CN103293109A - 光学无标记血清学检测方法及其系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫学检测领域,公开了一种光学无标记血清学检测方法及其系统。本发明中,将多孔硅光学微谐振腔生物传感器作为换能器产生对生物分子敏感的响应光信号,通过采集包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号和捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号,根据第一光信号和第二光信号的比较结果,得到检测结果。由于无需对检测对象进行添加标记处理,对试剂需求量少,降低了检测的复杂度和成本。并且,基于硅工艺制备,成本低,方便集成于手持设备中,而且响应速度快,能迅速得到检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域,特别涉及利用生物传感器的血清学检测技术。
背景技术
血清学检测是一种相对快速且低成本的疾病检测方法,已被广泛应用在结核病的检测中。
结核病是当今世界威胁人类健康的一大难题。据估计,全球约1/3的人口感染结核病,其中,大部分患者身处第三世界国家。目前,两种最常用的血清学检测方法分别是酶联法检测和微球悬浮检测。
然而,无论是酶联法检测,还是微球悬浮检测,都是基于标记检测。而标记检测存在操作复杂且信号可靠性低等缺陷。因此,开发一种快速且低成本的血清学检测已成为当今世界的紧要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光学无标记血清学检测方法及其系统,使得血清学的检测能够免于标记,有效降低了检测成本和操作复杂度,同时提高了检测的灵敏度。
为解决上述技术问题,本发明的实施方式提供了一种光学无标记血清学检测方法,包含以下步骤:
提供一多孔硅光学微谐振腔生物传感器;
将所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器包被生物探针分子;
采集所述包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号;
利用所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器捕获目标生物分子;
采集所述捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号;
根据所述第一光信号和所述第二光信号的比较结果,得到检测结果。
本发明的实施方式还提供了一种光学无标记血清学检测系统,包含:多孔硅光学微谐振腔生物传感器、光信号采集器和计算机;
所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器用于包被生物探针分子和捕获目标生物分子;
所述光信号采集器用于采集所述包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号,和采集所述捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号;
所述计算机用于对所述光信号采集器采集的第一光信号和所述第二光信号进行比较,并根据所述比较结果,得到检测结果。
本发明实施方式相对于现有技术而言,将多孔硅光学微谐振腔(microcavity)生物传感器作为换能器产生对生物分子敏感的响应光信号,通过采集包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号和捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号,根据第一光信号和第二光信号的比较结果,得到检测结果。由于无需对检测对象进行添加标记处理,对试剂需求量少,降低了检测的复杂度和成本。并且,基于硅工艺制备,成本低,方便集成于手持设备中,而且响应速度快,能迅速得到检测结果。
优选地,通过以下方式将多孔硅光学微谐振腔生物传感器包被生物探针分子:
A、氧化所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器的多孔硅微谐振腔薄膜表面;
B、对所述多孔硅微谐振腔薄膜表面进行硅烷化处理;
C、对所述多孔硅微谐振腔薄膜表面进行醛基化处理;
D、在所述多孔硅微谐振腔薄膜表面附着符合检测需求的生物探针分子。
实现简单,保证了检测的低复杂度和低成本。
附图说明
图1是根据本发明第一实施方式的光学无标记血清学检测方法流程图;
图2是根据本发明第一实施方式中的多孔硅光学微谐振腔生物传感器的结构示意图;
图3是根据本发明第一实施方式中的实现多孔硅光学微谐振腔生物传感器的生物功能化的流程图;
图4是根据本发明第一实施方式中的在多孔硅光学微谐振腔生物传感器中附着生物探针分子的流程图;
图5是根据本发明第二实施方式的光学无标记血清学检测系统的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而,本领域的普通技术人员可以理解,在本发明各实施方式中,为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是,即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改,也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
本发明的第一实施方式涉及一种光学无标记血清学检测方法。具体流程如图1所示。
在步骤110中,提供一多孔硅光学微谐振腔生物传感器,将多孔硅光学微谐振腔生物传感器包被生物探针分子,使得该多孔硅光学微谐振腔生物传感器生物功能化。
具体地说,本实施方式中提供的多孔硅光学微谐振腔生物传感器为N型多孔硅光学微谐振腔生物传感器,包括上布拉格(Bragg)反射镜、下布拉格反射镜以及夹在上布拉格反射镜和下布拉格反射镜之间的缺陷层。其结构如图2所示,由上Bragg反射镜1、下Bragg反射镜2以及它们所夹的缺陷层3构成,上布拉格反射镜和下布拉格反射镜分别包括:周期循环交替排列的高折射率层4和低折射率层5(如五个周期循环交替排列的高折射率层和低折射率层)。低折射率层也可表述为高多孔率层,由40mA/cm2的电流密度腐蚀而成;高折射率层也可表述为低多孔率层,由30mA/cm2的电流密度腐蚀而成,缺陷层是高折射率层4的厚度的2倍。
在本步骤中,具体可通过以下步骤将多孔硅光学微谐振腔生物传感器包被生物探针分子,即实现多孔硅光学微谐振腔生物传感器的生物功能化:
如图3所示,在步骤301中,氧化该多孔硅光学微谐振腔生物传感器的多孔硅微谐振腔薄膜表面。比如说,将N型多孔硅微谐振腔薄膜的氧化温度设为500℃,氧化时间设为30分钟,氧化多孔硅微谐振腔薄膜表面。
接着,在步骤302中,对该多孔硅微谐振腔薄膜表面进行硅烷化处理。比如说,将N型多孔硅微谐振腔薄膜浸泡于4%的3-APTES(3氨基丙基三乙氧基硅烷)溶液中20分钟,其中,4%的3-APTES溶液可由99%分析纯3-APTES溶液、去离子水以及95%分析纯酒精按体积比1:12.5:11.5混合而成。然后,将N型多孔硅微谐振腔薄膜取出,用去离子水冲洗,高纯氮气吹干,接着,将N型多孔硅微谐振腔薄膜置于100℃环境下进行表面固化处理(如将N型多孔微谐振腔薄膜置于100℃下烘培10分钟),完成该多孔硅微谐振腔薄膜表面的硅烷化处理。
接着,在步骤303中,对该多孔硅微谐振腔薄膜表面进行醛基化处理。具体地说,首先,将N型多孔硅微谐振腔薄膜浸泡于5%的戊二醛溶液中30分钟。其中,5%的戊二醛溶液可由50%的分析纯戊二醛溶液和pH=7.4的PBS溶液按体积比1:9混合而成。然后,将N型多孔硅微谐振腔薄膜取出,用pH=7.4的PBS缓冲液清洗并用氮气吹干。接着,将N型多孔硅微谐振腔薄膜浸泡于pH=7.4的PBS缓冲液中10分钟,以去除未反应的戊二醛分子。最后,将N型多孔硅微谐振腔薄膜取出,用pH=7.4的缓冲液清洗,并用氮气吹干,完成多孔硅微谐振腔薄膜表面的醛基化处理。
接着,在步骤304中,在该多孔硅微谐振腔薄膜表面附着符合检测需求的生物探针分子。在实际应用中,可采用以下方式附着所述生物探针分子:共价键链接、静电吸附、分子间相互作用力吸附。下面介绍一种具体地附着所述生物探针分子的实现方案:
如图4所示,在步骤401中,将多孔硅微谐振腔薄膜在探针分子溶液中浸泡预定的第一时长,如浸泡1至2小时(优选地,可浸泡1.5小时)。
接着,在步骤402中,将N型多孔硅微谐振腔薄膜取出,用缓冲液清洗并用高纯氮气吹干。比如说,将N型多孔硅微谐振腔薄膜取出,用pH=7.4的PBS缓冲液冲洗,并用氮气吹干。当然,也可以用其他缓冲液,在此不一一赘述。
接着,在步骤403中,将该多孔硅微谐振腔薄膜在缓冲液中浸泡预定的第二时长,第二时长为5至20分钟。比如说,将N型多孔硅微谐振腔薄膜浸泡在pH=7.4的PBS缓冲液中10分钟,以去除未反应的探针分子。
接着,在步骤404中,利用缓冲液冲洗取出的多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干。也就是说,将N型多孔硅微谐振腔薄膜取出,用pH=7.4的PBS缓冲液冲洗并用氮气吹干。
本领域技术人员可以理解,如图3所示的流程,只是一种具体的将探针分子包被在多孔硅表面(用于后续的捕获目标分子)的实现方式,但在实际应用中,也可以通过其他方式将探针分子包被在多孔硅表面用以捕获目标分子。比如说,不需要氧化多孔硅,而是在多孔硅表面硅氢键基础上,通过紫外光激发生物探针分子上的活性基团与硅氢键的化学反应来直接嫁接生物探针分子。
类似地,如图4所示的流程,也只是一种具体地在多孔硅微谐振腔薄膜表面附着符合检测需求的生物探针分子的实现方式,在实际应用中,也可以通过其他方式实现,如氧化多孔硅后,通过表面吸附作用将生物探针分子直接附着在多孔硅表面上。
在完成该多孔硅光学微谐振腔生物传感器的生物功能化后,进入步骤120,采集包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号。具体地,可通过光信号采集器(如光谱仪或者成像仪)得到植入探针后的N型多孔硅微谐振腔的光谱以及光谱谐振谷所在波长。
接着,在步骤130中,利用多孔硅光学微谐振腔生物传感器捕获目标生物分子。
具体地说,首先,在多孔硅光学微谐振腔生物传感器的多孔硅微谐振腔薄膜表面,滴加带有目标生物分子的待测溶液,并静置预设的第三时长。然后,用缓冲液冲洗所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器的多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干。接着,将所述多孔硅微谐振腔薄膜浸泡在所述缓冲液中,所述浸泡的时间为预设的第四时长。最后,利用所述缓冲液冲洗取出的所述多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干。其中,第三时长可为1至2小时,第四时长可为5至20分钟,缓冲液仍为pH值为7.4的磷酸盐PBS缓冲液。
接着,在步骤140中,采集捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号。与步骤120类似,仍可通过光信号采集器得到捕获目标生物分子后的的N型多孔硅微谐振腔薄膜的光谱以及光谱谐振谷所在波长。
接着,在步骤150中,根据在步骤120中得到的第一光信号和在步骤140中得到的第二光信号的比较结果,得到检测结果。比如说,通过测量多孔硅光学微谐振腔在生物分子结合前后的反射光谱中的谐振谷所在波长的变化,或者固定波长处的反射率变化,检测生物分子。本实施方式中的目标生物分子包含以下任意类型的生物分子:蛋白质、疾病标志物、抗原抗体。
下面以检测的生物分子为抗16kDa抗体为例进行具体说明。
在步骤110中,将多孔硅光学微谐振腔生物传感器包被生物探针分子,使得该多孔硅光学微谐振腔生物传感器生物功能化。在本步骤中,通过以下子步骤对N型多孔硅微谐振腔薄膜表面植入相应探针:
1、在N型多孔硅微谐振腔薄膜表面滴加20μL浓度为314μg/mL的16kDa抗原溶液,静置1.5小时;
2、用pH=7.4的PBS缓冲液清洗N型多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干;
3、将N型多孔硅微谐振腔薄膜浸泡于pH=7.4的PBS溶液中10分钟,以去除未反应的16kDa抗原分子;
4、用pH=7.4的PBS缓冲液清洗N型多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干。
接着,在步骤120中,通过光信号采集器(如光谱仪或者成像仪)得到植入探针后的N型多孔硅微谐振腔的光谱以及光谱谐振谷所在波长。
接着,在步骤130中,通过以下步骤捕获目标生物分子:
1、在已植入探针分子的N型多孔硅微谐振腔薄膜表面滴加20μL待测溶液,并静置1.5小时;
2、用pH=7.4的PBS缓冲液冲洗N型微谐振腔薄膜并用氮气吹干;
3、将N型多孔硅微谐振腔薄膜浸泡于pH=7.4的PBS缓冲液中10分钟,以去除未反应的抗16kDa抗体分子;
4、将N型多孔硅微谐振腔薄膜取出,用pH=7.4的PBS缓冲液冲洗并用氮气吹干。
接着,在步骤140中,通过光信号采集器得到被待测溶液浸泡后的N型多孔硅微谐振腔薄膜的光谱以及光谱谐振谷所在的波长。
接着,在步骤150中,将在步骤140中所得光谱以及光谱谐振谷所在的波长与添加完探针分子后在步骤120中得到的光谱以及光谱谐振谷所在的波长进行比较。如果光谱没有发生红移,则说明待测溶液中不含有抗16kDa抗体,如果光谱发生红移,则说明待测溶液中含有抗16kDa抗体,并能通过红移的幅度判断待测溶液中抗16kDa抗体的浓度。
类似地,如果检测的生物分子为16kDa抗原,则可采用类似的方法实现无标记的血清学检测:
在步骤110中,将多孔硅光学微谐振腔生物传感器包被生物探针分子,使得该多孔硅光学微谐振腔生物传感器生物功能化。在本步骤中,通过以下子步骤对N型多孔硅微谐振腔薄膜表面植入相应探针:
1、在N型多孔硅微谐振腔薄膜表面滴加20μL浓度为730μg/mL的抗16kDa抗体溶液。静置1.5小时;
2、用pH=7.4的PBS缓冲液清洗N型多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干;
3、将N型多孔硅微谐振腔薄膜浸泡于pH=7.4的PBS溶液中10分钟,以去除未反应的抗16kDa抗体分子;
4、用pH=7.4的PBS缓冲液清洗N型多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干。
接着,在步骤120中,通过光信号采集器得到植入探针后的N型多孔硅微谐振腔的光谱以及光谱谐振谷所在波长。
接着,在步骤130中,通过以下步骤捕获目标生物分子:
1、在已植入探针分子的N型多孔硅微谐振腔薄膜表面滴加20μL待测溶液,并静置1.5小时;
2、用pH=7.4的PBS缓冲液冲洗N型微谐振腔薄膜并用氮气吹干;
3、将N型多孔硅微谐振腔薄膜浸泡于pH=7.4的PBS缓冲液中10分钟,以去除未反应的16kDa抗原分子;
4、将N型多孔硅微谐振腔薄膜取出,用pH=7.4的PBS缓冲液冲洗并用氮气吹干。
接着,在步骤140中,通过光信号采集器得到被待测溶液浸泡后的N型多孔硅微谐振腔薄膜的光谱以及光谱谐振谷所在的波长。
接着,在步骤150中,将所得光谱以及光谱谐振谷所在的波长与添加完探针分子后的光谱以及光谱谐振谷所在的波长进行比较。如果光谱没有发生红移,则说明待测溶液中不含有16kDa抗原,如果光谱发生红移,则说明待测溶液中含有16kDa抗原,并能通过红移的幅度判断待测溶液中16kDa抗原的浓度。
当然,在实际应用中,还可以本实施方式中的方法对各种生物分子进行检测,在此不再赘述。另外,本实施方式中是以N型多孔硅光学微谐振腔生物传感器为例进行说明,在实际应用中,也可以是其他类型的多孔硅光学微谐振腔生物传感器,实现方式与本实施方式类似,在此不再赘述。
与现有技术相比较,由于是将多孔硅光学微谐振腔生物传感器作为换能器产生对生物分子敏感的响应光信号,根据光信号的变化得到检测结果。因此无需对检测对象进行添加标记处理,对试剂需求量少,降低了检测的复杂度和成本。并且,基于硅工艺制备,成本低,方便集成于手持设备中,而且响应速度快,能迅速得到检测结果。
总的来说,本实施方式具备以下优势:
(1)无需标记且系统结构简单,能够迅速得到检测结果。
(2)由于多孔硅具有海绵状结构,比表面积大,能够与检测分子发生充分的相互作用,系统灵敏度高。
(3)可以根据检测的目标分子植入相应的探针分子,易于调节且特异性好。
(4)支持多通道检测,数据处理量大。
上面方法的步骤划分,只是为了描述清楚,实现时可以合并为一个步骤或者对某些步骤进行拆分,分解为多个步骤,只要包含相同的逻辑关系,都在本专利的保护范围内;对算法中或者流程中添加无关紧要的修改或者引入无关紧要的设计,但不改变其算法和流程的核心设计都在该专利的保护范围内。
本发明的第二实施方式涉及一种光学无标记血清学检测系统。如图5所示,本实施方式的光学无标记血清学检测系统包含:多孔硅光学微谐振腔生物传感器11、光信号采集器22和计算机33。多孔硅光学微谐振腔生物传感器作为换能器产生对生物分子敏感的响应光信号,光信号采集器收集并处理响应光信号后将数据传送到计算和存储设备,并显示检测结果。
具体地说,多孔硅光学微谐振腔生物传感器用于包被生物探针分子和捕获目标生物分子。光信号采集器用于采集所述包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号,和采集所述捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号。计算机用于对所述光信号采集器采集的第一光信号和所述第二光信号进行比较,并根据所述比较结果,得到检测结果。
在本实施方式中,多孔硅光学微谐振腔生物传感器包括:
上布拉格反射镜1、下布拉格反射镜2以及夹在上布拉格反射镜和下布拉格反射镜之间的缺陷层3;
所述上布拉格反射镜和下布拉格反射镜分别包括:周期循环交替排列的高折射率层4和低折射率层5。
优选地,上布拉格反射镜和下布拉格反射镜分别包括五个周期循环交替排列的高折射率层和低折射率层。缺陷层厚度为所述高折射率层的厚度的2倍。当然,在实际应用中,布拉格反射镜和下布拉格反射镜中循环交替排列的高折射率层和低折射率层,也可以是其他周期,如四个周期,而且,缺陷层厚度为所述高折射率层的厚度的1.5倍或其他倍数,在此不一一例举。
另外,值得一提的是,本实施方式中的计算机为包含数据处理功能的广义上的计算机,可以是一台独立的具有数据处理功能的计算机,也可以是嵌入式处理器。
不难发现,本实施方式为与第一实施方式相对应的系统实施例,本实施方式可与第一实施方式互相配合实施。第一实施方式中提到的相关技术细节在本实施方式中依然有效,为了减少重复,这里不再赘述。相应地,本实施方式中提到的相关技术细节也可应用在第一实施方式中。
本领域的普通技术人员可以理解,上述各实施方式是实现本发明的具体实施例,而在实际应用中,可以在形式上和细节上对其作各种改变,而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (12)
1.一种光学无标记血清学检测方法,其特征在于,包含以下步骤:
提供一多孔硅光学微谐振腔生物传感器;
将所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器包被生物探针分子;
采集所述包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号;
利用所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器捕获目标生物分子;
采集所述捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号;
根据所述第一光信号和所述第二光信号的比较结果,得到检测结果。
2.根据权利要求1所述的光学无标记血清学检测方法,其特征在于,将所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器包被生物探针分子的步骤中,包含以下子步骤:
A、氧化所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器的多孔硅微谐振腔薄膜表面;
B、对所述多孔硅微谐振腔薄膜表面进行硅烷化处理;
C、对所述多孔硅微谐振腔薄膜表面进行醛基化处理;
D、在所述多孔硅微谐振腔薄膜表面附着符合检测需求的生物探针分子。
3.根据权利要求2所述的光学无标记血清学检测方法,其特征在于,在所述子步骤D中,采用以下方式附着所述生物探针分子:
共价键链接、静电吸附、分子间相互作用力吸附。
4.根据权利要求2所述的光学无标记血清学检测方法,其特征在于,所述子步骤D中,包含以下步骤:
D1、将多孔硅微谐振腔薄膜在探针分子溶液中浸泡预定的第一时长;
D2、利用缓冲液冲洗取出的多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干;
D3、将所述多孔硅微谐振腔薄膜在所述缓冲液中浸泡预定的第二时长;
D4、利用所述缓冲液冲洗取出的所述多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干。
5.根据权利要求4所述的光学无标记血清学检测方法,其特征在于,
所述第一时长为1至2小时;
所述第二时长为5至20分钟;
所述缓冲液为pH值为7.4的磷酸盐PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的光学无标记血清学检测方法,其特征在于,利用所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器捕获目标生物分子的步骤中,包含以下子步骤:
在所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器的多孔硅微谐振腔薄膜表面,滴加带有所述目标生物分子的待测溶液,并静置预设的第三时长;
用缓冲液冲洗所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器的多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干;
将所述多孔硅微谐振腔薄膜浸泡在所述缓冲液中,所述浸泡的时间为预设的第四时长;
利用所述缓冲液冲洗取出的所述多孔硅微谐振腔薄膜,并用氮气吹干。
7.根据权利要求6所述的光学无标记血清学检测方法,其特征在于,
所述第三时长为1至2小时;
所述第四时长为5至20分钟;
所述缓冲液为pH值为7.4的磷酸盐PBS缓冲液。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的光学无标记血清学检测方法,其特征在于,所述比较结果为所述第一光信号和所述第二光信号的光谱比较结果。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的光学无标记血清学检测方法,其特征在于,所述目标生物分子包含以下任意类型的生物分子:
蛋白质、疾病标志物、抗原抗体。
10.一种光学无标记血清学检测系统,其特征在于,包含:多孔硅光学微谐振腔生物传感器、光信号采集器和计算机;
所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器用于包被生物探针分子和捕获目标生物分子;
所述光信号采集器用于采集所述包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号,和采集所述捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号;
所述计算机用于对所述光信号采集器采集的第一光信号和所述第二光信号进行比较,并根据所述比较结果,得到检测结果。
11.根据权利要求10所述的光学无标记血清学检测系统,其特征在于,所述多孔硅光学微谐振腔生物传感器包括:
上布拉格反射镜、下布拉格反射镜以及夹在上布拉格反射镜和下布拉格反射镜之间的缺陷层;
所述上布拉格反射镜和下布拉格反射镜分别包括:周期循环交替排列的高折射率层和低折射率层。
12.根据权利要求11所述的光学无标记血清学检测系统,其特征在于,
所述上布拉格反射镜和下布拉格反射镜分别包括五个周期循环交替排列的高折射率层和低折射率层;
所述缺陷层厚度为所述高折射率层的厚度的2倍。
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- 2012-07-03 CN CN2012102286019A patent/CN103293109A/zh active Pending
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