CN106542976A - 一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，所述方法为：将五味子提取液与微乳液b混合，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测，获得待测样品色谱图，根据待测样品色谱图中木脂素类有效成分对应的峰面积及标准曲线，获得待测样品中木脂素类有效成分的含量；本发明采用分子筛作为吸附剂的基质固相分散萃取技术，结合微乳液电动毛细管色谱技术，能高效、环保地提取和检测五味子药材中的木脂素类有效成分含量。

Description

一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法
(一)技术领域
本发明涉及一种基质固相萃取技术(MSPD)和毛细管电动色谱技术(CE)的联用技术来提取分离中药五味子中木脂素类成分的分析检测方法，具体地说，它涉及由分子筛TS-1作为吸附剂，结合基质固相萃取技术和高效毛细管色谱技术，用来提取检测中药五味子中木脂素类成分含量的新方法。
(二)背景技术
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill的成熟果实。作为一味补益类药物，具有悠久药用历史，主要用于治疗久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心净失眠等症。木脂素类成分是五味子的主要活性成分，具有抗炎抗氧化、保肝、护肝、抗结肠自发收缩、抑制结肠癌细胞增殖、对短暂局灶性脑缺血神经的保护作用等活性。其中含量较高的包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲等。中国药典2015版将五味子醇甲作为指标性成分控制五味子药材及相关制剂的质量。但中药多成分多靶点的特性，使得学者不断致力于多成分提取及检测的新方法的开发。目前从样品前处理和检测两方面，对于五味子中木脂素类成分的提取检测方法已有很多报道。
五味子的样品前处理方法主要集中在超声提取上。该方法虽然简单易行，但对目标分子的提取效率较为低下，且受基质干扰影响较大，使得分析结果相应较低。而且这一方法存在的缺陷也是显而易见：实验过程中消耗大量的有毒害的有机溶剂，既耗时又耗溶剂，且对实验操作人员身体有害，对环境污染严重。
为解决上述难题，随着科技的发展，诸多新型提取方法也应运而生。其中就有基质固相分散萃取技术。基质固相分散萃取(MSPD)是建立在固相萃取基础上的一种新型样品处理技术，为近年来国内外研究的一个热门领域，已经广泛地应用于水果、蔬菜、果汁等植物样本的农药残留检测领域。
当前文献报道的基质固相分散萃取技术，特别是针对天然产物领域，其吸附剂的量、药材用量以及洗脱剂的用量较大，且为有毒害的有机溶剂，对操作员的身体有害，对环境也会造成污染。而常规的基质固相分散萃取技术中，所用到的吸附剂多数以硅胶、弗罗里硅土、C18反相硅胶等为主。
分子筛是指其内部具有均匀的微孔，其孔径与一般分子大小相当的一类物质。由于它孔径均匀、高比表面积、大孔体积、高吸附能力、强热稳定性等优点，故而分子筛的应用非常广泛，例如可以作选择性吸附剂、高效干燥剂、催化剂、离子交换剂等。分子筛作为吸附剂在中药活性成分的提取检测方面报道较少，是一种新颖的中药检测提取方法。而已报道的专利号CN 104297026 A一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法及专利号CN10456919 A一种检测含中药黄芩的牙膏中黄酮类有效成分含量的方法分别以分子筛SBA-15、KIT-6为吸附剂，集中在对黄酮类成分的提取检测上。目前为止，尚未有将分子筛作为吸附剂应用于木脂素类成分的提取检测的报道。本发明以五味子中的木脂素类成分为示范，将分子筛TS-1引入五味子5种木脂素的提取中，可简化提取步骤，提高提取率，且可避免有机溶剂的残留。
另一方面，目前五味子中木脂素类成分的分析方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用法、分光光度法等，通常以高效液相色谱法为主。该方法往往分析时间长、分离效率低，而且色谱柱容易被污染，并且色谱柱上沉积的污染物经常以杂质峰的形式出现，影响分析结果。且实验过程中使用大量有毒害的有机溶剂，对实验操作人员以及环境都造成一定的危害。
毛细管电泳作为20世纪80年代以来兴起的一种新的分离分析技术，在药物分析检测中的应用日益广泛。毛细管微乳电动色谱(MEEKC)是在胶束电动毛细管色谱基础上发展起来的，以微乳液为分离介质的一种较为新型的电泳分离模式。和HPLC相比，MEEKC进样体积小(nL)、分析时间快、流动相用量少(mL)、可直接分析“脏样品”，所以MEEKC在复杂基质的中药成分分析方面具有独特优势。目前尚无文献报道微乳液毛细管电动色谱(MEEKC)法分离检测五味子的木脂素成分。
综上，本发明建立了基于分子筛TS-1的基质分散固相萃取结合毛细管微乳电动色谱技术测定五味子五种木脂素类成分的含量，以期为五味子药材的质量控制提供一种更加绿色、简便、快速、高效的新方法。
(三)发明内容
本发明目的在于寻求一种比常规方法更快速更绿色环保的五味子木脂素提取及含量测定方法。本发明创造性地将基质固相分散萃取技术和微乳液电动毛细管色谱技术结合，分子筛作为基质固相分散萃取的吸附剂与基质固相分散混合物中的目标分子吸附结合，从而使得目标分子从复杂基质中分离出来，得到含有目标分子的洗脱液。洗脱液采用MEEKC进行分离检测。MEEKC所分离的物质的极性范围很宽，可以同时分离水溶性、脂溶性、带电或不带电的物质。且本发明在一个微量体系中实施，所用药材以及实验药品试剂均在微克级别，有害化学试剂使用量少，安全，经济，环保。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，所述木脂素类有效成分为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素，所述方法为：(1)提取：将五味子与吸附剂混合，粉碎，获得五味子混合粉末，将五味子混合粉末用固相萃取柱进行洗脱，加入洗脱剂，收集流出液，离心，取上清液即为五味子提取液，生药量为25-50mg/ml；所述吸附剂为下列之一：分子筛TS-1、硅藻土、中性Al2O3、硅胶或C18；所述洗脱剂为下列一种或两种的混合：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯；(2)标准曲线：将五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品用无水甲醇配制成混合对照品溶液母液，将混合对照品溶液母液用微乳液a梯度稀释成若干份混合对照品溶液试样，通过微乳液电动毛细管色谱法(MEEKC)进行检测，获得混合对照品色谱图，以混合对照品溶液试样中各个单一对照品进样浓度为横坐标，以色谱图中各个单一对照品各自对应的峰面积为纵坐标，制备标准曲线；所述微乳液a体积终浓度组成为：表面活性剂0.2％～1.2％(w/v，这里是指1mL微乳液中含有0.2-1.2g表面活性剂)、辅助表面活性剂1～6％(v/v)、油相0.5～1％(v/v)、有机添加剂0％～14％(v/v)，溶剂为pH9、5～30mmol/L硼砂缓冲液；所述表面活性剂为下列之一：十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠、聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(吐温-20)或月桂醇聚氧乙烯醚(Brij-35)；所述辅助表面活性剂为下列之一：正丁醇、异丙醇或正丙醇；所述油相为乙酸乙酯，所述有机添加剂为乙腈；所述混合对照品溶液母液中五味子醇甲终浓度0.04-1.0mg/mL、五味子醇乙终浓度0.02-0.5mg/mL、五味子酯甲终浓度0.01-0.2mg/mL、五味子甲素终浓度0.02-0.5mg/mL、五味子乙素终浓度0.04-1.0mg/mL；优选所述混合对照品溶液母液中五味子醇甲终浓度0.242mg/mL、五味子醇乙终浓度0.100mg/mL、五味子酯甲终浓度0.044mg/mL、五味子甲素终浓度0.124mg/mL、五味子乙素终浓度0.204mg/mL；(3)检测：将步骤(1)五味子提取液与微乳液b混合，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测，获得待测样品色谱图，根据待测样品色谱图中木脂素类有效成分对应的峰面积及标准曲线，获得待测样品中木脂素类有效成分的含量；所述微乳液b组成同微乳液a；即分别根据五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素各个标准曲线，获得待测样品中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素含量；所述微乳液b与五味子提取液体积比为1-10:1，优选2-6:1。
进一步，步骤(1)所述五味子与吸附剂质量比为1:0.5～3，更优选1:2。
进一步，步骤(1)所述吸附剂为分子筛TS-1，所述洗脱剂为甲醇。
进一步，步骤(1)所述研磨采用研钵研磨90～180s，优选150s。
进一步，步骤(1)所述洗脱剂为下列之一：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、体积比1:1的甲醇-乙醇混合液或体积比1:1的甲醇-乙腈混合液，优选为甲醇，所述洗脱剂的体积用量为125μL～1000μL，优选洗脱剂用量为1/2个柱体积，即500μL。
进一步，步骤(1)所述离心优选10000rpm～13000rpm离心3～5min，优选为13000rpm离心5min。
进一步，步骤(1)所述固相萃取柱底部放置筛板，同时在添加五味子混合粉末后用另一块筛板将粉末压实；洗脱剂采用加压加入的方式进行洗脱。即将混合物转移到固相萃取柱中，柱子底部和混合物的上方各放一个筛板，防止混合物损失，然后将填料压紧。取洗脱剂，注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用离心管收集洗脱液。所述固相萃取小柱有不同体积规格，根据五味子药材粉末和分子筛吸附剂研磨后固体的体积量来选择合适体积的固相萃取小柱即可，这是本领域技术人员公知的。
进一步，步骤(2)所述微乳液电动毛细管色谱法运行电压为20～25kv(优选25kv)，检测温度为15～30℃(优选25℃)，进样条件：50mbar，5s，检测波长205nm。
进一步，步骤(2)所述表面活性剂为SDS，所述辅助表面活性剂为正丁醇。
进一步，步骤(2)所述微乳液体积终浓度组成为：表面活性剂0.2％～1.2％、辅助表面活性剂5％、油相0.5％、有机添加剂10％，溶剂为pH 9、10mmol/L硼砂缓冲液；更优选为：SDS 0.6％、正丁醇5％、乙酸乙酯0.5％、乙腈10％，溶剂为pH 9、10mmol/L硼砂缓冲液。所述微乳液各个组分混合后，在600w的条件下超声30min后形成微乳液。
进一步，步骤(3)所述微乳液b：提取液＝4:1(v/v)。较优的检测条件是：微乳液体积终浓度组成：0.6％(w/v)SDS、5％(v/v)正丁醇、0.5％(v/v)乙酸乙酯、10％(v/v)乙腈，溶剂为pH 9、10mmol/L硼砂缓冲液，在600w的条件下超声30min。采用压力进样：50mbar，5s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长205nm条件下对提取液进行分析检测，得到提取液的电泳谱图。进样前按提取液：微乳液＝1:4稀释提取液，所有溶液使用前用0.22μm滤膜过滤。
本发明相对现有技术，具有如下的优点：
1、本发明方法将基质固相分散萃取技术用于中药药材提取，采用分子筛这一独特的吸附材料，相对于常规的基质固相分散萃取吸附剂更具有创新性，并且由于其具备一系列优异突出的物理化学性质：高比表面积、高吸附率、化学稳定性和热稳定性良好，耐酸碱腐蚀，对人体无毒、不污染环境，不燃，使得操作人员的实验环境安全可靠。
2、本发明的方法使用的有机溶剂仅为0.5mL甲醇，显著减少了有机溶剂的使用和使用有机溶剂之后对环境产生的污染，大大提高了环境保护效益。在基质固相分散萃取的洗脱环节，所消耗时间仅在2.5min左右，这就使得整个萃取流程效率高，而且整体流程快速便捷。
3、本发明方法将微乳液电泳毛细管色谱技术用于五味子药材中木脂素类有效成分的检测，MEEKC作为一种新型的毛细管分离模式，具有分辨率高、样品用量少、操作自动化、有机溶剂用量少、环境友好等优点，并且可以同时分离水溶性、脂溶性、带电或不带电的物质。相比液相色谱法更适用于复杂基质的中药成分分析、更环保、符合绿色化学。
即本发明创造性地提供了一种中药的微量提取检测方法。该方法采用分子筛作为吸附剂的基质固相分散萃取技术，结合微乳液电动毛细管色谱技术，能高效、环保地提取和检测五味子药材中的木脂素类有效成分含量。在最佳检测条件下，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素在20min内达到基线分离：迁移时间和峰面积的重复性RSD值分别为0.38～1.85％和1.25～7.06；迁移时间和峰面积的精密度RSD值分别为0.98～2.3％和1.54～4.07％；迁移时间和峰面积的日内稳定性RSD值分别为1.29～2.75％和3.26～12.25％；检测限为0.3～0.983μg/mL；加样回收率为99.3％～102.2％。
(四)附图说明
图1为本发明基质固相分散萃取方法的工艺流程图。
图2为微乳液电动毛细管色谱分离示意图。
图3为不同种类吸附剂的固相萃取效果柱状图，纵坐标为峰面积，单位mAu·s；1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。A、B、C、D、E代表不同的吸附剂，分别为：A：分子筛TS-1、B：硅胶、C：硅藻土、D：Al2O3、E：C18。
图4为药材和分子筛不同质量比例下的基质固相分散萃取效果柱状图，纵坐标为峰面积，单位mAu·s。1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。A、B、C、D、E代表不同的质量比例(药材：分子筛)，分别为：A：2:1、B：2:3、C：1:1、D：1:2、E：1:3。
图5为考察不同研磨时间的基质固相分散萃取效果折线图，纵坐标为峰面积，单位mAu·s；1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。图中横坐标为研磨时间，单位s。
图6为考察不同种类洗脱剂的基质固相分散萃取效果柱状图，纵坐标为峰面积，单位mAu·s。1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。A、B、C、D、E代表不同的洗脱液，分别为：A：甲醇、B：乙醇、C：乙腈、D：丙酮、E：甲醇—乙醇(50:50)、甲醇—乙腈(50:50)。
图7为考察不同体积洗脱剂的基质固相分散萃取效果折线图，纵坐标为峰面积，单位mAu·s。1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。图中横坐标为洗脱剂体积，单位mL；纵坐标为提取率，单位为mg/g。
图8为考察不同种类表面活性剂(SDS、胆酸钠、吐温-20、Brij-35)的微乳液电动毛细管色谱分离效果叠加图。图中，A、B、C、D分别代表不同的表面活性剂的混标电泳图，分别为：A：SDS；B：Brij-35；C：吐温-20；D：胆酸钠。
图9为考察不同浓度表面活性剂SDS的微乳液电泳毛细管色谱分离效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。图中横坐标为SDS浓度，单位％(w/v)，纵坐标为保留时间，单位min。
图10为考察不同种类辅助表面活性剂(正丁醇、异丙醇、正丙醇)的微乳液电泳毛细管色谱分离效果叠加图。图中，A、B、C分别代表不同的辅助表面活性剂的混标电泳图，分别为：A：正丙醇；B：异丙醇；C：正丁醇。
图11为考察不同浓度辅助表面活性剂正丁醇的微乳液电动毛细管色谱分离效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。图中横坐标为正丁醇浓度，单位％(v/v)，纵坐标为保留时间，单位min。
图12为考察不同浓度添加剂乙腈的微乳液电动色谱分离效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。图中横坐标为正丁醇浓度，单位％(v/v)，纵坐标为保留时间，单位min。
图13为五味子混合对照品的色谱图。图中，1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。
图14为8种不同产地五味子有效成分提取液的叠加色谱图。图中，1、2、3、4、5分别代表五味子中不同的有效成分，分别为：1：五味子醇甲；2：五味子醇乙；3：五味子酯甲；4：五味子甲素；5：五味子乙素。图中，A、B、C、D、E、F、G、H分别代表不同产地五味子的毛细管色谱图，分别为：A：山东；B：山西；C：延边；D：安徽；E陕西；F河南；G辽宁1；H辽宁2。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用五味子根据中国药典2015年版制备。
本发明实施例所用固相萃取小柱为1mL柱管，材质为PP，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用小柱筛板规格为1mL，材质为PE，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用分子筛TS-1孔径为0.56-0.58nm，硅钛比20-300，BET比表面积(m2/g)≥350，相对结晶度(％)≤95，灼减(5)≤5，优选购自南京吉仓纳米科技有限公司。
本发明实施例所用硅藻土SiO2·nH2O，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用中性Al2O3，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用硅胶mSiO2·nH2O，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用C18，购自上海正亚化工有限公司。
混合五味子对照品溶液母液的制备方法具体步骤为：分别精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素对照品各1mg混合，用甲醇溶解定容，置1mL容量瓶中，制成上述各种对照品终浓度均为1mg/mL的混合五味子对照品混合溶液母液。
实施例1吸附剂的选择
称取5份五味子药材粉末(产地辽宁)各25mg分别加入5组研钵中，并称取不同种类的吸附剂(分子筛TS-1、硅藻土、中性Al2O3、硅胶以及C18)各50mg，分别加入5组研钵中与五味子药材粉末研磨150s。取5支1mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取0.5mL甲醇，注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上清液即为木脂素类有效成分提取液(生药量为50mg/ml)，按微乳液：提取液＝4:1(v/v)稀释提取液，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE，Agilent 7100，毛细管柱：未涂层石英毛细管(56cm×50μm,i.d.,河北永年锐丰色谱器件有限公司)检测分析。
微乳液(10mL)组成：0.6％(w/v)SDS、5％(v/v)正丁醇、0.5％(v/v)乙酸乙酯、10％(v/v)乙腈，溶剂为pH 9.0、10mmol/L硼砂缓冲液，在600w的条件下超声30min后形成微乳液，采用毛细管电泳仪压力进样：50mbar，5s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长205nm。实验结果如下表1，表1中的数据为峰面积(单位：mAu·s)。
表1不同吸附剂提取的木脂素类有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表五味子醇甲、2代表五味子醇乙、3代表五味子酯甲、4代表五味子甲素、5代表五味子乙素。
不同种类吸附剂的固相萃取效果柱状图如图3所示。结果显示，分子筛的富集效果最优，可能的原因是，相对其他种类的吸附剂，分子筛其性能优异的内部结构——多孔通道，使得能够更好地吸附五味子中的木脂素类活性成分。
实施例2吸附剂用量的选择
称取5份五味子药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取不同质量(12.5mg、25mg、37.5mg、50mg、75mg)的分子筛TS-1，分别加入5组研钵中与五味子药材粉末研磨150s。取5支1mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取0.5mL甲醇，注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上清液即为木脂素类有效成分提取液(生药量为50mg/ml)，按微乳液：提取液＝4:1(v/v)稀释提取液，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析，同实施例1，实验结果如表2所示。
表2不同吸附剂量提取的木脂素类有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表五味子醇甲、2代表五味子醇乙、3代表五味子酯甲、4代表五味子甲素、5代表五味子乙素。
五味子粉末与分子筛之间不同质量比例，对基质固相分散萃取效果的影响如图4所示。随着分子筛加入量的增大，基质固相分散萃取的效果逐步增大，直到药材和分子筛质量比例为1:2时达到最佳，后随着分子筛加入量的增大，分子筛的效果趋向饱和，并且吸附剂增大会稍微影响洗脱效果，使得更多活性成分残留在分子筛孔道内部，变得难以洗脱，故药材与分子筛质量比1:2是最佳比例。
实施例3研磨时间选择
称取5份五味子药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取5份50mg分子筛TS-1，分别加入5组研钵中与五味子药材粉末研磨不同的时间(90s、150s、180s)。取5支1mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取0.5mL甲醇，注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上清液即为木脂素类有效成分提取液(生药量为50mg/ml)，微乳液：提取液＝4:1(v/v)稀释提取液，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析，同实施例1，实验结果如表3。
表3为不同研磨时间获得的木脂素类有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表五味子醇甲、2代表五味子醇乙、3代表五味子酯甲、4代表五味子甲素、5代表五味子乙素。
不同研磨时间下的基质固相分散萃取效果折线图见图5。结果显示，研磨时间从110s增大到150s，萃取效果变大，可能原因是时间变久能将药材粉末和分子筛更加充分的混匀，使得活性成分更好地被吸附到分子筛中。当时间大于150s之后，基质固相分散萃取的效果就趋于平缓，可能原因是两者混合程度已经在150s处达到饱和，五味子中活性成分已经基本被分子筛完全吸附，再增加研磨时间，不会增加萃取效果，反而稍微下降，因为活性成分被过度吸附到分子筛的孔道中，变得难以洗脱下来。
实施例4不同种类洗脱剂的选择
称取5份五味子药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取5份50mg分子筛TS-1，分别加入5组研钵中与五味子药材粉末研磨150s。取5支1mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取0.5mL不同种类洗脱剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甲醇-乙醇(50:50，v/v)、甲醇-乙腈(50:50，v/v))，分别注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上清液即为木脂素类有效成分提取液(生药量为50mg/ml)，按微乳液：提取液＝4:1(v/v)稀释提取液，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析，同实施例1，实验结果如表4。
表4为不同种类洗脱剂提取的木脂素类有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表五味子醇甲、2代表五味子醇乙、3代表五味子酯甲、4代表五味子甲素、5代表五味子乙素。
不同种类洗脱剂的基质固相分散萃取效果柱状图见图6。结果显示，甲醇的富集效果最优，这与五味子中活性成分的结构有关，五味子中主要包括木脂素类的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等，根据相似相溶原理，极性接近的物质溶解度最佳，综合比较这8类溶剂，甲醇的效果最佳。
实施例5洗脱剂用量的选择
称取5份五味子药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取5份50mg分子筛TS-1，分别加入5组研钵中与五味子药材粉末研磨150s。取5支1mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取不同体积(125μL、250μL、500uL、1000μL)的甲醇，分别注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上清液即为木脂素类有效成分提取液(生药量为50mg/ml)，按微乳液：提取液＝4:1(v/v)稀释提取液，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析，同实施例1，实验结果如表5。
表5不同洗脱剂用量下木脂素类有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表五味子醇甲、2代表五味子醇乙、3代表五味子酯甲、4代表五味子甲素、5代表五味子乙素。
不同体积洗脱剂的基质固相分散萃取效果折现图如图7所示。结果显示，洗脱液体积为125μL和250μL时，未能充分将分子筛中的活性成分洗脱下来，而当体积增大至500μL时，已可将目标物质洗脱完全。
实施例6
将实施例1中微乳液中SDS分别改为胆酸钠、吐温-20、Brij-35。采用分子筛TS-1，其他同实施例1。
不同种类表面活性剂(SDS、胆酸钠、吐温-20、Brij-35)的微乳液电动毛细管色谱分离效果折线图如图8所示，结果显示只有使用SDS时，五种木脂素类化合物才达到了较好的分离效果，所以SDS为较优表面活性剂。
图8中，A、B、C、D分别代表不同表面活性剂的毛细管电泳分离效果图，分别为：A：SDS；B：Brij-35；C：吐温-20；D：胆酸钠。
实施例7
将实施例1微乳液中SDS的浓度分别0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％(w/v)，采用分子筛TS-1，其他操作同实施例1。
不同浓度表面活性剂SDS的微乳液电动毛细管色谱分离效果折线图如图9所示。结果显示，各个组分的迁移时间随着SDS浓度的增加而增加，这主要是因为SDS浓度增加，使缓冲液离子强度增加，电渗流减小，微乳液滴的个数增加，从而使各组分的迁移时间随之延长。但当SDS过低时，微乳液滴的稳定性下降，峰形相对较差，基线不稳。同时，在所试验的SDS浓度范围内，五味子的五种组分之间的分离度基本不改变，即5种成分之间并不能通过改变SDS的浓度实现分离度的提高。最终选择SDS最佳浓度为0.6％。
实施例8
将实施例1微乳液中正丁醇分别改为异丙醇、正丙醇，采用分子筛TS-1，其他操作同实施例1。
不同种类辅助表面活性剂(正丁醇、异丙醇、正丙醇)的微乳液电动毛细管色谱分离效果叠加图如图10所示，结果显示，正丁醇为最佳辅助表面活性剂。
图中，A、B、C分别代表不同辅助表面活性剂的毛细管电泳分离效果图，分别为：A：正丙醇；B：异丙醇；C：正丁醇。
实施例9
将实施例1微乳液中正丁醇体积浓度分别改为1％、2％、3％、4％、5％(v/v)，采用分子筛TS-1，其他操作同实施例1。
不同浓度辅助表面活性剂正丁醇的微乳液电动毛细管色谱分离效果折线图如图11所示，结果显示，5种成分中五味子醇甲迁移时间随着正丁醇浓度的增加而减少，五味子醇乙基本稳定，而五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素迁移时间都有明显的增加。整体来看，随着正丁醇浓度增加，迁移时间窗口增大，分离度也逐渐增加。但正丁醇浓度过高会降低微乳体系的稳定性，产生破乳。考虑到迁移时间以及微乳液体系的稳定性和对实际样品的分离情况，综合考虑最终选定正丁醇浓度为5％。
实施例10
将实施例1微乳液中乙腈体积浓度分别改为0％、6％、8％、10％、12％、14％(v/v)，采用分子筛TS-1，其他操作同实施例1。
不同浓度有机添加剂乙腈的微乳电动毛细管色谱分离效果折线图如图12所示，结果显示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素随着乙腈浓度的增大迁移时间减小，五味子甲素和五味子乙素迁移时间先增后减，同时两组分的分离度也逐渐增大。当缓冲溶液中乙腈的浓度达到10％(v/v)时，迁移时间窗口最窄且各组分分离度较好。因此，实验选择了在最短时间内各组分彼此都能得到有效分离的乙腈含量10％作为缓冲液体系中乙腈的添加量。
实施例11
将实施例1中提取液改为五味子标准品混合液进行毛细管电泳分析，采用分子筛TS-1，其他操作同实施例1，获得标准品混合液的电泳图谱，结果见图13所示。
结果显明，5种有效成分之间分离度均>1.5，且在20min以内全部出峰。确定了该检测条件的可实施性。
实施例12
1、参照实施例1操作，将实施例1中五味子改为8个不同产地(辽宁、磐安、河南、陕西、安徽、山西、山东、延边)，获得不同样品的色谱图，如图14所示，结果显明，8种不同产地五味子中五种木脂素类成分在总量上没有显著差异，只是在各成分含有量构成上有所不同，这一研究更好地为控制五味子药材的内在质量提供了科学依据。
2、标准曲线的制定：
分别精密称取五味子醇甲对照品1.21mg、五味子醇乙对照品0.50mg、五味子酯甲对照品0.22mg、五味子甲素对照品0.62mg和五味子乙素对照品1.02mg，混合后用甲醇溶解并定容至5mL，配制成含五味子醇甲0.242mg/mL、五味子醇乙0.100mg/mL、五味子酯甲0.044mg/mL、五味子甲素0.124mg/mL、五味子乙素0.204mg/mL的混合对照溶液母液，备用。分别精密量取混合对照溶液母液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9μL于1mL容量瓶，用微乳液(组成同实施例1)定容至刻度，分别制成混合对照溶液试样。在实施例1检测条件下，对上述混合对照溶液试样进行毛细管电泳分析。以混合对照品溶液试样中各个单一对照品进样浓度为横坐标，以色谱图中各个单一对照品各自对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的标准曲线、线性相关系数、线性范围和检测限如下表6：
表6各成分制标准曲线方程
3、重复性考察
称取五味子过筛粉末25mg，分子筛TS-1为50mg，加入研钵中研磨150s，取1mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部再加入筛板。取0.5mL甲醇，注入萃取柱内，对萃取柱进行洗脱。底部用1.5mL离心管收集。洗脱结束后取洗脱液200μL和微乳液(组成同实施例1)800μL于离心管内混合均匀，13000rpm离心5min。按照上述方法平行制样6个，分别取上层清夜装样，在实施例1检测条件下考察其重复性，结果见表7。
表7木脂素类各个组分保留时间及峰面积(单位mAu·s)的相对标准偏差(±RSD)
4、精密度试验
取步骤2的混合对照溶液母液900μL，用微乳液(组成同实施例1)定容于至1mL容量瓶，在一天内连续进样5次，记录其保留时间和峰面积，考察日内精密度，结果见表8。
表8木脂素类各个组分保留时间及峰面积(单位mAu·s)的相对标准偏差(±RSD)
5、稳定性考察
称取五味子过筛粉末25mg，分子筛TS-1为50mg，加入研钵中研磨150s，取1mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部再加入筛板。取0.5mL甲醇，注入萃取柱内，对萃取柱进行洗脱。底部用1.5mL离心管收集。洗脱结束后取洗脱液200μL和微乳液(组成同实施例1)800μL于离心管内混合均匀，13000rpm离心5min，得到五味子供试品溶液，室温放置0、4、8、12、24h后，在实施例1检测条件下进行CE分析，测定5种木脂素的峰面积。结果显示：五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素在不同时间峰面积的RSD分别为7.25％、6.04％、8.91％、12.52％、3.26％，结果见表9。
表9木脂素类各个组分保留时间及峰面积(单位mAu·s)的相对标准偏差(±RSD)
6、加样回收率考察
称取五味子药材粉末25mg与50mg分子筛TS-1，平行做6组，均加入甲醇配制的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素终浓度分别为0.79mg/mL、0.12mg/mL、0.0584mg/mL、0.0996mg/mL、0.60mg/mL的对照品混合溶液100μL，6组均加入研钵中混合研磨150s。取1支1mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取0.5mL甲醇进行洗脱，取200μL洗脱液并用微乳液(组成同实施例1)定容至1mL，以13000rpm离心5min，经过0.22μm滤膜过滤，用毛细管电泳仪采样分析。
在实施例1检测条件下，获得加标五味子对照品提取液的色谱图；根据色谱图和标准曲线方程，计算得到五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的加标回收率及其相对标准偏差，结果见表10。
表10加样回收率考察结果(n＝6)
表11.不同产地五味子中木脂素类有效成含量测定实验结果(mg/g五味子)
-表示含量太低不能定量
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，所述木脂素类有效成分为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素，其特征在于所述方法为：(1)提取：将五味子与吸附剂混合，粉碎，获得五味子混合粉末，将五味子混合粉末用固相萃取柱进行洗脱，加入洗脱剂，收集流出液，离心，取上清液即为五味子提取液；所述吸附剂为下列之一：分子筛TS-1、硅藻土、中性Al2O3、硅胶或C18；所述洗脱剂为下列一种或两种的混合：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯；(2)标准曲线：将五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品用无水甲醇配制成混合对照品溶液母液，将混合对照品溶液母液用微乳液a梯度稀释成若干份混合对照品溶液试样，通过微乳液电动毛细管色谱法进行检测，获得混合对照品色谱图，以混合对照品溶液试样中各个单一对照品进样浓度为横坐标，以色谱图中各个单一对照品各自对应的峰面积为纵坐标，制备标准曲线；所述微乳液a体积终浓度组成为：表面活性剂0.2-1.2％、辅助表面活性剂1～6％、油相0.5～1％、有机添加剂0％～14％，溶剂为pH 9、5～30mmol/L硼砂缓冲液；所述表面活性剂为下列之一：十二烷基硫酸钠、胆酸钠、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯或月桂醇聚氧乙烯醚；所述辅助表面活性剂为下列之一：正丁醇、异丙醇或正丙醇；所述油相为乙酸乙酯，所述有机添加剂为乙腈；所述混合对照品溶液母液中五味子醇甲终浓度0.04-1.0mg/mL、五味子醇乙终浓度0.02-0.5mg/mL、五味子酯甲终浓度0.01-0.2mg/mL、五味子甲素终浓度0.02-0.5mg/mL、五味子乙素终浓度0.04-1.0mg/mL；(3)检测：将步骤(1)五味子提取液与微乳液b混合，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测，获得待测样品色谱图，根据待测样品色谱图中木脂素类有效成分对应的峰面积及标准曲线，获得待测样品中木脂素类有效成分的含量；所述微乳液b组成同微乳液a；所述微乳液b与五味子提取液体积比为1-10:1。
2.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(1)所述五味子与吸附剂质量比为1:0.5～3。
3.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(1)所述吸附剂为分子筛TS-1，所述洗脱剂为甲醇。
4.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(1)所述研磨采用研钵研磨90～180s。
5.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(1)所述洗脱剂为下列之一：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、体积比1:1的甲醇-乙醇混合液或体积比1:1的甲醇-乙腈混合液，所述洗脱剂的用量为1/2个柱体积。
6.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(1)所述固相萃取柱底部放置筛板，同时在添加五味子混合粉末后用另一块筛板将粉末压实；洗脱剂采用加压加入的方式进行洗脱。
7.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(2)所述微乳液电动毛细管色谱法运行电压为20～25kv，检测温度为15～30℃，进样条件：50mbar，5s，检测波长205nm。
8.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(2)所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述辅助表面活性剂为正丁醇。
9.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(2)所述微乳液体积终浓度组成为：十二烷基硫酸钠0.006g/L、正丁醇5％、乙酸乙酯0.5％、乙腈10％，溶剂为pH9、10mmol/L硼砂缓冲液。
10.如权利要求1所述五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，其特征在于步骤(3)所述微乳液b与五味子提取液体积比为4:1。
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