蒸发仪浓缩滤液，所得的物质分散于超纯水(20mL)中。将溶液离心3次(10000r/min)每次15min去除水溶性的CDs和杂质。将离心所得材料干燥并与H2N-PEG-NH2(6mg)乙醇溶液(10mL)混合，75℃下反应4h。冷却至室温后，将反应液置于透析袋中(500Da)，透析3天，去除未反应的杂质得到RCDs。最终，将RCDs冷冻干燥，并储存在4℃下，供进一步实验使用。
1.3 MnO2纳米片的合成
牛血清白蛋白(1.0mg)与MnCl2·4H2O(4mg)溶于超纯水中(10mL)，在室温(25℃)下搅拌1h，用NaOH(1.0M)将反应液pH调到10。在4℃下反应7h后，将产物离心、洗涤3次。最终得到的产物为MnO2纳米片，储存在4℃下，供进一步实验使用。
1.4 RCDs的量子产率的测定
以罗丹明B为参考标准物，在540nm激发波长下，量子产率为0.65。根据公式(1-1)计算RCDs的量子产率：
Figure BDA0003756197060000121
QY：荧光量子产率，I：荧光积分强度，A：吸光度，n：溶剂的折射率，sam和ref分别代表样品和参考标准物。
1.5 RCDs荧光法检测OPs步骤
检测BChE活性步骤：在Tris-HCl缓冲液(1.5mL,10mM,pH 8.0)中加入ATCh(12.5mM,15μL)与不同活性的BChE，37℃条件下，孵育25min。加入MnO2纳米片(5mgmL-1,50μL)并在37℃下反应10min，加入OPD(0.1M,15μL)反应15min。最后，加入CDs溶液(5mgmL-1,15μL)，荧光分光光度计记录荧光光谱。在检测OPs实验中，以敌敌畏为例。将不同浓度的敌敌畏与BChE(30UL-1)一起孵育15min，然后按照检测BChE活性的步骤进行。
1.6 T-3DμPAD的设计与制作
如图2-A所示，T-3DμPAD的疏水区域和亲水区域的形状通过手持式打孔器切割防水胶粘PVC标签纸(直径6mm,边长10mm×10mm)和Whatman 5号滤纸(直径8mm)制作。PVC标签纸粘在Whatman 5号滤纸的正反两面，制备2DμPAD，其它颜色的2DμPAD制作与此相同。在图2-B中，RCDs、oxOPD和罗丹明B溶液在2DμPAD上分布均匀，完全铺满在限定区域的滤纸上，且没有泄露出直径为6mm的圆形区域外。PVC标签在滤纸的正反面形成了有效的疏水屏障，由于不干胶粘PVC标签阻止了流体在多孔滤纸上的转移，而不是扩散在整张滤纸中。通过棉线将4张制作好的2DμPAD按照参加反应的先后次序串联起来，形成T-3DμPAD(图2-C)。T-3DμPAD包括4层2DμPAD，根据反应顺序命名为1-4层。
在检测OPs之前，根据以下步骤，分别先将参加反应的物质负载在1-4层。1st层负载BChE(400UL-1,6μL)，2nd层负载溶解ATCh(15mM)的Tris-HCl缓冲液(10mM,pH 8.0,6μL)，3rd层负载溶解MnO2纳米片(0.3mg mL-1)的Tris-HCl缓冲液(10mM,pH 8.0,6μL)，并在室温下干燥10min，然后滴加RCDs(0.2mgmL-1,6μL)。4th层负载OPD(0.1M,6μL)。最后，将T-3DμPAD在25℃条件下避光干燥15min。
1.7 T-3DμPAD分析OPs步骤
为了提高T-3DμPAD体系的稳定性和重现性，避免溶剂的蒸发效应带来的干扰，每一步反应过程中，两层2DμPAD的顶部和底部均覆盖载玻片。
第一步，将6μL不同浓度的OPs(0-120μgL-1)，滴加到1st层，避光干燥10min，使有机溶剂挥发完全。接着，在1st层的背面滴加BChE，37℃下孵育15min，使OPs对BChE的抑制效应达到完全。
第二步，将1st层堆叠在含有ATCh的2nd层上，并滴加超纯水(12μL)，触发BChE的酶解反应，37℃下孵育15min。
第三步，2nd层叠在3rd层上方，并加12μL超纯水，37℃下孵育10min触发TCh和MnO2纳米片的反应。
第四步：将3rd层叠在4th层上，并在4th层背面滴加12μL水，激活MnO2纳米片和OPD的反应，37℃下反应10min。
第五步，将3rd层作为检测层，放置在便携式装置中，使用智能手机拍摄荧光图像，通过颜色识别器应用软件分析得RGB值。
为了使用智能手机方便准确的获得T-3DμPAD检测层的荧光信号，便携式荧光检测装置(图3)，包括UV灯(365nm)、暗箱和智能手机。反应结束后，将3rd层2DμPAD放置在图中区域，通过智能手机上的照相机采集荧光图像，利用颜色识别器应用软件分析得图片的RGB值，实现现场定量OPs。
1.8 DDVP的选择性和抗干扰能力测试
在评价T-3DμPAD检测DDVP的选择性和抗干扰能力实验中，选择金属离子(Na+,K+,Ca2+,Mg2+,100μM)、小分子(Glu,L-Phe,L-Leu,100μM)、生物大分子(BSA,100μgL-1；ALP,1000UL-1)以及非OPs(2,4-D,fipronil,100μgL-1)为干扰物质，测试检测体系对DDVP(120μgL-1)的选择性和抗干扰能力。在选择性测试中，将上述干扰物质溶液滴加在1st层的背面进行反应。在抗干扰能力测试中，DDVP分别与干扰物质在1st层的背面混合，然后进行反应。反应过程与“1.7 T-3DμPAD分析OPs步骤”相同。
1.9 T-3DμPAD检测实际样中的DDVP
以菠菜和西红柿为实际样品，通过T-3DμPAD检测其中DDVP的含量。菠菜和西红柿(5.0g)捣碎，并加入乙腈(10mL)超声提取30min，离心(10000rpm)5min，过滤除杂(0.22μm,尼龙膜)，得澄清提取液。提取液(6μL)滴在T-3DμPAD的1st层背面，静置10min使有机溶剂乙腈挥发完全，然后滴加BChE，37℃条件下孵育15min。接下来的步骤与“1.7 T-3DμPAD分析OPs步骤”一致。在加标回收率的测定中，不同浓度的DDVP(5μgL-1，25μgL-1，80μgL-1)分别滴加到菠菜和西红柿的表面，基于“1.7 T-3DμPAD分析OPs步骤”进行测定。
结果与讨论
2.1RCDs和MnO2纳米片的表征
为了获得具有最佳光学性质的水溶性RCDs，如图4所示，干燥香菜(0.1g)与乙醇(10mL)在90℃条件下回流15h后，除杂并通过修饰H2N-PEG-NH2，制备了水溶性良好的RCDs。
首先通过TEM直观的表征RCDs的形貌大小和结构特征。在图5-A中，RCDs呈均匀的球形，分散性良好，平均粒径为5.5nm(图5-B)。在HR-TEM图中，RCDs的晶格为0.21nm，对应石墨碳的(100)晶面。由于无定型碳的sp2杂化，RCDs的XRD谱图在21.6°处有一个宽的衍射峰(图5-C)。通过FT-IR和XPS对RCDs表面的官能团和元素种类进行分析。在RCDs的FT-IR谱图中(图5-D)，N-H/O-H(3400cm-1),C-H(2925,2841cm-1),C＝O(1739cm-1),C＝C/C＝N(1639cm-1),C-N(1463,1341cm-1)和C-O-C(1110,1042cm-1)键的振动表明-OH、-COOH、-NH2等官能团的存在。
如图6-A所示，RCDs的XPS全谱在结合能为532.1,399.1和284.1eV处有峰，表明O(18.54％),N(4.56％)和C(76.90％)元素的存在。O1s的HR-XPS谱图在531.9和531.3eV处的峰，分别对应C-O和C＝O的结合能(图6-B)。在图6-C，N1s的谱图解卷积结果显示在399.4eV(graphiticN/amineN)和398.7eV(pyridinic-N)处有两个峰。在图6-D中，C1s的HR-XPS谱拟合为4个峰，分别对应C＝O(287.9eV),C-N(285.1eV),C-O/C＝N(284.5eV)和C-C/C＝C(283.9eV)的结合能。RCDs的FT-IR和XPS结果表明，RCDs被含氧元素和氮元素的官能团官能化。RCDs的UV-vis光谱在280,324,420和673nm处有吸收(图7-A)。其中，280nm处的吸收峰对应碳核中共轭C＝C的π-π*跃迁,324和420nm处的吸收为共轭C＝O/C＝N的n-π*跃迁，673nm处的吸收峰由于RCDs表面叶绿素衍生的卟啉结构导致n-π*跃迁。在365nm激发波长下，RCDs的最大发射强度位于680nm处，RCDs的水溶液呈明亮的红色荧光发射。如图7-B所示，随着激发波长从325nm变化到385nm，RCDs在红色荧光区域显示非激发依赖性质。以罗丹明B为参考标准(QY＝0.65,乙醇)，计算得RCDs的量子产率(QY)为6.1％。
如图8-A所示，TEM表征了合成MnO2纳米片的形貌。MnO2纳米片具有典型的褶皱2D片状形貌。在HR-TEM图中，面内晶格为0.23nm，对应MnO2的(420)晶面。在MnO2纳米片的XRD谱图中(图8-B)，18.3°,28.9°,36.2°和65.0°处的衍射峰分别对应于(002),(003),(100)和(110)晶面。在图8-C中，XPS分析了MnO2纳米片的化学组成，MnO2纳米片的全扫描XPS谱在结合能为640.91、531.3、399.5、284.5eV处有峰，表明MnO2纳米片中含有Mn、O、N、C元素。在MnO2纳米片的HR-XPS谱图中(图8-D)，在652.8和641.1eV处有两个特征峰，分别对应于Mn2p1/2和Mn2p3/2处的结合能。如图8-E所示，MnO2纳米片的FT-IR谱图中，在500cm-1处有Mn-O的特征伸缩振动峰。在图8-F中，MnO2纳米片的UV-vis吸收光谱在250nm到700nm范围内有宽的吸收。根据以上实验结果，证明MnO2纳米片已经被成功制备。
2.2检测OPs的荧光传感机理
MnO2纳米片是常见的类氧化酶和类过氧化酶，已经被应用在许多催化氧化反应中。在O2存在条件下，MnO2纳米片氧化不发荧光的OPD，生成发黄色荧光的oxOPD和H2O2，H2O2继续催化氧化未反应的OPD生成oxOPD。基于RCDs检测OPs的原理如图9-A所示。当在反应体系中加入BChE时，BChE特异性催化ATCh为TCh，TCh具有强还原性，还原MnO2纳米片为Mn2+,导致OPD的氧化过程被阻断，对RCDs的荧光信号没有影响。当存在OPs时，BChE的活性被抑制，MnO2纳米片不会被分解，氧化OPD生成oxOPD，oxOPD的荧光信号上升，RCDs的荧光强度降低。根据反应体系在黄色通道oxOPD升高的荧光信号和红色通道RCDs降低的荧光强度，建立比率荧光法实现灵敏的检测OPs。如图9-B所示，对反应体系UV-vis吸收光谱的变化进行了考察，加入BChE和ATCh的反应液后，MnO2纳米片吸收值降低，MnO2纳米片未与OPD反应，没有oxOPD吸收峰出现。不加BChE反应液，MnO2纳米片与OPD反应，生成oxOPD的吸收峰升高，也证实了上述原理的推测。
为了探究oxOPD对RCDs的荧光猝灭机理，对反应体系的UV-vis吸收光谱和荧光寿命进行了表征。如图9-C所示，oxOPD的吸收光谱(420nm)与RCDs的激发光谱(365nm)重叠程度很大，但是oxOPD的吸收光谱和RCDs的发射光谱几乎没有重叠，排除了FRET效应，表明猝灭机理可能是IFE。如图9-D所示，加入oxOPD后，RCDs的荧光寿命从5.84ns变化到5.73ns，荧光寿命几乎没有发生变化，排除了如FRET和PET等动态猝灭效应。如图9-E所示，通过测试RCDs和oxOPD的UV-vis吸收光谱发现，RCDs和oxOPD的混合物的光谱中没有新的吸收峰出现,表明RCDs与oxOPD之间没有新的复合物生成，排除了静态猝灭效应。因此，当oxOPD加入RCDs体系中，触发IFE的发生，导致RCDs荧光猝灭。
2.3 RCDs荧光法检测DDVP
在RCDs荧光法检测DDVP之前，优化了检测体系的反应条件，包括RCDs的浓度、MnO2纳米片浓度、OPD浓度、ATCh浓度、BChE孵育时间、pH以及温度影响。从图10-A中可以看出，随着RCDs浓度的升高，RCDs的荧光强度呈先升高后降低的过程，在浓度为50μgmL-1达到最高，因此在检测过程中，RCDs的浓度为50μgmL-1。随着MnO2纳米片浓度的升高，生成的oxOPD的浓度增大，因此F680/F570比值逐渐增大，在本发明中，MnO2纳米片浓度设定为40μgmL-1(图10-B)。随着OPD浓度的增加，F680/F570的比值逐渐增大，在大于1.0mM达到平衡。因此OPD的浓度设置为1.0mM(图10-C)。在BChE的反应中，在Tris-HCl(10mM,pH 8.0)缓冲液中，ATCh(125μM)在37℃条件下反应20min后，BChE的反应达到平衡，F680/F570比值达到最大(图11)。
在最优检测条件下，首先考察了RCDs体系检测BChE活性的灵敏度。如图12(A)所示，随着BChE活性的升高，在570nm处的荧光发射峰强度逐渐降低，680nm处的荧光强度逐渐升高。在图12(B)中，F570/F680比值与BChE活性在1.5-30UL-1范围内具有良好线性关系，线性方程式为：y＝-0.0382x+1.237，相关系数R2＝0.9928，LOD为0.6UL-1。在检测DDVP时，BChE的活性设定为30UL-1。如图13(A)所示，随着DDVP浓度的增大，570nm处出现新的荧光发射峰且强度逐渐增强，680nm处的荧光强度逐渐降低。如图13(B)所示，当DDVP浓度为0.2-7.0μgL-1范围内时，F570/F680比值与DDVP浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性方程为：y＝0.8574x+0.6733(R2＝0.9925)，LOD为0.08μgL-1。
2.4优化T-3DμPAD检测OPs的条件
为了提高T-3DμPAD检测OPs的准确度、高效性和稳定性，优化了纸基种类、溶液体积、RCDs的浓度、MnO2纳米片浓度、OPD浓度、ATCh浓度、BChE孵育时间、pH以及温度等参数。选取Whatman 5号滤纸、定量滤纸(快速)、Whatman 4号滤纸和定量滤纸(中速)4种不同的滤纸制备2DμPAD，以罗丹明B水溶液代替样品溶液进行测试。如图14(A)和(B)所示，使用Whatman 5号滤纸获得的图像在单层和双层纸基上都呈现均匀的分布且布满整个纸基工作区域。因此，选择Whatman 5号滤纸制作2DμPAD。如图14(C)和(D)所示，优化了单层和双层μPADs反应所需溶液的体积，当单层μPAD加入溶液体积为6μL，双层μPADs加入溶液体积为12μL时，获得的荧光响应更高，溶液完全到达纸基的工作区域而没有泄露。
实验反应条件对纸基传感器的性能有重要影响，对T-3DμPAD的1st-4th层负载物质浓度和反应条件进行了优化图15(A-C)。当RCDs的浓度为0.20mg mL-1时，G0/R0与G/R差值达到最大，表明该浓度下体系的检测范围越宽。随着3rd层MnO2纳米片浓度的增加，OPD被氧化的程度越高，G/R值逐渐升高，选择MnO2纳米片的浓度为0.3mgmL-1。当4th层的OPD浓度达到0.1M时，G/R值达到平衡，OPD浓度设定为0.1M。由于BChE的活性的高低直接检测OPs的灵敏度，因此，优化了BChE的反应条件。如图16(A-D)所示，BChE最佳的反应条件为在Tris-HCl(10mM,pH 8.0)缓冲液中，2nd层ATCh的浓度为15mM，37℃条件下孵育15min。
2.5 T-3DμPAD检测DDVP
在最优的检测条件下，首先测试了T-3DμPAD检测BChE活性的表现。如图17所示，随着BChE活性的增强，检测层的荧光颜色由黄色逐渐变为红色。当BChE活性在50-400UL-1范围内时，G/R比值与BChE活性呈线性关系，线性关系方程式为y＝-0.0012x+1.1852(R20.9902)，LOD为5.0UL-1。考虑到G/R比值随BChE活性的变化趋势，在OPs的检测中，第1st层负载BChE的活性为400UL-1。接着，评价了T-3DμPAD检测OPs的表现。如图18所示，随着DDVP浓度从2.5μgL-1到120μg L-1增大，检测层的荧光颜色呈现从红色到黄色明显的变化。G/R比值随着DDVP浓度的增加而上升，G/R比值与DDVP浓度的对数值呈线性关系，线性拟合方程为y＝0.2265x+0.7007(R2 0.9899)，LOD为1.0μg L-1(S/N 3)。基于T-3DμPAD方法具有便携式、快速和操作简便的优点，使其在日常生活应用中可以实现现场监测OPs。同时由于比率荧光传感器的自校正功能可以减少外界干扰，提高检测准确度，使得该方法在即时检测DDVP具有出色表现。如表3所示，T-3DμPAD检测DDVP的灵敏度与已报道的探针相当或更好，且可以实现少样品量、快速和无仪器设备的现场检测OPs，为农药的即时检测提供新方法。总之，本工作提出了一种出色的基于T-3DμPAD检测OPs的方法。
表3该传感器与其他已报道的方法的比较
Figure BDA0003756197060000201
Figure BDA0003756197060000211
a:Notreported.
2.6 T-3DμPAD检测DDVP的选择性和抗干扰能力
金属离子(Na+,K+,Ca2+,Mg2+)、小分子(Glu,L-Phe,L-Leu)、生物大分子(BSA,ALP)以及非OPs(2,4-D,fipronil)等一些常见物质作为干扰物来探究T-3DμPAD检测DDVP的选择性和抗干扰能力。如图19(A)所示，T-3DμPAD在检测DDVP时，有明显的颜色变化，G/R比值增大，当加入其它干扰物质后，检测层的颜色没有发生明显的变化。尤其是在检测OPs和非OPs之间存在明显的差异性，说明该平台对OPs的选择性很高，适合区分OPs和非OPs。DDVP通过抑制BChE的活性，触发MnO2纳米片氧化OPD生成oxOPD，猝灭RCDs的荧光，检测层变黄。如图19(B)所示，以上干扰物质与DDVP一起加入到反应体系中后，检测体系的G/R比值基本保持不变。如图20所示，RCDs在pH(7.0-9.0)、NaCl(0-1.0mM)和紫外灯光照(0-150min)下具有良好的光稳定性。因此，该体系高选择性、强抗干扰能力、出色的光稳定性质，表明T-3DμPAD在检测实际样品中的DDVP的含量具有巨大潜力。
2.7 T-3DμPAD检测实际样中的DDVP
为了评估该方法检测DDVP的实用性，选择菠菜和番茄作为实际样品进行分析。以菠菜为例，乙腈为溶剂提取DDVP，菠菜中的色素(如：叶绿素)和其他物质也被提取出来。如图21(A)和(B)所示，提取液有明显的紫外吸收和荧光发射，对紫外可见吸收法和荧光法检测OPs会产生严重的干扰。在图21(C)中，菠菜提取液在2DμPAD中有明显的绿色(日光灯照射)和红色荧光(365nm紫外灯照射)，甚至在稀释100倍后，仍然可以观察到这种现象。尽管对比色法和荧光法的干扰可以通过稀释提取液浓度消除，但是需要传感器具有更高的灵敏度和更低的检测限。
表4检测菠菜和番茄样品中的DDVP
Figure BDA0003756197060000221
a Not detected
如图21(D)所示，当菠菜提取液滴加至T-3DμPAD体系中时，与空白对照相比，在日光灯照射下1st层有明显的绿色，2nd层呈现浅绿色，3rd层未观察到明显的绿色；在紫外灯照射下，1st层发强烈红色荧光，2nd层发弱红色荧光，3rd层未观察到明显红色荧光信号。因此，通过T-3DμPAD体系可以排除提取液中其他物质的紫外和荧光干扰。在实际样的检测中，将提取液滴加到1st层，放置10min，使提取液中的乙腈挥发完全，然后滴加BChE溶液，以去除有机溶剂对BChE活度的影响。在图21(E)中，T-3DμPAD体系检测提取液中DDVP的G/R比值为0.70(0μgL-1)和1.17(120μgL-1)，在Tris-HCl缓冲液中的检测结果为0.71(0μgL-1)和1.18(120μgL-1)两种情况的检测结果保持一致。但是，提取液的荧光信号对2DμPAD体系检测DDVP产生严重的干扰，G/R比值为0.54(0μgL-1)和0.58(120μgL-1)。纸基上提取液中有机溶剂在的挥发避免了有机溶剂对BChE活性的影响。因此，本发明提出的T-3DμPAD可以消除背景干扰，直接检测农产品提取液中OPs而不需要复杂的样本处理过程。如表4所示，在菠菜和番茄样品中没有检测出DDVP。T-3DμPAD体系检测实际样的加标回收率为94.0％-106.0％，RSD低于8.6％。检测结果与HPLC-MS的检测结果基本一致。T-3DμPAD在检测DDVP上满意和优异的表现，表明该方法在检测食品和环境中的OPs也是可行的。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD，其特征是，包括四层2DμPAD和连接装置；
每层2DμPAD包括两层疏水材料，一层亲水材料，疏水材料在亲水材料正反面形成疏水屏障；两层疏水材料相同位置处设有通孔，亲水材料的尺寸介于通孔尺寸与疏水材料尺寸之间，且通过通孔在2DμPAD的上下表面裸露；
每层2DμPAD根据反应顺序命名为1-4层，1st层负载BChE，2nd层负载溶解ATCh的Tris-HCl缓冲液，3rd层负载溶解MnO2纳米片的Tris-HCl缓冲液与RCDs，4th层负载OPD；
所述连接装置将四层2DμPAD按照参加反应的先后次序串联起来。
2.如权利要求1所述的用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD，其特征是，所述疏水材料尺寸为10mm×10mm；所述通孔直径为4-8mm，所述亲水材料直径为6-10mm。
3.如权利要求2所述的用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD，其特征是，所述通孔直径为6mm；所述亲水材料直径为8mm。
4.一种用于检测有机磷农药的检测系统，其特征是，所述检测系统包括权利要求1或2所述的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD与载玻片；每层2DμPAD根据反应顺序命名为1-4层，1st层负载BChE，2nd层负载溶解ATCh的Tris-HCl缓冲液，3rd层负载MnO2纳米片的Tris-HCl缓冲液与RCDs，4th层负载OPD。
5.如权利要求4所述的用于检测有机磷农药的检测系统，其特征是，所述Tris-HCl缓冲液浓度为8-12mM；缓冲液的pH值为7.0-9.0；缓冲液的体积为4-8μL；
所述BChE的生物活性为300-500UL-1；所述BChE的体积为4-8μL；
所述ATCh的浓度为13-17mM；
所述MnO2纳米片的浓度为0.2-0.4mgmL-1；
所述RCDs的浓度为0.1-0.3mgmL-1；所述RCDs的体积为4-8μL；
所述OPD的浓度为0.1M,体积为4-8μL。
6.如权利要求5所述的用于检测有机磷农药的检测系统，其特征是，所述Tris-HCl缓冲液浓度为10mM；缓冲液的pH值为8.0；缓冲液的体积为6μL；
所述BChE的生物活性为400UL-1；所述BChE的体积为6μL；
所述ATCh的浓度为15mM；
所述MnO2纳米片的浓度为0.3mgmL-1；
所述RCDs的浓度为0.2mgmL-1；所述RCDs的体积为6μL；
所述OPD的体积为6μL。
7.如权利要求4所述的用于检测有机磷农药的检测系统，其特征是，所述RCDs的制备方法为:将原料洗净烘干，采用乙醇进行80-100℃加热回流；将上清液过滤后，浓缩离心；将离心所得材料干燥并与H2N-PEG-NH2乙醇溶液混合，75℃下反应4h；冷却至室温后，将反应液置于透析袋中，透析得RCDs。
8.如权利要求7所述的用于检测有机磷农药的检测系统，其特征是，所述原料为茄子、黄瓜、香菜、菠菜、西红柿、猕猴桃、韭菜、空心菜；
或，所述过滤以0.22μm膜进行过滤，收集滤液；
或，所述透析为：用透析袋将滤液透析2-4天，得到的RCDs冷却干燥，低温储存，备用。
9.如权利要求8所述的用于检测有机磷农药的检测系统，其特征是，所述原料为香菜。
10.一种检测有机磷农药的检测方法，其特征是，所述检测方法基于权利要求1或2所述的用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和/或权利要求3-6任一项所述的用于检测有机磷浓农药的检测系统。
11.如权利要求10所述的检测有机磷农药的检测方法，其特征是，所述检测方法包括:每一步反应过程中，两层2DμPAD的顶部和底部均覆盖载玻片；
在1st层2DμPAD的亲水材料上滴加不同浓度的OPs，有机溶剂挥发后，在1st层的背面滴加BChE，30-40℃孵育10-20min；
将1st层堆叠在含有ATCh的2nd层上方，并在1st层上滴加超纯水，30-40℃孵育10-20min；
将2nd层堆叠在含有MnO2纳米片与RCDs的3rd层上方，并在2nd层上滴加超纯水，30-40℃孵育10-20min；
将3rd层堆叠在含有OPD的4th层上方，并在4th层背面滴加超纯水，30-40℃孵育10-20min；
将3rd层作为检测层，放置于便携式装置中，使用智能手机拍摄荧光图像，通过颜色识别器应用软件分析得RGB值。
12.如权利要求11所述检测方法包括:
在1st层2DμPAD的亲水材料上滴加不同浓度的OPs，有机溶剂挥发后，在1st层的背面滴加BChE，37℃下孵育15min；
将1st层堆叠在含有ATCh的2nd层上方，并在1st层上滴加超纯水，37℃下孵育15min；
将2nd层堆叠在含有MnO2纳米片与RCDs的3rd层上方，并在2nd层上滴加超纯水，37℃下孵育10min；
将3rd层堆叠在含有OPD的4th层上方，并在4th层背面滴加超纯水，37℃下孵育10min。
13.如权利要求11所述的检测有机磷农药的检测方法，其特征是，所述便携式装置包括365nm的UV灯、暗箱和智能手机，暗箱上部设有拍照孔；UV灯位于暗箱内部，处于拍照孔的正下方；3rd层置于暗箱底部，拍照孔、UV灯与3rd层位于同一竖直方向；智能手机的摄像头通过拍照孔拍摄荧光图像。
14.一种可视化现场即时检测平台，其特征是，所述检测平台包括权利要求1或2所述的用于检测有机磷农药的串联3D比率荧光微流控装置T-3DμPAD和/或权利要求3-6任一所述的用于检测有机磷农药的检测系统。
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