CN107957460A - 一种基于芳香族芥子油苷的玛咖质量评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于芳香族芥子油苷的玛咖质量评价方法。本发明首先提供了玛咖中芳香族芥子油苷含量的测定方法，包括如下步骤：提取待测玛咖样品得上清液，进行HPLC检测；记录保留时间为13～15min的吸收峰的峰面积A₁、保留时间为18～20min的吸收峰的峰面积A₂和保留时间为21～23min的吸收峰的峰面积A₃；配制至少3种黑芥子硫苷酸钾水溶液，进行HPLC检测；以该水溶液的浓度为横坐标，以吸收峰峰面积为纵坐标制作标准曲线；根据各峰面积和标准曲线，得到各吸收峰所对应的芳香族芥子油苷的浓度；经换算即得到所述玛咖样品中芳香族芥子油苷的含量。本发明采用HPLC检测方法测定玛咖中芳香族芥子油苷的含量，并基于芳香族芥子油苷的含量和聚类分析方法，得到玛咖质量的分级。

Description

一种基于芳香族芥子油苷的玛咖质量评价方法

技术领域

本发明涉及一种玛咖质量评价方法，具体涉及一种基于芳香族芥子油苷的玛咖质量评价方法。

背景技术

玛咖(Lepidium meyenii Walp,Maca)属于十字花科，一年生或两年生的草本植物，原产于秘鲁和玻利维亚的安第斯山区，被用作药食同源性植物有2000多年。20世纪以来，大量的药理作用研究证明，玛咖具有提高生育能力、改善性功能、增强活力、抗疲劳、提高认知能力和调节免疫力等药理作用。从吗咖中分离发现了多种次生代谢物，这包括：玛咖酰胺、玛咖烯、芥子油苷、生物碱、甾醇类等。

玛咖于2002年引种到中国。2011年，我国卫生部批准玛咖粉为新资源食品。目前，玛咖在我国的云南、四川、新疆、吉林等地相继引种成功。随着国内外对玛咖生理、药理作用研究的不断深入，国内玛咖的种植规模和种植地域不断扩大、增加，这要求我国应尽快建立起国产玛咖的种类鉴别、品质鉴定及加工控制等一系列技术。目前，国内外学者相继研究了玛咖的质量评价方法：如，由于玛咖酰胺和玛咖烯未在其他植物中被发现，从而常被作为玛咖的典型标志。Ganzera等通过HPLC法分析玛咖中玛咖酰胺和玛咖烯的含量来评价玛咖的质量(Ganzera M,Zhao JP,Muhammad I, Khan IA.Chemical profiling andstandardization of Lepidium meyenii(Maca)by reversed phase high performanceliquid chromatography[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2002,50(7):988–991)。Hajdu等提出通过分析玛咖保健品中玛咖酰胺的含量和种类，达到评价产品质量的目的(Hajdu Z,Lorántfy L,Jedlinszki N,Boros K,Hohmann J, Csupor D.Qualitycontrol of maca-containing(Lepidium meyenii Walp.)dietary supplements[J].ActaAlimentaria,2015,44(3):461–467)。Jin等基于玛咖挥发油独特的 GC-MS特征评估玛咖质量(Jin WW,Xiong Y,Yu LJ.Identification and quality evaluation of Lepidiummeyenii.(Maca)based on gas chromatographic analysis of its essential oilsfrom roots[J].Agricultural Science and Technology,2006,7:2–9)。Chen等基于内部转录间隔序列通过DNA条形码鉴定玛咖材料(Chen JJ,Zhao QS,Liu YL,Zha SH,Zhao B.Identification of maca(Lepidium meyenii Walp.)and its adulterants by a DNA-barcoding approach based on the ITS sequence[J].Chinese Journal of NaturalMedicines,2015, 13(9):653–659)。

芥子油苷及其派生物形成了玛咖独特的辛辣风味，由于其具有抑制真菌和微生物的生长、消除病原体和癌细胞的生物活性等作用而广受科学界的关注。芥子油苷也称硫代葡萄糖苷或简称硫苷(glucosinolate，简称为GLs)，是一种含硫的植物次生代谢物，包含一个多变的侧链R和一个硫原子相连的D-吡喃葡萄糖。由于侧链R基团的不同，可以把芥子油苷分为三类：脂肪族、芳香族和吲哚族。Li等在新鲜的玛咖中发现8种GLs，并测定芥子油苷含量大约1％，是其他十字花科植物(如卷心菜、菜花、西蓝花等)含量的100倍(Li G,Ammermann U,Quirós CF.Glucosinolate contents in maca(Lepidium peruvianumChacon)seeds,sprouts,mature plants and several derived commercial products[J].Economic Botany,2001,55(2):255–262.)。Yábar等从不同颜色干秘鲁玛咖中发现了6种GLs，并且测定苄基芥子油苷在玛咖芥子油苷中含量最高，含量可达80％以上(Yábar E,Pedreschi R,Chirinos R,Campos D.Glucosinolate content and myrosinase activityevolution in three maca(Lepidium meyenii Walp.)ecotypes during preharvest,harvest and postharvest drying[J].Food Chemistry,2011, 127(127):1576–1583.)。Gonzals等研究发现，玛咖中芳香族芥子油苷(特别是苄基芥子油苷)及其异硫氰酸酯衍生物与玛咖的药理活性有着直接关联(Gonzals GF, Villaorduma L,Gasco M,Rubio J,Gonzales C.Maca(Lepidium meyenii Walp)a review of its biological properties[J].Revista Peruana De Medicina Experimental Y Salud Pública, 2014,31(1):100-110)。因此，芳香族芥子油苷有望成为评价玛咖质量的重要标志物。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于芳香族芥子油苷的玛咖质量评价方法，本发明采用HPLC检测方法测定玛咖中芳香族芥子油苷的含量，并基于芳香族芥子油苷的含量和聚类分析方法，得到玛咖质量的分级。

本发明所提供的玛咖中芳香族芥子油苷含量的测定方法，包括如下步骤：

(1)采用醇或醇水溶液提取待测玛咖样品，得到的上清液经纯化后进行HPLC 检测；记录保留时间为13～15min的a吸收峰的峰面积A₁、保留时间为18～20min的 b吸收峰的峰面积A₂和保留时间为21～23min的c吸收峰的峰面积A₃；

(2)配制至少3种黑芥子硫苷酸钾的水溶液；所述黑芥子硫苷酸钾的水溶液经所述纯化后进行所述HPLC检测；以所述黑芥子硫苷酸钾的水溶液的浓度为横坐标，以吸收峰的峰面积为纵坐标，制作标准曲线；

(3)根据所述峰面积A₁、所述峰面积A₂、所述峰面积A₃和所述标准曲线，得到所述吸收峰a、所述吸收峰b和所述吸收峰c所对应的芳香族芥子油苷的浓度；经换算即得到所述玛咖样品中所述芳香族芥子油苷的含量。

上述的测定方法中，所述醇为甲醇或乙醇。

上述的测定方法中，所述提取步骤之前，所述玛咖样品经自然晾晒干燥并粉碎处理，如粉碎后过60目筛；

所述提取的条件如下：

所述醇水溶液中醇的体积分数为60～80％；

采用沸腾状态的所述醇或醇水溶液；

所述玛咖样品与所述醇或所述醇水溶液的用量比为750～1200mg：12mL；

于50～75℃下水浴10～30min；

所述水浴过程中进行涡旋混合，如每隔2min取出离心管在旋涡混合器上进行旋涡混合；

离心后的残渣再复提1次，离心合并上清液。

上述的测定方法中，所述纯化的步骤如下：

将所述上清液加入至离子交换柱中，待液体排干后，加入醋酸钠水溶液至所述离子交换柱中，待液体排干后，加入硫酸酯酶溶液至所述离子交换柱中，密封后于进行反应，所述反应结束后用水冲洗所述离子交换柱，收集洗脱液，即实现对所述上清液的纯化。

上述的测定方法中，向所述离子交换柱中加入两次所述醋酸钠水溶液；

所述醋酸钠水溶液的摩尔浓度为15～25mmol/L；

所述上清液、所述醋酸钠水溶液和所述入硫酸酯酶溶液的体积比为2：1～3： 0.1～0.3；

每毫升所述硫酸酯酶溶液的活性单位不低于20。

上述的测定方法中，所述反应的条件如下：

温度为25～30℃，时间为10～15h；

所述方法还包括采用0.22μm的微孔滤膜过滤所述洗脱液的步骤。

上述的测定方法中，所述HPLC检测的条件如下：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；

流动相：液相A：过膜超声脱气后的去离子水；液相B：过膜超声脱气后的体积含量为20％乙腈水溶液；

流速：1～1.5mL/min；

检测波长：229～235nm；

柱温：25～30℃；

进样量：20～30μL；

洗脱梯度：保留时间为0～1min水维持100％；保留时间为1～25min水的梯度变化为100％～0；保留时间为25～30min水的梯度变化0～100％(体积)。

上述的测定方法中，所述黑芥子硫苷酸钾的水溶液的摩尔浓度为5～25mmol/L。

本发明还提供了一种基于芳香族芥子油苷的玛咖质量评价方法，包括如下步骤：

根据上述的方法测定待测玛咖样品中芳香族芥子油苷含量，则按照下述1)～5)的标准对待测玛咖样品进行分类：

1)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量≥65μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为优；

2)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为50～65μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为良；

3)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为35～50μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为中；

4)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为20～35μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为合格；

5)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为≤20μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为差。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过LC-MC指纹详图分析鉴定玛咖中芳香族芥子油苷分子的种类及峰位；采用HPLC外标法对玛咖芳香族芥子油苷进行定量分析，以本发明提供的色谱分析条件，在梯度洗脱条件下，30min内就可以同时分离6个色谱峰，通过MS确定其中3 号峰、4号峰、5号峰为芳香族芥子油苷，确定芳香族芥子油苷的总含量进而用于评价玛咖质量。

附图说明

图1为不同产地玛咖脱硫芥子油苷高效液相色谱图。

图2为产地云南怒江玛咖脱硫芥子油苷高效液相色谱图。

图3为脱硫芥子油苷的质谱图，其中，图3(A)为苯酚基芥子油苷的质谱图；图3(B)为苄基芥子油苷的质谱图；图3(C)为甲氧基苄基芥子油苷的质谱图。

图4为不同产地玛咖的聚类分析结果图。

图5为黑芥子硫苷酸钾的浓度与吸收峰的峰面积之间的线性关系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、

1、将各产地的玛咖样品均经过自然晾晒干燥，经粉碎机粉碎后过60目筛，备用。

2、溶液的制备。

1)外标溶液的制备：分别精密称取49.7mg、99.4mg、149.1mg、198.8mg和248.5 mg标准品黑芥子硫苷酸钾溶解于10mL水中，加水定容至25mL，得到浓度为5、10、 15、20和25mmol/L的外标溶液。

2)供试品溶液的制备：分别准确称取200.0mg待测玛咖样品(60目)至10mL 离心管中，在75℃条件下水浴保温1min，加入2mL 70％(体积)沸甲醇水溶液后， 75℃水浴10min，期间每隔2min取出离心管在旋涡混合器上旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温，8000r/min离心5min，转移上清液至5mL容量瓶中。残渣再复提 1次，离心合并上清液，将提取液定容至5mL，混匀。放入-18℃暗处保存备用。

3、芥子油苷的纯化。

取2mL供试品溶液缓缓加入DEAE-Sephadex A-25离子交换微柱中，注意不要搅动树脂表面，待液体排干后，分别加入2mL 0.02mol/L醋酸钠水溶液两次，每次加入后均让液体排干。加入200μL硫酸酯酶溶液(每毫升活性单位不低于20)至离子交换微柱，密封后于35℃条件下反应16h，用2mL超纯水冲洗离子交换柱2次，洗脱液收集于试管中。用超纯水将洗脱液定容至5mL，充分混匀后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，封口，用于HPLC分析测定。

4、LC-MS分析

HPLC条件：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×250nm 5μm)；流动相：液相A：过膜超声脱气后的去离子水；液相B：过膜超声脱气后的20％(体积)色谱级的乙腈水溶液；流速：1mL/min；检测波长：229nm；柱温：30℃；进样量30μL；洗脱梯度：0～1min水维持100％，1～25min水的梯度变化为100％～0，25～30min水的梯度变化0～100％。

在上述检测条件下，30min内就可以同时分离6个色谱峰，不同产地玛咖脱硫芥子油苷的高效液相色谱图如图1所示，其中产地云南怒江的玛咖脱硫芥子油苷的高效液相色谱图如图2所示。其中，3号峰的保留时间为14.24～14.32min，4号峰的保留时间为19.11～19.29min，5号峰的保留时间为21.58～21.73min。

采用MS鉴定3号峰、4号峰和5号峰。

MS条件：

采用Bruker HCT高容量离子阱质谱对芥子油苷分离峰进行分析。离子源为电喷雾(ESI)；离子极性为正离子；喷雾器压力为35psi；干燥气流(N₂)流速12L/min；干燥器温度：350℃；毛细管电压3000V；碎片电压70V；扫描离子范围：m/z 50.00～ 800.00。

在上述检测条件下，得到脱硫芥子油苷质谱图如图3所示，其中图3(A)为3 号峰的质谱图，经鉴定3号峰为对苯酚基芥子油苷的吸收峰，其中图3(B)为4号峰的质谱图，经鉴定4号峰为苄基芥子油苷的吸收峰，其中图3(C)为5号峰的质谱图，经鉴定5号峰为对甲氧基苄基芥子油苷的吸收峰，因此HPLC的芥子油苷分离峰中3 号峰、4号峰和5号峰为芳香族芥子油苷的吸收峰，记录各玛咖样品芥子油苷分离峰中3号峰、4号峰和5号峰的峰面积。

4、标准曲线的绘制

取2mL配制好的外标溶液经芥子油苷纯化后(与上述步骤3相同)，将洗脱液成倍稀释后，在HPLC条件下检测，得到黑芥子硫苷酸钾浓度与吸收峰的峰面积之间的标准曲线，可以看出，黑芥子硫苷酸钾在0.7598～0.0059mmol/L范围内呈现较好的线性关系。

5、计算

以黑芥子硫苷酸钾为外标，采用外标法进行定量。

通过峰面积(Y)对黑芥子硫苷酸钾的浓度(X)的回归，得到回归方程，即峰面积(Y)对黑芥子硫苷酸钾的浓度(X)的回归，回归方程为Y＝9983.5165X-1.7509， R²＝0.9999，如图5所示。

将各玛咖样品的高效液相色谱图中的3号峰、4号峰和5号峰的峰面积代入至该回归方程，得到各组分芥子油苷浓度(μmol·L^-1)，经换算(各组分芥子油苷浓度×体积÷样品量(g))得到芥子油苷各组分含量(μmol·g^-1)，各组分含量相加即得到芥子油苷总量(μmol·g^-1)。

苯酚基芥子油苷含量为4.68μmol·g^-1，苄基芥子油苷含量为42.11μmol·g^-1，甲氧基苄基芥子油苷含量为7.62μmol·g^-1。芥子油油苷总量为54.41μmol·g^-1，等级为良

各产地玛咖样品中芥子油苷各组分含量以及总量如表1中所示。

表1 15个产地玛咖样品中芥子油苷总量(μmol·g^-1)

其中，产地1为四川阿坝；产地2为云南大理；产地3为云南昭通-1；产地4为云南怒江；产地5为云南东川；产地6为云南巧家；产地7为云南会泽；产地8为云南永胜；产地9为四川理塘；产地10为云南昭通-2；产地11为四川乡城；产地12为四川小凉山；产地13为四川稻城；产地14为云南香格里拉；产地15为大凉山。

6、通过聚类分析评价玛咖等级

根据上述测定的15个不同产地的玛咖样品中芳香族芥子油苷各组分的含量，用SPSS 15.0软件对15个不同产地玛咖样品进行聚类分析，所用的聚类方法为Nearestneighbor，距离公式为Square Euclidean distance，得到聚类分析结果，如图4所示

根据聚类分析结果，得到如下玛咖的质量等级：

1)若玛咖样品中芳香族芥子油苷含量≥65μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为优；

2)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为50～65μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为良；

3)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为35～50μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为中；

4)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为20～35μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为合格；

5)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为≤20μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为差。

综上，本发明通过HPLC测定得到玛咖脱硫芥子油苷高效液相色谱图(图2)，利用MS得到脱硫芥子油苷质谱图(图3)，确定3号峰是苯酚基芥子油苷(图3A)、4 号峰是苄基芥子油苷(图3B)、5号峰是甲氧基苄基芥子油苷(图3C)。通过对国内 15个不同产地玛咖的测定得到15个产地玛咖脱硫芥子油苷高效液相色谱图(图1)，基于15个不同产地玛咖样品中确定的芳香族芥子油苷各组分的含量进行聚类分析，得到不同产地玛咖的聚类分析结果图(图4)。

Claims (8)

1.一种玛咖中芳香族芥子油苷含量的测定方法，包括如下步骤：

(1)采用醇或醇水溶液提取待测玛咖样品，得到的上清液经纯化后进行HPLC检测；记录保留时间为13～15min的a吸收峰的峰面积A₁、保留时间为18～20min的b吸收峰的峰面积A₂和保留时间为21～23min的c吸收峰的峰面积A₃；

(2)配制至少3种黑芥子硫苷酸钾的水溶液；所述黑芥子硫苷酸钾的水溶液经所述纯化后进行所述HPLC检测；以所述黑芥子硫苷酸钾的水溶液的浓度为横坐标，以吸收峰的峰面积为纵坐标，制作标准曲线；

(3)根据所述峰面积A₁、所述峰面积A₂、所述峰面积A₃和所述标准曲线，得到所述吸收峰a、所述吸收峰b和所述吸收峰c所对应的芳香族芥子油苷的浓度；经换算即得到所述玛咖样品中所述芳香族芥子油苷的含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述提取步骤之前，所述玛咖样品经自然晾晒干燥并粉碎处理；

所述提取的条件如下：

所述醇水溶液中醇的体积分数为60～80％；

采用沸腾状态的所述醇或醇水溶液；

所述玛咖样品与所述醇或所述醇水溶液的用量比为750～1200mg：12mL；

于50～75℃下水浴10～30min；

所述水浴过程中进行涡旋混合。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：所述纯化的步骤如下：

将所述上清液加入至离子交换柱中，待液体排干后，加入醋酸钠水溶液至所述离子交换柱中，待液体排干后，加入硫酸酯酶溶液至所述离子交换柱中，密封后于进行反应，所述反应结束后用水冲洗所述离子交换柱，收集洗脱液，即实现对所述上清液的纯化。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于：向所述离子交换柱中加入两次所述醋酸钠水溶液；

所述醋酸钠水溶液的摩尔浓度为15～25mmol/L；

所述上清液、所述醋酸钠水溶液和所述入硫酸酯酶溶液的体积比为2：1～3：0.1～0.3。

5.根据权利要求3或4所述的测定方法，其特征在于：所述反应的条件如下：

温度为25～30℃，时间为10～15h；

所述方法还包括采用0.22μm的微孔滤膜过滤所述洗脱液的步骤。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的测定方法，其特征在于：所述HPLC检测的条件如下：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；

流动相：液相A：过膜超声脱气后的去离子水；液相B：过膜超声脱气后的体积含量为20％乙腈水溶液；

流速：1～1.5mL/min；

检测波长：229～235nm；

柱温：25～30℃；

进样量：20～30μL；

洗脱梯度：保留时间为0～1min水维持100％；保留时间为1～25min水的梯度变化为100％～0；保留时间为25～30min水的梯度变化0～100％。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的测定方法，其特征在于：所述黑芥子硫苷酸钾的水溶液的摩尔浓度为5～25mol/L。

8.一种基于芳香族芥子油苷的玛咖质量评价方法，包括如下步骤：

根据权利要求1-7中任一项所述的方法测定待测玛咖样品中芳香族芥子油苷含量，则按照下述1)～5)的标准对待测玛咖样品进行分类：

1)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量≥65μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为优；

2)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为50～65μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为良；

3)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为35～50μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为中；

4)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为20～35μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为合格；

5)若该玛咖样品中芳香族芥子油苷含量为≤20μmol·g^-1，则待测玛咖样品的质量等级为差。