CN107085063A - 一种药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法，包括步骤：药食两用种子类中药材粉末的前处理；UHPLC‑MS/MS分析。所述前处理高效利用对直链烃结构具有特异性疏水性和良好的空间选择性的EMR‑Lipid净化填料，既能够获得更好的分离净化效果，又能够解决传统的净化填料PSA和C18等造成的伏马菌素类真菌毒素回收率不理想的问题；同时，本发明成功建立了62种真菌毒素高效、快速、灵敏的同时定性定量的UHPLC‑MS/MS分析体系与方法，为目前中药材中的真菌毒素的检测与分析提供了真菌毒素品种最多的高通量检测技术，大幅扩增了真菌毒素监测种类；本发明所述的药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法可得到广泛应用，并具有可观的市场潜力。

Description

一种药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法

技术领域

本发明属于中药材分析检测领域，具体涉及一种药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法。

背景技术

真菌毒素(Mycotoxin)是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，其可通过直接摄取、吸入以及皮肤接触进入人体及牲畜体内，对人类及动物的健康造成一定威胁，主要具有肝毒性、肾毒性、致癌性、致畸性危害等。其中黄曲霉毒素也因为其极强的毒性被世界卫生组织定为一类致癌物，对人类的生命健康造成了重大威胁。

目前全球已有超过100个国家制定了真菌毒素的相关标准，国内外已经建立食品饲料中10余种真菌毒素的相关标准，而涉及中药材中的真菌毒素的相关标准只有5种(主要包括黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A)。我国为中药使用大国，药食两用种子类中药材如：薏苡仁和桃仁，含脂量高，存在潜在的染菌风险，同时由于药食两用种子类中药材相较其他类中药材使用更加广泛且周期长，大部分真菌毒素具有热稳定性和蓄积性，长期食用被真菌毒素污染的中药材势必会导致真菌毒素慢性中毒。然而，现有检测技术及限度标准不能保证中药材真菌毒素安全，现阶段亟需对中药材真菌毒素污染进行全面研究；但是，真菌毒素在中药材中通常以痕量甚至超痕量的形式存在，如何有效提取富集待测组分同时去除干扰物是前处理的关键，目前国内外针对传统中药材中真菌毒素的提取和净化方法主要有免疫亲和柱法、固相萃取技术法和QuEChERS法等。例如，CN104931695A公开了一种同时分析4种真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫亲和柱制备方法，它包括抗体的制备和纯化、基质制备、配体偶联、装柱四个步骤，其中包括1mL基质Sepharose 4B与1～5mg DON抗体、0.1～1mg T-2、HT-2抗体、0.2～1mg ZEA抗体偶联。又如，拜尔公司(CN101384896A)提供了一种快速检测真菌毒素的方法，其包括以下步骤:a)提供薄膜波导，其包括在第二光透明层(b)上的第一光透明波导层(a)，其中(b)具有比(a)低的折射率，特异性和/或亲和性结合配偶体作为真菌毒素和/或结合配偶体的化学或生化识别元件以空间分离的方式固定在该薄膜波导上，b)将含一种或多种真菌毒素的样品和结合配偶体施加于所述薄膜波导上固定的结合配偶体上，c)检测由于固定在薄膜波导上的结合配偶体与来自样品的真菌毒素和/或与结合配偶体的相互作用产生的消逝场中的信号，d)确定样品中存在的一种或多种真菌毒素的量。

然而，免疫亲和柱法成本高且仅适用于单类真菌毒素的净化，商品化的免疫亲和柱也仅适用于10种以下的真菌毒素的样品前处理，固相萃取技术操作繁琐、费时且对技术人员要求较高。目前涌现的新型QuEChERS样品前处理方法凭借其成本低廉、高效、简单以及快速的特点成为针对样品中多种真菌毒素提取和净化的强有力的技术支撑手段。

其中，常见的应用在中药材中的QuEChERS样品前处理方法主要采用的净化填料有N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)、C18和石墨化炭黑(graphite carbonblack，GCB)等。现有技术中，如“ZHANG SS,JI S,LU JW,et al.Multi-mycotoxinsanalysis in Pheretimausing ultra-high-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry based on a modified QuEChERS method.Journal ofChromatography B,2016,1035:31-41”所披露的方法能够同时进行中药地龙中22种真菌毒素的测定，然而，该方法同时采用了PSA,C18和GCB三种净化填料，组成复杂且伏马菌素类真菌毒素的回收率不够理想，如以上文献中伏马菌素B1回收率为73％，可见明显不能满足国际通用回收率要求——80％～120％。

因此，研发出一种全新的针对含脂量高的药食两用种子类中药材的简单样品前处理技术同时保证满意的真菌毒素回收率，并实现定性与定量分析，成为了当前本领域研发人员的研究重点与难点之一。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明具体采用了一种特异性除脂EMR-Lipid净化填料，其相较于传统的净化填料，既具有更好的净化效果又能同时提高部分真菌毒素的回收率，从而实现了真菌毒素的快速提取分离；本发明还结合UHPLC-MS/MS技术建立了针对药食两用种子类中药材中62种真菌毒素的分析检测方法，具有高灵敏度、快速、高通量等特性。

因此，本发明提供了一种药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法，包括以下步骤：

S1：药食两用种子类中药材粉末的前处理；

S2：UHPLC-MS/MS分析；

其中，S1中所述的前处理包括：

精密称定并取所述药食两用种子类中药材粉末，过筛，置于离心管中，精密加入氘代莠去津内标溶液和¹³C-玉米赤霉烯酮内标溶液，接着加入水，涡旋；静置后，精密加入10％甲酸乙腈溶液，再次涡旋，然后置于高速振荡器上剧烈震荡，接着加入无水硫酸镁与氯化钠的混合粉末，立即摇散；再置于高速振荡器上剧烈震荡，冰浴后离心，移取上清液至装有EMR-Lipid净化填料的固相萃取净化管里，涡旋后，置于高速振荡器上剧烈震荡，离心；移取上清液至含无水硫酸镁与氯化钠的polish管中，置于高速振荡器上剧烈震荡，离心；移取上清液，并加入乙腈稀释，涡旋，再用微孔滤膜过滤，取续滤液，得进样液。

值得说明的是，传统的除脂填料有PSA和C18，两者分别通过化学吸附及疏水作用除去部分脂肪酸及脂肪类成分，新型除脂填料EMR-Lipid(Enhanced matrix removal-Lipid)，EMR-Lipid是一种二异氰酸酯多元醇共聚物，它不同于传统的固相分散吸附剂，其作用原理基于疏水作用及分子排阻作用，当用一定水活化以后能够特异性包被5个及以上直链烃结构，最终析出沉淀抑或在随后的相分层步骤中留在水层；简言之，EMR-Lipid净化填料对直链烃结构具有特异性疏水性和良好的空间选择性。

优选地，在上述分析方法中，S1中使用的水均为现配的无氧水，通过将氮气通入去离子水中15分钟以上而制得。

优选地，在上述分析方法中，所述氘代莠去津内标溶液的浓度为6mg/L，所述¹³C-玉米赤霉烯酮内标溶液的浓度为20mg/L。

优选地，在上述分析方法中，所述无水硫酸镁与氯化钠的质量比为4:1。

优选地，在上述分析方法中，所述离心的转速均为10000～12000r/min。

优选地，在上述分析方法中，S2中所述的UHPLC-MS/MS分析包括将所述进样液进样至超高效液相色谱与多级质谱联用系统内的步骤；其中，所述超高效液相色谱的条件包括：

Agilent Poroshell 120PFP色谱柱，150mm×2.1mm I.D,2.7μm；

正离子模式下，以含有0.4％甲酸和1mM甲酸铵的水溶液为流动相A，以含有0.4％甲酸和1mM甲酸铵的甲醇溶液为流动相B，流速0.45ml/min，梯度洗脱；负离子模式下，以水为流动相A，乙腈为流动相B，流速为0.45ml/min，梯度洗脱。

进一步优选地，在上述分析方法中，所述多级质谱的条件包括：

正离子模式(+)下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：50.0psi；辅助气压力：50.0psi；气帘气压力：30.0psi；碰撞气压力：7.0psi；离子源温度：450℃；碰撞室入口电压：10V；碰撞室出口电压：14V；

负离子模式(-)下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：-4500V；雾化气压力：50.0psi；辅助气压力：50.0psi；气帘气压力：30.0psi；碰撞气压力：7.0psi；离子源温度：400℃；碰撞室入口电压：-10V；碰撞室出口电压：-12V。

优选地，在上述分析方法中，各种真菌毒素的最低检测限为0.01μg/kg。

与现有技术相比，本发明所提供的技术方案具有以下优点：

本发明所提供的药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法，高效利用对直链烃结构具有特异性疏水性和良好的空间选择性的EMR-Lipid净化填料，既能够获得更好的分离净化效果，又能够解决传统的净化填料PSA和C18等造成的伏马菌素类真菌毒素回收率不理想的问题；同时，本发明成功建立了62种真菌毒素高效、快速、灵敏的同时定性定量的UHPLC-MS/MS分析体系与方法，为目前中药材中的真菌毒素的检测与分析提供了真菌毒素品种最多的高通量检测技术，大幅扩增了真菌毒素监测种类；综上所述，本发明所述的药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法可得到广泛应用，并具有可观的市场潜力。

附图说明

图1为净化前、以及采用不同净化填料净化后的薏苡仁基质总离子流图，其中：(A)正离子模式下的总离子流图，(B)负离子模式下的总离子流图。

具体实施方式

本发明提供了一种药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法，包括以下步骤：

S1：药食两用种子类中药材粉末的前处理；

S2：UHPLC-MS/MS分析。

在一个优选实施例中，S1中所述的前处理包括：

精密称定并取所述药食两用种子类中药材粉末3g，过3号筛，置于50ml塑料离心管中，精密加入250μL 6mg/L氘代莠去津内标溶液和10μL 20mg/L¹³C-玉米赤霉烯酮内标溶液，接着加入水15ml，涡旋使药粉充分浸润；静置30分钟后，精密加入10％甲酸乙腈溶液15ml，再次涡旋混匀，然后置于高速振荡器上剧烈震荡5分钟，接着加入无水硫酸镁与氯化钠(质量比4:1)的混合粉末5g，立即摇散；再置于高速振荡器上剧烈震荡5分钟，冰浴10分钟后，以12000r/min的转速离心10分钟，移取上清液5ml至装有0.5g已活化的EMR-Lipid净化填料的固相萃取净化管里(0.5g EMR-Lipid净化填料加入2.5ml水涡旋1min即实现活化)，涡旋混匀后，置于高速振荡器上剧烈震荡1分钟，以12000r/min的转速离心10分钟；移取上清液5ml至含1.6g无水硫酸镁与0.4g氯化钠的polish管中，置于高速振荡器上剧烈震荡1分钟，以12000r/min的转速离心10分钟；移取上清液0.5ml，并加入乙腈稀释至1ml，涡旋混匀，再用微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤，取续滤液，得进样液。

在一个优选实施例中，S1中使用的水均为现配的无氧水，通过将氮气通入去离子水中15分钟以上而制得。

在一个优选实施例中，S2中所述的UHPLC-MS/MS分析包括将所述进样液进样至超高效液相色谱与多级质谱联用系统内的步骤；其中，所述超高效液相色谱的条件包括：

Agilent Poroshell 120PFP色谱柱，150mm×2.1mm I.D,2.7μm；

正离子模式下，以含有0.4％甲酸和1mM甲酸铵的水溶液为流动相A，以含有0.4％甲酸和1mM甲酸铵的甲醇溶液为流动相B，流速0.45ml/min，梯度洗脱；负离子模式下，以水为流动相A，乙腈为流动相B，流速为0.45ml/min，梯度洗脱。具体的梯度洗脱条件如下表1和表2所示：

表1正离子模式下的梯度洗脱条件

表2负离子模式下的梯度洗脱条件

其中，所述多级质谱的条件包括：

正离子模式(+)下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：50.0psi；辅助气压力：50.0psi；气帘气压力：30.0psi；碰撞气压力：7.0psi；离子源温度：450℃；碰撞室入口电压：10V；碰撞室出口电压：14V；

负离子模式(-)下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：-4500V；雾化气压力：50.0psi；辅助气压力：50.0psi；气帘气压力：30.0psi；碰撞气压力：7.0psi；离子源温度：400℃；碰撞室入口电压：-10V；碰撞室出口电压：-12V。

并且，使用乙腈分别配制62种真菌毒素的适当浓度的标准溶液(100～500μg/kg)，并在manual tuning模式下使用针泵，以恒流方式进样。在Analystsoftware 1.6.2(ABSCIEX)软件上使用Q1Scan确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位；控制适当的浓度，尽可能使目标物的质谱峰响应值在1e6～3e6cps之间；以扫描范围100～相对分子质量+30以及扫描速度200Da/s进行扫描，找到响应最好的[M+H]⁺或[M+NH4]⁺峰作为母离子；随后在Product Ion Scan模式下，设定CE初始值为5eV，以5eV为步长手动调节CE，母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜，选择响应好且稳定的2～3个子离子，并判断裂解的可能性。根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对，每一对的分析时间设置为100ms；用Ramp模式自动优化碰撞能量(Collision Energy，CE)与去簇电压(Declustering Potential，DP)，最终得到的62种真菌毒素及2种内标溶液的质谱参数如下表3所示：

表3真菌毒素质谱参数表

实施例1

发明人取某厂薏苡仁样品按照本发明所提供的分析方法对薏苡仁中62种真菌毒素进行提取分离与分析检测，所得到的62种真菌毒素的线性范围与检测限(LOD)如下表4所示，62种真菌毒素的回收率如下表5所示。

表4真菌毒素的线性范围与检测限

表5真菌毒素的回收率

并且，发明人还分别采用EMR-Lipid净化填料与传统除脂填料PSA和C18对该厂薏苡仁样品实施了本发明相同的前处理(步骤S1)，对各自的净化效果进行了对比；结合Q-TOF高分辨质谱分别将净化前样品和净化后(用PSA、C18及EMR-Lipid分别净化)样品在正离子模式(m/z 100-1000)和负离子模式(m/z100-1100)下进行full scan模式下的全扫，如图1所示，采用EMR-Lipid净化填料净化之后所得的基质总离子流图曲线，显著减少了背景干扰，净化效果明显提高。

此外，发明人还将依照本发明所述分析方法对该厂薏苡仁样品分析所得的真菌毒素回收率与文献“ZHANG SS,JI S,LU JW,et al.Multi-mycotoxins analysisinPheretima using ultra-high-performance liquid chromatography tandemmassspectrometry based on a modified QuEChERS method.Journal ofChromatography B,2016,1035:31-41”中记载方法项下的结果进行了比较，如下表6所示：

表6真菌毒素回收率比较

可见，Ochratoxin A，Fumonisin B1、Fumonisin B2和Fumonisin B3这4种真菌毒素的回收率有明显提高，同时EMR-Lipid净化填料相比文献中应用的传统的PSA，C18和GCB填料具有更好的净化效果。

实施例2

发明人取某厂的桃仁样品按照本发明所提供的分析方法对桃仁中62种真菌毒素进行提取分离与分析检测，所得到的62种真菌毒素的回收率如下表7所示，可见62种真菌毒素在桃仁中均能获得令人满意的回收率。

表7真菌毒素的回收率

最后，值得补充说明的是，以上两个实施例仅旨在对本发明作出示例性说明，本发明所提供的技术方案并不限于上述两种中药材，例如，柏子仁、莲子等药食两用种子类中药材同样适用。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种药食两用种子类中药材中的真菌毒素的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：药食两用种子类中药材粉末的前处理；

S2：UHPLC-MS/MS分析；

其中，S1中所述的前处理包括：

精密称定并取所述药食两用种子类中药材粉末，过筛，置于离心管中，精密加入氘代莠去津内标溶液和¹³C-玉米赤霉烯酮内标溶液，接着加入水，涡旋；静置后，精密加入10％甲酸乙腈溶液，再次涡旋，然后置于高速振荡器上剧烈震荡，接着加入无水硫酸镁与氯化钠的混合粉末，立即摇散；再置于高速振荡器上剧烈震荡，冰浴后离心，移取上清液至装有EMR-Lipid净化填料的固相萃取净化管里，涡旋后，置于高速振荡器上剧烈震荡，离心；移取上清液至含无水硫酸镁与氯化钠的polish管中，置于高速振荡器上剧烈震荡，离心；移取上清液，并加入乙腈稀释，涡旋，再用微孔滤膜过滤，取续滤液，得进样液。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，S1中使用的水均为现配的无氧水，通过将氮气通入去离子水中15分钟以上而制得。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述氘代莠去津内标溶液的浓度为6mg/L，所述¹³C-玉米赤霉烯酮内标溶液的浓度为20mg/L。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述无水硫酸镁与氯化钠的质量比为4:1。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述离心的转速均为10000～12000r/min。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，S2中所述的UHPLC-MS/MS分析包括将所述进样液进样至超高效液相色谱与多级质谱联用系统内的步骤；其中，所述超高效液相色谱的条件包括：

Agilent Poroshell 120PFP色谱柱，150mm×2.1mm I.D,2.7μm；

正离子模式下，以含有0.4％甲酸和1mM甲酸铵的水溶液为流动相A，以含有0.4％甲酸和1mM甲酸铵的甲醇溶液为流动相B，流速0.45ml/min，梯度洗脱；负离子模式下，以水为流动相A，乙腈为流动相B，流速为0.45ml/min，梯度洗脱。

7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述多级质谱的条件包括：

正离子模式(+)下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：50.0psi；辅助气压力：50.0psi；气帘气压力：30.0psi；碰撞气压力：7.0psi；离子源温度：450℃；碰撞室入口电压：10V；碰撞室出口电压：14V；

负离子模式(-)下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：-4500V；雾化气压力：50.0psi；辅助气压力：50.0psi；气帘气压力：30.0psi；碰撞气压力：7.0psi；离子源温度：400℃；碰撞室入口电压：-10V；碰撞室出口电压：-12V。

8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，各种真菌毒素的最低检测限为0.01μg/kg。