CN113759126B - α-突触核蛋白感测薄膜及其制造方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明关于一种α‑突触核蛋白感测薄膜及其制造方法与用途，其中α‑突触核蛋白感测薄膜包含一基板以及聚合于所述基板上的多个α‑突触核蛋白辨识聚合物，每一α‑突触核蛋白辨识聚合物表面具有多个可辨识α‑突触核蛋白的微孔洞；所述α‑突触核蛋白辨识聚合物是通过电聚合法制成，且表面的微孔洞是利用α‑突触核蛋白多肽印迹所获得；将一样本与上述的α‑突触核蛋白感测薄膜反应，便可以检测样本中的α‑突触核蛋白。
Description
技术领域
本发明是关于一种α-突触核蛋白感测薄膜及其制造方法与用途，是使用α-突触核蛋白印迹于高分子聚合物上，以制得α-突触核蛋白感测薄膜，并用于检测样本中的α-突触核蛋白。
背景技术
α-突触核蛋白(α-synuclein)在人脑组织中的含量高，其在细胞中主要分布于神经细胞的尖端，目前认为α-突触核蛋白与调节多巴胺(dopamine)的释放有关。正常的α-突触核蛋白为可溶性蛋白，但是发生变异后的α-突触核蛋白会大量堆积在神经元内部，且无法被清除，进而影响到脑部的正常功能，甚至会使神经元大量死亡；目前认为α-突触核蛋白与多种神经性退化疾病，例如巴金森氏症(Parkinson’s disease)、路易氏体失智症(dementia with Lewy bodies)或是多发性系统萎缩症(multiple system atrophy)都有关连性。
现今检测血清或血浆中α-突触核蛋白的方法主要是利用抗体检测α-突触核蛋白，例如CN109001452A公开揭露了一种α-突触核蛋白积聚的检测探针，是以磁性颗粒为载体，并在其表面连接α-突触核蛋白单株抗体，以合成一种可检测帕金森氏病的探针；CN109180812A公开揭露了一种识别α-突触核蛋白的抗体，此抗体会结合到α-突触核蛋白的第118～126氨基酸，以诊断α-突触核蛋白的相关疾病。然而，抗体的筛选与制备不易，且以抗体检测α-突触核蛋白的方法所需要的时间也较高，因此在使用上不仅成本较高，且不方便。
发明内容
本发明是关于一种α-突触核蛋白感测薄膜及其制造方法与用途，是使用α-突触核蛋白的多肽片段印迹于高分子聚合物上，以制得α-突触核蛋白感测薄膜，并用于检测样本中的α-突触核蛋白。
本发明揭露的α-突触核蛋白感测薄膜，包含一基板以及一聚合于基板上的多个α-突触核蛋白辨识聚合物，其中每一所述α-突触核蛋白辨识聚合物表面具有多个可辨识α-突触核蛋白的微孔洞。
本发明亦揭露一种制备α-突触核蛋白感测薄膜的方法，是将一α-突触核蛋白多肽与一高分子聚合物单体混合，以电聚合方法设置于一导电基板上，其中所述α-突触核蛋白多肽序列是选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4所构成的群组。
本发明也揭露一种检测α-突触核蛋白的方法，是将一待测样本与一α-突触核蛋白感测薄膜反应，以检测所述待测样本中的α-突触核蛋白，其中所述α-突触核蛋白感测薄膜包含一基板以及一聚合于所述基板上的多个α-突触核蛋白辨识聚合物，且其中每一所述α-突触核蛋白辨识聚合物表面具有多个可辨识α-突触核蛋白的微孔洞。
于本发明的一实施例中，基板为导电基板，α-突触核蛋白辨识聚合物为α-突触核蛋白多肽印迹的高分子聚合物。
于本发明的一实施例中，导电基板为氧化铟锡(indium tin oxide，ITO)基板、PET可挠式导电玻璃基板、掺铝氧化锌(AZO)导电基板、掺氟氧化锡(FTO)导电基板与二氧化硅导电基板其中至少一种，且所述高分子聚合物的单体为3，4-亚乙基二氧噻吩(3，4-ethylenefioxythiophene，简称EDOT)以及羟甲基3，4-二氧乙基噻吩(hydroxymethyl 3，4-ethylenedioxy-thiophene，简称EDOT-OH)其中至少一种。
于本发明的一实施例中，α-突触核蛋白多肽序列是选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4所构成的群组。
于本发明的一实施例中，α-突触核蛋白感测薄膜的电流密度介于0.01～500mA。
于本发明的一实施例中，待测样本为一血液样本、一尿液样本、一唾液样本、一汗液样本、一泪液样本、一脑脊液样本或是自组织或器官中获得的样本其中至少一种。
由此，本发明制得的α-突触核蛋白感测薄膜，是将α-突触核蛋白多肽与高分子材料混合后，经过电聚合反应，以在一基板上形成可辨识α-突触核蛋白的聚合物，其能专一性辨识并结合α-突触核蛋白，且使用上相当方便。
附图说明
图1为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的制造方法示意图。
图2为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的安培法检测分析图。
图3为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的接触角分析图。
图4为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的扫描式电子显微镜照片。
图5为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的扫描式原子力显微镜照片以多肽1、多肽2或多肽3印迹的α-突触核蛋白感测薄膜的电流密度差值分析图。
图6为本发明以多肽1、多肽2或多肽3印迹的α-突触核蛋白感测薄膜的电流密度差值分析图。
图7为本发明的多肽3印迹的α-突触核蛋白感测薄膜的电流密度差值分析图。
图8为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的电流密度差值分析图。
图9为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的电流密度对应扫描速率的平方根分析图。
图10为本发明以多肽4与硫化钨印迹的α-突触核蛋白感测薄膜的电流密度分析图。
图11为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的循环伏安分析图。
图12为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的氧化峰值(oxidation peak current)电流密度分析图。
图13为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的交流阻抗(AC impedance)分析图。
图14为本发明α-突触核蛋白感测薄膜与SNCA蛋白质作用的电流密度分析图。
图15为本发明α-突触核蛋白感测薄膜的重复使用次数分析图。
图16为本发明α-突触核蛋白感测薄膜吸附SNCA能力分析图(一)。
图17为本发明α-突触核蛋白感测薄膜吸附SNCA能力分析图(二)。
图18为本发明α-突触核蛋白感测薄膜吸附SNCA能力分析图(三)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明揭露一种α-突触核蛋白感测薄膜、其制造方法与用途，α-突触核蛋白感测薄膜包含一基板以及聚合于基板上的多个α-突触核蛋白辨识聚合物，其中每一α-突触核蛋白辨识聚合物表面具有多个可辨识α-突触核蛋白的微孔洞；基板为导电基板，可为但不限于氧化铟锡基板、PET可挠式导电玻璃基板、掺铝氧化锌(AZO)导电基板、掺氟氧化锡(FTO)导电基板与二氧化硅导电基板，且α-突触核蛋白辨识聚合物是为一α-突触核蛋白多肽印迹的高分子聚合物，其中的高分子聚合物的单体可为3，4-亚乙基二氧噻吩以及羟甲基3，4-二氧乙基噻吩其中至少一种，且高分子聚合物是经过电聚合反应后所获得；此外，用于印迹的α-突触核蛋白多肽序列是选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4所构成的群组，而制得的α-突触核蛋白感测薄膜可用于检测待测样品中的α-突触核蛋白。
请参见图1，本发明中制备α-突触核蛋白感测薄膜的方法，是将一目标多肽与一高分子聚合物单体混合，以电聚合方法设置于一导电基板上，其中所述目标多肽为α-突触核蛋白多肽，且序列是选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4所构成的群组；电聚合反应后，再将目标多肽移除，便可获得α-突触核蛋白感测薄膜。
一、α-突触核蛋白感测薄膜的制备
准备一可导电的氧化铟锡(ITO)基板，并依序以去离子水、异丙醇以及酒精清洁后烘干。
首先，于ITO基板上以循环伏安法沉积一聚羟甲基3，4-二氧乙基噻吩(poly(EDOT-OH))薄层，以获得一预沉积基板，制作方法简述如下：将ITO基板为工作电极、以银/氯化银(Ag/AgCl)作为参考电极、以及以含有10mM的EDOT-OH、100mM的过氯酸锂(LiClO4)、以及50mM的十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)的水溶液作为电解溶液，以-0.6V～1.1V的循环电位、扫描速率100mV/sec的条件，进行小于3次循环的扫描，以在ITO基板上沉积一poly(EDOT-OH)薄层，poly(EDOT-OH)可以提高后续电聚合反应中、聚合物与ITO基板的附着力。
接着，将3，4-亚乙基二氧噻吩(EDOT)、羟甲基3，4-二氧乙基噻吩(EDOT-OH)以及含有等摩尔数的EDOT与EDOT-OH的混合物分别溶解于含有100mM的高氯酸四丁基铵(tetrabutylammonium perchlorate，TBAP)的二氯甲烷(CH2Cl2)溶剂中，以配置10mM(浓度)的EDOT溶液、10mM(浓度)EDOT-OH溶液以及包含10mM的EDOT/EDOT-OH混合溶液；接着，先将电极浸泡于0℃的溶液中3分钟，再实施电聚合反应，本实施例的电聚合反应是于固定电压1.1V vs Ag/Ag+的条件，作用10秒，以于上述的预沉积基板的表面沉积具有微纳米结构的PEDOT(poly-EDOT)、poly(EDOT-OH)以及EDOT/EDOT-OH的共聚物。
于进行多肽印迹时，先将α-突触核蛋白的多肽，溶解于去离子水中，以获得一α-突触核蛋白多肽溶液，本次实验中分别使用四段α-突触核蛋白的多肽进行印迹，以下称为多肽1、多肽2、多肽3与多肽4，多肽1的序列为SEQ ID NO:1，多肽2的序列为SEQ ID NO:1，多肽3的序列为SEQ ID NO:3，以及多肽4的序列为SEQ ID NO:4。
接着将上述配置的EDOT溶液、EDOT-OH溶液以及EDOT/EDOT-OH混合溶液，分别与四种α-突触核蛋白多肽溶液混合，并使α-突触核蛋白多肽混合溶液中的多肽浓度为0.01mg/mL，以获得一α-突触核蛋白多肽混合溶液；接着进行电聚合反应，步骤简述如下：以上述准备的可导电的ITO基板为工作电极(working electrode)，以白金电极作为辅助电极(counter electrode)，以及使用银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参考电极，并以上述的α-突触核蛋白多肽混合溶液作为导电液，固定电压1.1V vs Ag/Ag+的条件，进行电聚合反应，接着取出氧化铟锡基板，依序以去离子水、5(v/v)％酒精水溶液交替清洗两次，以洗去未聚合化合物单体以及多肽，便可获得α-突触核蛋白感测薄膜(后续简称MIPs)；在α-突触核蛋白感测薄膜上形成有多个α-突触核蛋白辨识聚合物，且每一α-突触核蛋白辨识聚合物上具有多个可辨识α-突触核蛋白的微孔洞。此外，同时制备仅使用EDOT溶液、EDOT-OH溶液以及EDOT/EDOT-OH混合溶液、而没有加入多肽溶液进行电聚合反应的组别，以获得一无印迹感测薄膜，以作为对照组，后续将其简称为NIPs。
此外，为了区分不同材料与α-突触核蛋白多肽制备的α-突触核蛋白感测薄膜，后续的MIPs将以“MIPs_高分子材料_多肽种类”方式呈现，例如“MIPs_EDOT_多肽1”代表用于电聚合的高分子材料为EDOT，且是使用多肽1作为印迹模板，以此类推。
接着，将面积1平方公分的α-突触核蛋白感测薄膜作为工作电极，以白金电极、钨钼合金电极或是陶瓷铜合金作为辅助电极(counter electrode)，以及使用银/氯化银电极、铜钨合金、银钨合金、钨钼合金或铬铜合金等等作为参考电极，再将三种电极浸泡于铁氯化钾/亚铁氰化钾电解液中，再以恒电位仪进行电化学测量分析；以下实施例中，辅助电极为白金电极、参考电极为银/氯化银电极。
首先，请参见图2中的(A)，为不同单体溶液以及以多肽1搭配不同单体溶液，于给予1.1V的电压强度进行电聚合反应时，电聚合过程中不同时间的电流密度分析图，于多肽1印迹的组别中，MIPs_EDOT-OH具有最高的电流密度，约为350～400μm/cm2，MIPs_EDOT的电流密度最低，约为200～250μm/cm2；再请参见图2中的(B)，为各感测薄膜于通电后20秒时的电流密度，于无多肽印迹的组别中，NIPs_PEDOT的电流密度约为50μm/cm2，低于MIPs_PEDOT的电流密度，于另外二组别中，经多肽印迹所制得的感测薄膜(MIPs)，其电流密度都高于无印迹感测薄膜(NIPs)。
请再参见图3中的(A)，为NIPs_EDOT-OH以及MIPs_EDOT-OH的水接触角分析图，根据图3中的(A)，在感测薄膜合成后、未移除模板的状态下，NIPs_EDOT-OH的接触角约为35.0±1.1°，低于MIPs_EDOT-OH感测薄膜的接触角(54.2±0.6°)，表示MIPs_EDOT-OH感测薄膜的表面疏水性较强；在将模板移除后，NIPs_EDOT-OH与MIPs_EDOT-OH的接触角都增加，表示二者的表面疏水性也都提高了；又，将NIPs_EDOT-OH与MIPs_EDOT-OH与印迹模板作用后，二者的接触角度相近，都约为102.9±3.7°。再请参见图3中的(B)，为以5(v/v)％乙醇清洗后的MIPs_EDOT-OH感测薄膜的化学分析电子光谱的分析结果，结果显示5(v/v)％乙醇确实能清洗掉所有的印迹模板。
请参见图4，为NIPs_EDOT-OH与MIPs_EDOT-OH的扫描式电子显微镜观察照片，照片中较亮的区域具有高度的光散射性，通常代表粗糙度较高的区域；图4中的(a)是MIPs_EDOT-OH于模板未移除时的扫描式电子显微镜照片，图4中的(b)是NIPs_EDOT-OH于模板未移除时的扫描式电子显微镜照片，都呈现出类似的管状构造，表示电聚合过程中，模板多肽的存在并不会影响EDOT-OH聚合物纳米结构的形成。
图4中的(c)是MIPs_EDOT-OH于移除模板后的扫描式电子显微镜照片，图4中的(d)是NIPs_EDOT-OH于移除模板后的扫描式电子显微镜照片，二者也具有类似的管状构造；图4中的(e)是MIPs_EDOT-OH重新与模板作用后的扫描式电子显微镜照片，图4中的(f)则是NIPs_EDOT-OH重新与模板作用后的扫描式电子显微镜照片，二者也具有类似的管状构造。
又，图5为NIPs_EDOT-OH与MIPs_EDOT-OH的原子力显微镜(Atomic ForceMicroscope)观察照片，图5中的(a)是未移除模板的MIPs_EDOT-OH，图5中的(b)是未移除模板的NIPs_EDOT-OH，图5中的(c)是移除模板后的MIPs_EDOT，图5中的(d)是移除模板后的NIPs_EDOT，图5中的(e)是重新与模板结合后的MIPs_EDOT，图5中的(f)则是重新与模板结合后的NIPs_EDOT，于所有的这片中都可以观察到管状构造，表示模板多肽的存在并不会影响电聚合过程EDOT-OH聚合物纳米结构的形成。
将制得的α-突触核蛋白感测薄膜以循环伏安法分析，扫描电压为-0.85～0.8伏特(V)，扫描速率为0.1V/秒，并将所得到的结果计算印迹效率；印迹效率的计算公式为：
印迹效率(α)＝MIPs电流量/NIPs电流量
请参见图6中的(A)，为使用多肽1印迹所得到的MIPs，MIPs_EDOT_多肽1的电流密度差值(current density differences，Δcurrent density)为0.586mA/cm2，而NIPs_EDOT的电流密度差值则为0.361mA/cm2；又，MIPs_EDOT/EDOT-OH_多肽1的电流密度差值也为0.572mA/cm2，而NIPs_EDOT/EDOT-OH的电流密度差值则为0.552mA/cm2；此外，MIPs_EDOT_OH-多肽1的电流密度差值为0.439mA/cm2，而NIPs_EDOT的电流密度差值则为0.173mA/cm2；而各组的印迹效率分别为：EDOT_多肽1的α值为1.623，EDOT/EDOT-OH_多肽1的α值为1.036，以及EDOT-OH_多肽1的α值为2.537，表示在使用多肽1为印迹模板的各组别中，以EDOT-OH作为高分子原料所获得的α-突触核蛋白感测薄膜具有较佳的印迹效率。
请参阅图6中的(B)，为使用多肽2印迹所得到的MIPs，MIPs_EDOT_多肽2的电流密度差值为0.369mA/cm2，而NIPs_EDOT的电流密度差值则为0.203mA/cm2；又，MIPs_EDOT/EDOT-OH_多肽2的电流密度差值也为0.740mA/cm2，而NIPs_EDOT/EDOT-OH的电流密度差值则为0.475mA/cm2；此外，MIPs_EDOT-OH_多肽2的电流密度差值为0.530mA/cm2，而NIPs_EDOT的电流密度差值则为0.444mA/cm2；而各组的印迹效率分别为：EDOT_多肽2的α值为1.82，EDOT/EDOT-OH_多肽2的α值为1.56，以及EDOT-OH_多肽2的α值为1.19，表示在使用多肽2为印迹模板的各组别中，以EDOT作为高分子原料所获得的α-突触核蛋白感测薄膜具有较佳的印迹效率。
请再参阅图7，为使用多肽3印迹所得到的MIPs，MIPs_EDOT_多肽3的电流密度差值为0.6205mA/cm2，而NIPs_EDOT的电流密度差值则为0.565mA/cm2；又，MIPs_EDOT/EDOT-OH_多肽3的电流密度差值为0.688mA/cm2，而NIPs_EDOT/EDOT-OH的电流密度差值则为0.602mA/cm2；此外，MIPs_EDOT-OH_多肽3的电流密度差值为0.333mA/cm2，而NIPs_EDOT的电流密度差值则为0.144mA/cm2；各组的印迹效率分别为：EDOT_多肽3的α值为1.10，EDOT/EDOT-OH_多肽3的α值为1.14，以及EDOT-OH_多肽3的α值为2.31，表示在使用多肽3为印迹模板的各组别中，以EDOT-OH作为高分子原料所获得的α-突触核蛋白感测薄膜具有较佳的印迹效率。
再请参见图8，再将EDOT-OH_多肽1、EDOT_多肽2与EDOT-OH_多肽3组别的α-突触核蛋白感测薄膜进行检测，MIPs_EDOT-OH_多肽1的电流密度差值为0.439mA/cm2，而NIPs_EDOT-OH的电流密度差值则为0.173mA/cm2，印迹效率α值为2.54；MIPs_EDOT_多肽2的电流密度差值为0.369mA/cm2，而NIPs_EDOT的电流密度差值则为0.203mA/cm2，印迹效率α值为1.82；MIPs_EDOT-OH_多肽3的电流密度差值为0.333mA/cm2，而NIPs_EDOT-OH的电流密度差值则为0.144mA/cm2，印迹效率α值为2.31；此结果表示以EDOT-OH作为高分子原料、以多肽1作为印迹模板所获得的α-突触核蛋白感测薄膜具有较佳的印迹效率。
请再参见图9，为MIPs_EDOT-OH_多肽1(图中标示为MIPs)与NIPs_EDOT-OH(图中标示为NIPs)的电流密度对应扫描速率的平方根的分析图，是用于分析二者电流峰值(peakcurrent)的线性关系，又根据Randles-Sevcik方程式，可计算出MIPs_EDOT-OH_多肽1的表面积为1.746cm2，以及NIPs_EDOT-OH的表面积为1.726cm2。
又，图10为使用50μg的多肽4与50μg硫化钨(WS2)进行印迹所获得α-突触核蛋白感测薄膜(MIPs_多肽4+WS2)，以及使用无印迹感测薄膜(NIPs)，感测浓度介于0.001～1000pg/mL的α-突触核蛋白，再进行电流密度差值分析的结果，根据图10，MIPs_多肽4+WS2的印迹效率α值为2.3。
请参见图11中的(A)，为使用浓度为0.000065nM～65nM的多肽1溶液，与MIPs_EDOT-OH_多肽1作用后，再以循环伏安法分析，以获得的循环伏安分析图，图11中的(B)则为NIPs_EDOT-OH与0.000065nM～65nM的多肽1溶液作用后的循环伏安分析图，其中MIPs_EDOT-OH_多肽1的氧化峰值为410-420mV，且还原电压介于90-100mV；根据图11中的(A)，未与多肽1作用的MIPs_EDOT-OH_多肽1，其氧化峰值电流密度为7.4mA/cm2，但与多肽1作用后，其氧化峰值电流密度会逐渐上升；又根据图11中的(B)，未与多肽1作用的NIPs_EDOT-OH，其氧化峰值电流密度为6.9mA/cm2，但与0.65nM(1.0ng·mL-1)多肽1作用后，其氧化峰值电流密度会上升，为7.1mA/cm2。
再请参见图12中的(A)，为使用不同聚合物单体、以多肽1印迹获得的α-突触核蛋白感测薄膜，与不同浓度的多肽1作用后，以循环伏安分析法所获得的氧化峰值(oxidationpeak current)电流密度的变化曲线图，其中有多肽印迹所获得的α-突触核蛋白感测薄膜，与无多肽印迹的组别相比，都具有较高的氧化峰值电流密度，且各组别的α-突触核蛋白感测薄膜，与越高浓度的多肽1作用后，其电流密度氧化峰值也都会随之上升，表示所制备的α-突触核蛋白感测薄膜都具备有感测α-突触核蛋白的能力；又，MIPs_EDOT-OH-多肽1与NIPs_EDOT-OH，二者的电流密度氧化峰值差异最大。再请参见图12中的(B)，为以多肽1印迹的各种α-突触核蛋白感测薄膜(MIPs)，以及无印迹感测薄膜(NIPs)，与0.65nM的多肽1溶液作用后，所获得的电流密度分析图，其中以MIPs_EDOT-OH的电流密度为高，次高者为MIPs_EDOT/EDOT-OH，而以MIPs_EDOT的电流密度最低；但是在无多肽印迹的组别中，NIPs_EDOT-OH的电流密度最低、NIPs_EDOT/EDOT-OH与NIPs_EDOT的电流密度则近似。
请参见图13，为MIPs_EDOT-OH-多肽1与NIPs_EDOT-OH的奈奎斯特图(Nyquistplot)，是用于表示其交流阻抗(AC impedance)特性，于印迹后洗去多肽模板(图中标示为“After washing”)，以及再与多肽1结合后(图中标示为“Rebound”)的电阻抗讯号测量结果；其中，NIPs_EDOT-OH的电阻抗讯号，于洗去多肽模板以及与多肽1结合后，都无明显变化，但是MIPs_EDOT-OH-多肽1于结合多肽1后，其交流电阻抗讯号会下降。
请参见图14，为NIPs_EDOT-OH与MIPs_EDOT-OH_多肽1，分别与0.65nM的多肽1、于第53个氨基酸丙氨酸由(alanine)突变成苏氨酸(threonine)的α-突触核蛋白(SNCA_A53T)、以及于第64号氨基酸由谷氨酸(glutamic acid)突变成赖氨酸(Lysine)以及第53个氨基酸丙氨酸由(alanine)突变成苏氨酸(threonine)的双突变的α-突触核蛋白(SNCA_E64K/A53T)作用后，所检测到的电流密度差值，与突变SCNA作用的MIPs_EDOT-OH_多肽1，其电流密度差值有明显下降的情形。
请参见图15，为本发明MIPs_EDOT-OH_多肽1的重复使用次数分析图，将MIPs_EDOT-OH_多肽1与0.65nM(1ng/mL)的多肽1溶液作用后，测量其电流密度，以获得第一次的测量结果；接着以清水清洗MIPs_EDOT-OH_多肽、阴干，再与1ng/mL的多肽1溶液作用，再测量电流密度，以获得第二次的测量结果；重复上述步骤，总共进行六次的测量，并将第一次测量结果视为100％，计算第2～6次测量结果的相对电流(relative current)；根据图15，六次测量结果的差距都不大，只有第六次测量结果的相对电流有些微下降的情形，表示本发明的α-突触核蛋白感测薄膜确实可以重复使用，且重复使用后的测量结果也具有可信度。
请再参见图16，为本发明MIPs_EDOT-OH_多肽1，以及NIPs_EDOT-OH，与不同浓度的α-突触核蛋白(SNCA)溶液，分别作用5分钟、10分钟与20分钟后，其电流密度差值的测量结果；图16显示，作用20分钟后，MIPs_EDOT-OH_多肽1具有最高的电流密度差值，且与NIPs_EDOT-OH具有明显差异，其次为作用10分钟的组别，也与NIPs_EDOT-OH具有明显差异；而作用5分钟的组别，MIPs_EDOT-OH_多肽1，以及NIPs_EDOT-OH的电流密度差值并无明显差异。
接着请参见图17，是先将MIPs_EDOT-OH_多肽1，以及NIPs_EDOT-OH分别与不同浓度的α-突触核蛋白(SNCA)作用，之后再以ELISA的方式检测MIPs_EDOT-OH_多肽1，以及NIPs_EDOT-OH可结合的SNCA量；图17的结果显示，MIPs_EDOT-OH_多肽1的SNCA最大结合量约为3.65μg/cm2。
接着，使用以SNCA未突变(图中标示为“wt”)以及SNCA基因具有三重复突变(图中标示为“3X”)的两株诱导性多能干细胞株(induced pluripotent stem cells)，先将其诱导成腹侧神经上皮干细胞(ventralized neural epithelial stem cell，简称为vNESCs)，再使vNESCs发育成中脑类器官(midbrain organioid)；将中脑类器官培养持续于培养基中，每三日换一次培养基，并于培养后第29日以及第38日收集培养基，进行后续试验。图18中的(A)为以MIPs_EDOT-OH_多肽1测量培养基中α-突触核蛋白(SNCA)浓度的试验结果，培养后第29日，wt组培养基中的SNCA浓度为186.7(±11.1％)fM，而3X组培养基中的SNCA浓度为228.2(±12.1％)fM；培养后第38日，wt组培养基中的SNCA浓度为172.9(±8.0％)fM，而3X组培养基中的SNCA浓度为325.0(±8.5)fM，显然3X组的中脑类器官确实表现较高量的SNCA。图18中的(B)是将所培养的中脑类器官，以免疫荧光染色法检测其中的SNCA表现情形，表现有SNCA的区域会呈现红色；根据图18中的(B)，wt组的中脑类器官内并无明显表现SNCA，但是3X组的中脑类器官内并确实可检测到大量的SNCA。
此外，本发明制得的α-突触核蛋白感测薄膜，可用于检测多种样本中的α-突触核蛋白含量，这些样本可为但不限于血液样本、尿液样本、唾液样本、脑脊液样本、或是自组织或器官中萃取得到的样本内的α-突触核蛋白含量，使用方便且准确性高。
序列表
<110> 陈月端
<120> α-突触核蛋白感测薄膜及其制造方法与用途
<130> GAI21TW3554
<150> 109118820
<151> 2020-06-04
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 1
Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val Val His Gly Val Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 4
Ala Glu Ala Ala Gly Lys Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr
1 5 10
Claims (6)
1. 一种能够重复使用的α-突触核蛋白感测薄膜，其包含一基板以及一聚合于所述基板上的多个α-突触核蛋白辨识聚合物，其中每一所述α-突触核蛋白辨识聚合物表面具有多个可辨识α-突触核蛋白的微孔洞，其中所述α-突触核蛋白辨识聚合物为α-突触核蛋白多肽印迹的高分子聚合物，且其中所述α-突触核蛋白多肽的序列是选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4所构成的群组，并且所述高分子聚合物的单体为3,4-亚乙基二氧噻吩以及羟甲基3,4-二氧乙基噻吩单体其中至少一种。
2.根据权利要求1所述的α-突触核蛋白感测薄膜，其中所述基板为导电基板，所述导电基板为一氧化铟锡基板，且所述高分子聚合物的单体由3,4-亚乙基二氧噻吩以及羟甲基3,4-二氧乙基噻吩单体组成。
3. 一种制备能够重复使用的α-突触核蛋白感测薄膜的方法，其是将一α-突触核蛋白多肽与一高分子聚合物单体混合，并以电聚合方法聚合于一导电基板上，其中所述α-突触核蛋白多肽序列是选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4所构成的群组，并且所述高分子聚合物的单体为3,4-亚乙基二氧噻吩以及羟甲基3,4-二氧乙基噻吩单体其中至少一种。
4.根据权利要求3所述的制备α-突触核蛋白感测薄膜的方法，其中所述导电基板为一氧化铟锡基板。
5.一种使用权利要求1所述的能够重复使用的α-突触核蛋白感测薄膜检测α-突触核蛋白的方法，其是将一待测样本与一α-突触核蛋白感测薄膜反应，以检测所述待测样本中的α-突触核蛋白，其中所述α-突触核蛋白感测薄膜包含一基板以及一聚合于所述基板上的多个α-突触核蛋白辨识聚合物，且其中每一所述α-突触核蛋白辨识聚合物表面具有多个可辨识α-突触核蛋白的微孔洞。
6.根据权利要求5所述的检测α-突触核蛋白的方法，其中所述待测样本为一血液样本、一尿液样本、一唾液样本、一汗液样本、一泪液样本、一脑脊液样本其中至少一种。
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