CN110763786B

CN110763786B - 鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法及应用

Info

Publication number: CN110763786B
Application number: CN201911119534.5A
Authority: CN
Inventors: 李阳; 樊霞; 肖志明; 贾铮; 索德成; 王石
Original assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110763786A

Abstract

本发明涉及鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法及应用。所述方法包括：a)样品的提取：向待检测物中添加提取溶剂进行提取，获得提取溶液；将所述提取溶液进行离心、过滤后，获得待检测溶液；b)液相色谱分离：采用液相色谱对步骤a)中获得的待检测溶液进行分离，获得分离成分；c)质谱检测：采用质谱对所述分离成分进行检测，通过分析总离子提取色谱结果和碎片离子结果判断是否存在所述头孢菌素药渣的标志物；若检测到所述标志物，则表示所述植物源性蛋白饲料原料中掺有头孢菌素药渣。所述方法样品用量少、过程简单、检测周期短，灵敏度较高、结果准确，而且成本可控，溶剂回收利用率高。

Description

鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法及应用

技术领域

本发明涉及饲料质量安全检测领域，具体而言，涉及鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法及应用。

背景技术

植物源性蛋白饲料原料(例如豆粕、棉粕、菜籽粕)为重要的饲料蛋白源，被大量应用于畜禽养殖，以满足畜禽生长的生理需求。不法养殖者将抗生素药渣掺杂到饲料原料中替代蛋白使用的现象偶有发生，存在影响动物源性食品安全和公共健康的潜在风险。

例如，头孢菌素药渣是生物发酵生产头孢菌素C后剩余的发酵培养基经过滤后产生废渣，具有一定粗蛋白，属于一种产量的较大的抗生素药渣。养殖过程使用含有头孢菌素药渣的饲料原料将危害养殖动物健康、影响食品安全和诱导产生细菌耐药性等潜在风险隐患，因此，抗生素药渣，特别是头孢菌素药渣是被严禁掺加到饲料中使用的。然而，目前国内外尚无准确有效鉴别植物源性蛋白饲料原料中掺加抗生素药渣，尤其是头孢菌素药渣的分析方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法，所述方法样品用量少、过程简单、检测周期短，灵敏度较高、结果准确，而且成本可控，溶剂回收利用率高。

本发明的第二目的在于提供上述方法在鉴别植物源性蛋白饲料原料是否掺杂头孢菌素药渣方面的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法，其包括：

a)样品的提取：向待检测物中添加提取溶剂进行提取，获得提取溶液；将所述提取溶液进行离心、过滤后，获得待检测溶液；

b)液相色谱分离：采用液相色谱对步骤a)中获得的待检测溶液进行分离，获得分离成分；所述液相色谱的分离条件包括：

以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为0.2mL/min～0.5mL/min；

流动相A为0.05vol.％～0.15vol.％的甲酸水溶液；流动相B为0.05vol.％～0.15vol.％的甲酸-乙腈水溶液；

所述梯度洗脱的方式为：以体积百分比计，0min～1min，A：95％，B：5％；1min～5min，A：95％～70％，B：5％～30％；5min～11min，A：70％～5％，B：30％～95％；11min～13min，A：5％，B：95％；13min～16min，A：95％，B：5％；

c)质谱检测：采用质谱对所述分离成分进行检测，通过分析总离子提取色谱结果和碎片离子结果判断是否存在所述头孢菌素药渣的标志物；若检测到所述标志物，则表示所述植物源性蛋白饲料原料中掺有头孢菌素药渣；

所述质谱的检测条件包括：

电喷雾电离源；正离子扫描，扫描范围100m/z～500m/z；

雾化气(N₂)流量：40psi～60psi；辅助加热气(N₂)流量：40psi～60psi；气帘气流量(N₂)：40psi～60psi；毛细管温度：400℃～600℃；

离子化电压：4000V～6000V；气簇电压：70V～90V；碰撞能量：30V～40V；CES电压：10V～20V。

可选地，所述流动相的流速为0.4mL/min。

可选地，所述流动相A为0.1vol.％的甲酸水溶液；所述流动相B为0.1vol.％的甲酸-乙腈水溶液。

可选地，所述质谱的检测条件包括：

电喷雾电离源；正离子扫描，扫描范围100m/z～500m/z；

雾化气(N₂)流量：50psi；辅助加热气(N₂)流量：50psi；气帘气流量(N₂)：50psi；毛细管温度：500℃；

离子化电压：5500V；气簇电压：80V；碰撞能量：35V；CES电压：15V。

可选地，所述质谱为飞行时间质谱。

作为本发明的一种实施方式，所述液相色谱的色谱柱为Kinetex F5色谱柱。

作为本发明的一种实施方式，所述质谱通过四级杆-飞行时间质谱(TripleTOF5600+)检测。

可选地，所述标志物包括头孢菌素C、盘尼西林N和脱乙酰氧基头孢菌素C中的至少一种。

可选地，所述标志物包括头孢菌素C、盘尼西林N和脱乙酰氧基头孢菌素C。

可选地，在步骤a)中，所述待检测物和所述提取溶剂的固液比为0.5～2:10g/mL，优选为1:10g/mL。

可选地，所述提取溶剂为有机溶剂与水的混合溶剂，混合体积比为1～4:1，更优选为1:1。

可选地，所述有机溶剂为乙腈。

可选地，步骤b)中，所述液相色谱的进样量为10μL～30μL。

可选地，步骤b)中，所述液相色谱的进样量为20μL。

可选地，所述液相色谱的柱温为30℃～50℃。

可选地，所述液相色谱的柱温为40℃。

可选地，所述液相色谱的流动相B中甲酸与乙腈的体积比为0.05～0.15:100。

可选地，所述提取包括涡旋和振荡。

可选地，所述涡旋的时间为1min～5min，优选为2min。

可选地，所述振荡的速率为1500rpm～3000rpm，所述振荡的时间为20min～40min。

可选地，所述离心的转速为5000rpm～8000rpm，优选为6000rpm。

可选地，所述离心的时间为3min～8min，优选为5min。

可选地，所述过滤所采用的滤膜的孔径为0.2μm～0.5μm。

可选地，在提取样品之前，所述方法还包括：对所述待检测物进行预处理。

可选地，所述预处理包括粉碎处理；经所述粉碎处理后，所述待检测物的粒径为18目～40目。

可选地，所述粉碎处理可以采用旋风磨进行。

作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：

1)样品的预处理：将饲料或饲料原料进行粉碎；

2)溶剂提取：将提取溶剂加入粉碎后的饲料或饲料原料中，涡旋后振摇提取，获得提取溶液；

3)离心：将所述提取溶液进行离心，获得上清溶液；

4)过滤：将上清溶液进行过滤，获得检测溶液；

5)液相色谱分离：采用液相色谱对检测溶液进行分离；

6)质谱检测：采用飞行时间质谱检测步骤5)分离后所得成分；

7)结果判断：经质谱检测后获得质谱结果，通过分析总离子提取色谱结果和碎片离子结果判断是否存在头孢菌素药渣的标志物，如检测到标志物，则所述饲料或饲料原料中掺加头孢菌素药渣。

作为本发明的一种实施方式，以头孢菌素C、盘尼西林N和脱乙酰氧基头孢菌素C作为头孢菌素药渣的标志物，通过溶剂提取样品，离心和过滤后采用液相色谱-飞行时间质谱分离和检测3种标志物，从而鉴别植物源性蛋白饲料原料中是否掺有头孢菌素药渣。

作为本发明的一种实施方式，液相色谱分离和质谱检测的结果通过谱图判断。液相色谱-质谱检测的谱图共包括两种类型：总离子流提取色谱图和特征碎片离子图。根据标志物总离子流提取色谱出峰时间和特征碎片离子信息进行定性鉴别，判断原则为：若总离子流提取色谱明显出峰，特征碎片离子均被检出，则认定为掺有头孢菌素药渣。

作为本发明的一种实施方式，以质荷比为416.1788±0.005m/z和228.1348±0.005m/z作为头孢菌素C的特征碎片，以质荷比为360.1237±0.005m/z和156.0121±0.005m/z作为盘尼西林N的特征碎片，以质荷比为358.1055±0.005m/z和197.0926±0.005m/z作为脱乙酰氧基头孢菌素C的特征碎片。

根据本发明的另一目的，提供了上述任一鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法在鉴别植物源性蛋白饲料原料是否掺杂头孢菌素药渣方面的应用。

可选地，所述植物源性蛋白饲料原料包括豆粕、棉粕、菜籽粕。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法，样品用量少、过程简单、检测周期短，灵敏度较高、结果准确，而且溶剂回收利用率高。

(2)本发明提供的鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法，适用于鉴别植物源性蛋白饲料原料中是否掺有头孢菌素药渣，检测成本可控，检测效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种实施方式中，头孢菌素C的总离子流提取色谱图；

图2为本发明一种实施方式中，头孢菌素C的特征碎片离子图；

图3为本发明一种实施方式中，盘尼西林N的总离子流提取色谱图；

图4为本发明一种实施方式中，盘尼西林N的特征碎片离子图；

图5为本发明一种实施方式中，脱乙酰氧基头孢菌素C的总离子流提取色谱图；

图6为本发明一种实施方式中，脱乙酰氧基头孢菌素C的特征碎片离子图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

(1)样品预处理

采用旋风磨将掺有头孢菌素药渣(10％，m/m)的植物源性蛋白饲料原料粉碎，粉碎后其平均粒度约为18目。

(2)溶剂提取

称取0.5g粉碎后的饲料原料至洁净的离心管中，加入5mL提取溶剂(提取溶剂为乙腈/水混合溶液，乙腈与水体积比为1:1)，涡旋2min后置于摇床上，在1500rpm～3000rpm的速率下振摇30min进行提取，获得提取溶液。

(3)离心

吸取3mL提取溶液，在6000rpm的离心力下离心5min，得到上清溶液。

(4)过滤

吸取1mL上清溶液，采用聚四氟乙烯滤膜(孔径为0.45μm)过滤，得到净化溶液后进行液相色谱分离。液相色谱分离的操作条件包括：

色谱柱为Kinetex F5色谱柱，柱温：40℃；

流动相A为：0.1vol.％甲酸水溶液，流动相B为：0.1vol.％甲酸乙腈溶液，流速均为0.4mL/min；

梯度洗脱方式：以体积百分比计，0.00～1.00min，A：95％，B：5％；1.00～5.00min，A：95％-70％，B：5％～30％；5.00～11.00min，A：70％～5％，B：30％～95％；11.00～13.00min，A：5％，B：95％；13.01～16.00min，A：95％，B：5％；

进样量：20μL。

(5)质谱检测

经液相色谱分离后，分离所得的成分通过四级杆-飞行时间质谱(Triple TOF5600+)检测，质谱的操作条件包括：

电喷雾电离源；

正离子扫描，扫描范围100～500m/z；

雾化气(N₂)流量：50psi；

辅助加热气(N₂)流量：50psi；

气帘气流量(N₂)：50psi；

毛细管温度：500℃；

离子化电压：5500V；

气簇电压：80V；

碰撞能量：35V；

CES电压：15V。

(6)结果判定

如图1所示的总离子流提取色谱图中，在2.469min处提取出头孢菌素C色谱峰，其特征碎片离子图如图2所示；

如图3所示的总离子流提取色谱图中，在3.037min处提取出盘尼西林N色谱峰，其特征碎片离子图如图4所示；

如图5所示的总离子流提取色谱图中，在2.616min处提取出脱乙酰氧基头孢菌素C色谱峰，其特征碎片离子图如图6所示。

由图1～图6的结果可以发现，本发明提供的测定方法样品用量少、过程简单、检测周期短，非常灵敏地检测出头孢菌素药渣标志物，并准确地判定了植物源性蛋白饲料原料中确实掺有头孢菌素药渣这一事实。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法，其特征在于，所述方法包括：

a）样品的提取：向待检测物中添加提取溶剂进行提取，获得提取溶液；将所述提取溶液进行离心、过滤后，获得待检测溶液；

b）液相色谱分离：采用液相色谱对步骤a）中获得的待检测溶液进行分离，获得分离成分；所述液相色谱的分离条件包括：

以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为0.2 mL/min ~0.5 mL/min；

流动相A为0.05 vol.%~0.15 vol.%的甲酸水溶液；流动相B为0.05 vol.%~0.15 vol.%的甲酸-乙腈水溶液；

所述梯度洗脱的方式为：以体积百分比计，0 min~1 min，A：95%，B：5%；1 min~5 min，A：95%~70%，B：5%~30%；5 min~11 min，A：70%~5%，B：30%~95%；11 min~13 min，A：5%，B：95%；13min~16 min，A：95%，B：5%；

所述液相色谱的色谱柱为Kinetex F5色谱柱；

c）质谱检测：采用质谱对所述分离成分进行检测，通过分析总离子提取色谱结果和碎片离子结果判断是否存在所述头孢菌素药渣的标志物；若检测到所述标志物，则表示所述植物源性蛋白饲料原料中掺有头孢菌素药渣；

所述质谱的检测条件包括：

电喷雾电离源；正离子扫描，扫描范围100 m/z~500 m/z；

雾化气流量：40 psi~60 psi；辅助加热气流量：40 psi~60 psi；气帘气流量：40 psi~60 psi；毛细管温度：400℃~600℃；

离子化电压：4000 V~6000 V；气簇电压：70 V~90 V；碰撞能量：30 V~40 V；CES电压：10V~20 V；

所述标志物为头孢菌素C、盘尼西林N和脱乙酰氧基头孢菌素C。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a）中，所述待检测物和所述提取溶剂的固液比为0.5~2:10 g/mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤a）中，所述待检测物和所述提取溶剂的固液比为1:10 g/mL。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂为有机溶剂与水的混合溶剂，混合体积比为1~4:1，所述有机溶剂为乙腈。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂中有机溶剂与水的混合体积比为1:1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b）中，所述液相色谱的进样量为10μL~30μL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤b）中，所述液相色谱的进样量为30μL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b）中，所述液相色谱的柱温为30℃~50℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤b）中，所述液相色谱的柱温为40℃。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取包括涡旋和振荡；

所述涡旋的时间为1 min~5 min；

所述振荡的速率为1500 rpm~3000 rpm，所述振荡的时间为20 min~40 min。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述涡旋的时间为2 min。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为5000 rpm~8000 rpm；所述离心的时间为3 min~8 min。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为6000 rpm；所述离心的时间为5 min。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤所采用的滤膜的孔径为0.2μm~0.5μm。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在提取样品之前，所述方法还包括：对所述待检测物进行预处理；

所述预处理包括粉碎处理；经所述粉碎处理后，所述待检测物的粒径为18目~40目。

16.权利要求1至15任一项所述的鉴别植物源性蛋白饲料原料中头孢菌素药渣的方法在鉴别植物源性蛋白饲料原料是否掺杂头孢菌素药渣方面的应用；

所述植物源性蛋白饲料原料包括豆粕、棉粕、菜籽粕。