CN111289672B - 检测中药产品中多环芳烃标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及检测中药产品中多环芳烃标志物的样品前处理方法和测定方法。本发明先将待测样品与乙醇、水混合，使待测样品充分润湿分散，利于进一步的提取；选用正己烷为提取剂能够有效提取待测样品中的苯并[a]蒽、䓛、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘，同时最小量提取出干扰物质，获得第一正己烷提取液；然后将第一正己烷提取液依次进行Florisil柱净化和EU多环芳烃固相萃取柱净化，可将酚类化合物、叶绿素、叶黄素、烷烃、脂肪、黄色色素等干扰物质去除，将所得净化液的溶剂去除，即可得到第二净化提取物，可用于精确检测多环芳烃标志物的含量。

Description

检测中药产品中多环芳烃标志物的方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及检测中药产品中多环芳烃标志物的样品前处理方法和测定方法。

背景技术

中药材原料及其提取物在保健食品的使用是我国保健食品的特色，国家卫生计生委陆续发布100多种药食同源的中药原料，但保健食品的中药原料及其提取物安全性不容忽视，除了中药材本身内源性毒性不能掉以轻心，还有外部污染物如重金属、农药残留、真菌毒素、有机污染物等等也应该加以重视。目前我国中药原料生产、质量标准体系还不够完善，特别是外源性污染物仍缺乏检测方法及其限量标准，苯并[a]芘等多环芳烃(PAHs)就是其中之一。

由于多环芳烃具有高度致癌、致畸和致突变作用，欧盟委员会颁布了 EU 2015/1933号法规，规定了食品补充剂(即保健食品)、干草药和干香料中多环芳烃的最大残留量，同时对苯并[a]芘的含量和苯并[a]蒽、

苯并[b] 荧蒽、苯并[a]芘4种PAH标志物总量(简称PAH4)均提出了限量要求，法规中明确规定食品补充剂及干草药中苯并[a]芘含量应低于10.0μg/kg，PAH4 总量应低于50.0μg/kg。

目前国内尚无中药材及中药提取物、中药保健食品中多环芳烃标准测定方法及限量要求，GB5009.265《食品安全国家标准食品中多环芳烃的测定》采用液相色谱(HPLC)或气相色谱质谱法(GC-MS)测定食品中多环芳烃，但由于中药产品的基质比较复杂采用该标准对中药产品中的多环芳烃进行检测，误差比较大。

发明内容

本发明的目的在于提供检测中药产品中多环芳烃标志物的样品前处理方法，经本发明样品前处理方法可较好的除去中药产品中干扰物质，获得的净化提取物中干扰物质少，能够更好的对多环芳烃标志物进行定性定量检测。

本发明提供了一种检测中药产品中多环芳烃标志物的样品前处理方法，包括以下步骤：

1)提取：

将待测中药产品样品、内标溶液和乙醇混合后进行第一超声处理，得到第一混合溶液；

将所述第一混合溶液与水混合后依次进行第一涡旋提取和第二超声处理，得到第二混合溶液；

将所述第二混合溶液和正己烷混合后进行第二涡旋提取，然后经离心，取上层，得到第一正己烷提取液；

2)净化：

将所述第一正己烷提取液进行Florisil柱净化，得到第一净化液；

将所述第一净化液进行第一溶剂去除后，将所得第一净化提取物溶解于正己烷中，得到第一净化提取物的正己烷溶液；

将所述第一净化提取物的正己烷溶液进行EU多环芳烃固相萃取柱净化，得到第二净化液；

将所述第二净化液中进行第二溶剂去除，得到第二净化提取物。

优选的，所述步骤1)中，待测样品和乙醇的质量体积比为0.1～2.0g:10mL，水和待测样品的体积质量比为10mL:0.1～2.0g，正己烷和待测样品的体积质量比为10mL:0.1～2.0g。

优选的，所述内标溶液为D₁₂-苯并[a]蒽、D₁₂-

D₁₂-苯并[b]荧蒽和D₁₂- 苯并[a]芘的混合丙酮溶液。

优选的，所述第一涡旋提取的转速为2500rpm，时间为40～80s。

优选的，所述第二涡旋提取的转速为2500rpm，时间为4～6min。

优选的，所述Florisil柱净化包括如下步骤：将所述第一正己烷提取液过Florisil柱并收集提取液流出液，然后用第一洗脱液进行洗脱，收集洗脱流出液，将所述提取液流出液与洗脱流出液合并，得到第一净化液；

所述第一洗脱液为二氯甲烷-正己烷混合溶液，所述二氯甲烷-正己烷混合溶液中二氯甲烷和正己烷的体积比为2～4:17；所述第一洗脱液的用量为 0.5～1.5倍柱体积。

优选的，所述第一正己烷提取液过Florisil柱时的流速为1～2mL/min，所述第一洗脱液的流速为0.5～2mL/min。

优选的，所述EU多环芳烃固相萃取柱净化包括如下步骤：将所述第一净化提取物的正己烷溶液过EU多环芳烃固相萃取柱，然后采用正己烷进行淋洗除杂，再用第二洗脱液对淋洗除杂后的EU多环芳烃固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱流出液，得到第二净化液；

所述第二洗脱液为二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶液，所述二氯甲烷-乙酸乙酯溶液中二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为1～1.5:1，所述第二洗脱液的用量为0.5～1.5倍柱体积，所述淋洗除杂用正己烷的用量为0.5～1.5倍柱体积。

优选的，所述第一净化提取物的正己烷溶液过EU多环芳烃固相萃取柱时的流速为1～2mL/min。

本发明还提供了一种中药产品中多环芳烃标志物的测定方法，包括以下步骤：

(1)采用上述技术方案所述的样品前处理方法对待测样品进行样品前处理，得到第二净化提取物；

(2)将所述第二净化提取物溶解于丙酮-异辛烷溶液中，得到待测液；

(3)将所述待测液进行气相色谱-质谱分析，得到质量色谱图；

(4)根据所述质量色谱图，采用标准曲线法，计算多环芳烃标志物的含量。

本发明提供了一种检测中药产品中多环芳烃标志物的样品前处理方法，包括以下步骤：1)提取：将待测样品、内标溶液和乙醇混合后进行第一超声处理，得到第一混合溶液；将所述第一混合溶液与水混合后依次进行第一涡旋提取和第二超声处理，得到第二混合溶液；将所述第二混合溶液和正己烷混合后进行第二涡旋提取，然后经离心，取上层，得到第一正己烷提取液； 2)净化：将所述第一正己烷提取液进行Florisil柱净化，得到第一净化液；将所述第一净化液进行第一溶剂去除后，将所得第一净化提取物溶解于正己烷中，得到第一净化提取物的正己烷溶液；将所述第一净化提取物的正己烷溶液进行EU多环芳烃固相萃取柱净化，得到第二净化液；将所述第二净化液进行第二溶剂去除，得到第二净化提取物。本发明先将待测样品与乙醇、水混合，使待测样品充分润湿分散，利于进一步的提取；本发明选用正己烷为提取剂能够有效提取待测样品中的苯并[a]蒽、

苯并[b]荧蒽、苯并[a] 芘，同时对干扰物质的提取量达到最小化，将所得第一正己烷提取液进一步进行净化，具体为先通过Florisil柱净化将待测样品中酚类化合物、叶绿素、叶黄素等吸附在Florisil柱中，从而除去一部分干扰物质，然后利用EU多环芳烃固相萃取柱进行进一步净化，可将烷烃、脂肪、黄色色素干扰物质去除获得第二净化液，将第二净化液中的溶剂去除，即可得到第二净化提取物，以用于精确测定中药产品中多环芳烃标志物的含量。

附图说明

图1为标准工作液的质量色谱图；

图2为空白试样的质量色谱图；

图3为葡萄籽提取物1的质量色谱图；

图4为天麻的质量色谱谱图；

其中BaA为苯并[a]蒽的简称，CHR为

的简称，BbFA为苯并[b]荧蒽的简称，BaP为苯并[a]芘的简称；D₁₂-BaA为D₁₂-苯并[a]蒽的简称，D₁₂-CHR 为D₁₂-

的简称，D₁₂-BbFA为D₁₂-苯并[b]荧蒽的简称，D₁₂-BaP为D₁₂-苯并 [a]芘的简称，D₁₂代表12个氘代氕。

具体实施方式

本发明提供了一种检测中药产品中多环芳烃标志物的样品前处理方法，包括以下步骤：

1)提取：

将待测样品、内标溶液和乙醇混合后进行第一超声处理，得到第一混合溶液；

将所述第一混合溶液与水混合后依次进行第一涡旋提取和第二超声处理，得到第二混合溶液；

将所述第二混合溶液和正己烷混合后进行第二涡旋提取，然后经离心，取上层，得到第一正己烷提取液；

2)净化：

将所述第一正己烷提取液进行Florisil柱净化，得到第一净化液；

将所述第一净化液进行第一溶剂去除后，将所得第一净化提取物溶解于正己烷中，得到第一净化提取物的正己烷溶液；

将所述第一净化提取物的正己烷溶液进行EU多环芳烃固相萃取柱净化，得到第二净化液；

将所述第二净化液进行第二溶剂去除，得到第二净化提取物。

本发明首先将待测样品、内标溶液和乙醇混合后进行第一超声处理，得到第一混合溶液。

在本发明中，当所述待测样品为中药材或片状的中药保健食品时，优选对中药材或片状的中药保健食品依次进行粉碎和过筛，得到80目的待测样品，再进行第一超声处理；所述粉粹用设备优选为超微粉碎机，所述过筛用筛网的目数优选为80目；当所述待测样品为胶囊形式的中药保健食品时，优选将胶囊内容物取出进行第一超声处理。

在本发明中，所述内标溶液优选为D₁₂-苯并[a]蒽、D₁₂-

D₁₂-苯并[b] 荧蒽和D₁₂-苯并[a]芘的混合丙酮溶液。在本发明中所述D₁₂-苯并[a]蒽简称为 D₁₂-BaA，所述D₁₂-

简称为D₁₂-CHR，所述D₁₂-苯并[b]荧蒽简称为 D₁₂-BbFA，所述D₁₂-苯并[a]芘简称为D₁₂-BaP，所述D₁₂-苯并[a]蒽、D₁₂-

D₁₂-苯并[b]荧蒽和D₁₂-苯并[a]芘的混合丙酮溶液简称为D₁₂-PAH4混合内标溶液；所述内标溶液中D₁₂-BaA、D₁₂-CHR、D₁₂-BbFA和D₁₂-BaP的浓度均优选为0.2μg/mL。本发明对所述D₁₂-PAH4混合内标溶液的配制方法没有特殊限定，能够得到所需浓度的内标溶液即可，在本发明实施例中，所述 D₁₂-PAH4混合内标溶液的配制优选包括以下步骤：吸取0.02mL标准 D₁₂-PAH4混合内标溶液，转移至容量瓶中用丙酮定容至10mL；所述标准 D₁₂-PAH4混合内标溶液中D₁₂-BaA、D₁₂-CHR、D₁₂-BbFA和D₁₂-BaP的浓度均优选为100μg/mL；所述标准D₁₂-PAH4混合内标溶液优选购自德国Dr公司。

在本发明中，所述待测样品和D₁₂-PAH4混合内标溶液质量体积比优选为0.1～2.0g：50～200μL；所述待测样品和乙醇的质量体积比优选为0.1～2.0g：10mL。在本发明中，所述待测样品的质量与待测样品中多环芳烃标志物的含量有关，当所述待测样品中的多环芳烃标志物含量较高时，所述待测样品的取样质量可适当小一些，所述待测样品中苯并[a]蒽、

苯并[a]荧蒽和苯并[a]芘的质量独立地优选为1～20ng。在本发明中，所述乙醇优选为分析纯，所述乙醇能够将中药材提取物和中药保健食品溶解，利于进一步提取。

在本发明中，所述第一超声处理的功率优选为200W，频率优选为 40kHz，时间优选为3～7min，更优选为5min。本发明对所述第一超声处理所用设备没有特殊限定，能够实现第一超声处理即可，在本发明实施例中，所述第一超声处理优选采用超声波清洗器，所述超声波清洗器优选购自昆山超声仪器有限公司。

得到第一混合溶液后，本发明将所述第一混合溶液与水混合后依次进行第一涡旋提取和第二超声处理，得到第二混合溶液。

在本发明中，所述水和待测样品的体积质量比优选为10mL：0.1～2.0g。

在本发明中，所述第一涡旋提取的转速优选为2500rpm，时间优选为 40～80s，更优选为60s。本发明对所述第一涡旋提取用设备没有特殊限定能够实现上述第一涡旋提取即可，在本发明实施例中，所述第一涡旋提取所用设备优选为多样品涡旋振荡器，所述多样品涡旋振荡器优选购自德国 Heidolph。

在本发明中，所述第二超声处理的功率优选为200W频率优选为40kHz，时间优选为3～7min，更优选为5min。本发明对所述第二超声处理所用设备没有特殊限定，能够实现上述第二超声处理即可，在本发明实施例中，所述第二超声处理所用设备优选为超声波清洗器，所述超声波清洗器优选购自昆山超声仪器有限公司。

得到第二混合溶液后，本发明将所述第二混合溶液和正己烷混合后进行第二涡旋提取，然后经离心，取上层，得到第一正己烷提取液。

在本发明中，所述正己烷和待测样品的体积质量比优选为10mL： 0.1～2.0g。

在本发明中，所述第二涡旋提取的转速优选为2500rpm，时间优选为 4～6min，更优选为5min。本发明对所述第一涡旋提取用设备没有特殊限定能够实现上述第一涡旋提取即可，在本发明实施例中，所述第二涡旋提取所用设备优选为多样品涡旋振荡器，所述多样品涡旋振荡器优选购自德国 Heidolph。在本发明中，所述离心的转速优选为10000rpm，时间优选为3min。本发明对所述离心所用设备没有特殊限定，能够实现上述离心操作即可，在本发明实施例中，所述离心所用设备优选为高速离心机，所述高速离心机优选购自美国Beckman公司。

得到第一正己烷提取液后，本发明将所述第一正己烷提取液进行Florisil 柱净化，得到第一净化液。

在本发明中，所述Florisil柱净化所用Florisil柱的规格优选为2g/12mL (填料量/柱体积)，本发明对所述Florisil柱的来源没有特殊限定，在本发明实施例中，所述Florisil柱优选购自康源科技有限公司。

在本发明中，本发明优选将所述Florisil柱净化所用Florisil柱进行活化处理，再用于Florisil柱净化；所述活化处理包括如下步骤：在Florisil柱中加入无水硫酸钠，然后使用正己烷进行淋洗；所述无水硫酸钠的质量优选为 0.5～2.0g，更优选为1.0g；所述无水硫酸钠的纯度优选为分析纯。在本发明中，所述活化处理用正己烷的体积优选为4～6mL，更优选为5mL。在本发明中，所述无水硫酸钠用于除去第一正己烷提取液中的水分。

在本发明中，所述Florisil柱净化包括如下步骤：将所述第一正己烷提取液过Florisil柱并收集提取液流出液，然后用第一洗脱液进行洗脱，收集洗脱流出液，将所述提取液流出液与洗脱流出液合并，得到第一净化液。

在本发明中，所述第一洗脱液优选为二氯甲烷-正己烷溶液，所述二氯甲烷-正己烷溶液中二氯甲烷和正己烷的体积比优选为2～4:17，更优选为 3:17；所述第一洗脱液的用量为0.3～0.5倍柱体积。

在本发明中，所述Florisil柱净化过程中第一正己烷提取液过Florisil柱的流速优选为1～2mL/min，更优选为1mL/min；所述第一洗脱液的流速优选为0.5～2.0mL/min。

在本发明中，所述Florisil柱净化过程将待测样品中的酚类化合物、叶绿素、叶黄素等吸附在Florisil柱中，从而除去一部分干扰物质。

得到第一净化液后，本发明将所述第一净化液进行第一溶剂去除后，将所得第一净化提取物溶解于正己烷中，得到第一净化提取物的正己烷溶液。

在本发明中，所述第一溶剂去除的方式优选为将所述第一净化液加热至 50℃后用氮气吹干除去第一溶剂，所述第一溶剂优选包括正己烷和二氯甲烷，本发明对所述氮气吹干所用设备没有特殊限定，在本发明实施例中，所述氮气吹干所用设备为氮吹仪，所述氮吹仪购自上海安谱公司。

在本发明中，所述正己烷的体积优选为1.8～2.2mL，更优选为2mL。

得到第一净化提取物的正己烷溶液后，本发明将所述第一净化提取物的正己烷溶液进行EU多环芳烃固相萃取柱净化，得到第二净化液。

在本发明中，所述EU多环芳烃固相萃取柱净化所用EU多环芳烃固相萃取柱的规格优选为250mg/6mL，所述EU多环芳烃固相萃取柱的填料优选为二乙烯基苯聚合物和N-丙基乙二胺，所述EU多环芳烃固相萃取柱优选购自康源科技有限公司。

本发明优选将所述EU多环芳烃固相萃取柱净化所用EU多环芳烃固相萃取柱进行活化处理，在用于EU多环芳烃固相萃取柱净化；所述活化处理包括如下步骤：利用二氯甲烷和正己烷依次对EU多环芳烃固相萃取柱进行淋洗；所述二氯甲烷的体积优选为2.5～4.0mL，更优选为3mL，所述正己烷的体积优选为2.5～4.0mL，更优选为3mL。

在本发明中，所述EU多环芳烃固相萃取柱净化包括如下步骤：将所述第一净化提取物的正己烷溶液过EU多环芳烃固相萃取柱，然后采用正己烷进行淋洗除杂，再用第二洗脱液对淋洗除杂后的EU多环芳烃固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱流出液，得到第二净化液。

在本发明中，所述第二洗脱液优选为二氯甲烷-乙酸乙酯溶液，所述二氯甲烷-乙酸乙酯溶液中二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比优选为1～1.5:1，更优选为1:1；所述第二洗脱液的用量为0.8～1.5倍柱体积，更优选为0.83倍柱体积，所述淋洗除杂用正己烷的用量为0.5～1.5倍柱体积。

在本发明中，所述EU多环芳烃固相萃取柱净化过程中，第一净化提取物的正己烷溶液过EU多环芳烃固相萃取柱的流速优选为1～2mL/min，更优选为1mL/min。

在本发明中，所述EU多环芳烃固相萃取柱净化过程除去了待测样品中的烷烃、脂肪和黄色色素。

得到第二净化液后，本发明将所述第二净化液进行第二溶剂去除，得到第二净化提取物。在本发明中，所述第二溶剂去除优选将所述第二净化液加热至40℃后用氮气吹干除去第二溶剂，所述第二溶剂优选包括二氯甲烷和乙酸乙酯，本发明对所述氮气吹干所用设备没有特殊限定，在本发明实施例中，所述氮气吹干所用设备为氮吹仪，所述氮吹仪购自上海安谱公司。

本发明还提供了一种中药产品中多环芳烃标志物的测定方法，包括以下步骤：

一种中药产品中多环芳烃标志物的测定方法，包括以下步骤：

(1)采用上述技术方案所述的样品前处理方法对待测样品进行样品前处理，得到第二净化提取物；

(2)将所述第二净化提取物溶解于丙酮-异辛烷溶液中，得到待测液；

(3)将所述待测液进行气相色谱质谱分析，得到质量色谱图；

(4)根据所述质量色谱图，采用标准曲线法，计算多环芳烃标志物的含量。

在本发明中，所述气相色谱-质谱联用仪中的色谱条件优选包括：色谱柱，DB-EUPAH毛细管色谱柱，所述DB-EUPAH毛细管柱长优选为20m，内径优选为0.18mm，膜厚优选为0.14μm；柱温程序，初温80℃，保持2min，以10℃/min升至250℃，保持2min，以8℃/min升至320℃，保持5min；

质谱条件优选包括：电子轰击离子源；电离能量为70eV；电子倍增器增益250V；离子源温度230℃；传输线温度280℃；四级杆温度150℃；

在本发明中，所述气相色谱-质谱联用仪的进样口温度优选为280℃，所用载气优选为氦气，所述氦气的纯度优选≥99.999％，进样体积优选为2μL，所述进样的方式优选为不分流进样，所述进样时溶剂延迟时间优选为25min。

本发明采用上述技术方案所述的样品前处理方法对待测样品进行样品前处理，得到第二净化提取物。

在本发明中，为了减少外界环境对检测结果的影响，优选将器皿在使用前进行300℃高温烘烤，更优选将器皿在使用前利用正己烷进行淋洗。

得到第二净化提取物后，本发明将所述第二净化提取物溶解于丙酮-异辛烷溶液中，得到待测液，所述丙酮-异辛烷溶液优选为180～220μL，更优选为200μL，所述丙酮-异辛烷溶液中丙酮和异辛烷的体积比优选为0.8～1.2:1，更优选为1:1。在本发明中，所述丙酮和异辛烷的纯度优选为色谱纯。

得到待测液后，本发明将所述待测液进行气相色谱质谱分析，得到质量色谱图。在本发明中，所述气相色谱质谱分析所用气相色谱-质谱联用仪的型号优选为6890GC-5973MS，优选购自Agilent公司。在本发明中，所述气相色谱质谱分析中色谱的条件包括：

色谱柱：DB-EUPAH毛细管色谱柱；

柱温程序：初温80℃，保持2min，以10℃/min升至250℃，保持2min，以8℃/min升至320℃，保持5min；

质谱条件包括：电子轰击离子源；电离能量为70eV；电子倍增器增益 250V；离子源温度230℃；传输线温度280℃；四级杆温度150℃；

得到质量色谱图后，本发明根据所述质量色谱图，采用标准曲线法，计算多环芳烃标志物的含量。

本发明对所述标准曲线法所用标准曲线的获取方式没有特殊限定，本领域技术人员采用常规的方式即可得到标准曲线。在本发明实施例中，所述标准曲线的绘制方法优选包括以下步骤：

1)配制标准工作液

配制PAH4混合标准溶液，所述PAH4混合标准溶液中BaA、CHR、BbFA 和BaP的浓度均为0.2μg/mL；

配制D₁₂-PAH4混合内标溶液，所述D₁₂-PAH4混合内标溶液中D₁₂-BaA、 D₁₂-CHR、D₁₂-BbFA和D₁₂-BaP的浓度均为0.2μg/mL；

配制五种标准工作液，每种标准工作液中BaA、CHR、BbFA和BaP的浓度一样，第一种标准工作液中BaA、CHR、BbFA和BaP的浓度为5ng/mL，第二种标准工作液中BaA、CHR、BbFA和BaP的浓度为10ng/mL，第三种标准工作液中BaA、CHR、BbFA和BaP的浓度为25ng/mL，第四种标准工作液中BaA、CHR、BbFA和BaP的浓度为50ng/mL，第五种标准工作液中 BaA、CHR、BbFA和BaP的浓度为100ng/mL；所述五种标准工作液中 D₁₂-BaA、D₁₂-CHR、D₁₂-BbFA和D₁₂-BaP的浓度均为50ng/mL。

2)制备标准曲线

采用与待测液相同的测试方法对上述标准工作液进行气相色谱质谱分析，得到质谱色谱谱图，将BaA和D₁₂-BaA的浓度比作为横坐标x₁，以BaA 和D₁₂-BaA峰面积的比作为纵坐标y₁；将CHR和D₁₂-CHR的浓度比作为横坐标x₂，以CHR和D₁₂-CHR峰面积的比作为纵坐标y₂；将BbFA和D₁₂-BbFA 的浓度比作为横坐标x₃，以BbFA和D₁₂-BbFA峰面积的比作为纵坐标y₃；将BaP和D₁₂-BaP的浓度比作为横坐标x₄，以BaP和D₁₂BaP峰面积的比作为纵坐标y₄；得到各多环芳烃标志物的标准曲线。其中图1为检测BaA、 CHR、BbFA和BaP的浓度为10ng/mL的标准工作液得到的色谱谱图。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的检测中药产品中多环芳烃标志物的样品前处理方法和测定方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例中所用试剂的来源：

乙醇购自上海国药公司；丙酮和异辛烷购自MERCK；乙酸乙酯和正己烷购自MERCK；D₁₂-PAH4混合标准溶液购自德国Dr公司；PAH4混合标准溶液购于德国Dr公司。

实施例1

空白实验

实验前将所用玻璃器皿在300℃进行高温烘烤，其他均为一次性容器；

1)将50μL的D₁₂-PAH4混合内标溶液(D₁₂-BaA、D₁₂-CHR、D₁₂-BbFA 和D₁₂-BaP的浓度均优选为0.2μg/mL)和10mL无水乙醇混合，在功率为 200W频率为40kHz的条件下超声提取5min，得到得到第一混合溶液；

将所述第一混合溶液与10mL水混合后在转速为2500rpm的条件下涡旋提取1min，然后在功率为200W频率为40kHz的条件下超声提取5min，得到第二混合溶液；

将所述第二混合溶液和10mL正己烷混合后在转速为2500rpm的条件下进行第二涡旋提取5min，然后以10000rpm离心3min经离心，取上层液，得到第一正己烷提取液；

2)净化

在Florisil柱(2g/12mL)中加入1g无水硫酸钠，用5mL正己烷活化进行活化，活化结束后将所述第一正己烷提取液转移至Florisil柱中，保持流速1mL/min，收集流出液；待过柱后，用6mL体积比为3:17的二氯甲烷- 正己烷溶液进行洗脱，收集洗脱液，将流出液和洗脱液合并得到第一净化液；

将所述第一净化液水浴加热至50℃后用氮吹仪除去第一净化液中的第一溶剂，将所得第一净化提取物溶解于正己烷中，得到第一净化提取物的正己烷溶液；

用3mL二氯甲烷、3mL正己烷依次淋洗活化EU多环芳烃固相萃取柱 (250mg/6mL)，将所述第一净化提取物的正己烷溶液转移至EU多环芳烃固相萃取柱净化，进行过柱，控制过柱流速为1.mL/min，待过柱结束后，用 4mL正己烷淋洗除杂，最后用5mL体积比为1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯溶液洗脱，收集洗脱液，洗得到第二净化液；

将所述第二净化液加热至40℃后利用氮吹仪除去第二净化液中的第二溶剂，得到第二净化提取物；

3)将第二净化提取物溶解于200μL体积比为1：1的丙酮-异辛烷溶液，得到空白待测液。

将所述空白待测液进行气相色谱质谱分析，得到质量色谱图如图2所示；所述气相色谱质谱分析中的色谱条件包括：

色谱柱：DB-EUPAH毛细管色谱柱，柱长20m，内径0.18mm，膜厚 0.14μm；

进样口温度：280℃；

载气：氦气，纯度≥99.999％；

进样体积：2μL，不分流进样，溶剂延迟时间为25min；

柱温程序：初温80℃，保持2min，以10℃/min升至250℃，保持2min，以8℃/min升至320℃，保持5min；

质谱条件包括：电子轰击离子源(EI)；电离能量为70eV；电子倍增器增益250V；离子源温度230℃；传输线温度280℃；四级杆温度150℃。

由图2可知，空白实验获得的质量色谱图中未检测到苯并[a]蒽、

苯并[a]荧蒽、苯并[a]芘，说明试验环境中苯并[a]蒽、

苯并[a]荧蒽、苯并[a] 芘4种多环芳烃标志物含量均小于本发明检测方法检出限，有效的保证了结果可靠性。

实施例2

将0.2mL PAH4混合标准溶液(BaA、CHR、BbFA和BaP的浓度均为 0.2μg/mL)转移至10mL容量瓶中，用丙酮定容至10mL，得到待测PAH4 混合标准溶液(BaA、CHR、BbFA和BaP的浓度均为0.2μg/mL)；

将0.02mL的D₁₂-PAH4混合标准溶液(D₁₂-BaA、D₁₂-CHR、D₁₂-BbFA 和D₁₂-BaP的浓度均为100.0μg/mL)转移至容量瓶，用丙酮定容至10.0mL，得到D₁₂-PAH4混合内标溶液(D₁₂-BaA、D₁₂-CHR、D₁₂-BbFA和D₁₂-BaP的浓度均为0.2μg/mL)；

分别将5μL、10μL、25μL、50μL和100μL所述待测PAH4混合标准溶液，转移至5个进样瓶中，分别在5个进样瓶中加入50μL所述D₁₂-PAH4 混合内标溶液，用丙酮-异辛烷溶液(丙酮-异辛烷溶液中丙酮和异辛烷的体积比为1:1)定容到200μL，得到不同浓度的标准工作液，所述标准工作液中D₁₂-BaA、D₁₂-CHR、D₁₂-BbFA和D₁₂-BaP的浓度均为50ng/mL。

利用气相色谱-质谱联用仪检测所述标准工作液，得到质量色谱图如图1 所示，将PAH4与对应内标物D₁₂-PAH4的浓度比作为横坐标x，以PAH4 的峰面积与对应内标物D₁₂-PAH4峰面积比作为纵坐标y，得到各多环芳烃标志物的标准曲线。

表1各化合物监测离子及线性方程

注：带“*”为定量离子，x₁是BaA和D₁₂-BaA的浓度比，y₁是BaA和 D₁₂-BaA峰面积的比；x₂是CHR和D₁₂-CHR的浓度比，y₂是CHR和D₁₂-CHR 峰面积的比；x₃是BbFA和D₁₂-BbFA的浓度比，y₃是BbFA和D₁₂-BbFA峰面积的比；x₄是BaP和D₁₂-BaP的浓度比，y₄是BaP和D₁₂BaP峰面积的比。

按照实施例1的方法分别对低本底(即不含多环芳烃标志物)铁皮石斛、铁皮石斛提取物和铁皮石斛保健食品进行加标回收试验，与实施例1不同之处在于，在步骤1)中加入1g待测样品(铁皮石斛、铁皮石斛提取物或铁皮石斛保健食品)和不同量的加标液(即实施例2中的待测PAH4混合标准溶液)，其结果列于表2中，其中加标浓度为待测液中各多环芳烃标志物的浓度。

表2铁皮石斛、铁皮石斛提取物和铁皮石斛保健食品加标回收结果

由表2可知，对铁皮石斛、铁皮石斛提取物和铁皮石斛保健食品进行加标回收试验得到的回收率为78.6％～107.6％，精密度为2.3％～10.5％，完全可以满足欧盟关于中药产品中苯并[a]芘和PAH4限量为10.0μg/kg、50.0μg/kg 的规定要求。

根据表2结果，可知样品中加标2.0μg/kg，回收率均在70％～120％之间，符合GBT27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》要求，此时4中多环芳烃标志物信噪比(S/N)在24.6～35.2，大于10，因此确定本方法4个标志性化合物定量限为2.0μg/kg，以1/3定量限确定信噪比，4个标志性化合物定量限为0.7μg/kg。

因此当取1.00g样品时，确定本方法4个标志性化合物定量限为 2.0μg/kg，检出限为0.7μg/kg。

实施例3

实验前将所用玻璃器皿在300℃进行高温烘烤；

1)提取：

称取1.0g待测样品，加入0.2μg/mL多环芳烃混合内标使用液50μL，加 10mL无水乙醇，在功率为200W频率为40kHz的条件下超声提取5min，得到得到第一混合溶液；

将所述第一混合溶液与10mL水混合后在转速为2500rpm的条件下涡旋提取1min，然后在功率为200W频率为40kHz的条件下超声提取5min，得到第二混合溶液；

将所述第二混合溶液和10mL正己烷混合后在转速为2500rpm的条件下进行第二涡旋提取5min，然后以10000rpm离心3min经离心，取上层液，得到第一正己烷提取液；

2)净化

在Florisil柱中加入1g无水硫酸钠，用5mL正己烷活化进行活化，活化结束后将所述第一正己烷提取液转移至Florisil柱中，保持流速1mL/min，收集流出液；待过柱后，用6mL体积比为3:17的二氯甲烷-正己烷溶液进行洗脱，收集洗脱液，将流出液和洗脱液合并得到第一净化液；

将所述第一净化液水浴加热至50℃后用氮吹仪除去第一净化液中的第一溶剂，将所得第一净化提取物溶解于正己烷中，得到第一净化提取物的正己烷溶液；

用3mL二氯甲烷、3mL正己烷依次淋洗活化EU多环芳烃固相萃取柱，将所述第一净化提取物的正己烷溶液转移至EU多环芳烃固相萃取柱净化，进行过柱，控制过柱流速为1.mL/min，待过柱结束后，用4mL正己烷淋洗除杂，最后用5mL体积比为1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯溶液洗脱，收集洗脱液，洗得到第二净化液；

将所述第二净化液加热至40℃后利用氮吹仪除去第二净化液中的第二溶剂，得到第二净化提取物；

3)检测

将所述第二净化提取物溶解于200μL丙酮-异辛烷溶液(丙酮和异辛烷的体积比为1：1)中，得到待测液；

将所述待测液进行气相色谱质谱分析，得到质量色谱图；所述气相色谱质谱分析的条件与实施例1相同；

根据所述质量色谱图，采用实施例2获得的标准曲线，计算待测样品中多环芳烃标志物的含量，其结果列于表3中。

表3中药材、中药提取物及中药保健食品PAH4含量结果

上述待测样品均为市售产品。

测定葡萄籽提取物1色谱图如图3所示，测定天麻的质量色谱图如图4 所示，由图3和图4可知本方法适合葡萄籽提取物、天麻等多种样品的检测。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一种检测中药产品中多环芳烃标志物的样品前处理方法，所述多环芳烃标志物为苯并[a]蒽、䓛、苯并[a]荧蒽和苯并[a]芘，所述前处理方法包括以下步骤：

1）提取：

将待测中药产品样品、内标溶液和乙醇混合后进行第一超声处理，得到第一混合溶液；

将所述第一混合溶液与水混合后依次进行第一涡旋提取和第二超声处理，得到第二混合溶液；

将所述第二混合溶液和正己烷混合后进行第二涡旋提取，然后经离心，取上层，得到第一正己烷提取液；

2）净化：

将所述第一正己烷提取液进行Florisil柱净化，得到第一净化液；所述Florisil柱净化包括如下步骤：将所述第一正己烷提取液过Florisil柱并收集提取液流出液，然后用第一洗脱液进行洗脱，收集洗脱流出液，将所述提取液流出液与洗脱流出液合并，得到第一净化液；所述第一洗脱液为二氯甲烷-正己烷混合溶液，所述二氯甲烷-正己烷混合溶液中二氯甲烷和正己烷的体积比为2~4:17；所述第一洗脱液的用量为0.5~1.5倍柱体积；

将所述第一净化液进行第一溶剂去除后，将所得第一净化提取物溶解于正己烷中，得到第一净化提取物的正己烷溶液；

将所述第一净化提取物的正己烷溶液进行EU多环芳烃固相萃取柱净化，得到第二净化液；所述EU多环芳烃固相萃取柱的填料为二乙烯基苯聚合物和N-丙基乙二胺；所述EU多环芳烃固相萃取柱净化包括如下步骤：将所述第一净化提取物的正己烷溶液过EU多环芳烃固相萃取柱，然后采用正己烷进行淋洗除杂，再用第二洗脱液对淋洗除杂后的EU多环芳烃固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱流出液，得到第二净化液；所述第二洗脱液为二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶液，所述二氯甲烷-乙酸乙酯溶液中二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为1~1.5:1，所述第二洗脱液的用量为0.5~1.5倍柱体积，所述淋洗除杂用正己烷的用量为0.5~1.5倍柱体积；

将所述第二净化液中进行第二溶剂去除，得到第二净化提取物。

2.根据权利要求1所述样品前处理方法，其特征在于，所述步骤1）中，待测样品和乙醇的质量体积比为0.1~2.0g:10mL，水和待测样品的体积质量比为10mL:0.1~2.0g，正己烷和待测样品的体积质量比为10mL:0.1~2.0g。

3.根据权利要求1所述样品前处理方法，其特征在于，所述内标溶液为D₁₂-苯并[a]蒽、D₁₂-䓛、D₁₂-苯并[b]荧蒽和D₁₂-苯并[a]芘的混合丙酮溶液。

4.根据权利要求1所述样品前处理方法，其特征在于，所述第一涡旋提取的转速为2500rpm，时间为40~80s。

5.根据权利要求1所述样品前处理方法，其特征在于，所述第二涡旋提取的转速为2500rpm，时间为4~6min。

6.根据权利要求1所述样品前处理方法，其特征在于，所述第一正己烷提取液过Florisil柱时的流速为1~2mL/min，所述第一洗脱液的流速为0.5~2mL/min。

7.根据权利要求1所述样品前处理方法，其特征在于，所述第一净化提取物的正己烷溶液过EU多环芳烃固相萃取柱时的流速为1~2mL/min。

8.一种中药产品中多环芳烃标志物的测定方法，包括以下步骤：

（1）采用权利要求1~7任一项所述的样品前处理方法对待测样品进行样品前处理，得到第二净化提取物；

（2）将所述第二净化提取物溶解于丙酮-异辛烷溶液中，得到待测液；

（3）将所述待测液进行气相色谱-质谱分析，得到质量色谱图；

（4）根据所述质量色谱图，采用标准曲线法，计算多环芳烃标志物的含量。

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