CN105424663A - 一种基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法，1）构建光纤免疫传感检测系统；2）标准抑制曲线的建立；2.1）将荧光标记抗体溶液与已知浓度的邻苯二甲酸酯类化合物标准溶液混合，预反应后输入光纤免疫传感检测系统，得到响应信号；2.2）改变邻苯二甲酸酯类化合物浓度，重复步骤2.1），得到不同浓度下的响应信号；2.3）根据浓度对数值和抑制率绘制标准抑制曲线；3.1）将待测邻苯二甲酸酯类化合物重复步骤2.1），得到响应信号和抑制率；3.2）根据标准抑制曲线，即可获得待测邻苯二甲酸酯类化合物的浓度。本方法可以同时检测多种PAEs，且具有较高的灵敏度和精密度，检测快速。

Description

一种基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法

技术领域

本发明涉及邻苯二甲酸酯类化合物的检测，具体涉及一种基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

邻苯二甲酸酯类化合物（phthalateesters，PAEs）又名酞酸酯，作为增塑剂被广泛应用于工业生产和塑料制品中，可提高塑料制品的塑性和强度。PAEs一般为无色透明的油状粘稠液体，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇和乙醚等有机溶剂，属于难挥发、中等极性、高脂溶性物质。在塑料制品中PAEs与塑料分子的相容性较好，二者间不能形成有效的化学键合，而是通过氢键或范德华力连接，彼此保持各自独立的化学性质。PAEs是环境内分泌干扰物，进入动物体内会产生类雌激素作用，阻止与动物生殖和发育有关的激素的合成、分泌、贮存、运输、结合和清除等过程，干扰血液维持正常的激素水平，具有致癌性、致畸性和致突变性。

目前，国内外检测PAEs的主要方法有气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法联用（GC-MS）、高效液相色谱法（HLPC）和酶联免疫吸附法（ELISA）等。仪器分析方法的样品前处理步骤复杂、操作繁琐，导致检测成本高、周期长，无法满足批量样品的快速筛查和现场检测的实际要求。ELISA法存在重现性较低、稳定性较差等问题，测定结果容易受外部环境和人为因素的影响，并且不能用于现场快速分析。将荧光免疫分析与光纤传感技术结合的光纤免疫传感技术具有操作简便、易于仪器化和可以实时监测等特点，能够弥补ELISA法的不足。

现有免疫分析方法的线性范围较窄、灵敏度较低，制备的抗体只能检测单一PAEs，不能满足同时检测多种PAEs的实际需要。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法，本方法可以同时检测多种PAEs，即能够得到试样中所有PAEs的总浓度，且具有较高的灵敏度和精密度，样品仅需简单提取，检测快速。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法，步骤如下，

1）光纤免疫传感检测系统的构建；

光纤免疫传感检测系统包括激光发射装置、用于光路传递的非对称光纤耦合器、光纤探头、样品池、荧光滤光片、光电二极管、锁相放大器和计算机，非对称光纤耦合器由单模光纤和多模光纤构成；非对称光纤耦合器的多模光纤一端通过光纤连接器接光纤探头，多模光纤另一端朝向荧光滤光片；光纤探头置于样品池中，光纤探头表面附着有包被原；

2）光纤免疫传感检测标准抑制曲线的建立；

2.1）将600μL浓度为0.5μg·mL^-1的荧光标记抗体溶液与600μL某已知浓度的邻苯二甲酸酯类化合物标准溶液混合，其中抗体为可与多种邻苯二甲酸酯类化合物特异性结合的广谱性抗体，预反应5min；再用蠕动泵将该混合液以0.3mL·min^-1的速度输入到样品池，持续2min，继续反应6min，使得光纤探头表面抗原与荧光标记抗体结合；启动激光发射装置，发出的激光依次通过非对称光纤耦合器的单模光纤和多模光纤、光纤连接器，进入光纤探头，在光纤探头表面产生倏逝波，倏逝波激发探头表面的荧光物质产生荧光；部分荧光耦合回光纤探头，经光纤连接器进入非对称光纤耦合器的多模光纤，并从多模光纤的另一端射出；射出的荧光经荧光滤光片滤除反射的激发光后，绝大部分荧光透过，透过的荧光经雪崩光电二极管探测并将光信号转换为电信号，电信号经锁相放大器放大后，由计算机采集并进行数据处理，从而得到与已知浓度的该邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号；

2.2）改变邻苯二甲酸酯类化合物浓度，重复步骤2.1），得到不同已知浓度下的该邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号；

2.3）以该邻苯二甲酸酯类化合物的浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准抑制曲线；抑制率指该邻苯二甲酸酯类化合物抑制时的响应信号值与无抑制时的响应信号值之比；无抑制时的响应信号值即步骤2.1）中邻苯二甲酸酯类化合物的浓度为0时的响应信号值；

3）待测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的检测；

3.1）将已知浓度的邻苯二甲酸酯类化合物替换为待测邻苯二甲酸酯类化合物，然后重复步骤2.1），得到待测邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号，计算获得抑制率；

3.2）根据光纤免疫传感检测标准抑制曲线上横坐标和纵坐标的对应关系，找到与待测邻苯二甲酸酯类化合物抑制率对应的浓度对数值，即可获得待测邻苯二甲酸酯类化合物的浓度。

所述激光发射装置的光源波长为650nm、输出功率为8mW；光纤探头与非对称光纤耦合器的多模光纤为同种光纤；激光发射装置为脉冲激光发射装置，其脉冲信号由脉冲信号发生器提供，该脉冲信号同时为锁相放大器提供相同频率的参考信号。

所述光纤探头按如下方法制作得到，

1.1）去除多模石英光纤一端的涂覆层，将去除涂覆层的裸露光纤放入质量浓度为30%的HF溶液中腐蚀适当时间，以得到所需锥角度的组合型探头，锥型部分的长度约为0.5cm，锥角度为45o；

1.2）将步骤1.1）得到的组合型探头浸入浓H₂SO₄:H₂O₂体积比为3:1的Piranha溶液中0.5h后，放入超声波清洗仪中清洗，再用超纯水充分清洗，直至清洗液的pH为中性，最后在室温下用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用；

1.3）将1.2）清洗干燥的探头放入质量浓度为2%的3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液（MTS，溶于甲苯）中反应2h，用甲苯清洗3次；然后将探头置于浓度为0.02mol·L^-1的N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺-丁酸酯溶液（GMBS，溶于乙醇）中反应1h，用乙醇冲洗3次；再用pH为7.4、浓度为0.01mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗干净；将硅烷化后的探头放入0.05mg·mL^-1的包被原中反应2h，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后，再放入2mg·mL^-1牛血清蛋白（BSA）溶液中20min，以封闭非特异性吸附位点，得到表面附着有包被原的光纤探头，最后在4℃冰箱中保存备用。

在按步骤2.1）进行光纤探头响应检测时，所述光纤探头检测一次后进行再生处理，以用于下次检测；再生处理过程为：将0.25μg·mL^-1的荧光标记抗体以0.3mL·min^-1流速输入样品池，反应6min；再用浓度为2mg·mL^-1的胃蛋白酶溶液（pH1.9）以0.3mL·min^-1流速输入样品池，冲洗4min；再用体积比50:50:1的乙腈、超纯水和丙酸混合液冲洗30s，最后用磷酸盐缓冲溶液冲洗2min；

重复上述过程一次，再生后的光纤探头即可用于下次检测。

本发明根据光波在光纤内以全反射方式传输时，在光纤免疫传感探头接触的介质中产生倏逝波，激发探头表面标记在抗体或抗原分子上的荧光物质，结合免疫反应原理，可实现待测物质的定量检测。本发明利用可与多种PAEs特异性结合的广谱性抗体，建立光纤免疫传感检测技术，并应用于设施菜地土壤中PAEs的快速灵敏检测。

本发明在最佳的免疫传感检测条件下，获得邻苯二甲酸二甲酯（DMP）的半数抑制浓度（IC₅₀）为9.54ng·mL^-1，检出限为0.147ng·mL^-1，线性范围为0.22~145ng·mL^-1。抗体对邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二正辛酯（DnOP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）、邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）和邻苯二甲酸二壬酯（DNP）具有较高的交叉反应率（16.63%~71.94%），抗体对7种PAEs具有较宽的识别范围，满足同时检测多种PAEs的要求。本发明光纤免疫传感检测方法的平均加标回收率为61.5%~106.7%，相对标准偏差（RSD）<13.41%；GC-MS法（国标方法）的平均加标回收率为66.1%~104.5%，RSD<11.63%，两种方法取得了一致的结果。由此可见，本发明光纤免疫传感检测技术具有较高的灵敏度和精密度，且样品仅需简单提取，在15min内完成测试，本方法已成功应用于设施菜地土壤中PAEs的检测。

附图说明

图1-本发明光纤免疫传感器的结构示意图。

图2-光纤免疫传感检测DMP的信号轨迹图。

图3-光纤免疫传感检测DMP的标准抑制曲线。

图4-探头进行60次检测后的荧光信号变化图。

具体实施方式

目前，采用ELISA法大多只能检测单一PAEs，未见同时识别与快速检测多种PAEs的研究报道。为此，本发明利用PAEs通用半抗原和特异性抗体，建立一种基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法。其具体处理步骤为。

1）光纤免疫传感检测系统的构建；

本发明构建的光纤免疫传感检测系统包括激光发射装置、激光传递和荧光接收的非对称光纤耦合器、光纤探头、样品池、荧光滤光片、光电二极管、锁相放大器和计算机，非对称光纤耦合器由单模光纤和多模光纤构成。非对称光纤耦合器的多模光纤一端通过光纤连接器接光纤探头，多模光纤另一端朝向荧光滤光片，光纤探头表面附着有包被原，光纤探头置于样品池中。光纤免疫传感检测系统结构见图1。

本方法用带尾纤半导体脉冲激光器（波长为650nm、输出功率为8mW）作为光源，激光器发出的激光进入非对称光纤耦合器中的单模光纤，单模光纤只传递一种模式的光，可有效减少光的损失，再经非对称光纤耦合器的多模光纤传输，通过光纤连接器进入光纤探头（光纤探头与非对称光纤耦合器的多模光纤为同种光纤），激光在探头表面产生倏逝波，激发光纤探头表面标记在抗体或抗原分子上的荧光物质。部分被激发的荧光耦合回探头，经连接器进入非对称光纤耦合器的多模光纤，由多模光纤的另一端射出。荧光滤光片滤除反射的激发光，使绝大部分荧光透过，透过的荧光经雪崩光电二极管探测并将光信号转换为电信号，电信号经锁相放大器经放大后，由计算机采集并进行数据处理，得到响应信号。脉冲激光器的脉冲信号由脉冲信号发生器提供，脉冲信号发生器同时为锁相放大器提供相同频率的参考信号。

2）光纤免疫传感检测标准抑制曲线的建立；

2.1）图2为光纤免疫传感检测DMP的信号轨迹图。采用间接竞争抑制法免疫传感检测PAEs。将600μL浓度为0.5μg·mL^-1的荧光标记抗体溶液与600μL某已知浓度的邻苯二甲酸酯类化合物标准溶液混合，其中抗体为可与多种PAEs特异性结合的广谱性抗体，预反应5min；再用蠕动泵将二者形成的混合液以0.3mL·min^-1的速度输入到样品池，持续2min（是指蠕动泵工作2分钟），继续反应6min，使得光纤探头表面抗体或抗原分子上标记有荧光物质；最后启动检测系统，从而得到与该某已知浓度邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号；

2.2）改变邻苯二甲酸酯类化合物浓度，重复步骤2.1），得到不同已知浓度下的该邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号；

2.3）以该邻苯二甲酸酯类化合物的浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准抑制曲线；抑制率指该邻苯二甲酸酯类化合物抑制时的响应信号值与无抑制时的响应信号值之比；无抑制时的响应信号值即步骤2.1）中邻苯二甲酸酯类化合物的浓度为0时的响应信号值。

本发明采用光纤免疫传感技术测定PAEs对抗体的抑制反应。在最佳的免疫检测条件下，测定无抑制时和不同浓度的PAEs标准溶液抑制时的荧光信号，以PAEs的浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准抑制曲线。图3为PAEs标准溶液为DMP，其浓度为1000、100、10、1、0.1和0.01ng·mL^-1时绘制出的标准抑制曲线。获得DMP的IC₅₀为9.54ng·mL^-1，以抑制率为90%时对应的浓度最低，获得检出限为0.147ng·mL^-1，线性范围为0.22~145ng·mL^-1。同时获得DMP、DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DCHP和DNP的IC₅₀值范围为9.54~57.37ng·mL^-1，检测限为0.147~0.342ng/mL，抗体与其它7种PAEs的交叉反应率范围为16.63%~71.94%（DMP为100%）。

本发明实验研制的抗体是抗DMP的抗体；经酶联免疫吸附分析（ELISA）检测该抗体对其它7种PAEs具有较高的交叉反应率，而这8种PAEs为环境中经常检出的PAEs，即除这8种PAEs之外，极少检出其他PAEs，所以通过DMP的标准抑制曲线可以确定PAEs的总量。

3）待测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的检测；

3.1）将已知浓度的邻苯二甲酸酯类化合物替换为待测邻苯二甲酸酯类化合物，然后重复步骤2.1），得到待测邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号，该响应信号为待测样品中所有邻苯二甲酸酯类化合物的总响应，计算抑制率；

3.2）根据光纤免疫传感检测标准抑制曲线上横坐标和纵坐标的对应关系，找到与待测邻苯二甲酸酯类化合物抑制率对应的浓度对数值，即可获得待测邻苯二甲酸酯类化合物的浓度，该浓度即为待测对象中所有邻苯二甲酸酯类化合物的总浓度。

4）光纤探头具体按如下方法制作、清洗与修饰；

1.1）去除多模石英光纤（长度为11cm）的涂覆层（长度约6.5cm），将裸露的光纤放入30%HF溶液中腐蚀适当时间，以得到所需锥角度的组合型探头（因为该探头一端有包层和纤芯，另一端只有纤芯，所以叫组合型），锥型部分的长度约为0.5cm；

1.2）将步骤1.1）得到的组合型探头浸入浓H₂SO₄:H₂O₂体积比为3:1的Piranha溶液中0.5h后，放入超声波清洗仪中清洗，再用超纯水充分清洗，直至清洗液的pH为中性，最后在室温下用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用；

1.3）将抗原固定到探头表面，进行间接竞争免疫分析。将1.2）清洗干燥的探头放入质量浓度为2%的3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液（MTS，溶于甲苯）中反应2h，用甲苯清洗3次；然后将探头置于浓度为0.02mol·L^-1的N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺-丁酸酯溶液（GMBS，溶于乙醇）中反应1h，用乙醇冲洗3次；再用pH为7.4、浓度为0.01mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗干净。为制备光纤免疫传感器，将硅烷化后的探头放入0.05mg·mL^-1的包被原（此处包被原就是半抗原-OVA，OVA为卵清蛋白）中反应2h，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，再放入2mg·mL^-1牛血清蛋白（BSA）溶液中20min，以封闭非特异性吸附位点，得到表面附着有包被原的光纤探头，最后在4℃冰箱中保存备用。

5）本发明按如下方面对光纤免疫传感检测条件进行优化；

①包被抗原浓度：

为了得到最佳固定包被原浓度，设置固定到探头表面的包被原浓度分别为10、20、50、100、150μg·mL^-1，采用1μg·mL^-1荧光标记抗体测定，记录荧光信号。

②PBS溶液的pH值：

为考察pH对检测PAEs的影响，用0.1mol·L^-1HCl和NaOH溶液将PBS溶液的pH值分别调节至5.5、6.5、7.5、8.5和9.5，确定PBS溶液的最佳pH值。

③PBS溶液中盐浓度：

用0.01、0.02、0.03、0.04和0.05mol·L^-1的PBS缓冲液（pH7.4）稀释抗体，考察PBS溶液中盐浓度对免疫传感检测的影响。

④抗原-抗体预反应时间：

设置抗原-抗体的预反应时间为5、10、20min，考察荧光标记抗体与PAEs的预反应时间对免疫传感检测的影响。

本发明最终得到的优化条件为：包被原浓度为50μg·mL^-1，PBS溶液的pH值为7.4，PBS溶液中盐浓度为0.01mol·L^-1，抗原-抗体预反应时间为5min。

6）光纤免疫传感探头的再生和稳定性；

为再生探头实现重复利用，本发明将0.25μg·mL^-1的荧光标记抗体以0.3mL·min^-1输入玻璃样品池，继续反应6min，用2mg·mL^-1胃蛋白酶溶液（pH1.9）以同样流速输入样品池，冲洗4min，再用体积比为50:50:1的乙腈、超纯水和丙酸混合液冲洗30s（此处的目的是冲洗探头，对流速和流量没有严格限制，实际流速设置为0.5mL·min^-1），最后用PBS溶液冲洗2min。为彻底去除探头表面结合的抗体，重复上述过程一次，再生后的探头即可用于下次检测。图4为探头进行60次检测后的荧光信号变化图。

7）土壤样品的前处理；

称取5.00g过60目筛后的风干土样于锥形瓶中，加入20mL体积比为1:1的丙酮-正己烷混合溶剂，静置过夜。在25℃的水中超声30min，1500r/min下离心5min，上清液用中速定性滤纸过滤，收集滤液于离心瓶中。再向离心瓶中加入20mL体积比为1:1的丙酮-正己烷混合溶剂，超声15min，离心，上清液用中速定性滤纸过滤。重复上述操作，合并滤液（约60mL），40℃水浴和80r/min下旋转蒸发至近干，加入4mL正己烷，再旋转蒸发至近干，用正己烷定容至1mL。

8）加标回收实验；

以空白土壤样品进行加标回收实验，加标水平分别为0.5、1.0和10.0ng·mL^-1。按上述处理，旋转蒸发至近干后，加入5mL甲醇，旋转蒸发至1~2mL，用PBST溶液（PBS与吐温-20的混合液）稀释至20mL，用光纤免疫传感器测定。光纤免疫传感检测方法的平均回收率为61.5%~106.7%，RSD<13.41%；GC-MS法的平均回收率为66.1%~104.5%，RSD<11.63%，两种方法取得了一致的结果。建立的光纤免疫传感检测技术具有较高的灵敏度和精密度，样品仅需简单提取，在15min内完成测试。

9）设施菜地土壤中PAEs的测定；

采用建立的光纤免疫传感技术与GC-MS法，测定设施菜地土壤样品中的PAEs含量，获得的结果如表1所示。

表1设施菜地土壤中PAEs的含量(mgkg^-1干重，n=4)

从表1可以看出，本发明光纤免疫传感检测方法与GC-MS法检测PAEs取得了基本一致的结果。

本发明检测原理为：光纤免疫传感器利用光波在光纤内，以全反射方式传输时在探头所处的介质中产生倏逝波，该倏逝波能够激发探头表面的抗原与标记抗体结合的荧光物质，结合免疫反应原理，可实现待测物质的定量检测。另外，荧光素的多少无法决定响应信号大小；因为光纤免疫传感器只能探测到位于倏逝波场范围内（数十至数百纳米）的荧光分子发出的荧光，而样品池的溶液中游离的荧光分子对检测结果几乎没有影响。

本发明的上述实施仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (4)

1.一种基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法，其特征在于：步骤如下，

1）光纤免疫传感检测系统的构建；

光纤免疫传感检测系统包括激光发射装置、用于光路传递的非对称光纤耦合器、光纤探头、样品池、荧光滤光片、光电二极管、锁相放大器和计算机，非对称光纤耦合器由单模光纤和多模光纤构成；非对称光纤耦合器的多模光纤一端通过光纤连接器接光纤探头，多模光纤另一端朝向荧光滤光片；光纤探头置于样品池中，光纤探头表面附着有包被原；

2）光纤免疫传感检测标准抑制曲线的建立；

2.1）将600μL浓度为0.5μg·mL^-1的荧光标记抗体溶液与600μL某已知浓度的邻苯二甲酸酯类化合物标准溶液混合，其中抗体为可与多种邻苯二甲酸酯类化合物特异性结合的广谱性抗体，预反应5min；再用蠕动泵将该混合液以0.3mL·min^-1的速度输入到样品池，持续2min，继续反应6min，使得光纤探头表面抗原与荧光标记抗体结合；启动激光发射装置，发出的激光依次通过非对称光纤耦合器的单模光纤和多模光纤、光纤连接器，进入光纤探头，在光纤探头表面产生倏逝波，倏逝波激发探头表面的荧光物质产生荧光；部分荧光耦合回光纤探头，经光纤连接器进入非对称光纤耦合器的多模光纤，并从多模光纤的另一端射出；射出的荧光经荧光滤光片滤除反射的激发光后，绝大部分荧光透过，透过的荧光经雪崩光电二极管探测并将光信号转换为电信号，电信号经锁相放大器放大后，由计算机采集并进行数据处理，从而得到与已知浓度的该邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号；

2.2）改变邻苯二甲酸酯类化合物浓度，重复步骤2.1），得到不同已知浓度下的该邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号；

2.3）以该邻苯二甲酸酯类化合物的浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准抑制曲线；抑制率指该邻苯二甲酸酯类化合物抑制时的响应信号值与无抑制时的响应信号值之比；无抑制时的响应信号值即步骤2.1）中邻苯二甲酸酯类化合物的浓度为0时的响应信号值；

3）待测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的检测；

3.1）将已知浓度的邻苯二甲酸酯类化合物替换为待测邻苯二甲酸酯类化合物，然后重复步骤2.1），得到待测邻苯二甲酸酯类化合物对应的响应信号，计算获得抑制率；

3.2）根据光纤免疫传感检测标准抑制曲线上横坐标和纵坐标的对应关系，找到与待测邻苯二甲酸酯类化合物抑制率对应的浓度对数值，即可获得待测邻苯二甲酸酯类化合物的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法，其特征在于：所述激光发射装置的光源波长为650nm、输出功率为8mW；光纤探头与非对称光纤耦合器的多模光纤为同种光纤；激光发射装置为脉冲激光发射装置，其脉冲信号由脉冲信号发生器提供，该脉冲信号同时为锁相放大器提供相同频率的参考信号。

3.根据权利要求1所述的基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法，其特征在于：所述光纤探头按如下方法制作得到，

1.1）去除多模石英光纤一端的涂覆层，将去除涂覆层的裸露光纤放入质量浓度为30%的HF溶液中腐蚀适当时间，以得到所需锥角度的组合型探头，锥型部分的长度约为0.5cm，锥角度为45o；

1.2）将步骤1.1）得到的组合型探头浸入浓H₂SO₄:H₂O₂体积比为3:1的Piranha溶液中0.5h后，放入超声波清洗仪中清洗，再用超纯水充分清洗，直至清洗液的pH为中性，最后在室温下用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用；

1.3）将1.2）清洗干燥的探头放入质量浓度为2%的3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液（MTS，溶于甲苯）中反应2h，用甲苯清洗3次；然后将探头置于浓度为0.02mol·L^-1的N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺-丁酸酯溶液（GMBS，溶于乙醇）中反应1h，用乙醇冲洗3次；再用pH为7.4、浓度为0.01mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗干净；将硅烷化后的探头放入0.05mg·mL^-1的包被原中反应2h，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后，再放入2mg·mL^-1牛血清蛋白（BSA）溶液中20min，以封闭非特异性吸附位点，得到表面附着有包被原的光纤探头，最后在4℃冰箱中保存备用。

4.根据权利要求1所述的基于光纤免疫传感检测邻苯二甲酸酯类化合物浓度的方法，其特征在于：在按步骤2.1）进行光纤探头响应检测时，所述光纤探头检测一次后进行再生处理，以用于下次检测；再生处理过程为：将0.25μg·mL^-1的荧光标记抗体以0.3mL·min^-1流速输入样品池，反应6min；再用浓度为2mg·mL^-1的胃蛋白酶溶液（pH1.9）以0.3mL·min^-1流速输入样品池，冲洗4min；再用体积比50:50:1的乙腈、超纯水和丙酸混合液冲洗30s，最后用磷酸盐缓冲溶液冲洗2min；

重复上述过程一次，再生后的光纤探头即可用于下次检测。