CN103954607B - 一种测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法 - Google Patents

一种测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法 Download PDF

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Abstract

一种测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法，属于纳米生物技术检测技术领域。本发明15nm的金纳米粒子分别用捕获Hg2+的两个适配体序列修饰，金纳米粒子在Hg2+存在的条件下组装成链状结构，金纳米粒子链状结构用表面增强拉曼光谱（SERS）进行测定。本发明应用胸腺嘧啶-胸腺嘧啶（T-T）错配碱基组成的双链DNA对Hg2+的高选择性和高捕获能力，金纳米粒子组装成不同长度的链状结构，通过SERS信号对Hg2+进行检测。本方法对Hg2+检测的灵敏度高、特异性好、实用性强，是一种理想的痕量Hg2+超灵敏检测方法。

Description

一种测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法
技术领域
本发明涉及一种测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法，属于纳米生物技术检测技术领域。
背景技术
汞是一种普遍存在的环境污染物，其所有的氧化态都具有高毒性，污染源主要来自于人为汞的排放和自然环境。同时，汞也是一种累积性的污染物，它可以在人体重要的组织和器官积累，从而对人体健康造成严重的危害，特别是由汞中毒所导致的中枢神经系统、呼吸系统、肾脏、心脏和肌肉等方面的损伤。美国国家环境保护局设定的饮用水中Hg2+的最大允许限量为2ppb，因此开发高灵敏的Hg2+检测方法尤为重要。
基于仪器检测的传统方法主要包括冷蒸汽原子荧光光谱(CV-AFS)、原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体（ICP-MS）。虽然这些方法可以对Hg2+进行精确的检测，但是昂贵的仪器、复杂耗时的样品前处理操作程序和专业的操作人员要求，限制了这类方法的普遍应用。金纳米粒子具有独特的光学特性，包括：表面等离子共振、较高的吸收和消光系数以及依赖于粒径和距离的一些性质，使得金纳米粒子作为生物探针已广泛应用于基础和应用研究。作为等离子纳米粒子，金纳米粒子组装体作为SERS基底普遍用于SERS传感的构建，并且达到高灵敏的检测水平。
据报道由连续的胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配碱基组成的双链DNA对Hg2+表现出高选择性和高捕获能力，基于T-Hg2+-T碱基错配的多种传感器被建立，例如：比色传感器、荧光传感器、SERS传感器、表面等离子共振传感器、磁共振传感器等。
本发明是借助于T-Hg2+-T碱基错配作用将DNA探针修饰的金纳米粒子组装成金纳米粒子链状结构，在不同Hg2+浓度存在的条件下，链状结构的组装程度不同，随着Hg2+浓度的增加，组装程度越大，金纳米粒子链越长，从而SERS信号强度越强，根据SERS信号的强度与Hg2+浓度之间建立的对应关系，从而对Hg2+含量进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对Hg2+进行检测与定量的超灵敏SERS传感器方法，借助于T-Hg2+-T碱基错配作用将金纳米粒子探针组装成金纳米粒子链状结构，在不同浓度Hg2+存在的条件下，金纳米粒子的组装程度不同SERS信号强度有所差异，最后通过SERS光谱对组装体进行测定，从而间接检测目标Hg2+的含量。
本发明的技术方案，一种测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法，包括：15nm的金纳米粒子分别用捕获Hg2+的两个适配体序列修饰，金纳米粒子在Hg2+存在的条件下组装成链状结构，金纳米粒子链状结构用表面增强拉曼光谱（SERS）进行测定。
具体步骤为：
（1）15nm的金纳米粒子分别用捕获Hg2+的两个适配体序列修饰：将新合成的15nm的金纳米粒子在10000r/min的转速条件下通过离心浓缩十倍，然后将其重悬到0.01M的Tris-HCl缓冲液中，测得终浓度为20nM，以用于DNA的偶联；DNA的偶联在100μL的反应体系中进行，2μL4μM的DNA1及2μL4μM的DNA2分别加入到100μL20nM的金纳米粒子溶液中，使得DNA的终浓度均为80nM，DNA和金纳米粒子以4︰1的摩尔比进行偶联反应，在室温下孵育8h后，将样品在10000r/min的转速条件下进行离心，以除去未偶联的DNA分子，然后将纳米粒子再次重悬到0.01M的Tris-HCl缓冲液中，DNA修饰的金纳米粒子制备完成；
（2）金纳米粒子在Hg2+存在的条件下组装成链状结构：50μL的金纳米粒子-DNA1和50μL的金纳米粒子-DNA2以1︰1的摩尔比混合，然后在不同的反应管中同时分别加入不同浓度（0.001ngmL-1、0.005ngmL-1、0.01ngmL-1、0.05ngmL-1、0.1ngmL-1、0.2ngmL-1、0.5ngmL-1）的Hg2+，在不断振荡的状态下反应6h，借助于T-Hg2+-T错配碱基对Hg2+的识别和捕获作用，两条DNA链进行结合，同时偶联有DNA的金纳米粒子互相靠近，组装成不同长度的链状结构；
（3）金纳米粒子链状结构用SERS进行测定：在每个反应体系所对应的链状结构中加入1μL终浓度为2μM的信标分子4-硝基苯硫酚（4-NTP），经过12h的孵育，信标分子嵌入到金纳米粒子之间的间隙，然后在633nm的激发波长下用SERS光谱对组装结构进行检测；随着Hg2+浓度的增加，金纳米粒子的组装程度越大，金纳米粒子链越长，SERS信号强度越强，根据Hg2+浓度与SERS信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用SERS信号对Hg2+进行检测。
所述的15nm的金纳米粒子通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法进行合成，合成步骤：将三口瓶用王水浸泡过夜，然后用超纯水清洗干净，在洁净的三口瓶中加入194mL的超纯水，再加入5mL质量浓度为0.4%的氯金酸，磁力搅拌并加热沸腾，7-8min后加入5mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠，溶液从无色变为红色后停止加热，继续搅拌15min，即得到15nm金纳米粒子。
所述DNA1序列及DNA2序列为：
DNA1：5’-SH-AAAAAAGTGACCATTTTTGCAGTG-3’；
DNA2：5’-SH-AAAAAACACTGCTTTTTTGGTCAC-3’。
本发明的有益效果：本发明提供了一种对Hg2+进行检测与定量的SERS传感器方法，借助于T-Hg2+-T错配碱基作用将金纳米粒子探针组装成金纳米粒子链状结构，在不同浓度Hg2+存在的条件下，金纳米粒子的组装程度不同SERS信号强度有所差异，最后通过SERS光谱对组装体进行测定，从而间接检测目标Hg2+的含量。
附图说明
图1Hg2+检测的SERS光谱；
图2Hg2+检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法，15nm的金纳米粒子分别用捕获Hg2+的两个适配体序列修饰，金纳米粒子在Hg2+存在的条件下组装成链状结构，金纳米粒子链状结构用表面增强拉曼光谱（SERS）进行测定；具体步骤为：
（1）15nm的金纳米粒子分别用捕获Hg2+的两个适配体序列修饰：
将新合成的15nm的金纳米粒子在10000r/min的转速条件下通过离心浓缩十倍，然后将其重悬到0.01M的Tris-HCl缓冲液中，测得终浓度为20nM，以用于DNA的偶联；DNA的偶联在100μL的反应体系中进行，2μL4μM的DNA1和DNA2分别加入到100μL20nM的金纳米粒子溶液中，使得DNA的终浓度均为80nM，DNA和金纳米粒子以4︰1的摩尔比进行偶联反应，在室温下孵育8h后，将样品在10000r/min的转速条件下进行离心，以除去未偶联的DNA分子，然后将纳米粒子再次重悬到0.01M的Tris-HCl缓冲液中，DNA修饰的金纳米粒子制备完成；
DNA1:5’-SH-AAAAAAGTGACCATTTTTGCAGTG-3’,
DNA2:5’-SH-AAAAAACACTGCTTTTTTGGTCAC-3’；
（2）金纳米粒子在Hg2+存在的条件下组装成链状结构：50μL的金纳米粒子-DNA1和50μL的金纳米粒子-DNA2以1︰1的摩尔比混合，然后在不同的反应管中同时分别加入不同浓度（0.001ngmL-1、0.005ngmL-1、0.01ngmL-1、0.05ngmL-1、0.1ngmL-1、0.2ngmL-1、0.5ngmL-1）的Hg2+，在不断振荡的状态下反应6h，借助于T-Hg2+-T错配碱基对Hg2+的识别和捕获作用，两条DNA链进行结合，同时偶联有DNA的金纳米粒子互相靠近，组装成不同长度的链状结构；
（3）金纳米粒子链状结构用SERS进行测定：在每个反应体系所对应的链状结构中加入1μL终浓度为2μM的信标分子4-硝基苯硫酚（4-NTP），经过12h的孵育，信标分子嵌入到金纳米粒子之间的间隙，然后在633nm的激发波长下用SERS光谱对组装结构进行检测；随着Hg2+浓度的增加，金纳米粒子的组装程度越大，金纳米粒子链越长，SERS信号强度越强，根据Hg2+浓度与SERS信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用SERS信号对Hg2+进行检测。
（4）检测灵敏度研究：根据每个目标Hg2+浓度下对应的SERS信号强度，在0.001-0.5ngmL-1的Hg2+浓度范围内，以Hg2+浓度为横坐标，SERS信号强度为纵坐标做出一条标准曲线，根据标准曲线计算出Hg2+的检测限为0.45pgmL-1。
（5）特异性研究：通过测定其它六种重金属离子（Zn2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Pb2+、Mn2+）SERS强度分析此方法的特异性。在0.5ngmL-1的检测浓度下，Hg2+的拉曼强度与其它几种重金属离子的拉曼强度相比表现出明显的增强，从而表明了在其它几种重金属离子存在的条件下，纳米粒子组装体没有形成，进一步说明了其它重金属离子没有与T-T错配碱基相互作用，导致SERS强度没有增强效果。因此，此方法对Hg2+检测的特异性较高。Hg2+检测的SERS光谱如图1所示。
（6）添加回收实验：在含有0.01ngmL-1Hg2+的饮用水中，测定了添加不同浓度Hg2+后的添加回收结果，在0.15、0.08、0.04、0.007和0.002ngmL-1的添加浓度下，Hg2+的回收率在97.1%-98.3%范围内，回收结果表明此方法可以用于实际水样品中的Hg2+含量分析。Hg2+检测的标准曲线如图2所示。

Claims (2)

1.一种测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法，其特征在于步骤为：
（1）金纳米粒子的修饰：将新合成的15nm的金纳米粒子在10000r/min的转速条件下通过离心浓缩十倍，然后将其重悬到0.01M的Tris-HCl缓冲液中，测得终浓度为20nM，以用于DNA的偶联；DNA的偶联在100μL的反应体系中进行，2μL4μM的DNA1及2μL4μM的DNA2分别加入到100μL20nM的金纳米粒子溶液中，使得DNA的终浓度均为80nM，DNA和金纳米粒子以4︰1的摩尔比进行偶联反应，在室温下孵育8h后，将样品在10000r/min的转速条件下进行离心，以除去未偶联的DNA分子，然后将纳米粒子再次重悬到0.01M的Tris-HCl缓冲液中，即得到DNA修饰的金纳米粒子；
所述DNA1序列及DNA2序列为：
DNA1：5’-SH-AAAAAAGTGACCATTTTTGCAGTG-3’；
DNA2：5’-SH-AAAAAACACTGCTTTTTTGGTCAC-3’；
（2）金纳米粒子链状结构的组装：取步骤（1）制备的50μL的金纳米粒子-DNA1和50μL的金纳米粒子-DNA2以1︰1的摩尔比混合，然后在不同的反应管中同时分别加入不同浓度：0.001ngmL-1、0.005ngmL-1、0.01ngmL-1、0.05ngmL-1、0.1ngmL-1、0.2ngmL-1、0.5ngmL-1的Hg2+，在不断振荡的状态下反应6h，借助于T-Hg2+-T错配碱基对Hg2+的识别和捕获作用，两条DNA链进行结合，同时偶联有DNA的金纳米粒子互相靠近，组装成不同长度的链状结构；
（3）金纳米粒子链状结构的SERS测定：在步骤（2）所得每个反应体系所对应的链状结构中加入1μL终浓度为2μM的信标分子4-硝基苯硫酚4-NTP，经过12h的孵育，信标分子嵌入到金纳米粒子之间的间隙，然后在633nm的激发波长下用SERS光谱对组装结构进行检测；随着Hg2+浓度的增加，金纳米粒子的组装程度越大，金纳米粒子链越长，SERS信号强度越强，根据Hg2+浓度与SERS信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用SERS信号对Hg2+进行检测。
2.根据权利要求1所述测定Hg2+的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器的构建方法，其特征在于所述的15nm的金纳米粒子的合成：将三口瓶用王水浸泡过夜，然后用超纯水清洗干净，在洁净的三口瓶中加入194mL的超纯水，再加入5mL质量浓度为0.4%的氯金酸，磁力搅拌并加热沸腾，7-8min后加入5mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠，溶液从无色变为红色后停止加热，继续搅拌15min，即得到15nm金纳米粒子。
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