CN111751474A - 一种红花中化学成分鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种红花中化学成分鉴定的方法，采用超高效液相色谱‑离子淌度‑四级杆飞行时间质谱联用，鉴定红花中的化学成分。采用本申请的方法，通过合理选择色谱条件和质谱条件，可以实现中药红花中多类别化学成分的鉴定，且所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，为进一步研究红花药效物质基础提供了依据。

Description

一种红花中化学成分鉴定的方法
技术领域
本发明涉及中药成分鉴定技术领域，具体涉及一种红花中化学成分鉴定的方法。
背景技术
红花，为菊科植物红花属植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花，是活血通经、祛瘀止痛的良药。现代药理学研究表明，红花具有扩张血管、增加血流量、改善微循环和抑制血小板聚集等作用，为了阐明红花的化学物质基础，寻找其活性成分，需要对红花的化学成分进行检测和鉴定。
然而，由于现有分析技术的局限，难以对中药红花的化学成分进行全面、准确的检测与鉴定，因此亟需一种分析方法，以对红花化学成分进行更全面并且有效的鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红花中化学成分鉴定的方法，采用超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱联用，鉴定红花中的化学成分，为进一步研究红花药效物质基础提供了依据。
本申请提供了一种红花中化学成分鉴定的方法，所述方法包括：
制备5-20mg/mL的待测样品溶液，溶剂为0-100vol％甲醇水溶液；
通过超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱，获得各化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值；
其中，超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数5-99％A相，1-95％B相，梯度洗脱；柱温：20-45℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样量V1：2-5μL；
离子淌度-四级杆飞行时间质谱的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，以负离子检测作为检测模式，质谱参数为：
喷雾电压为-0.5～-1kV；锥孔电压为20-120V；脱溶剂气体流量为700-900L/h；锥孔气体流量为40-60L/h；毛细管温度为100-140℃；辅助气加热温度为450-550℃；一级碰撞能量为4-8eV；高清MSE二级碰撞能量为20-100eV；数据依赖性采集二级碰撞能量为10-70eV；扫描范围为50-1500m/z；数据依赖性采集一级响应前N强离子的二级信息，其中，3≤N≤10，触发二级采集的母离子强度阈值为1300计数，停止二级采集的阈值为500计数或时间超过0.4s；
基于各化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值，确定待测样品中的化学成分。
本领域技术人员可以根据本申请的方法分离的化合物的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值等信息，与商业数据库、已发表的文章中已公开的红花化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值等信息进行比对，或者通过将已知的红花标准品采用与待测样品溶液相同的方法进行鉴定，获得的红花标准品的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值等信息，与分离的化合物的信息进行比对，以确定待测样品溶液中的化学成分，此为本领域常用的技术手段，本领域技术人员可根据实际需要选择比对的方式，本申请在此不做限制。
本发明提供的一种红花中化学成分鉴定的方法，采用超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱联用，通过合理选择色谱条件和质谱条件，可以实现中药红花中多类别化学成分的鉴定，且所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，为进一步研究红花药效物质基础提供了依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1为红花多成分鉴定中使用的15个标准品结构式；
图2为负离子模式监测下，红花样品的基峰离子图(相对强度(％)VS保留时间)；图2中，各数字标号分别代表：1.腺苷；2. 6-羟基山柰酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷；3.羟基红花黄色素A；4.咖啡酸；5.对香豆酸；6.芦丁；7.槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷；8.(2S)-4’,5,6,7-四羟基二氢黄酮-6-O-β-D-葡萄糖苷；9.脱水红花黄色素B；10.山柰酚-3-O-芸香苷；11.木犀草素；12.槲皮素；13.芹菜素；14.山柰酚；
图3为负离子模式监测下，红花多成分鉴定色谱条件构建中色谱柱优选图；其中A图为基峰离子图(相对强度(％)VS保留时间)；B图为分离出的离子的散点图(质荷比VS保留时间)；
图4为红花多成分鉴定主要质谱离子源参数毛细管电压与锥孔电压优选柱状图；其中A图为毛细管电压优选柱状图；B图为锥孔电压优选柱状图；
图5为红花中醌式查尔酮碳苷鉴定的二级质谱裂解示意图；其中A图为标准品羟基红花黄色素A(#24)；B图为一未知醌式查尔酮碳苷#120；
图6为红花中醌式查尔酮碳苷二聚体鉴定的二级质谱裂解示意图；其中A图为标准品脱水羟基红花黄色素B(#90)；B图为一未知醌式查尔酮碳苷二聚体#123；
图7为红花中黄酮氧苷鉴定的二级质谱裂解示意图；其中A图为标准品芦丁(#76)；B图为一未知黄酮氧苷#53；
图8为离子淌度分离DIA与DDA组合式二级质谱采集方法(HDMSE/HSDDA)与其它3种单一扫描模式(输入母离子列表的HSDDA，HSDDA/PIL；没有母离子列表的HSDDA；HDMSE)的性能对比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请提供了一种红花中化学成分鉴定的方法，所述方法包括：
制备5-20mg/mL的待测样品溶液，溶剂为0-100vol％甲醇水溶液；
通过超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱，获得各化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值；
其中，超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数5-99％A相，1-95％B相，梯度洗脱；柱温：20-45℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样量V1：2-5μL；
离子淌度-四级杆飞行时间质谱的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，以负离子检测作为检测模式，质谱参数为：
喷雾电压为-0.5～-1kV；锥孔电压为20-120V；脱溶剂气体流量为700-900L/h；锥孔气体流量为40-60L/h；毛细管温度为100-140℃；辅助气加热温度为450-550℃；一级碰撞能量为4-8eV；高清MSE二级碰撞能量为20-100eV；数据依赖性采集二级碰撞能量为10-70eV；扫描范围为50-1500m/z；数据依赖性采集一级响应前N强离子的二级信息，其中，3≤N≤10，触发二级采集的母离子强度阈值为1300计数，停止二级采集的阈值为500计数或时间超过0.4s；
基于各化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值，确定待测样品中的化学成分。
本申请中所述溶剂为0-100vol％甲醇水溶液，其可以为纯水或任意比例的甲醇水溶液或甲醇。
在本申请的一些实施方式中，优选地，所述溶剂为30-80vol％的甲醇水溶液。
在本申请的一些实施方式中，优选地，所述梯度洗脱具体为：0-4分钟，1-13％B相；4-9分钟，13-16％B相；9-11分钟，16-19％B相；11-16分钟，19-26％B相；16-19分钟，26-35％B相；19-23分钟，35-45％B相；23-24分钟，45-95％B相；24-26分钟，95％B相。
在本申请的一些实施方式中，所述色谱柱选自HSS T3、CSH Phenyl-Hexyl、CSHC18、BEH Shield RP18、BEH C18、CORTECS UPLC C18+、Kinetex Biphenyl、Zorbax ExtendC18、Zorbax Eclipse Plus C18或Zorbax SB-Aq，柱温为25-40℃。
在本申请的一些实施方式中，将获得的待测样品中化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值，与已知红花成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值进行比对，确定待测样品的化学成分。
为了高效鉴定色谱分离后的化学成分，以便于获得更准确的化学成分的鉴定结果，在本申请的一些实施方式中，所述已知红花成分包括脱水红花黄色素B、羟基红花黄色素A、6-羟基山柰酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷、芦丁、山柰酚-3-O-芸香苷、槲皮素、异槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、杨梅素、(2S)-4’,5,6,7-四羟基二氢黄酮-6-O-β-D-葡萄糖苷、咖啡酸、对香豆酸、腺苷。
在本申请的一些实施方式中，所述已知红花成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值是按照以下过程获得的：
制备5-20μg/mL的所述已知红花成分的标准品溶液，溶剂为0-100vol％甲醇水溶液；
通过超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱，获得所述红花成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值；
其中，超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数5-99％A相，1-95％B相，梯度洗脱；柱温：20-45℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样量V1：2-5μL；
离子淌度-四级杆飞行时间质谱的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，以负离子检测作为检测模式，质谱参数为：
喷雾电压为-0.5～-1kV；锥孔电压为20-120V；脱溶剂气体流量为700-900L/h；锥孔气体流量为40-60L/h；毛细管温度为100-140℃；辅助气加热温度为450-550℃；一级碰撞能量为4-8eV；高清MSE二级碰撞能量为20-100eV；数据依赖性采集二级碰撞能量为10-70eV；扫描范围为50-1500m/z；数据依赖性采集一级响应前N强离子的二级信息，其中，3≤N≤10，触发二级采集的母离子强度阈值为1300计数，停止二级采集的阈值为500计数或时间超过0.4s。
在本申请中，HDMSE为离子淌度分离、数据非依赖性采集(DIA)的高分辨二级质谱；HSDDA为离子淌度分离、数据依赖性采集(DDA)的高分辨二级质谱；HDMSE-HSMS/MS(high-definition MSE/high-selectivity MS/MS)组合式采集方法为离子淌度分离功能、单次进样交替进行数据非依赖性采集(DIA)与数据依赖性采集(DDA)的高分辨二级质谱高效采集的方法。
下面对本发明所需的仪器与试剂进行说明。
1、仪器
UPLC超高效液相色谱仪(Waters Corporation,Manchester,UK)；VionTM IMS-QTOF离子淌度四级杆飞行时间质谱仪(Waters Corporation,Manchester,UK)；KQ-250E超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，江苏，中国)；AX205十万分之一天平(Mettler Toledo,Switzerland)；BP121S万分之一天平(Sartorius,Germany)；XW-80A涡旋混合仪(上海泸西分析仪器厂，上海，中国)；Eppendorf高速离心机(Eppendorf中国有限公司，北京，中国)。
2、试剂
乙腈、甲酸(Fisher,Fair lawn,NJ,USA)，均为色谱/质谱级；去离子水经Milli-QIntegral 5系统(Millipore,Bedford,MA,USA)纯化。红花样品购自北京同仁堂大药房(天津)，源产自新疆。15个标准品购自上海诗丹德生物技术有限公司或成都德思特生物技术有限公司(化合物英文命名、中文命名、分子式、精确分子量对应如表1所示，各标准品结构式见图1)。
表1 15个标准品信息
Figure BDA0002599013350000061
Figure BDA0002599013350000071
实施例1
1、确定色谱条件
色谱柱：HSS T3色谱柱(2.1×100mm,1.8μm)；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；洗脱梯度：0-4min，1-13％B相；4-9min，13-16％B相；9-11min，16-19％B相；11-16min，19-26％B相；16-19min，26-35％B相；19-23min，35-45％B相；23-24min，45-95％B相；24-26min，95％B相；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：3μL。
2、确定质谱条件
质谱条件参数设置为：喷雾电压为-0.5kV；脱溶剂气体流量(N2)为800L/h；锥孔气体流量(N2)为50L/h；毛细管电压为0.5kV；毛细管温度为120℃；辅助气加热温度为500℃；锥孔电压为20V；一级碰撞能量为6eV；HDMSE二级碰撞能量为40-80eV；DDA二级碰撞能量为15-70eV；扫描范围为100-1300m/z；DDA采集一级响应前5强离子的二级信息，触发二级采集的阈值为1300counts，停止二级采集的阈值为500counts或时间超过0.4s；离子源为电喷雾离子源(ESI)，以负离子检测作为检测模式，采用HDMSE-HSMS/MS扫描方法，同时打开Precursor Ion Inclusion功能，包含根据文献报道的已知成分建立的母离子列表(见表2)。
表2红花多成分鉴定质谱方法数据依赖性采集设置中的母离子列表
Figure BDA0002599013350000081
3、标准品的制备
以脱水红花黄色素B(1)、羟基红花黄色素A(2)、6-羟基山柰酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷(3)、芦丁(4)、山柰酚-3-O-芸香苷(5)、槲皮素(6)、异槲皮素(7)、木犀草素(8)、山柰酚(9)、芹菜素(10)、杨梅素(11)、(2S)-4’,5,6,7-四羟基二氢黄酮-6-O-β-D-葡萄糖苷(12)、咖啡酸(13)、对香豆酸(14)和腺苷(15)作为标准品，称取1mg脱水红花黄色素B，其余标准品各称取0.5mg，以50vol％甲醇水溶液为溶剂溶解标准品，配制成1mg/mL溶液，等体积混合后稀释6倍，以14000r/min的转速离心10min，取上清液作为标准品溶液，浓度为11μg/mL。
4、待测样品溶液的制备
取红花药材，粉碎过三号筛。精密称定红花粉末100mg于50ml离心管中，加入50vol％甲醇水溶液10mL，称重，涡旋2min，超声提取60min，提取液恢复至室温后，用50vol％甲醇水溶液补足失重，摇匀，以14000r/min的转速离心10min，取上清液作为待测样品溶液。
实施例2提取溶剂优化
采用5种不同比例的甲醇水溶液，纯水、30vol％甲醇、50vol％甲醇、80vol％甲醇和100vol％甲醇，按实施例1的方法制备待测样品溶液，按上述色谱条件和质谱条件进行检测，结果表明，以50vol％甲醇水溶液对红花样品提取，能够兼顾强极性与弱极性的红花成分，最终选择50vol％甲醇水溶液作为提取溶剂。
实施例3色谱柱优化
分别采用10根色谱柱HSS T3、CSH Phenyl-Hexyl、CSH C18、BEH Shield RP18、BEHC18、CORTECS UPLC C18+、Kinetex Biphenyl、Zorbax Extend C18、Zorbax Eclipse PlusC18、Zorbax SB-Aq，按实施例1的方法制备待测样品溶液，按上述色谱条件和质谱条件进行检测，评价在有效分离时间内(17min)10根色谱柱对于红花醇提取的各化合物的分离度和分离出的离子总数，根据结果(图3)最终选择HSS T3色谱柱。
实施例4柱温优化
按实施例1的方法制备待测样品溶液，在上述相同色谱条件和质谱条件下，分别选择25℃、30℃、35℃、40℃四个柱温进行检测，通过比较分析各温度下谱图中最强离子峰的分离情况，发现样品于30℃可以获得良好的分离效果，基线平稳、峰形对称性好、响应值高，最终选择30℃柱温。
实施例5锥孔电压与毛细管电压优化
在上述相同色谱条件和质谱条件下，分别选择毛细管电压0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0kV和锥孔电压20、40、60、80、100、120V的参数设置，以5个亚型的6-羟基山柰酚-3,6,7-三-O-β-D-葡萄糖苷、羟基红花黄色素A、芦丁、脱水红花黄色素B、(2S)-4',5,6,7-四羟基-黄烷酮-6-O-β-D-葡萄糖苷作为参数，结果表明，5种化合物对于毛细管电压的相对标准偏差小于2.1％，对于锥孔电压小于4.4％，这些数值表明了良好的准确性和可重复性。经试验比较(图4)，0.5kV毛细管电压和20V锥孔电压的参数设置表现出了更好的性能。
实施例6碰撞能量优化
按实施例1的方法制备待测样品溶液，在上述相同色谱条件和质谱条件下，为了使红花中不同类别的化学成分具有足够丰富的碎片，对碰撞能量进行了优化。与其他采集方法不同，HDMSE-DDA采集方法在两个通道分别得到DIA和DDA两种数据，所以采集方法中为两个通道设置不同的裂解能量，其中DDA是应用质量相关的斜坡碰撞能量(MDRCE)，DDA模式下的MDRCE可以在预先定义的扫描范围内对前体进行定制的碰撞能量斜坡，更适合于获取由不同种类的大质量跨度天然化合物组成的复杂化学体系的裂解信息。首先，在负离子MSE扫描模式下，设置并评估了四个RCE水平(20-40eV；40-60eV；40-80eV；60-80eV；80-100eV)。基于得到的MS2片段的多样性，40-80eV的RCE更适合于MSE模式下分离红花中主要成分黄酮类化合物。另外在DDA方法下比较了4种不同MDRCE水平下获得的CID-MS2光谱包括：10-60eV；20-50eV；15-70eV；40–70eV。研究发现，15–70eV的设置能够更好地分离红花中糖基个数不同的化合物。
实施例7数据处理
采用软件UNIFI 1.9.3.0software(Waters,Milford,MA,USA)对HDMS E-HSMS/MS采集到的数据进行处理，有效进行数据校正、峰值提取和峰值注释。采用该软件处理原始数据，得到包含不同质荷比离子信息的负离子模式列表，并显示每个离子对应的一级、二级图，根据母离子及对应的二级碎片信息进行红花多类别成分鉴定。UNIFI中设置的关键参数如下。查找4D峰值(仅在HDMSE中设置)：高能量强度阈值，500.0个计数；低能量强度阈值，1000.0个计数。查找DDA质量(在HD-DDA和DDA中设置)：一级离子强度阈值，1000.0个计数；一级离子强度阈值，500.0个计数。按质量划分的目标：目标匹配公差：10.0ppm；筛选候选中的所有同位素，从结构中生成预测碎片，并启用寻找源中碎片；碎片匹配差值：10.0ppm。加合物：阴性加合物，包括+HCOO-,-H-。校正质量：组合宽度，3次扫描；质量窗口，0.5m/z；参考质量，554.2620；参考电荷，-1。
实施例8待测样品溶液中多类别成分的分离与鉴定
1、待测样品溶液中多类别成分的分离
按照实施例1的方法制备红花药材粉末的待测样品溶液，按照实施例1的色谱条件，进行超高效液相色谱分离，再按照实施例1的质谱条件，进行分离检测，通过实施例7的方法进行数据处理，获得红花中化合物对应的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值等信息，其中，红花样品的基峰离子图如图2所示。
2、标准品鉴定
采用实施例1的方法制备15种标准品溶液，按照实施例1的色谱条件和质谱条件对标准品溶液进行检测，并通过实施例7的方法进行数据分析，得到15种标准品的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值等信息，用于对待测样品溶液检测结果进行对比和验证。
3、待测样品鉴定
按照实施例7的数据处理方法，利用UNIFI软件调用红花数据库，对HDMSE与HSDDA数据处理后分别获得“已鉴定成分列表”(Identified)与“未知成分列表”(Unknown)。进一步地，通过上述方法获得红花中化合物对应的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值等信息，采用与标准品的信息比对(保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值等)，与红花自建数据库比对、与相关文献比对等方法，对采集到的数据进行分析和分类，对红花中多类别化学成分进行系统鉴定。
以下为根据已获得的化合物相关信息，采用比对的方法，对红花中主要的醌式查尔酮碳苷(包括单分子与二聚体)与黄酮氧苷成分分类鉴定的举例：
红花黄酮类成分的鉴定标准：以[M-H]-为分子离子峰，主要包括醌式查尔酮碳苷、醌式查尔酮碳苷二聚体和黄酮氧苷三大类。
醌式查尔酮碳苷的鉴定标准：以[M-H]-为分子离子峰，特征碎片常见为m/z119.05。
以化合物#24(tR 5.72min，C27H32O16)为例(#24表示按保留时间排序，第24个化合物，下同)介绍醌式查尔酮碳苷类化合物的裂解行为，其二级质谱图如图5的A图所示，其[M-H]-峰m/z 611.1569在失去一分子C4H8O4(120Da)后，得到m/z 491.1191([M-H-C4H8O4]-)碎片，继续失去一分子C4H8O4，一分子CO，和一分子H2O，得到主要碎片m/z 325.0712([M-H-C4H8O4-CO-H2O]-)，最后通过苷元离子的裂解得到特征碎片m/z 119.0501碎片。与标准品羟基红花黄色素A比对，与母离子质量数差异值<5ppm，与所述保留时间差值<0.1s，且含有特征碎片m/z 119.0501等信息，最终判断化合物#24为羟基红花黄色素A。
根据对化合物#24的鉴定结果，参照醌式查尔酮碳苷裂解规律对未知化合物#120(tR 16.06min，C30H30O14)进行鉴定，其二级质谱图如图5的B图所示，其[M-H]-峰m/z613.1569在失去一分子C11H10O4(206Da)后，得到m/z 407.1004([M-H-C11H10O4]-)碎片，继续失去一分子C4H8O4，得到主要碎片m/z 287.0567([M-H-C11H10O4-C4H8O4]-)，最后通过苷元离子的裂解得到特征碎片m/z119.0501碎片。根据化合物碎裂结果，最终判断化合物#120为Safflomin C(或其异构体)。
醌式查尔酮碳苷二聚体的鉴定标准：以[M-H]-为分子离子峰，特征碎片常见为m/z119.05。
以化合物#90(tR 13.19min，C48H52O26)为例介绍醌式查尔酮碳苷二聚体类化合物的裂解行为，其二级质谱图如图6的A图所示，其[M-H]-峰m/z1043.2695在失去一分子水和一个葡萄糖分子后，得到m/z 862.1993([M-H-H2O-C6H11O5]-)碎片，继续失去一分子C3H6O3，得到碎片m/z 772.1669，同时主要碎片m/z 449.1081和m/z 287.0558是通过分子离子[M-H]-丢失一分子C27H30O15和继续丢失一分子葡萄糖得到，最后通过苷元离子的裂解得到特征碎片m/z 119.0506碎片。与对照标准品脱水羟基红花黄色素B比对，与母离子质量数差异值<5ppm，与所述保留时间差值<0.1s，且含有特征碎片119.0506等信息，最终判断化合物#90为脱水羟基红花黄色素B。
根据对化合物#90的鉴定结果，参照醌式查尔酮碳苷裂解规律对未知化合物#123(tR 16.69min，C49H52O28)进行鉴定，其二级质谱图如图6的B图所示，其[M-H]-峰m/z1087.2579通过聚合键断裂，形成两个单独离子碎片，一个m/z 625.1408碎片和一个m/z463.0870碎片，继而在m/z 625.1408基础上失去一个葡萄糖C6H11O5(162.05Da)后，得到m/z463.0870([M-H-C27H29O17]-)碎片，并在连续丢失两分子葡萄糖后得到主要碎片m/z301.0343([M-H-C22H23O11-2C6H11O5]-)，最后通过查尔酮单体部分苷元裂解得到特征碎片m/z119.0502碎片。根据化合物碎裂结果，最终判断化合物#123为Cartorquinoside A。
黄酮氧苷的鉴定标准：以[M-H]-为分子离子峰，特征碎片常见为m/z 300.02(或m/z 301.03)或m/z 285.03或m/z 271.05等苷元碎片，包括几种特征碎片同时出现的情况。
以化合物#76(tR 11.61min，C27H30O16)为例介绍黄酮氧苷类化合物的裂解行为，其二级质谱图如图7的A图所示，其[M-H]-峰m/z 609.1449在失去一分子葡萄糖和一个鼠李糖后，得到黄酮氧苷类成分常见的m/z 301.0329([M-H-C12H21O9]-)碎片，继续失去一个CH2O,得到特征碎片m/z 271.0236([M-H-C12H21O9-CH2O]-)，同时m/z 301.0329碎片丢失一分子CO2后得到m/z 255.0288([M-H-C12H21O9-CO2]-)碎片，最后通过连续裂解得到苷元碎片m/z151.0039。与对照标准品芦丁比对，与母离子质量数差异值<5ppm，与所述保留时间差值<0.1s，且含有特征碎片m/z 301.0329等信息，最终判断化合物#76为芦丁。
根据对化合物#76的鉴定结果，参照黄酮氧苷裂解规律对未知化合物#53(tR8.56min，C27H30O17)进行鉴定，其二级质谱图如图7的B图所示，其[M-H]-峰m/z 625.1405失去一分子葡萄糖C6H11O5(162.05Da)后得到m/z 463.0870([M-H-C6H11O5]-)碎片，在m/z463.0870基础上继续失去一个葡萄糖C6H11O5得到黄酮氧苷的常见m/z 301.0344([M-H-2C6H11O5]-)碎片，失去一分子CH2O后得到了另个常见主要碎片m/z 271.0242([M-H-2C6H11O5-CH2O]-)，最后苷元裂解得到碎片m/z 165.9915和m/z 111.0050碎片。根据化合物碎裂结果，最终判断化合物#53为6-Hydroxykaempferol-3,6-di-O-β-D-glucoside。
实施例9结果对比
按照实施例8的方法进行鉴定，结果显示，比较的4种方法(具体是HDMSE-HSDDA(PIL)、HSDDA(PIL)、HSDDA和HDMSE)中HDMSE-HSDDA加列表采集方法对于红花成分的UNIFI自动峰匹配峰鉴定个数虽然没有另外三种采集方式多(图8)，但从UNIFI的Unknown数量和手动筛选结果来看，HDMSE方法采集到大量的假阳性数据，这对于鉴定成分来说，增加了很多的工作量，降低了工作效率；而HDMSE-HSDDA鉴定结果则更具有目的性、选择性，采集到更多的有效数据，减少了假阳性数据，提高了鉴定效率和可靠性。
本申请建立超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱联用方法，鉴定红花中的化学成分，此方法简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种红花中化学成分鉴定的方法，所述方法包括：
制备5-20mg/mL的待测样品溶液，溶剂为0-100vol％甲醇水溶液；
通过超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱，获得各化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值；
其中，超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数5-99％A相，1-95％B相，梯度洗脱；柱温：20-45℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样量V1：2-5μL；
离子淌度-四级杆飞行时间质谱的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，以负离子检测作为检测模式，质谱参数为：
喷雾电压为-0.5～-1kV；锥孔电压为20-120V；脱溶剂气体流量为700-900L/h；锥孔气体流量为40-60L/h；毛细管温度为100-140℃；辅助气加热温度为450-550℃；一级碰撞能量为4-8eV；高清MSE二级碰撞能量为20-100eV；数据依赖性采集二级碰撞能量为10-70eV；扫描范围为50-1500m/z；数据依赖性采集一级响应前N强离子的二级信息，其中，3≤N≤10，触发二级采集的母离子强度阈值为1300计数停止二级采集的阈值为500计数或时间超过0.4s；
基于各化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值，确定待测样品中的化学成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述溶剂为30-80vol％的甲醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述梯度洗脱具体为：0-4分钟，1-13％B相；4-9分钟，13-16％B相；9-11分钟，16-19％B相；11-16分钟，19-26％B相；16-19分钟，26-35％B相；19-23分钟，35-45％B相；23-24分钟，45-95％B相；24-26分钟，95％B相。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱柱选自HSS T3、CSH Phenyl-Hexyl、CSHC18、BEH Shield RP18、BEH C18、CORTECS UPLC C18+、Kinetex Biphenyl、Zorbax ExtendC18、Zorbax Eclipse Plus C18或Zorbax SB-Aq，柱温为25-40℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，将获得的待测样品中化学成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值，与已知红花成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值进行比对，确定待测样品的化学成分。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述已知红花成分包括脱水红花黄色素B、羟基红花黄色素A、6-羟基山柰酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷、芦丁、山柰酚-3-O-芸香苷、槲皮素、异槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、杨梅素、(2S)-4’,5,6,7-四羟基二氢黄酮-6-O-β-D-葡萄糖苷、咖啡酸、对香豆酸、腺苷。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述已知红花成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值是按照以下过程获得的：
制备5-20μg/mL的所述已知红花成分的标准品溶液，溶剂为0-100vol％甲醇水溶液；
通过超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱，获得所述红花成分的保留时间、母离子质荷比、二级碎片离子质荷比、母离子碰撞截面值；
其中，超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数5-99％A相，1-95％B相，梯度洗脱；柱温：20-45℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样量V1：2-5μL；
离子淌度-四级杆飞行时间质谱的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，以负离子检测作为检测模式，质谱参数为：
喷雾电压为-0.5～-1kV；锥孔电压为20-120V；脱溶剂气体流量为700-900L/h；锥孔气体流量为40-60L/h；毛细管温度为100-140℃；辅助气加热温度为450-550℃；一级碰撞能量为4-8eV；高清MSE二级碰撞能量为20-100eV；数据依赖性采集二级碰撞能量为10-70eV；扫描范围为50-1500m/z；数据依赖性采集一级响应前N强离子的二级信息，其中，3≤N≤10，触发二级采集的母离子强度阈值为1300计数，停止二级采集的阈值为500计数或时间超过0.4s。
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