CN112051237A - 一种用于检测禽流感病毒的生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测禽流感病毒的生物传感器及其制备方法，首先对色散拐点长周期光纤光栅(DTP‑LPFG)表面进行羟基化，使其表面暴露羟基基团与氧化石墨烯表面的羧基基团在常温下通过氢键结合在DTP‑LPFG表面；接着，用EDC/NHS活化剂活化GO表面的羧基基团；然后，将禽流感病毒抗体通过酰胺反应固定于传感器表面制得AIV‑GO‑DTP‑LPFG传感器。利用氧化石墨烯上吸附的禽流感病毒单克隆抗体与禽流感病毒抗原的特异性结合引起的长周期光纤光栅谐振波长变化进行双峰谐振检测，该传感器对禽流感病毒的检测极限为1.05ng/mL、检测饱和点为～25μg/mL，检测范围为1.05ng/mL～25μg/mL。本发明具有良好的特异性、临床性和可重用性、实时监测以及超高灵敏度、免标记、操作简便、快速检测等优点。

Description

一种用于检测禽流感病毒的生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物分子技术领域，特别的涉及一种用于检测禽流感病毒的生物传感器及其制备方法。
背景技术
禽流感是由AIV引起的一种急性传染病，由于其高致病率和潜在死亡率已成为全球公共卫生的新威胁。目前，关于禽流感的检测方法主要包括：病毒分离鉴定法、血清学鉴定法、分子生物学鉴定法、基因芯片法、新一代高通量测序法和生物传感器检测技术等。然而，病毒分离法的分离培养和血清鉴定需要复杂的程序，这些程序耗时长(从数天到数周)，且操作繁琐。分子生物学鉴定法虽然可以提高检测的敏感性和特异性，但其敏感性和特异性依赖于对禽流感病毒RNA的控制，其中一些手段还存在交叉污染、操作繁琐和成本高的缺点。新一代高通量测序法虽然精度高，错误机率小，但其检测需要复杂的仪器设备。因此，如何快速、准确诊断和及时检测可能爆发的禽流感病毒，研究一种能够快速、准确、重复性好的检测禽流感的方法已成为科研工作者的一项严峻挑战。
光纤光栅生物传感器不仅继承了生物传感器的高生物敏感性、高特异性或光谱选择性，同时还具有无污染、快速实时、便携、体积小、成本低等优点，因此，在生物医学研究、临床诊疗、基因分析、食品安全和环境监测中得到广泛地应用。然而，在光纤光栅传感领域，研究的最大挑战是缺乏对生物小分子和低浓度分析物的应用的灵敏度。针对这一问题，国内外研究者通过对光纤生物传感器进行包层腐蚀、侧抛和光纤拉锥等技术以提高其传感性能。但这些方法均破坏了光纤结构的完整性。
长周期光纤光栅(long period fiber grating,LPFG)是一种在纤芯、包层或二者中引入周期性折射率扰动的无源光子器件，能够在多个分立的谐振波长处实现纤芯导模和同向传输包层模之间的模式耦合，从而在其透射谱中产生多个分立的谐振峰。由于外界环境折射率的变化会对包层模的模式特性产生较大影响，且模次越高，外界环境对其影响越大，因此长周期光纤光栅是一种重要的折射率传感检测装置件。为提高LPFG的折射率传感灵敏度，目前常用的方法是应用双峰谐振LPFG，由于双峰谐振长周期光纤光栅(DR-LPFGs)的左、右峰对周围介质具有相反的折射率响应，即谐振波长向相反的方向迁移，因此具有对外部干扰的最高灵敏度。相比普通LPFG来说，DR-LPFGs的灵敏度可以提高2-3个数量级。2017年，A.A.Badmos等在掺硼/锗单模光纤中制作了DR-LPFG，该光栅用于折射率传感时，其灵敏度达到4298.20nm/RIU。
另外，在LPFG表面镀传感膜可以进一步提高LPFG的传感性能，由于在LPFG上沉积薄膜会引起其传输特性的潜在变化，只要合理选择具有足够厚度和折射率的薄膜可以为外界环境折射率测量提供最高的灵敏度。氧化石墨烯作为石墨烯的一种含氧衍生物，具有很强的亲水性和生物相容性，由于其基底平面和片状边缘富含各种含氧基团，如羟基、环氧基、羧基等，使得GO可通过共价键固定各种生物分子，此外，GO还可通过非共价相互作用如氢键，π-π堆积和静电相互作用来吸附生物分子。Jiang等在82°倾斜光纤光栅上涂覆GO，用于检测低浓度葡萄糖溶液，在0～8mM的浓度范围内其灵敏度为0.25nm/mM。Luo等在81°倾斜光纤光栅上涂覆GO，用于对牛血清蛋白检测，在1.5nM到75nM的检测范围内，其检测极限为0.88nM。Wang等在倾斜角为10°的TFBG上修饰GO用于相对湿度(RH)传感，灵敏度为0.129dB/％RH。Liu等在普通LPFG上涂敷GO用作光学生物传感器，检测人类血红蛋白，灵敏度为1.9dB/(mg/mL)。然而，在实际应用中上述传感检测装置需要较复杂的制备工艺和过程，并且至今未有采用镀膜双峰谐振LPFG技术来进行病毒检测的相关报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种用于检测禽流感病毒的生物传感器及其制备方法，解决现有检测方法存在操作繁琐，耗时长，成本高以及准确性和特异性不佳等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：包括用于产生具有一定宽波段入射光的超连续谱光源和与之依次相连的衰减器、光纤隔离器、待测样品池和光谱仪，所述待测样品池为放置有AIV-GO-DTP-LPFG传感器的反应器皿，所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器包括色散拐点长周期光纤光栅，所述色散拐点长周期光纤光栅的表面通过氢键结合有氧化石墨烯层，所述氧化石墨烯层的表面通过共价键固定有禽流感病毒单克隆抗体；所述光纤隔离器通过单模光纤与色散拐点长周期光纤光栅的一端相连，所述光谱分析仪通过单模光纤与所述色散拐点长周期光纤光栅的另一端相连，用于接收所述工作于双峰谐振状态的色散拐点长周期光纤光栅的输出光，并根据所述接收到的处于双峰谐振状态的输出光，通过确定其双峰谐振波长的间距随环境参数变化的漂移来实现对所述待测样品的检测。
作为优选的，所述超连续谱光源的输出光谱范围为480nm～2200nm，总输出功率800mW。
作为优选的，所述生物传感器的操作温度为25℃。
作为优选的，所述生物传感器在操作时衰减器将光源能量衰减至输出功率的80％。
本发明的另一个目的在于提供一种AIV-GO-DTP-LPFG传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)使用浓度为5％的HNO3溶液浸泡色散拐点长周期光纤光栅DTP-LPFG，再用超纯水和无水乙醇清洗表面，然后在35℃～45℃恒温条件下将DTP-LPFG浸入0.2M NaOH溶液3～5h后，再于室温下继续浸泡20～40min，以激活DTP-LPFG表面的-OH基团，最后用超纯水反复冲洗光栅表面并干燥，得到预处理后的DTP-LPFG传感器；
2)用氧化石墨烯溶液在室温下浸泡步骤1)得到的预处理后的DTP-LPFG传感器10～14h后，然后用超纯水和无水乙醇反复冲洗其表面，冲去未结合的GO，得到GO-DTP-LPFG传感器；
3)在室温下将步骤2)得到的GO-DTP-LPFG传感器浸入EDC/NHS活化剂中，然后在室温下再将GO-DTP-LPFG传感器置于AIV单克隆抗体溶液中充分反应，反应结束后用PBS缓冲溶液反复冲洗，再用配置好的SMPSF封闭液浸泡，以封闭光栅表面未被AIV单克隆抗体封闭的羧基位点，即得到所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器。
作为优选的，所述AIV单克隆抗体溶液的浓度为20～100μg/mL。
作为优选的，所述氧化石墨烯的浓度为1～10mg/mL。
作为优选的，所述EDC/NHS活化剂中EDC和NHS的质量比为3:1～1:1。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提出的禽流感病毒生物传感器，首先对DTP-LPFG表面进行羟基化，使其表面暴露羟基基团与氧化石墨烯表面的羧基基团在常温下通过氢键结合在DTP-LPFG表面；接着，用EDC/NHS活化剂活化GO表面的羧基基团；然后，将禽流感病毒抗体通过酰胺反应固定于传感器表面。DTP-LPFG在不破坏光纤结构完整性的同时，其本身还具备对外界环境折射率的高灵敏度响应，另外，利用在DTP-LPFG外涂覆高折射率氧化石墨烯薄膜使其包层模式位于模式转换区，可以进一步提高其对外界环境折射率的灵敏度，同时也可以扩展DTP-LPFG折射率传感范围，极大提高免疫传感器的灵敏度、稳定性及特异性，从而解决普通LPFG仅对环境折射率略低于包层折射率时才敏感的限制。
2、本发明制备得到的氧化石墨烯修饰色散拐点长周期光纤光栅生物传感器AIV-GO-DTP-LPFG，氧化石墨烯通过氢键结合在色散拐点长周期光纤光栅表面上，并通过共价键将禽流感病毒单克隆抗体与氧化石墨烯表面的羧基相结合。对禽流感病毒的检测极限为1.05ng/mL，传感器的解离常数为～5.31×10-9M，亲和系数为～1.88×108M-1，检测范围为1.05ng/mL～25μg/mL。且具有良好的特异性、临床性和可重用性。因此，本发明的免疫传感器具有应用于禽流感病毒的快速和早期诊断的可能性，具有良好的应用前景，同时也为禽流感病毒检测提供了新的思路和选择。
3、本发明检测方法利用氧化石墨烯上吸附的禽流感病毒单克隆抗体与禽流感病毒抗原的特异性结合引起的色散拐点长周期光纤光栅的双谐振波长变化进行检测，两个谐振峰分别沿着相反的方向移动，通过监测双谐振波长的间距变化，即可实现环境折射率的传感，具有对外部干扰的最高传感灵敏度。本发明所制作的免疫传感器通过检测不同浓度等级的高纯度AIV抗原溶液，得到对AIV抗原的检测极限为～1.05ng/mL，该值与未涂覆GO的普通LPFG生物传感器的检测极限～2μg/mL和～0.1μg/mL相比分别提高了～1905和～95倍；与未涂覆GO的DTP-LFG的检测极限～70ng/mL相比提高了约～67倍，与GO-DTP-LPFG生物传感器的检测极限～7ng/mL相比提高了约～7倍；该值与目前临床广泛应用的禽流感胶体金诊断试纸检测限～1.7μg/mL相比提高了～1619倍。此外，该传感器检测饱和点为～25μg/mL，检测范围为1.05ng/mL～25μg/mL。通过对AIV空白尿囊液和NDV尿囊液的对比检测试验，结果表明该传感器对AIV具有高度的特异性，而且达到了临床应用的水平。相对于传统的检测方法，本发明具有良好的特异性、临床性和可重用性、实时监测以及超高灵敏度、免标记、操作简便、快速检测等优点。
附图说明
图1为本发明生物传感器的结构示意图；
图2为本发明制备AIV-GO-DTP-LPFG传感器的过程示意图；
图3为本发明GO修饰DTP-LPFG生物传感器的表面形貌特征；a-d为SEM图，e为能谱图。
图4为本发明制备生物传感器表面修饰过程中的变化；a为光谱图；b为波长图。
图5为AIV免疫检测过程中随着AIV抗原溶液浓度变化生物传感器的变化；a为双峰谐振波长的间距变化随时间的变化图；b为光谱图。
图6为本发明的生物传感器的谐振双峰间距变化量与AIV抗原溶液浓度的关系曲线图。
图7为本发明生物传感器的特异性和临床性测试过程双峰谐振波长的间距变化图。
图8为本发明生物传感器在3次循环实验的双峰间距变化量百分比和初始结合率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得和/或根据已知的方法制备获得。
脱脂奶粉封闭液(SMPSF)由脱脂奶粉、Tween和三乙醇胺缓冲盐水(Tris bufferedsaline,TBS,0.1M,pH＝7.4)按一定比例混合而成，用于对光栅表面GO羧基端进行封闭处理。AIV单克隆抗体(AIV-MAbs，浓度2mg/mL)购自美国Abcam公司。H5亚型AIV病毒株，由南京农业大学动物医学院传染病组馈赠。禽流感H5N1弱毒株，由重庆市疾病控制中心馈赠，将禽流感病毒液注入9日龄的SPF鸡胚中，37℃培养约72h后，观察后取出鸡胚，4℃放置24h，使血管收缩防止出血，用取液器收取尿囊液，5000r/min离心5min后，取上清液，获得AIV尿囊液；新城疫病毒(NDV-AV29)株，购自中国兽医药品监察所，取9日龄SPF鸡胚，每个鸡胚尿囊腔接种NDV-AV29株稀释0.2mL，37℃孵育，在接毒后48h内，获得NDV尿囊液。
一、一种用于检测禽流感病毒的生物传感器
如图1所示，一种用于检测禽流感病毒的生物传感器，包括用于产生具有一定宽波段入射光的超连续谱光源1和与之依次相连的衰减器2、光纤隔离器3、待测样品池5和光谱仪6，所述待测样品池5为放置有AIV-GO-DTP-LPFG传感器的反应器皿，所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器包括色散拐点长周期光纤光栅，所述色散拐点长周期光纤光栅的表面通过氢键结合有氧化石墨烯层，所述氧化石墨烯层的表面通过共价键固定有禽流感病毒单克隆抗体；所述光纤隔离器3通过单模光纤4与色散拐点长周期光纤光栅5的一端相连，所述光谱分析仪6通过单模光纤4与所述色散拐点长周期光纤光栅5的另一端相连，用于接收所述工作于双峰谐振状态的色散拐点长周期光纤光栅的输出光，并根据所述接收到的处于双峰谐振状态的输出光，通过确定其双峰谐振波长随环境参数变化的漂移来实现对所述待测样品的检测。
具体实施时，光从超连续谱光源(SC-5，480nm～2200nm，总输出功率800mW)输出，并经过衰减器(Attenuator)将光源能量衰减至输出功率的80％，这样既可以保证光谱的稳定性，同时也可以防止对光路的损坏。然后，光通过光纤隔离器(Isolator)后，传输至AIV-GO-DTP-LPFG传感器。最后，通过单模光纤连接到光谱仪(OSA，MS9740A，分辨率为0.03nm)记录光谱变化。实验过程中，必须要保持AIV-GO-DTP-LPFG的自由水平状态，实验室温度保持恒定(25℃)，以避免应变和温度引起的传感器交叉敏感效应带来的折射率检测误差。
二、用于检测禽流感病毒的生物传感器的制备方法
1、DTP-LPFG的制作
利用准连续高重频KrF激光器(波长为248nm)和扫描掩模技术在石英单模光纤(SMF-28，纤芯直径为8.2μm，包层直径为125.0±0.7μm)上写入光栅。首先对光纤进行载氢处理，以增加掺锗纤芯的光敏性。准连续高重频KrF激光器的激光束由两个正交柱透镜聚焦，整个刻栅过程中，光纤位于连续移动线性位移平台，通过调整光开关的频率和电动位移台移动的速度，以确定该DTP-LPFG的周期。DTP-LPFG制作完成后，将其放置在80℃的环境中进行约24h退火处理，以确保DTP-LPFG具有稳定的光谱特性。所制得的DTP-LPFG周期为～136μm，长度为～19mm。DTP-LPFG的相位匹配条件为
Figure BDA0002676097260000051
其中，λres为谐振峰中心波长，
Figure BDA0002676097260000061
分别为光纤纤芯基模和m次包层模的有效折射率，Λ为LPFG周期。DTP-LPFG的折射率灵(Refractive Index，RI)敏度取决于相位匹配条件，由Λ和纤芯模与包层模有效折射率之差共同决定。
在周围介质折射率(Surrounding Refractive Index，SRI)发生变化的情况下，可以通过等式(2)描述LPFG谐振波长的漂移，
Figure BDA0002676097260000062
其中，um是第一类零阶贝塞尔函数的第m个根；nsur为周围介质折射率；rco和rcl分别为LPFG纤芯和包层半径。当Λ足够小时，由于相位匹配曲线中存在转折点，可在匹配曲线转折点两侧将两个不连续的谐振波长耦合到相同的包层模式，从而导致出现双谐振峰[32]。包层模有效折射率取决于包层折射率(Cladding Refractive Index，CRI)和SRI的差值。随着SRI增加，包层模式的有效折射率增加，纤芯基模有效折射率不变。因此，对于DTP-LPFG，在
Figure BDA0002676097260000063
(即DTP-LPFG的左谐振峰λL)区域，随着RI的增加，DTP-LPFG的左谐振峰会发生蓝移；在
Figure BDA0002676097260000064
(即DTP-LPFG的右谐振峰λR)区域，随着折射率的增加，DTP-LPFG的右谐振峰会发生红移；而当其处于在色散拐点附近时，
Figure BDA0002676097260000065
光栅对外部环境非常敏感。
2、DTP-LPFG的表面修饰过程
DTP-LPFG的表面修饰过程如图2所示，具体步骤如下：
1)使用浓度为5％的HNO3溶液对浸泡光栅2h，再用超纯水和无水乙醇彻底清洗。然后，在40℃的恒温箱内，将该DTP-LPFG浸入0.2M的NaOH溶液～3.5h，再于室温下继续浸泡0.5h，以激活DTP-LPFG表面的-OH基团，用超纯水反复冲洗光栅表面，去除多余杂质，再置于50℃的对流烘干机中干燥10min，得到预处理后的DTP-LPFG传感器。
2)用浓度为2mg/mL的GO溶液在室温下浸泡预处理后的DTP-LPFG传感器12h后，用超纯水和无水乙醇反复冲洗其表面，冲去未结合的GO，最终得到GO-DTP-LPFG传感器。
3)将EDC(0.004g)和NHS(0.002g)以2:1的质量比溶于200μL超纯水中，然后取MES缓冲液300μL混合均匀，得到EDC/NHS活化剂；然后，在室温下将GO-DTP-LPFG传感器浸入300μL的EDC/NHS活化剂中1h，以活化GO-DTP-LPFG表面的-COOH基团；接着在室温下将GO-DTP-LPFG传感器置于50μg/mL的AIV-MAbs溶液(300μL)中1h，然后用PBS反复冲洗传感器以去除其表面未结合的AIV-MAbs；最后，用配置好的SMPSF封闭液浸泡GO-DTP-LPFG传感器1h，以封闭光栅表面未被AIV-MAbs封闭的羧基位点，即得到所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器。
三、性能检测
1、形貌表征
利用场发射扫描电子显微镜(FESEM，ZEISS SIGMAHD)对GO修饰后的DTP-LPFG表面形貌进行表征，结果如图3所示。
由图3(a)-3(d)可见，GO薄膜能够比较均匀地沉积在光栅表面，但存在有褶皱，从热力学的角度而言，褶皱的存在可降低GO材料的表面能，从而维持其附着在光栅表面的稳定性。图3(e)为GO沉积在光纤表面的能谱图，可知光纤表面沉积GO后主要存在C、O、Si三种元素，其中C元素和部分O元素是来自光纤表面GO，而Si元素和部分O元素为光纤包层的材料SiO2。这些结果均为GO在光纤表面的固定效果提供较好的依据，同时也证明在DTP-LPFG表面已附着一层比较均匀的GO薄膜。
2、光谱检测
实验中对DTP-LPFG的每个表面修饰进行了光谱监测，每个步骤的光谱测试都在PBS中进行。图4(a)和图4(b)为从裸光栅开始到SMPSF封闭GO表面多余位点的光谱演变和相应的谐振双峰间距变化情况。
由图可知，随着表面修饰物的增加，DTP-LPFG的左谐振峰发生蓝移，右谐振峰发生红移，谐振双峰的间距增加。从裸DTP-LPFG到羟基化再到GO沉积于DTP-LPFG表面的过程中，DTP-LPFG双峰间距变化量相对于上一步修饰分别变化～2.5025nm和～3.465nm。这是由于GO薄膜复折射率的实部影响DTP-LPFG包层模色散方程，GO涂覆层会引起DTP-LPFG包层模有效折射率
Figure BDA0002676097260000071
增加，结合式(1)分析可知，DTP-LPFG的双谐振峰的左峰会发生蓝移，而右峰会发生红移，从而导致谐振双峰之间的间距增加；此外，由图4(a)可见，随着GO在光栅的沉积，光谱的耦合强度将会增强。这是由于GO复折射率的虚部表示GO材料的吸收特性，在光栅表面涂覆GO后，增加了传播过程中的光损失，导致DTP-LPFG传输损耗增加，谐振峰强度增强。
从对GO表面-COOH基团进行活化处理，到固定AIV-MAbs再到用SMPSF封闭GO表面多余位点的过程中，DTP-LPFG谐振双峰间距变化量分别相对于上一步修饰分别变化～4.69nm、～2.8725nm和～0.7975nm。此过程中DTP-LPFG的左谐振峰继续蓝移，右谐振峰继续红移，谐振双峰的间距进一步增加。这是由于随着涂层厚度的增加，DTP-LPFG包层模的有效折射率增加，结合式(1)和(2)分析可知，其左谐振峰发生蓝移，右谐振峰发生红移，谐振双峰的间距增加。
3、灵敏度试验
首先，加入PBS溶液以覆盖光栅区域，并记录对应的谐振波长作为参考波长。接着，依次使用300μL不同浓度等级的AIV抗原溶液(PBS配置,1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)进行免疫检测,通过光谱分析仪监测每个浓度等级的免疫反应过程。在每个浓度等级的AIV抗原溶液的监测过程中，待光谱仪的光谱趋于稳定之后，记录光谱数据；然后，撤下AIV抗原溶液并用PBS冲洗光栅以去除其表面未结合的抗原，便可以开始下一个更高浓度等级的AIV抗原溶液的免疫检测，结果如图5所示。
从图中可以看出，随着AIV抗原浓度的增大，该生物传感器谐振双峰中左峰发生蓝移，右峰发生发生红移，双峰间距逐渐增加。具体的，当AIV抗原浓度从1ng/mL增大到100μg/mL时，该生物传感器谐振峰间距总变化量为～10.56nm。当AIV抗原浓度由25μg/mL增大到100μg/mL时，该生物传感器谐振峰间距的变化量为～0.55nm，而当AIV抗原浓度由10μg/mL增大到25μg/mL时，该生物传感器谐振峰间距的变化量为～1.76nm(根据AIV抗原溶液折射率与浓度的响应关系，随着AIV抗原溶液浓度的增加，其折射率也相应增加，若该生物传感器未饱和，当AIV抗原浓度由25μg/mL增大到100μg/mL时，该生物传感器谐振峰间距变化量应大于1.76nm，而实验结果表明，在该浓度范围内，该生物传感器谐振峰间距的总变化量为0.55nm，远小于1.76nm)，说明该生物传感器在10μg/mL时已趋于饱和，即该生物传感器的饱和浓度为～10μg/mL。同时，在上述免疫测试中，发现光谱在每个测试浓度水平仅需10～20min就能达到稳定状态，这表明所提出的生物传感器对AIV抗原具有快速检测的能力。
4、灵敏度试验
根据图5(a)中生物传感器的双峰间距变化量与AIV抗原溶液浓度之间的关系，并用Langmuir模型进行拟合。根据使用生物传感器的校准曲线和国际纯粹与应用化学联合会(International Union ofPure andApplied Chemistry，IUPAC)建议，检测极限为
Figure BDA0002676097260000081
其中，
Figure BDA0002676097260000082
为空白测量的平均值，σmax为空白测量的标准偏差。通过图5和式(4)，求得该生物传感器的LOD为～1.05ng/mL(其中，σmax＝0.01 nm)，较之前的检测极限(LOD为40ng/mL)提高了约～38倍；该值与未涂覆GO的普通LPFG生物传感器的检测极限～2μg/mL和～0.1μg/mL相比分别提高了～1905和～95倍；与未涂覆GO的DTP-LFG的检测极限～70ng/mL相比提高了约～67倍，与GO-DTP-LPFG生物传感器的检测极限～7ng/mL相比提高了约～7倍；该值与目前临床广泛应用的禽流感胶体金诊断试纸检测限～1.7μg/mL相比提高了～1619倍，证明该检测极限满足禽流感病毒检测的临床需求。
为了进一步了解GO-DTP-LPFG生物传感器的检测结果，根据图6给出的该生物传感器双峰间距变化量与AIV抗原溶液浓度之间的拟合结果，传感器对AIV分子的特异性吸附遵循Langmuir模型
Figure BDA0002676097260000091
其中,C为AIV抗原的浓度，Δλmax为AIV抗原检测过程中的最大谐振双峰间距变化量；解离系数Kd是描述两个相互作用分子之间结合能力的一个重要参数。通过图6和式(5)，求得该GO-DTP-LPFG生物传感器对AIV的解离系数为Kd为5.31×10-9M，亲和系数Ka为1.88×108M-1。这些结果表明，基于GO修饰的DTP-LPFG禽流感病毒传感器对AIV分子具有较好的亲和力，基于GO修饰的DTP-LPFG传感器可用作检测禽流感病毒分子的生物传感平台。
5、特异性试验
为进行特异性测试和免疫测定的实验，使用HF溶液轻微腐蚀该GO-DTP-LPFG生物传感器，以清除其表面所有的吸附层，然后使用以上表面修饰步骤，重新将AIV-MAbs分子固定于传感器表面。首先将该重新功能化的AIV生物传感器用于检测不含AIV的病毒原液(即，AIV空白尿囊液，Blank-AIVAllantoic Fluid，300μL)，然后检测新城疫病毒原液(即，NDV尿囊液，NDVAllantoic Fluid，300μL)，每次检测反应20min之后使用PBS和去离子水多次冲洗传感器表面，并记录传感器在PBS环境下的光谱。由于尿囊液中含有许多其他生物分子杂质(如：杂蛋白、生物盐、细胞等)，但不含AIV抗原分子，因此，这两个检测步骤能够鉴定该AIV生物传感器对AIV抗原结合的特异性，结果如图7所示。
从图中可以看出，该AIV-GO-DTP-LPFG生物传感器谐振峰较参考光谱基本保持不变，表明该AIV生物传感器对AIV空白尿囊液和NDV尿囊液没有任何特异性结合的能力。
6、临床性试验
使用该AIV-GO-DTP-LPFG生物传感器依次检测浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、100ng/mL、10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL的通过病毒扩增的AIV病毒原液(即，AIV尿囊液，AIVAllantoic Fluid)，测试方法同上。以上整个检测过程中AIV-GO-DTP-LPFG生物传感器谐振双峰间距变化如图7所示。
从图中可以看出，当AIV病毒原液的浓度从1ng/mL变化至50μg/mL时，谐振双峰间距量为～9.9625nm，与第一次检测的高纯度AIV抗原溶液的双峰间距变化量(～10.2025nm，见图5)相当。但是后者的双峰间距变化量较前者的略有降低，这是由于AIV尿囊液里含有的是整个AIV病毒，属于临床检测，而之前检测用的AIV是经纯化后的高浓度抗原蛋白，从而导致两者检测数据的差异。
7、重用性试验
对于生物传感器的实际应用而言，可重用性是一项必不可少的因素。为此，通过用HCl处理再生生物传感器表面活性来评估该生物传感器可重用性。将上述结合完全生物传感器在室温下浸没到0.01M的HCl溶液中10min，形成低pH环境(pH＝2.0)，使AIV抗原与AIV-MAbs之间的共价键发生断裂，同时不会对光栅表面AIV-MAbs造成影响；然后，用PBS缓冲液反复冲洗传感器表面并在常温下干燥10min。剥离AIV抗原后，通过多次检测5ng/mL的AIV抗原溶液来确认该生物传感器的可重用性。结果如图8所示。
从图中可以看出，本发明生物传感器在第二和第三次循环实验后，经过PBS缓冲液冲洗并干燥处理后，双峰间距变化量百分比分别保持在93％和80％。同样，在第二和第三次循环实验后，经过PBS缓冲液冲洗并干燥处理后，抗原核抗体结合相互作用的前1min初始结合率分别为94％和96％。这些结果均证实了该GO-DTP-LPFG生物传感器可以多次测量抗体-抗原结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于检测禽流感病毒的生物传感器，其特征在于，包括用于产生具有一定宽波段入射光的超连续谱光源和与之依次相连的衰减器、光纤隔离器、待测样品池和光谱仪，所述待测样品池为放置有AIV-GO-DTP-LPFG传感器的反应器皿，所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器包括色散拐点长周期光纤光栅，所述色散拐点长周期光纤光栅的表面通过氢键结合有氧化石墨烯层，所述氧化石墨烯层的表面通过共价键固定有禽流感病毒单克隆抗体；所述光纤隔离器通过单模光纤与色散拐点长周期光纤光栅的一端相连，所述光谱分析仪通过单模光纤与所述色散拐点长周期光纤光栅的另一端相连，用于接收所述工作于双峰谐振状态的色散拐点长周期光纤光栅的输出光，并根据所述接收到的处于双峰谐振状态的输出光，通过确定其双峰谐振波长的间距随环境参数变化的漂移来实现对所述待测样品的检测。
2.根据权利要求1所述用于检测禽流感病毒的生物传感器，其特征在于，所述超连续谱光源的输出光谱范围为480nm～2200nm，总输出功率800mW。
3.根据权利要求1所述用于检测禽流感病毒的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器的操作温度为25℃。
4.根据权利要求1所述用于检测禽流感病毒的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器在操作时衰减器将光源能量衰减至输出功率的80％。
5.一种如权利要求1～4任一项所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)使用浓度为5％的HNO3溶液浸泡色散拐点长周期光纤光栅DTP-LPFG，再用超纯水和无水乙醇清洗表面，然后在35℃～45℃恒温条件下将DTP-LPFG浸入0.2M NaOH溶液3～5h后，再于室温下继续浸泡20～40min，以激活DTP-LPFG表面的-OH基团，最后用超纯水反复冲洗光栅表面并干燥，得到预处理后的DTP-LPFG传感器；
2)用氧化石墨烯溶液在室温下浸泡步骤1)得到的预处理后的DTP-LPFG传感器10～14h后，然后用超纯水和无水乙醇反复冲洗其表面，冲去未结合的GO，得到GO-DTP-LPFG传感器；
3)在室温下将步骤2)得到的GO-DTP-LPFG传感器浸入EDC/NHS活化剂中，然后在室温下再将GO-DTP-LPFG传感器置于AIV单克隆抗体溶液中充分反应，反应结束后用PBS缓冲溶液反复冲洗，再用配置好的SMPSF封闭液，浸泡，以封闭光栅表面未被AIV单克隆抗体封闭的羧基位点，即得到所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器。
6.根据权利要求5所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器的制备方法，其特征在于，所述AIV单克隆抗体溶液的浓度为20～100μg/mL。
7.根据权利要求5所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器的制备方法，其特征在于，所述氧化石墨烯的浓度为1～10mg/mL。
8.根据权利要求5所述AIV-GO-DTP-LPFG传感器的制备方法，其特征在于，所述EDC/NHS活化剂中EDC和NHS的质量比为3:1～1:1。
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