CN103163187A - 具固定相位的c-反应蛋白所拓印的薄膜及其应用于感测晶片系统 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种具固定相位的C-反应蛋白所拓印的薄膜及其应用于感测晶片系统。本发明将蛋白质抗体接于金层上，因此可固定蛋白质于其上，使能统一蛋白质相位，进而聚合出相似的拓印孔洞，利用本发明的C-反应蛋白拓印薄膜的方法制造的C-反应蛋白拓印薄膜，其对目标蛋白质吸附能力约为生物抗体的99%。另外，本发明利用上述C-反应蛋白拓印薄膜以及动态电容感测技术，提供一种C-反应蛋白的感测晶片系统。
Description
技术领域
本发明关于一种制备拓印蛋白质分子拓印薄膜及其应用，尤其关于一种具固定相位的C-反应蛋白拓印薄膜及其应用于感测晶片系统。
背景技术
现今医学技术已达到一定水准，但仍面临了一些医治率低或难以检测的疾病，这些疾病往往不是单一原因造成的，因此诊断也较为不易。而各种疾病都会造成一个共同的现象－发炎。以往认为是后天生活习惯所造成的文明病，如心血管疾病、糖尿病、阿兹海默氏症、过敏症、癌症及自体免疫疾病等，经研究发现同样与发炎反应有着密切的关系，此发现更刊登在2004年时代杂志封面。
由发炎反应所引起的这些疾病有两个共通点：一、并非单一病因所造成，使得主要病因检验十分不便；二、疾病初期较容易控制与治疗，拖到中后期往往难以治愈，甚至成为不治之症，使得初期诊断很重要，越早精确地预测出疾病发生的可能性，越能够避免这些疾病的威胁。
C-反应蛋白(c-reactive protein,CRP)是由肝脏分泌，在外伤、局部缺血、烧伤、各种发炎与感染时数量会迅速上升1,000倍以上，状况缓解后也会很快下降，所以C-反应蛋白被当作主要发炎的指标。临床上用途主要在于组织损伤的筛检和监测，判断病人是否发炎及诊断发炎性疾病复发的可能性，借以评估抗发炎药物治疗的成效。另外，早产也被认为是一种感染造成的炎性反应，故对于待产的孕妇，C-反应蛋白亦为一个重要的检测项目。
早产常造成新生儿很高的死亡率及罹病率，目前仍是产科学无法克服的主要问题之一。自发性早产是指不明原因或早期破水导致在妊娠37周以前生产者。早产是一个多发性病因的疾病，不容易由临床症状或单一检查来预判。当孕妇因临床病症被诊断为早产时，常已面临即将分娩而无法安胎，因此发展临床诊断工具提早来预测早产可能性有其重要和必要性。而因早产也被认为可能是一种发炎反应，故C-反应蛋白为即将生产的指标蛋白质之一，可观察孕妇体内的C-反应蛋白浓度是否在非预产期时有不正常升高的现象，而提早准备孕妇早产处理，减少早产儿因时间拖延不及照顾而导致的并发症。
蛋白质感测于生物医学发展上一直是个受到重视的研究领域，但现今蛋白质感测的感测层多半使用生物性分子。这个问题于2010年的μTAS会议中被提出讨论，使用生物性分子作为感测层的研究无法离开实验室，因此蛋白质检测始终停留在检验所的阶段，需要长时间的检测时间、专业的检测人员、昂贵的实验仪器或药剂。
分子拓印技术(Molecular imprinted technology,MIT)是结合有机高分子与无机网络结构材料，并将模板分子拓印于此材料上，使得拓印孔拥有互补的几何形状以及键结，具有选择性的吸附目标分析物。换言之，此技术所制成的辨识层类似于人工抗体，且制程快速、简易廉价，对于发展生医感测层有极大的潜能。以小分子为模板分子的拓印技术经过几十年的发展已相当成熟，但从小分子模板要实施至巨大蛋白质分子模板所遇到的瓶颈大致可分为下面四点：1.蛋白质具有多功能基团，无法针对少数几种而达到专一性吸附，亦容易造成非特异性吸附的产生；2.蛋白质为巨大分子(分子量6,000Da-几百万Da)难以接近拓印孔洞，亦难脱离；3.蛋白质难溶于普遍使用的拓印溶剂中；4.弹性结构的蛋白质易在太过刺激的环境中因变性而产生形变；故虽发展大分子拓印薄膜至今已超过35年的时间，但进展有限，离有效吸附目标分子仍有一段距离。
发明内容
为了改进上述缺点，本发明以分子拓印技术的概念发展人工抗体感测层，有别于现今使用的生物分子感测层。本发明提供一种具固定相位的C-反应蛋白所拓印的薄膜，包含复数个固定相位的拓印孔洞，这些拓印孔洞借由移除复数个C-反应蛋白而产生，其中这些C-反应蛋白连结于改质的第一基板表面的复数个抗体，其中该改质的第一基板表面，借由半胱胺及戊二醛与该第一基板表面的金层反应所获得。
在本发明的实施例中，进一步于该反应中使用甘氨酸阻隔未连接这些抗体的戊二醛醛基基团，且这些C-反应蛋白进一步与O-4-硝基苯基磷胆碱接触形成复数个预聚合复合物，该复数个预聚合复合物与第二基板的组合物进行微接触，且该组合物由交联剂与起始剂所组成，该交联剂与该起始剂的摩尔比例范围为600:1~640:1；该交联剂为二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯；该起始剂为2,2’-二甲基-2-苯基苯乙酮、1-羟基-环己基-苯酮、对-苯基二苯酮或苯甲基二甲基缩酮。
本发明另提供一种C-反应蛋白的感测晶片系统，包含晶片本体，包含第一腔体，该第一腔体内设有如前两段所述的薄膜，且该第一腔体分别连通设置第一流通口与第二流通口，借以使含有C-反应蛋白的待测溶液由该第一流通口注入后流经该薄膜，而由该第二流通口流出；第二腔体，该第二腔体内设有感测电极，且该第二腔体分别连通设置第三流通口与第四流通口，借由萃取溶液使该拓印薄膜上的C-反应蛋白经由该第三流通口流至该第二腔体；以及侦测器，侦测该感测电极的电位变化，并根据该电位变化产生侦测结果。
于本发明C-反应蛋白的感测晶片系统中的实施例中，该感测电极为指叉状电极，且由镀金玻璃材料经微影制程所制成，该感测电极表面经硫化改质或以抗体修饰；该电位变化由该感测电极与该第二腔体内的萃取溶液所形成的等效电路，与该侦测器的感测电路的电位能动态平衡所造成，且该侦测结果由该电位变化的时间常数判定。
本发明的目的为将蛋白分子拓印薄膜结合微流体晶片，制成蛋白质辨识薄膜整合实验室晶片（lab-on-a-chip,LOC）取代传统的大型仪器，以达到降低样本量、能源消耗与产品成本，并简化样本处理步骤，提升反应时间与检测精度，以及系统微小化等诉求，完成新一代可携带式、可产品化的生医感测器。
于临床上为各种原因(例如早产)监控发炎反应，可借着侦测C-反应蛋白的浓度得知，而现今针对蛋白质的感测方式除了传统以质谱仪等大型仪器分析的外，检验所及实验室的蛋白质感测方式主流为酵素免疫分析法(ELISA)，但这些方法必须待在实验室检测，且所需时间达数天，较难即时得知病患情况，故发展专门且微小化的生医诊断平台已成为现今的趋势。本发明为可携式临床诊断工具能够方便诊断，一方面掌控病患的身体状况，一方面协助医师调整诊断方式，较现有的大型仪器便宜、迅速、更贴近病患与医师的需求。本发明将利用微机电晶片的技术，结合微流道晶片与分子拓印薄模，同时针对不同病因的指标蛋白质进行感测，并且希望发展出纳米生医的感测平台，只要使用微量(μL)的血浆检体即可以同时有多种指标蛋白质的分析结果，且不需要专业人员的操作。利用这种分析方法将可以更有效率的用来预测疾病发生的可能。
因此，本发明使用分子拓印技术概念发展的人工抗体感测层，具有物理稳定性（耐高温、高压）、较佳的化学稳定性（耐酸、碱、有机溶剂与金属离子）、生命周期长（数年）、可重复使用及价格低廉等多种优点，皆有别于习知使用的生物分子感测层。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。
附图说明
图1为拓印模板表面改质的采用半胱胺-戊二醛(cysteamine-glutaraldehyde)法步骤示意图。
图2为拓印模板的表面改质处理示意图。
图3A为C-反应蛋白拓印薄膜(PIP)制程示意图。
图3B为C-反应蛋白抗体拓印薄膜(AIP)制程示意图。
图4为C-反应蛋白或其抗体的拓印薄膜(PIP或AIP)的光聚合图案化制程示意图。
图5为改善制程后PIP的AFM扫描结果图。
图6为原子力显微镜以C-反应蛋白抗体探针微观量测C-反应蛋白拓印薄膜表面的作用力与距离关系图。
图7为C-反应蛋白感测微晶片系统的示意图。
图8为C-反应蛋白感测微晶片系统的第一腔体与第二腔体规格示意图。
图9为裸金电极的等效电路分析图。
图10为经表面改质的金电极上外部电路与感测电极间关系图。
图11为不同C-反应蛋白浓度所测得的动态电位变化图。
图12为图10电位变化曲线的时间常数与C-反应蛋白浓度关系图。
图13为C-反应蛋白的感测微晶片系统的感测电极于第二腔体中动态吸附目标蛋白质的表面电容变化图。
主要元件符号说明
2 试片
21 模板
22 功能性单体
23 交联剂与起始剂混合溶液
241、242 垫片
25 玻璃晶圆
26 光罩
27 拓印薄膜(PIP或AIP)
3 C-反应蛋白的感测微晶片系统
31 晶片本体
32 第一腔体
33 拓印薄膜(PIP或AIP)
34 第二腔体
35 感测电极
36 微通道
371~374 液体流通口
具体实施方式
定义：
本发明说明书中所提及的「人工抗体」，定义为人工制造，且可与特定抗原结合之物，例如本案的C-反应蛋白拓印薄膜。
本发明说明书中所提及的「同向性」一词，若无特别说明，其意义与「固定相位」相同。
本发明的实施例的蛋白分子拓印薄膜，可将蛋白质分子抗体接于金层上，而达到固定蛋白质于其上，且可做到统一蛋白质的相位，聚合出相似的拓印孔洞；另外并检验改质后拓印模板上生化分子间作用力，观察化学分子及生物分子之间产生键结的动态变化，借此建立可重复使用的拓印模板，而降低制程成本。本发明技术特征包含调整溶剂的混合比例以提高辨识薄膜的专一性，以及调整光聚合时间以定义出完整且结构良好的辨识薄膜。
以下就C-反应蛋白拓印薄膜制备方法、利用原子力显微镜(atomic forcemicroscope,AFM)测量C-反应蛋白拓印薄膜的表面状态以及C-反应蛋白的感测微晶片系统分别详述如下：
实施例1：
C-反应蛋白拓印薄膜的制备
1-1拓印模板
本发明主要制程分为两部分：拓印模板与蛋白质拓印薄膜。在拓印薄膜方面，本发明的实施例使用的拓印模板为四寸玻璃晶圆，表面以电子枪(E-gun)真空蒸镀厚度为400nm的金层与25nm的黏着层(Ti)。
拓印模板的表面改质采用半胱胺-戊二醛(cysteamine-glutaraldehyde)法，如图1所示，其中第一个改质试剂为半胱胺(cysteamine)，化学式如式(1)：
利用半胱胺一端的硫键上的成对电子对与金原子外层的空轨域形成稳定的配位，此为类似共价键结的金-硫键结（极性共价键）。反应式为：
虽然金很安定，具有高活化能，但金表面容易吸附空气中的碳氢化合物，硫醇分子与金表面具高键能的吸附性质，可以用置换的方式取代金表面吸附的碳氢化合物，因此能够形成稳定的分子自组单层膜。
第二个改质试剂为戊二醛(glutaraldehyde)，化学式如式(2)：
利用戊二醛一端上的醛基与半胱胺未接合端上的氨基形成希夫碱(schiffbase)，而另一端上的醛基则可与生物分子抗体上的氨基产生键结，剩下没有与抗体作用的醛基，用化学式如式(3)的甘氨酸(glycine)阻隔，以避免目标分子受到非专一性的吸附。
式(3)
因此，利用半胱胺和金电极表面相互作用形成硫-金键结，再以戊二醛一端的醛基与胱胺的胺基形成希夫碱(Schiff base)，戊二醛另一端的醛基再与抗体分子上的氨基进行接合，借此把人工抗体固定于金表面。
本发明拓印模板的表面改质处理的示意图如图2所示，拓印模板的表面改质及处理步骤如下，各步骤的溶液皆为20ml，步骤间清洗以超纯水冲洗：
1.准备一块表面镀金的玻璃模板，如图2(A)，浸泡模板于18mM半胱胺水溶液中8个小时(于暗室室温)，之后以超纯水润洗，接着浸泡在含有12%戊二醛水溶液中8个小时，之后以超纯水润洗，如图2(B)所示；以及
2.浸在50μg/ml C-反应蛋白抗体的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，于室温之下1个小时，形成如图2(C)的状态；加入0.02M甘氨酸的磷酸盐缓冲溶液1.5个小时，用来阻隔(block)住没有接上C-反应蛋白抗体的醛基团(aldehyde)，如图2(D)。
依照上述步骤便可得到本发明的抗体阵列模板，其中本发明的实施例所使用的C-反应蛋白抗体(Anti-CRP)购买于SIGMA-ALDRICH公司，为由鼠腹水制造的抗-C-反应蛋白单株抗体CRP-8，原始浓度为28.5mg/ml。
改质溶剂键结时间探讨
将电化学阻抗分析仪的电极的指叉状部分浸泡于前述步骤1的改质溶液中，以阻抗量测仪器进行监测，由刚开始改质后每五分钟做一次阻抗量测，欲得知何时改质物质与金表面或其他分子的化学键结达到稳定，并依序监测每个改质步骤，借此将改质制程最佳化。由于改质的状况变数较多，可能影响每次键结的时间有所差异，因此这一部分的分析取一个范围，最慢到达表面电容值稳定的为基准，以确保每次改质的品质。
经由电化学阻抗频谱分析(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)监控的结果于分别于半胱胺为8个小时、戊二醛为8个小时、C-反应蛋白抗体为0.8个小时、甘氨酸为1.5个小时，表面电容值趋于稳定，因此将改质步骤浸泡时间订为半胱胺为8个小时、戊二醛为8个小时、C-反应蛋白抗体为1个小时、甘氨酸为1.5个小时。
于本发明拓印模板表面改质及处理的程序中，C-反应蛋白抗体改质后会继续接合C-反应蛋白以及功能性单体O-4-硝基苯基磷胆碱(O-4-nitrophenylphosphorylcholine,O-4NPPC)，此功能性单体之后可与交联剂聚合形成高分子基质。经由EIS监控的结果，表面电容值分别于1.5个小时与3个小时后，趋于稳定，因此分别将C-反应蛋白及O-4NPPC的改质时间定为1.5个小时与3个小时。
改质步骤间清洗次数探讨
于拓印模板改质步骤间，皆会以超纯水清洗金表面，洗去未结合的分子，确保改质分子能够一层层的迭加上去；每次清洗将试片浸置超纯水中摇晃数次，重复此动作直到金表面电容值达到稳定，表示已冲洗掉未接合上的分子。以EIS于12Hz下量测金表面阻抗换算成表面电容的方式，间接推测改质试剂于金表面的状态。由半胱胺、戊二醛、C-反应蛋白抗体、甘氨酸分别在改质后量测清洗次数造成的表面电容变化曲线看出粉末状的半胱胺与甘氨酸较容易残留于金表面，所以需要较多次清洗（半胱胺约需清洗8次；甘氨酸则需清洗6次），表面电容值才趋于稳定；而戊二醛与C-反应蛋白抗体为溶液态，残留现象较不明显，清洗3次后，表面电容即趋于稳定。
1-2 蛋白质拓印高分子薄膜合成
本发明的蛋白质分子拓印技术包含三个步骤：结合(combination)、聚合(polymerization)、萃取(extraction)。结合步骤是将功能性单体(functionalmonomer)以及模板分子(template molecule)进行混合，因为功能性单体及模板分子之间的作用力结合形成为预聚合复合物，彼此之间的作用力可能为共价键或非共价键；聚合步骤为加入起始剂、交联剂与预聚合复合物均匀混合，起始剂受到光或热的激发而启动聚合作用，透过交联剂与功能性单体的聚合形成高分子基质；而萃取步骤则是将模板分子萃取出后，即形成能够抓取目标分子的孔洞(cavity)，完成分子拓印薄膜，便可以对特定分子进行辨识。
另外，本发明在蛋白质拓印薄膜方面，以C-反应蛋白(c-reactive protein,CRP)为模板分子，采用微接触拓印的方式，以紫外光微固化聚合蛋白质拓印高分子薄膜，使用光罩定义其形状与面积。感测薄膜制程示意图如图3所示。
1.请参考图3A(A)的左图(即为图2(D)的抗体阵列模板)，将前述抗体阵列模板浸在5μg/ml C-反应蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，于室温下1.5个小时，将C-反应蛋白接于抗体上，即制成如图3A(A)的中图所示。
2.接着参考图3A的右图，将模板浸在溶于超纯水的0.1mg/ml O-4-硝基苯基磷胆碱(O-4-nitrophenylphosphorylcholine,O-4NPPC)的功能性单体与2mM钙离子(Ca2+)中，于室温下3个小时，使O-4NPPC与模板分子形成预聚合复合物。
3.请参考图A(B)，于交联剂(二甲基丙烯酸酯，PEG400DMA)中加入分子筛去除抑制剂后，以640:1的摩尔比配制交联剂与起始剂(2,2’-二甲基-2-苯基苯乙酮，2,2’-dimethoxy-2-phenyl-acetophenon，DMPA)的混合溶液，滴在另一块清洗过的四寸玻璃晶圆上，并以微接触方式将盖于前述处理的模板上方。
4.请参考图4，该图为C-反应蛋白拓印薄膜的光聚合图案化制程示意图，模板21上覆有功能性单体22再盖有垫片241、242，垫片241、242留有的空间以交联剂与起始剂混合溶液23充满再覆上玻璃晶圆25，将试片2置于曝光箱中，垫片为25μm的高分子拓印薄膜，曝光仪器为紫外光平行曝光机（I-line，365nm，能量约6.4mW/cm2，平行光），曝光时间为300秒，以光罩26定义薄膜形状及大小，完成含C-反应蛋白的拓印薄膜27。
5.请参考图3A(C)，聚合完成后，将C-反应蛋白拓印高分子薄膜浸泡至10%(w/v)十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)与10%(v/v)醋酸的混合溶液中，以超音波振荡30分钟，萃取出模板分子CRP即完成C-反应蛋白拓印高分子辨识薄膜。
前述图3A(A)的中图，使用抗体及C-反应蛋白二层的阵列模板，发明人另外已研究出使用只有人工抗体单层的阵列模板，而蛋白质拓印薄膜方面，除使用人工抗体及C-反应蛋白二层的阵列模板制作外，也可以使用单层抗体模板制作，如图3B所示。在本发明另一实施例，图4的光聚合图案化制程示意图中，元件符号27为具有抗体拓印孔洞的拓印薄膜(AIP)，其利用抗体负向结构键结来抓取蛋白质，此同样具有蛋白质结合的专一性，且成本也比二层式大幅降低。
实施例2：
利用AFM测量C-反应蛋白拓印薄膜的表面状态
原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)以微悬臂梁的震荡及其前端的细小探针来感测与样本之间的各种相互作用，如机械接触力、凡得瓦力、化学键、静电力、磁力等，探针的前端以雷射光定位，并于反射处用光电二极体进行感测，当悬臂梁产生偏移，反射至光电二极体亦发生偏移，借此得知探针与样本表面的相互作用关系。解析度能够达到原子等级。由于AFM能够观测导体或是非导体的样本。
四种样本薄膜：NIP(无拓印高分子薄膜，non-imprinted polymer)、本发明AIP(抗体拓印高分子薄膜，antibody imprinted polymer)、本发明PIP(蛋白质拓印高分子，protein imprinted polymer)(固定相位)及PIP(乱数分布)。NIP只有加入起始剂与交联剂，为单纯的高分子材料，用来测试生物分子对其造成的非专一性吸附力；AIP为拓印模板接上抗体后与高分子试剂进行微接触拓印所制成的拓印高分子，与PIP相较为省略接上C反应蛋白的步骤，故薄膜上的拓印孔为抗体拓印孔，而非C反应蛋白拓印孔；PIP为拓印模板上接合抗体后固定CRP相位并加入功能性单体(O-4NPPC)，再与高分子试剂进行微接触拓印所制成的拓印高分子，如实施例一的方法制成，而PIP(乱数分布)则是模拟Chou(P.C.Chou,J.Rick,T.C.Chou,C-reactive protein thin-film molecularly imprintedpolymers formed using a micro-contact approach,Analytica Chimica Acta,Vol.542,p20-25,2005)的微接触制程，拓印模板上以半胱胺-戊二醛改质，使其表面布满醛基，其能够对生物分子产生非专一性的吸附，使得C-反应蛋白乱数分布于拓印模板上，再与高分子试剂进行微接触拓印所制成拓印高分子，用来与PIP做比较。以下的探讨将蛋白质拓印高分子薄膜分为1.NIP、2.本发明AIP、3.PIP(乱数分布)、4.a未改善制程前的PIP和4.b改善制程后的PIP。
本发明改善制程后的PIP，主要是改善拓印模板表面改质的分布、改质步骤间清洗残留物的次数、改质溶液键结的时间及交联剂与起始剂的比例，详细步骤参见实施例一。
改善制程后的PIP如图5所示，该图为改善制程后PIP的AFM扫描结果图。起伏度的均方根值为16.826nm，起伏度为最大(NIP为0.291nm，本发明AIP为3.117nm，PIP(乱数分布)为2.768nm)。侧剖面中疑似拓印孔洞处深度有10.690nm，孔径大小为66.406nm，深宽比约为1:6.5，用抗体一方面固定C-反应蛋白的相位，另一方面能够将C-反应蛋白垫高，于微接触拓印中，高分子试剂能够更完整的包覆整颗C-反应蛋白分子，与PIP(乱数分布)拓印所造成的深宽比作比较大幅改善，专一性吸附力也能够有所提升。拓印模板制程的最佳化确实有助于拓印高分子表面拓印孔洞的完整性。
探讨AFM探针与拓印模板以及高分子薄膜之间的作用力关系，将AFM探针分为三种状况：金探针、抗体探针以及CRP探针（表面处理过程如同前述镀金表面的改质处理）；拓印模板也分为三种状况：金表面、半胱胺-戊二醛表面处理以及C-反应蛋白表面处理；高分子薄膜分为NIP、AIP、PIP（乱数分布）、最佳化前PIP（固定相位）及最佳化后PIP（固定相位）五种。
模板主要探讨抗体与C-反应蛋白之间的作用力（专一性吸附力），抗体探针对金模板表面及金探针对C-反应蛋白模板表面应为微弱作用力的对照组；抗体探针对半胱胺-戊二醛模板表面或抗体模板表面则为非专一性吸附力的测试。
因为探针有经过改质步骤，共有三种AFM探针：未改质前、接上抗体后以及接上抗体和C-反应蛋白。
如前所述，AFM探针对样本表面有交互作用力，故针对AFM探针远离样本时所产生的负值黏滞力做分析，利用AFM探针的弹力常数K与黏滞力所造成的位移X换算出作用力大小F，公式如下：
F＝-K×X
以九宫格的方式进行探测，点跟点之间的距离为100nm，探测结果如下：
I.拓印模板
经测试后，发现生物分子（C-反应蛋白抗体或C-反应蛋白）不论是在探针上还是在模板上，与金之间的微弱作用力约为10nN；抗体探针对半胱胺-戊二醛模板表面或抗体模板表面所造成的非专一性吸附力约为20nN；抗体与C-反应蛋白间的专一性吸附力则接近30nN。对照组的背景微弱作用力稍大，因C-反应蛋白抗体或C-反应蛋白表面具有多种键结，容易与其他物质产生吸引力，但仍然能够比较出专一性与非专一性吸附力的差异。
II.蛋白质拓印高分子
经测试后，C-反应蛋白抗体与NIP之间所产生的非专一吸附力约为11.75nN，只稍大于拓印模板测试中的背景微弱作用力，表示交联剂所造成的非专一性吸附情形不严重；C-反应蛋白抗体对AIP与PIP(乱数分布)造成的作用力接近20nN，与拓印模板测试中抗体探针对半胱胺-戊二醛模板表面或抗体模板表面所造成的非专一性吸附力差不多，并没有特别突出的专一性吸附力；PIP在最佳化之前，与C-反应蛋白抗体间的作用力只有略大于20nN，与非专一性吸附力值差异不大，并无明显的专一性吸附力，而PIP在最佳化制程后(即改善制程后)，请参考图6，该图为原子力显微镜以C-反应蛋白抗体探针微观量测C-反应蛋白拓印薄膜表面的作用力与距离关系图，由图中可知C-反应蛋白抗体对PIP造成的作用力接近30nN，与C-反应蛋白抗体对C-反应蛋白间的作用力差不多，皆有较明显的专一性吸附力，但分布较不均匀，若是与拓印孔洞反应作用力应较大，因此改善拓印孔洞的分布均匀性，亦能够增强其专一性吸附能力。
样本-探针间的作用力探讨针对了拓印模板及蛋白质拓印高分子。于拓印模板探测中，C-反应蛋白抗体探针与金之间的微弱作用力约为10nN；C-反应蛋白抗体探针对半胱胺-戊二醛模板表面或C-反应蛋白抗体模板表面所造成的非专一性吸附力约为20nN；而C-反应蛋白抗体与C-反应蛋白间的专一性吸附力则接近30nN。于蛋白质拓印高分子探测中，C-反应蛋白抗体与NIP之间所产生的非专一吸附力约为11.75nN，只稍大于拓印模板测试中的背景微弱作用力，无明显的非专一性吸附力；C-反应蛋白抗体对AIP与PIP(乱数分布)造成的作用力接近20nN，与拓印模板中的非专一性吸附力大小差异不大；PIP在最佳化之前，与C-反应蛋白抗体间的作用力只有略大于20nN；PIP在最佳化制程后(即改善制程后)，C-反应蛋白抗体对蛋白质拓印高分子造成的作用力接近30nN(29.36±4.90nN)，与C-反应蛋白抗体对C-反应蛋白间的作用力差不多，有较明显的专一性吸附力。而本发明制程最佳化后PIP薄膜与生物抗体的结合力十分接近，达14.28nN，约为C-反应蛋白与生物抗体结合力的87%。
另外，为了得知所制作PIP薄膜是否对目标分子具有吸附能力，而因欲探讨PIP薄膜的特异吸附性能力，针对PIP拓印孔洞上功能性键结吸附目标分子的能力，因此须要有个对照组为高分子基材本身对目标分子的吸附能力，此现象称为非特异性吸附，另外合成无拓印分子高分子(non-imprinted polymer,NIP)，NIP与PIP合成高分子基材相同，仅模板上无目标分子，即没有拓印孔洞，不会产生功能性键结，故NIP的吸附量可视为基材对生物分子的附着情形，实际上因特异性键结而吸附于PIP薄膜的目标分子，应用PIP吸附量扣除NIP吸附量，以此来判定PIP的特异吸附性。测试步骤如下：
(1)使用0.1μg/ml与0.5μg/ml两种浓度样本溶液，分别注入置有NIP、PIP(random)及PIP感测薄膜的微流道中，腔体体积为1.032μl，吸附时间为10秒，量测溶液剩余的浓度。
(2)由量测到的浓度值换算出各薄膜的吸附量，可得PIP及NIP的吸附情形，两者相减即得PIP薄膜的特异吸附量。量测结果如表一，其中「比值」为各个拓印薄膜的吸附量分别对NIP的吸附量的比值。
表一薄膜的特异吸附性能力
由表一可知，PIP薄膜的吸附量与生物抗体接近，PIP-r次之，而AIP也有不错的结果。
另外，于PIP薄膜浸在配置好的三种不同浓度的C-反应蛋白溶液分别为0.1、0.5、1μg/ml，由0.1、0.5至1μg/ml，存在吸附量越来越高的趋势。取1μg/ml的结果来比较，NIP吸附量（非专一性吸附）明显较低，而PIP及生物抗体的吸附量分别为0.746、0.752ng/cm2，与NIP的比值分别为5.33、5.37。量测得的PIP薄膜吸附能力为0.75ng/㎝2；NIP为0.14ng/㎝2。若是以1㎝2的面积去换算，其专一性吸附量为0.61ng，
同方向性PIP拓印薄膜对目标蛋白质吸附能力较接近生物抗体，约生物抗体的99%。
实施例3：
C-反应蛋白的感测微晶片系统
学术上多采用高效液相层析仪(High-performance liquid chromatography,HPLC)量测方式，但实际上量测时，浓度需要大于100μg/ml才能够较准确得估算出溶液中成分，临床上，正常人体内约小于8μg/ml，对于量测方面似乎无法满足临床上需求。
临床上则采用酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunoassay,ELISA)量测方式，其需要做序列稀释至1000pg/ml以下，而临床上样本浓度介于1-15μg/ml，即样本需要稀释1000倍左右，担心稀释上的人为误差或因稀释而污染造成影响。
C-反应蛋白感测微晶片系统的示意图如图7，图中C-反应蛋白的感测微晶片系统3包含一晶片本体31，可为平板状，在虚线下方的部份可为较薄以便插入侦测器38(图中未示)的插槽；晶片本体31包括第一腔体32，在第一腔体32中置放C-反应蛋白拓印薄膜33，且第一腔体32分别连通设置第一流通口371与第二流通口372，借以使含有C-反应蛋白的待测溶液由该第一流通口注入后流经该拓印薄膜33，而由该第二流通口372流出；第二腔体34，第二腔体34内设有感测电极35，且第二腔体34分别连通设置第三流通口373与第四流通口374，借由萃取溶液使该拓印薄膜33上的C-反应蛋白经由第三流通口373流至该第二腔体34；晶片本体31另包括侦测器38(图中未示)，侦测感测电极35的电位变化，并根据该电位变化产生一侦测结果。本实施例所例示的第一腔体与第二腔体的规格如图8，流道高度皆为100μm。
本发明在使用C-反应蛋白的感测微晶片系统3进行检测时，先将1μl待测溶液从液体流通口371进入第一腔体32内，让待测溶液中的C-反应蛋白吸附于C-反应蛋白拓印薄膜33(可为具同向性的PIP，亦可为同向性的C-反应蛋白抗体拓印薄膜AIP)上，停留60秒后将待测溶液从液体流通口372移除，再用磷酸盐缓冲溶液利用液体流通口371、372进出清洗掉非专一性吸附的其他物质，再由液体流通口371注入2μl萃取溶液(十二烷基硫酸钠10%w/v+乙酸10%v/v)将C-反应蛋白拓印薄膜吸附到的目标分子C-反应蛋白萃取出，接着将萃取溶液移至第二腔体34由感测电极35进行浓度分析(此时溶液中应只有C-反应蛋白分子)，10秒后量测电极讯号(动态放电电性量测)。
本发明另一实施例亦可先将1μl待测溶液从液体流通口371进入第一腔体32内停留60秒后，让待测溶液中的C-反应蛋白吸附于C-反应蛋白拓印薄膜33上，将待测溶液移至第二腔体34，10秒后由感测电极35进行浓度分析(LCR量测电容)。
在低频时，阻抗频率关系图跟电极表面的状态较有关系，而于电极表面接上抗体及C-反应蛋白所改变的电容值对照等效电路应为电双层电容，因此量测时针对低频(12Hz)做分析。
动态电容感测机制
由PIP薄膜抓取C-反应蛋白后,以SDS溶剂将抓取的C-反应蛋白溶出，并输送至感测电极上，此感测电极可经由表面硫化改质或以抗体修饰来抓取分离的C-反应蛋白，并由动态电容量测法来获得电极表面电容变化，由表面电容变化与检量线对应至浓度关系。
动态电容量测法的电路适用于可携式装置或掌上型装置。在进行动态电容量测之前，必须先将待分析系统进行简化，以方便后续分析的进行。在动态电容量测系统中，计算出来的结果为系统电容与系统电阻，而金电极与表面改质分子，可将其简化为等效系统电容与等效系统电阻。如此系统架构下，可以假想此等效系统电容与等效系统电阻为动态电容量测系统中的电双层电容与漏电电阻，并依据放电曲线，计算此系统的时间常数与电容电阻值，达到动态电容量测的目的。
依据上述说明，首先要针对电极做进一步的等效电路分析，将整体系统进行分析与简化。感测电极的等效电路分析分为两个部份：裸金电极与表面改质部分。裸金电极分析如图9，电路符号分别为：Cs为电解质电容；Rs为电解质电阻；Cdl为电双层电容。
表面改质的金电极制作方法如下：以玻璃为模板，表面用电子枪(E-gun)真空蒸镀上400nm金层以及25nm铬黏着层，将镀金晶圆经过微影制程做成指叉状电极，再由模板表面改质步骤，将指叉状电极表面接上抗体。
金电极上的表面改质可以简化成等效电容，当蛋白质被吸附于表面时，则使得电容产生变化，借由外部电路与感测电路间的电位能动态平衡，造成外部电位下降状况来判断感测电路的表面电容变化，如图10所示，其中C为电容；Zreal与Zima分别为阻抗的实部与虚部；i(t)为电流；Uc(t)为阻抗虚部的电位能；U(t)为所量测的电位能。
人体血清试验:
调配以人体血清调配浓度为6.382、7.382、8.882、11.382μg/ml的C-反应蛋白溶液，由PIP薄膜抓取C-反应蛋白后,以SDS溶剂将抓取的C-反应蛋白溶出，并输送至感测电极上，此感测电极可经由表面硫化改质或以抗体修饰来抓取分离的C-反应蛋白，并由动态电容量测法来获得电极表面电位变化如图11所示，该图是于第75秒量测，并于第80秒结束量测，微流道深度为125μm；其中，不同浓度呈现不同动态电位下降结果，再依其下降曲线计算出不同浓度样本的时间常数，如图12所示。故即可依此时间常数与C-反应蛋白浓度的对应关系，判断未知浓度的C-反应蛋白的浓度。此外，请参考图13，该图为C-反应蛋白的感测微晶片系统的感测电极于第二腔体中动态吸附目标蛋白质的表面电容变化图，可知侦测器反应时间为10秒(故量测分析总时间约70秒)，与传统ELISA分析时间为数小时(>2小时)相较，大幅降低了检测所需时间。
Claims (19)
1.一种具固定相位的C-反应蛋白所拓印的薄膜，包含复数个固定相位的拓印孔洞，这些拓印孔洞是借由移除复数个C-反应蛋白而产生，其中这些C-反应蛋白连结于改质的第一基板表面的复数个抗体。
2.一种具固定相位的C-反应蛋白抗体所拓印的薄膜，包含复数个固定相位的拓印孔洞，这些拓印孔洞借由移除复数个C-反应蛋白抗体而产生，其中这些C-反应蛋白抗体连结于一改质的第一基板表面。
3.如权利要求1或2所述的薄膜，其中该改质的第一基板表面，借由半胱胺及戊二醛与该第一基板表面的金层反应所获得。
4.如权利要求3所述的薄膜，进一步于该反应中使用甘氨酸阻隔未连接这些抗体的戊二醛醛基基团。
5.如权利要求1所述的薄膜，其中这些C-反应蛋白进一步与O-4-硝基苯基磷胆碱接触形成复数个预聚合复合物。
6.如权利要求2所述的薄膜，其中这些C-反应蛋白抗体进一步与O-4-硝基苯基磷胆碱接触形成复数个预聚合复合物。
7.如权利要求5或6所述的薄膜，其中该复数个预聚合复合物与第二基板的组合物进行微接触，且该组合物由交联剂与起始剂所组成。
8.如权利要求7所述的薄膜，其中该交联剂为二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。
9.如权利要求7所述的薄膜，其中该起始剂为2,2’-二甲基-2-苯基苯乙酮、1-羟基-环己基-苯酮、对-苯基二苯酮或苯甲基二甲基缩酮。
10.如权利要求7所述的薄膜，其中该交联剂与该起始剂的摩尔比例范围为600:1~640:1。
11.一种C-反应蛋白的感测晶片系统，包含：
晶片本体，包含；
第一腔体，该第一腔体内设有一如权利要求1或2所述的薄膜，且该第一腔体分别连通设置第一流通口与第二流通口，借以使含有C-反应蛋白的待测溶液由该第一流通口注入后流经该拓印薄膜，而由该第二流通口流出；
第二腔体，该第二腔体内设有感测电极，且该第二腔体分别连通设置第三流通口与第四流通口，借由萃取溶液使该拓印薄膜上的C-反应蛋白经由该第三流通口流至该第二腔体；以及
侦测器，侦测该感测电极的电位变化，并根据该电位变化产生侦测结果。
12.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该感测电极为金电极。
13.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该感测电极为指叉状电极。
14.如权利要求13所述的感测晶片系统，其中该指叉状电极由镀金玻璃材料经微影制程所制成。
15.如权利要求11至13任一项所述的感测晶片系统，其中该感测电极表面经硫化改质或以抗体修饰。
16.如权利要求15所述的感测晶片系统，其中该抗体为生物抗体或人工抗体。
17.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该晶片本体为平板状。
18.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该电位变化由该感测电极与该第二腔体内的萃取溶液所形成的等效电路，与该侦测器的感测电路的电位能动态平衡所造成。
19.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该侦测结果由该电位变化的时间常数判定。
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