CN103616366B

CN103616366B - 一种可以定量检测多氯联苯的表面增强拉曼光谱的方法

Info

Publication number: CN103616366B
Application number: CN201310589987.0A
Authority: CN
Inventors: 黄青; 鲁逸林
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2013-11-20
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-11-20
Also published as: CN103616366A

Abstract

本发明公开了一种可以定量检测多氯联苯的表面增强拉曼光谱的方法，包括以下步骤：制备均匀的金包裹二氧化硅纳米颗粒，并利用偶联剂将核壳结构纳米颗粒固定在石英玻璃片上构建SERS基底；将PCB的适配体在一端连接巯基，再通过巯基共价连接到纳米颗粒的金壳层表面；把制备的SERS基底浸泡在含有PCB的溶液中，等待足够时间后取出，用去离子水清洗，然后进行拉曼光谱测量。本发明中制备的金包裹二氧化硅纳米颗粒形貌和粒径均一性好，其等离子体激元共振吸收出现在750nm处，在785nm^‑1激光激发下有较强SERS增强效应。

Description

一种可以定量检测多氯联苯的表面增强拉曼光谱的方法

技术领域

本发明内容主要包括制设计和制备连接了PCB适配体单链DNA的金包裹二氧化硅的核壳型纳米颗粒，利用其适配体单链DNA的表面增强拉曼散射光谱的变化特征，对PCB实现特异性和和定量化的测量和分析。

背景技术

多氯联苯（PCB：Polychlorinated biphenyls）是一种环境中不易分解的有机物，大多数有毒，并会在生物体中富集，从而引起环境污染，对动物和人类的生存造成危害。对于监测和定量分析PCB，传统方法包括气相色谱，液相色谱，液质联用等方法等。光谱的方法也受到人们的重视，比如有磷光及荧光方法进行PCB检测。但以上的方法中，色谱及质谱的方法样品制备过程复杂，需要对操作人员进行专业培训；荧光的方法灵敏，但荧光光谱一般不具备特异性的指纹特征，需要其它辅助手段。

表面增强拉曼散射(SERS：Surface Enhanced Raman Scattering)技术是一种近年来发展很快的无损、痕量测量技术，它是在具有纳米级粗糙度的贵金属颗粒或溶胶表面，在激光的照射下，吸附分子的拉曼散射信号大幅度增强的现象。与传统的拉曼光谱方法相比，灵敏度一般可以提高6-7个量级，甚至可以达到单分子测量水平。表面增强拉曼光谱技术不仅具有高灵敏，而且可以提供待测物的“指纹信息”，并且是一种无损检测手段，非常适合对各种化学分子进行无损、痕量检测。不过，利用SERS进行定量化测量仍然是在实际应用中待解的难题。本发明目的就是应用表面拉曼光谱方法，通过设计一种新的、能特异性识别PCB、同时又能产生强的SERS效应的纳米材料或基底，并利用SERS光谱中特殊的光谱指标，从而对PCB进行特异性和定量化的检测。

发明内容

本发明属于生化分析检测领域，涉及制备表面用多氯联苯（PCB）适配体单链DNA进行修饰的金包裹二氧化硅纳米材料，该纳米材料适合用红外激光得到表面增强拉曼光谱（SERS），可以对相应的多氯联苯PCB进行免标记、特异性、痕量、定量的检测，其准确性和灵敏度较高。该方法在环境中污染物检测方面有应用前景。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种可以定量检测多氯联苯的表面增强拉曼光谱的方法，包括以下步骤：

（1）首先，采用分步的方法制备均匀的金包裹二氧化硅纳米颗粒其等离子体激元共振吸收在700nm-760nm之间，然后利用偶联剂将核壳结构纳米颗粒固定在石英玻璃片上构建SERS基底；

（2）将PCB的适配体DNA在一端连接巯基，这样，可以通过巯基共价修饰连接到纳米颗粒的金壳层表面，连接过程中，可以通过调节DNA的浓度，控制DNA在金属表面的数量及状态；

所述的PCB的适配体为一种DNA，其序列可以通过SELEX方法得到；

（3）把制备的SERS基底浸泡在含有PCB的溶液中，等待足够时间后取出，用去离子水清洗，然后进行拉曼光谱测量，测量时，可用红外激光激发样品，通过分析某些特征拉曼峰的光谱强度比值从而实现对PCB的定量检测。

本发明的优点是：

所制备的纳米颗粒形态均一性好，并适合用红外激光（如：785 nm）得到表面增强拉曼散射效应（这样可以有效避免和减少来自样品背景荧光的干扰）；

在其表面控制连接了被称为核酸适配体的特殊单链DNA（例如，对PCB77来说，其序列含有多个鸟嘌呤G，可能构成G四聚体结构，它可以特异性识别和捕获PCB77；

利用表面增强拉曼散射光谱，通过分析某些特征拉曼峰的光谱强度比值（例如，对PCB77的测量，可以用I(660cm^-1)/I(736cm^-1)，I(1457cm^-1)/I(736cm^-1)等光谱指标分析），从而实现对PCB的高灵敏度、高特异性、痕量、无损、定量检测；

本发明中制备的金包裹二氧化硅纳米颗粒形貌和粒径均一性好，其等离子体激元共振吸收出现在750nm处，在785nm^-1激光激发下有较强SERS增强效应；经过处理的单链DNA在基底的表面具有高度统一的状态，当适配体与PCB作用时，单链DNA会发生构象改变，其拉曼光谱强度变化的大小与被适配体捕获在金壳层表面的PCB数量成一定的比例关系，从而基于SERS技术可以做到对PCB特异性和定量化的测量。

附图说明

图1为基于表面增强拉曼散射光谱，对PCB进行定量检测技术路线示意图；

图2为用SEM、TEM和UV-Vis方法对金包裹二氧化硅核壳纳米颗粒进行表征；

图3a为加入不同浓度PCB77前后观测单链DNA的拉曼光谱变化及通过不同拉曼光谱谱带强度比值I(660cm^-1)/I(736cm^-1)I，(1457cm^-1)/I(736cm^-1)；

图3b为对PCB77进行定量检测（a：无PCB77，b：1*10^-6M PCB77, c：1*10^-5M PCB77, d：1*10^-4M PCB77）。

具体实施方式

实施例1

金包裹二氧化硅材料的基底制备及表征

首先,合成1-3nm金种子，在45mL的超纯水中加入0.5mL浓度为1.0M的氢氧化钠，紧接着加入50mM的THPC。在这里，THPC既做还原剂也用做表面活性剂。混合溶液剧烈搅拌5 min后，加入36µL浓度为1.0 M的氯金酸溶液。反应液的颜色立即从无色转变成深棕色，降低搅拌速度，继续搅拌15min。得到的反应液保存在4℃的冰箱里备用。然后，合成APTMS修饰的二氧化硅纳米纳米颗粒。对于制备二氧化硅纳米球，先把3mL的氨水溶液（30wt%）与50mL的纯酒精溶液混合，再加入1.5mL的TEOS溶液，混合溶液低速搅拌过夜。取10mL乳白色产物加入过量的APTMS（200µL），混合液在常温条件下搅拌过夜。为了增加APTMS在二氧化硅表面的连接效率，含有的APTMS与二氧化硅的混合液78℃水浴2h，不断的添加酒精溶液维持反应体积恒定。APTMS修饰的二氧化硅纳米粒子用酒精洗涤超声分散3次，最终溶解在6mL纯酒精中。之后，把金种子与二氧化硅连接。取150µL新鲜制备的APTMS修饰的二氧化硅溶液加入到20mL未稀释的金种子溶液中。为提高金种子和二氧化硅的连接量可以在反应液中加入一定量氯化钠溶液。混合液轻微摇晃10min后，静置12h。为除去未固定在二氧化硅表面的金种子，超纯水与酒精交替清洗制备好的材料，最终连接金种子的二氧化硅纳米粒子溶解在4mL的纯水中。

接着，进行金壳层生长。25mg的碳酸钾溶液加入到100mL的超纯水中搅拌10min，接着加入36µL浓度为1.0M的氯金酸溶液。30min后，反应液的颜色逐渐从淡黄色转变成无色透明，说明金溶胶离子化。反应液封口放置于4℃冰箱中冷藏备用。取10mL冷藏的氯金酸溶液，加入含有金种子修饰的二氧化硅纳米粒子的水溶液150µL，立即添加10µL还原剂甲醛，强烈搅拌，提高金溶液还原速率。反应溶液在15 min内从淡紫红色转变为深绿色，通过离心分离终止反应。最终得到的金包裹二氧化硅纳米材料，离心洗涤后在超纯水中保存。

然后，把这些金包裹二氧化硅核壳纳米颗粒固定在石英片上，制作成SiO₂@Au核壳纳米颗粒分散较均匀的SERS基底。为此，先把石英片浸泡在新鲜配制的水虎溶液(硫酸：过氧化氢=7：3)中2h，可以80℃水浴提高石英片表面羟基化的效率。得到的石英片用大量去离子水冲洗，氮气吹干。在20mL超纯水中滴加20µLAPTMS溶液，新鲜处理的石英片浸在APTMS溶液中15min后取出，酒精和水溶液交替冲洗，氮气吹干。氨基化的石英片浸没在新鲜制备的金包裹二氧化硅水溶液中，避光过夜处理。固定有材料的石英基片小心的用超纯水淋洗，自然晾干备用。

通过SEM、TEM及可见-紫外吸收光谱对制备的SiO₂@Au核壳纳米颗粒进行表征。由图2中的SEM图可以看出，核壳结构大小均一，每一个二氧化硅的表面均包裹有金壳层；由图2中单个的核壳结构的TEM照片可以确定氧元素、硅元素和金元素的分布。从元素的分布中可以看出，金元素处于氧元素及硅元素的外部，中间颜色较淡，氧元素和硅元素重叠，进一步说明金壳层包裹在二氧化硅的表面。另外，图2中的纳米颗粒的可见-紫外吸收光谱显示，其吸收峰在750nm附近。这样制得的材料可以和785nm激光共振，从而可以避开生物样品荧光，有利于单链DNA信号的检测。

用PCB适配体即单链DNA修饰SiO₂@Au核壳纳米颗粒

把能够识别PCB的适配体，即一种特殊序列的单链ssDNA进行连接到SiO2@Au核壳纳米颗粒的金壳表面上。不同PCB有不同适配体，一般可以通过SELEX技术得到其序列，如，对PCB72和PCB106，其适配体分别是：CGCTACACCTCGCCAGCAAATTGCCGCCCGCAGCCCTCTA和GGGACTCGAGACCCGTTCCGTTCTCCGCTTGCCCCACAAT等。在本实施方式举例中，我们以测量PCB77为例（下同），其适配体是GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG，我们为了把它连接到金表面，设计时在5’末端带有巯基，即：5’-SH-(CH2)6-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3’。这种适配体含有重复多个含有多个鸟嘌呤G，可能构成G四聚体的单链DNA。作为适配体，通过巯基连接到SiO₂@Au核壳纳米颗粒上。实验证明，通过调节适配体单链DNA的浓度，可以控制单链DNA在金属表面的数量及状态。

具体操作如下：把与PCB77作用的适配体单链ssDNA进行预备处理并连接到纳米颗粒的金壳层上。这里选取巯基修饰的含有40碱基的单链DNA，即：5’-SH-(CH2)6-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3’作为PCB77的适配体。巯基修饰的单链DNA在10mM的TCEP水溶液中孵育2h，利用NAP-5（GE healthcare）盐层析柱纯化去除过量的TCEP和盐离子。活化的单链DNA 通过紫外可见吸收光谱在260cm^-1吸收值处标定其浓度，单链DNA浓度控制在20µM。单链DNA经90℃水浴10-15min后，立即冰水浴30min。5 µL加热处理过的单链DNA样品滴加在新鲜制备的基底上，将基底放置于湿润的环境中，4℃保存过夜。连接好DNA的基底用纯水冲洗，去除非共价连接游离的单链DNA。基底浸没在10nM的巯基乙醇（MCH）水溶液中4h，MCH的处理可以降低DNA在材料表面的非特异性吸附并防止待测分子与金属材料的直接作用。MCH处理后的基片清水冲洗，氮气吹干。

PCB的SERS光谱检测与分析

对于水溶液中PCB，测量主要过程如下：把固定有巯基修饰的单链DNA的SERS基片浸泡在不同浓度的PCB水溶液中（10^-4M-10^-6M）8h，样品用清水冲洗干燥之后，然后利用XploRA (HORIBA JOBIN YVON)拉曼光谱仪进行拉曼光谱测量，测量激发光使用785nm激光。

以PCB77为例，单链DNA适配体与PCB77作用，其在SERS基底上的构象发生变化，由此而导致SERS光谱发生变化，结果如图3所示。拉曼光谱上主要出现660cm^-1(归属于鸟嘌呤的呼吸振动)，736cm^-1(归属于腺嘌呤的呼吸振动)，1341cm^-1(归属于单链DNA骨架的振动峰)，1457cm^-1(归属于腺嘌呤及单链DNA骨架的振动峰)等几个显著的拉曼峰，考察它们对应的比值，分析发现I(660cm^-1)/I(736cm^-1)，I(1457cm^-1)/I(736cm^-1)与被检测的PCB77浓度之间有确定的数值关系，如图3所示。利用此关系，我们可以对PCB77进行定量测量。实验中，我们将固定有巯基修饰的单链DNA（20µM）的基片浸泡在不同浓度的PCB77水溶液中（10^-4M-10^-6M）8h。在测量拉曼光谱之前，基片经超纯水冲洗去除未特异性相互作用的PCB77，自然晾干。当PCB77的浓度变化，对应的主要拉曼峰比值发生相应改变，证明本发明体系对PCB77有良好的检测效果。在图3中，PCB77的浓度在100μM到1μM范围内，均有良好的检测效果，并且检测极限可达1μM。

Claims

1. 一种可以定量检测多氯联苯的表面增强拉曼光谱的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）采用分步的方法制备均匀的金包裹二氧化硅纳米颗粒，其等离子体激元共振吸收在700nm-760nm之间，然后利用偶联剂将核壳结构纳米颗粒固定在石英玻璃片上构建SERS基底；

（2）将PCB的适配体在一端连接巯基，这样，可以通过巯基共价修饰连接到纳米颗粒的金壳层表面，连接过程中，可以通过调节DNA的浓度，控制DNA在金属表面的数量及状态；

（3）把制备的SERS基底浸泡在含有PCB的溶液中，等待足够时间后取出，用去离子水清洗，然后进行拉曼光谱测量，测量时，可用红外激光激发样品，通过分析特征拉曼峰的光谱强度比值I（660）/I(736)从而实现PCB定量检测。