TW201326386A - 具固定相位之ｃ－反應蛋白所拓印之薄膜及其應用於感測晶片系統 - Google Patents

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Abstract

本發明係為一種具固定相位之C-反應蛋白所拓印之薄膜及其應用於感測晶片系統。本發明將蛋白質抗體接於金層上，因此可固定蛋白質於其上，使能統一蛋白質相位，進而聚合出相似之拓印孔洞，利用本發明之C-反應蛋白拓印薄膜的方法製造之C-反應蛋白拓印薄膜，其對目標蛋白質吸附能力約為生物抗體之99%。另外，本發明利用上述C-反應蛋白拓印薄膜以及動態電容感測技術，提供一種C-反應蛋白之感測晶片系統。

Description

具固定相位之C-反應蛋白所拓印之薄膜及其應用於感測晶片系統
本發明係關於一種製備拓印蛋白質分子拓印薄膜及其應用，尤其關於一種具固定相位之C-反應蛋白拓印薄膜及其應用於感測晶片系統。
現今醫學技術已達到一定水準，但仍面臨了一些醫治率低或難以檢測的疾病，這些疾病往往不是單一原因造成的，因此診斷也較為不易。而各種疾病都會造成一個共同的現象-發炎。以往認為是後天生活習慣所造成的文明病，如心血管疾病、糖尿病、阿茲海默氏症、過敏症、癌症及自體免疫疾病等，經研究發現同樣與發炎反應有著密切的關係，此發現更刊登在2004年時代雜誌封面。
由發炎反應所引起的這些疾病有兩個共通點：一、並非單一病因所造成，使得主要病因檢驗十分不便；二、疾病初期較容易控制與治療，拖到中後期往往難以治癒，甚至成為不治之症，使得初期診斷很重要，越早精確地預測出疾病發生的可能性，越能夠避免這些疾病的威脅。
C-反應蛋白(c-reactive protein,CRP)是由肝臟分泌，在外傷、局部缺血、燒傷、各種發炎與感染時數量會迅速上升1,000倍以上，狀況緩解後也會很快下降，所以C-反應蛋白被當作主要發炎的指標。臨床上用途主要在於組織損傷的篩檢和監測，判斷病人是否發炎及診斷發炎性疾病復發的可能性，藉以評估抗發炎藥物治療的成效。另外，早產也被認為是一種感染造成之炎性反應，故對於待產的孕婦，C-反應蛋白亦為一個重要的檢測項目。
早產常造成新生兒很高的死亡率及罹病率，目前仍是產科學無法克服的主要問題之一。自發性早產是指不明原因或早期破水導致在妊娠37週以前生產者。早產是一個多發性病因的疾病，不容易由臨床症狀或單一檢查來預判。當孕婦因臨床病癥被診斷為早產時，常已面臨即將分娩而無法安胎，因此發展臨床診斷工具提早來預測早產可能性有其重要和必要性。而因早產也被認為可能是一種發炎反應，故C-反應蛋白為即將生產的指標蛋白質之一，可觀察孕婦體內的C-反應蛋白濃度是否在非預產期時有不正常升高的現象，而提早準備孕婦早產處理，減少早產兒因時間拖延不及照顧而導致的併發症。
蛋白質感測於生物醫學發展上一直是個受到重視的研究領域，但現今蛋白質感測的感測層多半使用生物性分子。這個問題於2010年的μTAS會議中被提出討論，使用生物性分子作為感測層的研究無法離開實驗室，因此蛋白質檢測始終停留在檢驗所的階段，需要長時間的檢測時間、專業的檢測人員、昂貴的實驗儀器或藥劑。
分子拓印技術(Molecular imprinted technology,MIT)是結合有機高分子與無機網絡結構材料，並將模板分子拓印於此材料上，使得拓印孔擁有互補的幾何形狀以及鍵結，具有選擇性的吸附目標分析物。換言之，此技術所製成的辨識層類似於人工抗體，且製程快速、簡易廉價，對於發展生醫感測層有極大的潛能。以小分子為模板分子的拓印技術經過幾十年的發展已相當成熟，但從小分子模板要實施至巨大蛋白質分子模板所遇到的瓶頸大致可分為下面四點：1.蛋白質具有多功能基團，無法針對少數幾種而達到專一性吸附，亦容易造成非特異性吸附的產生；2.蛋白質為巨大分子(分子量6,000 Da-幾百萬Da)難以接近拓印孔洞，亦難脫離；3.蛋白質難溶於普遍使用的拓印溶劑中；4.彈性結構的蛋白質易在太過刺激的環境中因變性而產生形變；故雖發展大分子拓印薄膜至今已超過35年的時間，但進展有限，離有效吸附目標分子仍有一段距離。
為了改進上述缺點，本發明以分子拓印技術的概念發展人工抗體感測層，有別於現今使用的生物分子感測層。本發明提供一種具固定相位之C-反應蛋白所拓印之薄膜，係包含複數個固定相位之拓印孔洞，該些拓印孔洞係藉由移除複數個C-反應蛋白而產生，其中該些C-反應蛋白係連結於一改質的第一基板表面之複數個抗體，其中該改質的第一基板表面，係藉由半胱胺及戊二醛與該第一基板表面之一金層反應所獲得。
在本發明之一實施例中，進一步於該反應中使用甘氨酸阻隔未連接該些抗體的戊二醛醛基基團，且該些C-反應蛋白進一步與O-4-硝基苯基磷膽鹼接觸形成複數個預聚合複合物，該複數個預聚合複合物與一第二基板的組合物進行微接觸，且該組合物係由一交聯劑與一起始劑所組成，該交聯劑與該起始劑之莫耳比例範圍為600:1~640:1；該交聯劑係為二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯或三羥甲基丙烷三丙烯酸酯；該起始劑係為2,2’-二甲基-2-苯基苯乙酮、1-羥基-環己基-苯酮、對-苯基二苯酮或苯甲基二甲基縮酮。
本發明另提供一種C-反應蛋白之感測晶片系統，係包含一晶片本體，包含一第一腔體，該第一腔體內設有一如前兩段所述之薄膜，且該第一腔體分別連通設置一第一流通口與一第二流通口，藉以使一含有C-反應蛋白的待測溶液由該第一流通口注入後流經該薄膜，而由該第二流通口流出；一第二腔體，該第二腔體內設有一感測電極，且該第二腔體分別連通設置一第三流通口與一第四流通口，藉由一萃取溶液使該拓印薄膜上的C-反應蛋白經由該第三流通口流至該第二腔體；以及一偵測器，偵測該感測電極之一電位變化，並根據該電位變化產生一偵測結果。
於本發明C-反應蛋白之感測晶片系統中之一實施例中，該感測電極為一指叉狀電極，且由鍍金玻璃材料經微影製程所製成，該感測電極表面經硫化改質或以抗體修飾；該電位變化係由該感測電極與該第二腔體內之萃取溶液所形成之一等效電路，與該偵測器之一感測電路的電位能動態平衡所造成，且該偵測結果係由該電位變化之時間常數判定。
本發明之一目的為將蛋白分子拓印薄膜結合微流體晶片，製成蛋白質辨識薄膜整合實驗室晶片(lab-on-a-chip,LOC)取代傳統的大型儀器，以達到降低樣本量、能源消耗與產品成本，並簡化樣本處理步驟，提升反應時間與檢測精度，以及系統微小化等訴求，完成新一代可攜帶式、可產品化之生醫感測器。
於臨床上為各種原因(例如早產)監控發炎反應，可藉著偵測C-反應蛋白的濃度得知，而現今針對蛋白質的感測方式除了傳統以質譜儀等大型儀器分析之外，檢驗所及實驗室的蛋白質感測方式主流為酵素免疫分析法(ELISA)，但這些方法必須待在實驗室檢測，且所需時間達數天，較難即時得知病患情況，故發展專門且微小化的生醫診斷平台已成為現今的趨勢。本發明為可攜式臨床診斷工具能夠方便診斷，一方面掌控病患的身體狀況，一方面協助醫師調整診斷方式，較現有的大型儀器便宜、迅速、更貼近病患與醫師的需求。本發明將利用微機電晶片的技術，結合微流道晶片與分子拓印薄模，同時針對不同病因之指標蛋白質進行感測，並且希望發展出奈米生醫的感測平台，只要使用微量(μL)的血漿檢體即可以同時有多種指標蛋白質的分析結果，且不需要專業人員的操作。利用這種分析方法將可以更有效率的用來預測疾病發生的可能。
因此，本發明使用分子拓印技術概念發展的人工抗體感測層，係具有物理穩定性(耐高溫、高壓)、較佳的化學穩定性(耐酸、鹼、有機溶劑與金屬離子)、生命週期長(數年)、可重複使用及價格低廉等多種優點，皆有別於習知使用的生物分子感測層。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
 定義：
本發明說明書中所提及之「人工抗體」，定義為人工製造，且可與特定抗原結合之物，例如本案之C-反應蛋白拓印薄膜。
本發明說明書中所提及之「同向性」一詞，若無特別說明，其意義與「固定相位」相同。
本發明之一實施例的蛋白分子拓印薄膜，係可將蛋白質分子抗體接於金層上，而達到固定蛋白質於其上，且可做到統一蛋白質的相位，聚合出相似之拓印孔洞；另外並檢驗改質後拓印模板上生化分子間作用力，觀察化學分子及生物分子之間產生鍵結的動態變化，藉此建立可重複使用之拓印模板，而降低製程成本。本發明技術特徵包含調整溶劑的混合比例以提高辨識薄膜的專一性，以及調整光聚合時間以定義出完整且結構良好的辨識薄膜。
以下就C-反應蛋白拓印薄膜製備方法、利用原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)測量C-反應蛋白拓印薄膜之表面狀態以及C-反應蛋白之感測微晶片系統分別詳述如下：
實施例1： C-反應蛋白拓印薄膜之製備 1-1　拓印模板
本發明主要製程分為兩部分：拓印模板與蛋白質拓印薄膜。在拓印薄膜方面，本發明之一實施例使用的拓印模板為四吋玻璃晶圓，表面以電子鎗(E-gun)真空蒸鍍厚度為400 nm的金層與25 nm的黏著層(Ti)。
拓印模板之表面改質採用半胱胺-戊二醛(cysteamine-glutaraldehyde)法，如第一圖所示，其中第一個改質試劑為半胱胺(cysteamine)，化學式如式(1)：
利用半胱胺一端的硫鍵上的成對電子對與金原子外層的空軌域形成穩定的配位，此為類似共價鍵結的金-硫鍵結(極性共價鍵)。反應式為：
雖然金很安定，具有高活化能，但金表面容易吸附空氣中的碳氫化合物，硫醇分子與金表面具高鍵能的吸附性質，可以用置換的方式取代金表面吸附的碳氫化合物，因此能夠形成穩定的分子自組單層膜。
第二個改質試劑為戊二醛(glutaraldehyde)，化學式如式(2)：
利用戊二醛一端上的醛基與半胱胺未接合端上的氨基形成希夫鹼(schiff base)，而另一端上的醛基則可與生物分子抗體上的氨基產生鍵結，剩下沒有與抗體作用的醛基，用化學式如式(3)之甘氨酸(glycine)阻隔，以避免目標分子受到非專一性的吸附。
因此，利用半胱胺和金電極表面相互作用形成硫-金鍵結，再以戊二醛一端之醛基與胱胺之胺基形成希夫鹼(Schiff base)，戊二醛另一端之醛基再與抗體分子上之氨基進行接合，藉此把人工抗體固定於金表面。
本發明拓印模板的表面改質處理之示意圖如第二圖所示，拓印模板的表面改質及處理步驟如下，各步驟的溶液皆為20 ml，步驟間清洗以超純水沖洗：
1.準備一塊表面鍍金的玻璃模板，如第二圖(A)，浸泡模板於18 mM半胱胺水溶液中8個小時(於暗室室溫)，之後以超純水潤洗，接著浸泡在含有12%戊二醛水溶液中8個小時，之後以超純水潤洗，如第二圖(B)所示；以及
2.浸在50 μg/ml C-反應蛋白抗體的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，於室溫之下1個小時，形成如第二圖(C)的狀態；加入0.02 M甘氨酸的磷酸鹽緩衝溶液1.5個小時，用來阻隔(block)住沒有接上C-反應蛋白抗體之醛基團(aldehyde)，如第二圖(D)。
依照上述步驟便可得到本發明的抗體陣列模板，其中本發明之一實施例所使用的C-反應蛋白抗體(Anti-CRP)購買於SIGMA-ALDRICH公司，為由鼠腹水製造的抗-C-反應蛋白單株抗體CRP-8，原始濃度為28.5 mg/ml。
改質溶劑鍵結時間探討
將電化學阻抗分析儀之電極的指叉狀部分浸泡於前述步驟1的改質溶液中，以阻抗量測儀器進行監測，由剛開始改質後每五分鐘做一次阻抗量測，欲得知何時改質物質與金表面或其他分子之化學鍵結達到穩定，並依序監測每個改質步驟，藉此將改質製程最佳化。由於改質的狀況變數較多，可能影響每次鍵結的時間有所差異，因此這一部分的分析取一個範圍，最慢到達表面電容值穩定的為基準，以確保每次改質的品質。
經由電化學阻抗頻譜分析(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)監控的結果於分別於半胱胺為8個小時、戊二醛為8個小時、C-反應蛋白抗體為0.8個小時、甘氨酸為1.5個小時，表面電容值趨於穩定，因此將改質步驟浸泡時間訂為半胱胺為8個小時、戊二醛為8個小時、C-反應蛋白抗體為1個小時、甘氨酸為1.5個小時。
於本發明拓印模板表面改質及處理的程序中，C-反應蛋白抗體改質後會繼續接合C-反應蛋白以及功能性單體O-4-硝基苯基磷膽鹼(O-4-nitrophenylphosphorylcholine,O-4NPPC)，此功能性單體之後可與交聯劑聚合形成高分子基質。經由EIS監控的結果，表面電容值分別於1.5個小時與3個小時後，趨於穩定，因此分別將C-反應蛋白及O-4NPPC的改質時間定為1.5個小時與3個小時。
改質步驟間清洗次數探討
於拓印模板改質步驟間，皆會以超純水清洗金表面，洗去未結合的分子，確保改質分子能夠一層層的疊加上去；每次清洗將試片浸置超純水中搖晃數次，重複此動作直到金表面電容值達到穩定，表示已沖洗掉未接合上的分子。以EIS於12 Hz下量測金表面阻抗換算成表面電容的方式，間接推測改質試劑於金表面的狀態。由半胱胺、戊二醛、C-反應蛋白抗體、甘氨酸分別在改質後量測清洗次數造成的表面電容變化曲線看出粉末狀的半胱胺與甘氨酸較容易殘留於金表面，所以需要較多次清洗(半胱胺約需清洗8次；甘氨酸則需清洗6次)，表面電容值才趨於穩定；而戊二醛與C-反應蛋白抗體為溶液態，殘留現象較不明顯，清洗3次後，表面電容即趨於穩定。
1-2　蛋白質拓印高分子薄膜合成
本發明之蛋白質分子拓印技術包含三個步驟：結合(combination)、聚合(polymerization)、萃取(extraction)。結合步驟是將功能性單體(functional monomer)以及模板分子(template molecule)進行混合，因為功能性單體及模板分子之間的作用力結合形成為一預聚合複合物，彼此之間的作用力可能為共價鍵或非共價鍵；聚合步驟為加入起始劑、交聯劑與預聚合複合物均勻混合，起始劑受到光或熱的激發而啟動聚合作用，透過交聯劑與功能性單體的聚合形成高分子基質；而萃取步驟則是將模板分子萃取出後，即形成能夠抓取目標分子的孔洞(cavity)，完成分子拓印薄膜，便可以對特定分子進行辨識。
另外，本發明在蛋白質拓印薄膜方面，以C-反應蛋白(c-reactive protein,CRP)為模板分子，採用微接觸拓印的方式，以紫外光微固化聚合蛋白質拓印高分子薄膜，使用光罩定義其形狀與面積。感測薄膜製程示意圖如第三圖所示。
1.請參考第三A圖(A)之左圖(即為第二圖(D)之抗體陣列模板)，將前述抗體陣列模板浸在5 μg/ml C-反應蛋白的磷酸鹽緩衝溶液中，於室溫下1.5個小時，將C-反應蛋白接於抗體上，即製成如第三A圖(A)之中圖所示。
2.接著參考第三A圖之右圖，將模板浸在溶於超純水的0.1 mg/ml O-4-硝基苯基磷膽鹼(O-4-nitrophenylphosphorylcholine,O-4NPPC)之功能性單體與2 mM鈣離子(Ca2+)中，於室溫下3個小時，使O-4NPPC與模板分子形成預聚合複合物。
3.請參考第三A圖(B)，於交聯劑(二甲基丙烯酸酯，PEG400DMA)中加入分子篩去除抑制劑後，以640:1的莫耳比配製交聯劑與起始劑(2,2’-二甲基-2-苯基苯乙酮，2,2’-dimethoxy-2-phenyl-acetophenon，DMPA)的混合溶液，滴在另一塊清洗過的四吋玻璃晶圓上，並以微接觸方式將蓋於前述處理的模板上方。
4.請參考第四圖，該圖係為C-反應蛋白拓印薄膜之光聚合圖案化製程示意圖，模板21上覆有功能性單體22再蓋有墊片241、242，墊片241、242留有的空間以交聯劑與起始劑混合溶液23充滿再覆上玻璃晶圓25，將試片2置於曝光箱中，墊片為25 μm的高分子拓印薄膜，曝光儀器為紫外光平行曝光機(I-line，365 nm，能量約6.4 mW/cm2，平行光)，曝光時間為300秒，以光罩26定義薄膜形狀及大小，完成含C-反應蛋白之拓印薄膜27。
5.請參考第三A圖(C)，聚合完成後，將C-反應蛋白拓印高分子薄膜浸泡至10%(w/v)十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)與10%(v/v)醋酸的混合溶液中，以超音波振盪30分鐘，萃取出模板分子CRP即完成C-反應蛋白拓印高分子辨識薄膜。
前述第三A圖(A)之中圖，係使用抗體及C-反應蛋白二層的陣列模板，發明人另外已研究出使用只有人工抗體單層的陣列模板，而蛋白質拓印薄膜方面，除使用人工抗體及C-反應蛋白二層的陣列模板製作外，也可以使用單層抗體模板製作，如第三B圖所示。在本發明另一實施例，第四圖的光聚合圖案化製程示意圖中，元件符號27係為具有抗體拓印孔洞之拓印薄膜(AIP)，其係利用抗體負向結構鍵結來抓取蛋白質，此同樣具有蛋白質結合的專一性，且成本也比二層式大幅降低。
實施例2： 利用AFM測量C-反應蛋白拓印薄膜之表面狀態
原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)以微懸臂樑的震盪及其前端之細小探針來感測與樣本之間的各種相互作用，如機械接觸力、凡得瓦力、化學鍵、靜電力、磁力等，探針的前端以雷射光定位，並於反射處用光電二極體進行感測，當懸臂樑產生偏移，反射至光電二極體亦發生偏移，藉此得知探針與樣本表面的相互作用關係。解析度能夠達到原子等級。由於AFM能夠觀測導體或是非導體的樣本。
四種樣本薄膜：NIP(無拓印高分子薄膜，non-imprinted polymer)、本發明AIP(抗體拓印高分子薄膜，antibody imprinted polymer)、本發明PIP(蛋白質拓印高分子，protein imprinted polymer)(固定相位)及PIP(亂數分布)。NIP只有加入起始劑與交聯劑，為單純的高分子材料，用來測試生物分子對其造成的非專一性吸附力；AIP為拓印模板接上抗體後與高分子試劑進行微接觸拓印所製成的拓印高分子，與PIP相較為省略接上C反應蛋白的步驟，故薄膜上之拓印孔為抗體拓印孔，而非C反應蛋白拓印孔；PIP為拓印模板上接合抗體後固定CRP相位並加入功能性單體(O-4NPPC)，再與高分子試劑進行微接觸拓印所製成的拓印高分子，如實施例一之方法製成，而PIP(亂數分布)則是模擬Chou(P. C. Chou,J. Rick,T. C. Chou,C-reactive protein thin-film molecularly imprinted polymers formed using a micro-contact approach,Analytica Chimica Acta,Vol. 542,p20-25,2005)的微接觸製程，拓印模板上以半胱胺-戊二醛改質，使其表面佈滿醛基，其能夠對生物分子產生非專一性的吸附，使得C-反應蛋白亂數分佈於拓印模板上，再與高分子試劑進行微接觸拓印所製成拓印高分子，用來與PIP做比較。以下的探討將蛋白質拓印高分子薄膜分為1. NIP、2.本發明AIP、3. PIP(亂數分布)、4.a未改善製程前之PIP和4.b改善製程後之PIP。
本發明改善製程後之PIP，主要是改善拓印模板表面改質的分布、改質步驟間清洗殘留物的次數、改質溶液鍵結的時間及交聯劑與起始劑的比例，詳細步驟參見實施例一。
改善製程後之PIP如第五圖所示，該圖為改善製程後PIP的AFM掃描結果圖。起伏度的均方根值為16.826 nm，起伏度為最大(NIP為0.291 nm，本發明AIP為3.117 nm，PIP(亂數分布)為2.768 nm)。側剖面中疑似拓印孔洞處深度有10.690 nm，孔徑大小為66.406 nm，深寬比約為1:6.5，用抗體一方面固定C-反應蛋白之相位，另一方面能夠將C-反應蛋白墊高，於微接觸拓印中，高分子試劑能夠更完整的包覆整顆C-反應蛋白分子，與PIP(亂數分布)拓印所造成的深寬比作比較大幅改善，專一性吸附力也能夠有所提升。拓印模板製程的最佳化確實有助於拓印高分子表面拓印孔洞的完整性。
探討AFM探針與拓印模板以及高分子薄膜之間的作用力關係，將AFM探針分為三種狀況：金探針、抗體探針以及CRP探針(表面處理過程如同前述鍍金表面之改質處理)；拓印模板也分為三種狀況：金表面、半胱胺-戊二醛表面處理以及C-反應蛋白表面處理；高分子薄膜分為NIP、AIP、PIP(亂數分布)、最佳化前PIP(固定相位)及最佳化後PIP(固定相位)五種。
模板主要探討抗體與C-反應蛋白之間的作用力(專一性吸附力)，抗體探針對金模板表面及金探針對C-反應蛋白模板表面應為微弱作用力的對照組；抗體探針對半胱胺-戊二醛模板表面或抗體模板表面則為非專一性吸附力的測試。
因為探針有經過改質步驟，共有三種AFM探針：未改質前、接上抗體後以及接上抗體和C-反應蛋白。
如前所述，AFM探針對樣本表面有交互作用力，故針對AFM探針遠離樣本時所產生的負值黏滯力做分析，利用AFM探針的彈力常數K與黏滯力所造成的位移X換算出作用力大小F，公式如下：
F=-K×X
以九宮格的方式進行探測，點跟點之間的距離為100 nm，探測結果如下：
I.　拓印模板
經測試後，發現生物分子(C-反應蛋白抗體或C-反應蛋白)不論是在探針上還是在模板上，與金之間的微弱作用力約為10 nN；抗體探針對半胱胺-戊二醛模板表面或抗體模板表面所造成的非專一性吸附力約為20 nN；抗體與C-反應蛋白間的專一性吸附力則接近30 nN。對照組的背景微弱作用力稍大，因C-反應蛋白抗體或C-反應蛋白表面具有多種鍵結，容易與其他物質產生吸引力，但仍然能夠比較出專一性與非專一性吸附力的差異。
II.　蛋白質拓印高分子
經測試後，C-反應蛋白抗體與NIP之間所產生的非專一吸附力約為11.75 nN，只稍大於拓印模板測試中的背景微弱作用力，表示交聯劑所造成的非專一性吸附情形不嚴重；C-反應蛋白抗體對AIP與PIP(亂數分布)造成的作用力接近20 nN，與拓印模板測試中抗體探針對半胱胺-戊二醛模板表面或抗體模板表面所造成的非專一性吸附力差不多，並沒有特別突出的專一性吸附力；PIP在最佳化之前，與C-反應蛋白抗體間的作用力只有略大於20 nN，與非專一性吸附力值差異不大，並無明顯的專一性吸附力，而PIP在最佳化製程後(即改善製程後)，請參考第六圖，該圖係為原子力顯微鏡以C-反應蛋白抗體探針微觀量測C-反應蛋白拓印薄膜表面之作用力與距離關係圖，由圖中可知C-反應蛋白抗體對PIP造成的作用力接近30 nN，與C-反應蛋白抗體對C-反應蛋白間的作用力差不多，皆有較明顯的專一性吸附力，但分佈較不均勻，若是與拓印孔洞反應作用力應較大，因此改善拓印孔洞的分佈均勻性，亦能夠增強其專一性吸附能力。
樣本-探針間的作用力探討針對了拓印模板及蛋白質拓印高分子。於拓印模板探測中，C-反應蛋白抗體探針與金之間的微弱作用力約為10 nN；C-反應蛋白抗體探針對半胱胺-戊二醛模板表面或C-反應蛋白抗體模板表面所造成的非專一性吸附力約為20 nN；而C-反應蛋白抗體與C-反應蛋白間的專一性吸附力則接近30 nN。於蛋白質拓印高分子探測中，C-反應蛋白抗體與NIP之間所產生的非專一吸附力約為11.75 nN，只稍大於拓印模板測試中的背景微弱作用力，無明顯的非專一性吸附力；C-反應蛋白抗體對AIP與PIP(亂數分布)造成的作用力接近20 nN，與拓印模板中的非專一性吸附力大小差異不大；PIP在最佳化之前，與C-反應蛋白抗體間的作用力只有略大於20 nN；PIP在最佳化製程後(即改善製程後)，C-反應蛋白抗體對蛋白質拓印高分子造成的作用力接近30 nN(29.36±4.90 nN)，與C-反應蛋白抗體對C-反應蛋白間的作用力差不多，有較明顯的專一性吸附力。而本發明製程最佳化後PIP薄膜與生物抗體之結合力十分接近，達14.28 nN，約為C-反應蛋白與生物抗體結合力之87%。
另外，為了得知所製作PIP薄膜是否對目標分子具有吸附能力，而因欲探討PIP薄膜之特異吸附性能力，針對PIP拓印孔洞上功能性鍵結吸附目標分子的能力，因此須要有個對照組為高分子基材本身對目標分子的吸附能力，此現象稱為非特異性吸附，另外合成無拓印分子高分子(non-imprinted polymer,NIP)，NIP與PIP合成高分子基材相同，僅模板上無目標分子，即沒有拓印孔洞，不會產生功能性鍵結，故NIP的吸附量可視為基材對生物分子的附著情形，實際上因特異性鍵結而吸附於PIP薄膜的目標分子，應用PIP吸附量扣除NIP吸附量，以此來判定PIP的特異吸附性。測試步驟如下：
(1)　使用0.1 μg/ml與0.5 μg/ml兩種濃度樣本溶液，分別注入置有NIP、PIP(random)及PIP感測薄膜的微流道中，腔體體積為1.032 μl，吸附時間為10秒，量測溶液剩餘的濃度。
(2)　由量測到的濃度值換算出各薄膜的吸附量，可得PIP及NIP的吸附情形，兩者相減即得PIP薄膜之特異吸附量。量測結果如表一，其中「比值」為各個拓印薄膜之吸附量分別對NIP之吸附量之比值。
由表一可知，PIP薄膜之吸附量與生物抗體接近，PIP-r次之，而AIP也有不錯的結果。
另外，於PIP薄膜浸在配置好的三種不同濃度之C-反應蛋白溶液分別為0.1、0.5、1 μg/ml，由0.1、0.5至1 μg/ml，存在吸附量越來越高的趨勢。取1 μg/ml之結果來比較，NIP吸附量(非專一性吸附)明顯較低，而PIP及生物抗體之吸附量分別為0.746、0.752 ng/cm2，與NIP的比值分別為5.33、5.37。量測得之PIP薄膜吸附能力為0.75 ng/cm2；NIP為0.14 ng/cm2。若是以1 cm2的面積去換算，其專一性吸附量為0.61 ng，PIP/NIP5。同方向性PIP拓印薄膜對目標蛋白質吸附能力較接近生物抗體，約生物抗體之99%。
實施例3： C-反應蛋白之感測微晶片系統
學術上多採用高效液相層析儀(High-performance liquid chromatography,HPLC)量測方式，但實際上量測時，濃度需要大於100 μg/ml才能夠較準確得估算出溶液中成分，臨床上，正常人體內約小於8 μg/ml，對於量測方面似乎無法滿足臨床上需求。
臨床上則採用酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunoassay,ELISA)量測方式，其需要做序列稀釋至1000 pg/ml以下，而臨床上樣本濃度介於1-15 μg/ml，即樣本需要稀釋1000倍左右，擔心稀釋上的人為誤差或因稀釋而汙染造成影響。
C-反應蛋白感測微晶片系統之示意圖如第七圖，圖中C-反應蛋白之感測微晶片系統3包含一晶片本體31，可為一平板狀，在虛線下方的部份可為較薄以便插入偵測器38(圖中未示)之插槽；晶片本體31包括一第一腔體32，在第一腔體32中置放C-反應蛋白拓印薄膜33，且第一腔體32分別連通設置一第一流通口371與一第二流通口372，藉以使一含有C-反應蛋白的待測溶液由該第一流通口注入後流經該拓印薄膜33，而由該第二流通口372流出；一第二腔體34，第二腔體34內設有一感測電極35，且第二腔體34分別連通設置一第三流通口373與一第四流通口374，藉由一萃取溶液使該拓印薄膜33上的C-反應蛋白經由第三流通口373流至該第二腔體34；晶片本體31另包括一偵測器38(圖中未示)，偵測感測電極35之電位變化，並根據該電位變化產生一偵測結果。本實施例所例示之第一腔體與第二腔體之規格如第八圖，流道高度皆為100 μm。
本發明在使用C-反應蛋白之感測微晶片系統3進行檢測時，先將1μl待測溶液從液體流通口371進入第一腔體32內，讓待測溶液中之C-反應蛋白吸附於C-反應蛋白拓印薄膜33(可為具同向性之PIP，亦可為同向性的C-反應蛋白抗體拓印薄膜AIP)上，停留60秒後將待測溶液從液體流通口372移除，再用磷酸鹽緩衝溶液利用液體流通口371、372進出清洗掉非專一性吸附之其他物質，再由液體流通口371注入2μl萃取溶液(十二烷基硫酸鈉10% w/v+乙酸10% v/v)將C-反應蛋白拓印薄膜吸附到的目標分子C-反應蛋白萃取出，接著將萃取溶液移至第二腔體34由感測電極35進行濃度分析(此時溶液中應只有C-反應蛋白分子)，10秒後量測電極訊號(動態放電電性量測)。
本發明另一實施例亦可先將1μl待測溶液從液體流通口371進入第一腔體32內停留60秒後，讓待測溶液中之C-反應蛋白吸附於C-反應蛋白拓印薄膜33上，將待測溶液移至第二腔體34，10秒後由感測電極35進行濃度分析(LCR量測電容)。
在低頻時，阻抗頻率關係圖跟電極表面的狀態較有關係，而於電極表面接上抗體及C-反應蛋白所改變的電容值對照等效電路應為電雙層電容，因此量測時針對低頻(12Hz)做分析。
動態電容感測機制
由PIP薄膜抓取C-反應蛋白後，以SDS溶劑將抓取之C-反應蛋白溶出，並輸送至感測電極上，此感測電極可經由表面硫化改質或以抗體修飾來抓取分離之C-反應蛋白，並由動態電容量測法來獲得電極表面電容變化，由表面電容變化與檢量線對應至濃度關係。
動態電容量測法之電路適用於可攜式裝置或掌上型裝置。在進行動態電容量測之前，必須先將待分析系統進行簡化，以方便後續分析的進行。在動態電容量測系統中，計算出來的結果為系統電容與系統電阻，而金電極與表面改質分子，可將其簡化為一等效系統電容與一等效系統電阻。如此系統架構下，可以假想此一等效系統電容與等效系統電阻為動態電容量測系統中之電雙層電容與漏電電阻，並依據放電曲線，計算此系統之時間常數與電容電阻值，達到動態電容量測的目的。
依據上述說明，首先要針對電極做進一步的等效電路分析，將整體系統進行分析與簡化。感測電極之等效電路分析分為兩個部份：裸金電極與表面改質部分。裸金電極分析如第九圖，電路符號分別為：Cs為電解質電容；Rs為電解質電阻；Cd1為電雙層電容。
表面改質之金電極製作方法如下：以玻璃為模板，表面用電子鎗(E-gun)真空蒸鍍上400 nm金層以及25 nm鉻黏著層，將鍍金晶圓經過微影製程做成指叉狀電極，再由模板表面改質步驟，將指叉狀電極表面接上抗體。
金電極上之表面改質可以簡化成等效電容，當蛋白質被吸附於表面時，則使得電容產生變化，藉由外部電路與感測電路間之電位能動態平衡，造成外部電位下降狀況來判斷感測電路之表面電容變化，如第十圖所示，其中C為電容；Zreal與Zima分別為阻抗之實部與虛部；i(t)為電流；Uc(t)為阻抗虛部之電位能；U(t)為所量測的電位能。
人體血清試驗：
調配以人體血清調配濃度為6.382、7.382、8.882、11.382 μg/ml的C-反應蛋白溶液，由PIP薄膜抓取C-反應蛋白後，以SDS溶劑將抓取之C-反應蛋白溶出，並輸送至感測電極上，此感測電極可經由表面硫化改質或以抗體修飾來抓取分離之C-反應蛋白，並由動態電容量測法來獲得電極表面電位變化如第十一圖所示，該圖是於第75秒量測，並於第80秒結束量測，微流道深度為125 μm；其中，不同濃度呈現不同動態電位下降結果，再依其下降曲線計算出不同濃度樣本之時間常數，如第十二圖所示。故即可依此時間常數與C-反應蛋白濃度之對應關係，判斷未知濃度之C-反應蛋白的濃度。此外，請參考第十三圖，該圖為C-反應蛋白之感測微晶片系統之感測電極於第二腔體中動態吸附目標蛋白質之表面電容變化圖，可知偵測器反應時間為10秒(故量測分析總時間約70秒)，與傳統ELISA分析時間為數小時(>2小時)相較，大幅降低了檢測所需時間。
2．．．試片
21．．．模板
22．．．功能性單體
23．．．交聯劑與起始劑混合溶液
241、242．．．墊片
25．．．玻璃晶圓
26．．．光罩
27．．．拓印薄膜(PIP或AIP)
3．．．C-反應蛋白之感測微晶片系統
31．．．晶片本體
32．．．第一腔體
33．．．拓印薄膜(PIP或AIP)
34．．．第二腔體
35．．．感測電極
36．．．微通道
371~374．．．液體流通口
第一圖係為拓印模板表面改質之採用半胱胺-戊二醛(cysteamine-glutaraldehyde)法步驟示意圖。
第二圖係為拓印模板的表面改質處理示意圖。
第三A圖係為C-反應蛋白拓印薄膜(PIP)製程示意圖。
第三B圖係為C-反應蛋白抗體拓印薄膜(AIP)製程示意圖。
第四圖係為C-反應蛋白或其抗體之拓印薄膜(PIP或AIP)的光聚合圖案化製程示意圖。
第五圖係為改善製程後PIP的AFM掃描結果圖。
第六圖係為原子力顯微鏡以C-反應蛋白抗體探針微觀量測C-反應蛋白拓印薄膜表面之作用力與距離關係圖。
第七圖係為C-反應蛋白感測微晶片系統之示意圖。
第八圖係為C-反應蛋白感測微晶片系統之第一腔體與第二腔體規格示意圖。
第九圖係為裸金電極之等效電路分析圖。
第十圖係為經表面改質之金電極上外部電路與感測電極間關係圖。
第十一圖係為不同C-反應蛋白濃度所測得之動態電位變化圖。
第十二圖係為第十圖電位變化曲線之時間常數與C-反應蛋白濃度關係圖。
第十三圖係為C-反應蛋白之感測微晶片系統之感測電極於第二腔體中動態吸附目標蛋白質之表面電容變化圖。

Claims (19)

  1. 一種具固定相位之C-反應蛋白所拓印之薄膜，係包含複數個固定相位之拓印孔洞，該些拓印孔洞係藉由移除複數個C-反應蛋白而產生，其中該些C-反應蛋白係連結於一改質的第一基板表面之複數個抗體。
  2. 一種具固定相位之C-反應蛋白抗體所拓印之薄膜，係包含複數個固定相位之拓印孔洞，該些拓印孔洞係藉由移除複數個C-反應蛋白抗體而產生，其中該些C-反應蛋白抗體係連結於一改質的第一基板表面。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之薄膜，其中該改質的第一基板表面，係藉由半胱胺及戊二醛與該第一基板表面之一金層反應所獲得。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之薄膜，進一步於該反應中使用甘氨酸阻隔未連接該些抗體的戊二醛醛基基團。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之薄膜，其中該些C-反應蛋白進一步與O-4-硝基苯基磷膽鹼接觸形成複數個預聚合複合物。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之薄膜，其中該些C-反應蛋白抗體進一步與O-4-硝基苯基磷膽鹼接觸形成複數個預聚合複合物。
  7. 如申請專利範圍第5或6項所述之薄膜，其中該複數個預聚合複合物與一第二基板的組合物進行微接觸，且該組合物係由一交聯劑與一起始劑所組成。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之薄膜，其中該交聯劑係為二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯或三羥甲基丙烷三丙烯酸酯。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之薄膜，其中該起始劑係為2,2’-二甲基-2-苯基苯乙酮、1-羥基-環己基-苯酮、對-苯基二苯酮或苯甲基二甲基縮酮。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之薄膜，其中該交聯劑與該起始劑之莫耳比例範圍為600:1~640:1。
  11. 一種C-反應蛋白之感測晶片系統，係包含：一晶片本體，包含；一第一腔體，該第一腔體內設有一如申請專利範圍第1或2項所述之薄膜，且該第一腔體分別連通設置一第一流通口與一第二流通口，藉以使一含有C-反應蛋白的待測溶液由該第一流通口注入後流經該拓印薄膜，而由該第二流通口流出；一第二腔體，該第二腔體內設有一感測電極，且該第二腔體分別連通設置一第三流通口與一第四流通口，藉由一萃取溶液使該拓印薄膜上的C-反應蛋白經由該第三流通口流至該第二腔體；以及一偵測器，偵測該感測電極之一電位變化，並根據該電位變化產生一偵測結果。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的感測晶片系統，其中該感測電極為一金電極。
  13. 如申請專利範圍第11項所述的感測晶片系統，其中該感測電極為一指叉狀電極。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的感測晶片系統，其中該指叉狀電極係由鍍金玻璃材料經微影製程所製成。
  15. 如申請專利範圍第11至13項任一項所述的感測晶片系統，其中該感測電極表面經硫化改質或以抗體修飾。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的感測晶片系統，其中該抗體為一生物抗體或一人工抗體。
  17. 如申請專利範圍第11項所述的感測晶片系統，其中該晶片本體為平板狀。
  18. 如申請專利範圍第11項所述的感測晶片系統，其中該電位變化係由該感測電極與該第二腔體內之萃取溶液所形成之一等效電路，與該偵測器之一感測電路的電位能動態平衡所造成。
  19. 如申請專利範圍第11項所述的感測晶片系統，其中該偵測結果係由該電位變化之時間常數判定。
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