CN101629937B - 土壤中五氯苯酚的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土壤中五氯苯酚的定量检测方法，属于化合物分析检测领域。本发明方法包括下列步骤：a)调节待测土壤样品的pH值，使五氯苯酚以分子形式析出；b)向所述样品中加入萃取剂和正己烷，将五氯苯酚浸提到萃取剂中；c)向萃取液中加入吸附剂，净化萃取液；d)通过液相色谱检测所述萃取液中的五氯苯酚。本方法可用于作为标准方法定量检测土壤中的五氯苯酚含量，具有快速、简单、通用性好、毒性小、操作简单、重现性好、检出限低等特点。

Description

土壤中五氯苯酚的定量检测方法

技术领域

本发明涉及五氯苯酚，尤其涉及土壤中五氯苯酚的定量检测方法。该方法将振荡超声与QuEChERS技术相结合，快速准确地对五氯苯酚进行定量检测，属于化合物分析检测领域。

背景技术

五氯苯酚(pentachlorophenol，PCP)是一种有毒的难降解有机化合物，它是由苯酚苯环上的五个氢原子被五个氯原子所取代而形成的。五氯苯酚作为有机氯农药广泛地用作杀菌剂、杀螺剂、杀藻剂、杀虫剂和除草剂，以及木材防腐剂。由于它在环境中的持久难降解性，以及对人体健康的潜在威胁，已被美国国家环保局(US EPA)、欧洲委员会(EuropeanCommission)、中国环境监测总站和日本环境署列入环境治理优先控制重点污染物名单，并禁止继续使用。

毒理学研究表明，PCP能使细胞膜对质子的通透性增加，阻断氧化磷酸化作用，从而导致跨膜pH值和电势的丧失(DANIEL V.Association of elevated blood levels ofPentachlorophenol with cellular and humoral immunodeficiencies[J].Arehives of environmentalhealth.2001，56(1)：77-83)。哺乳动物的皮肤对PCP有吸收作用，能从土壤等环境介质中直接吸收PCP，PCP能使皮肤腐蚀，引起灼伤和水泡。PCP具有“致癌、致畸、致突变”作用，在生物体内能够蓄积，有很强的生物稳定性，其危害性也会更强、更持久。另外，PCP对土壤和沉积物有很强的吸附性，用含有PCP的水源灌溉农作物会影响产品质量危害人体健康同时还会对土壤生物有直接毒害作用，进而可以间接地影响土壤的pH值和有机土层中水中PCP的含量，从而改变土壤的生态环境，影响土壤生物的正常环境功能。

环境样品中PCP的常用萃取方法有液液提取法、柱提取法以及索氏提取等，这些技术虽然非常有效，但大都存在着操作复杂、耗时等缺点。而固相微萃取技术、超临界流体萃取技术和加速溶剂提取技术在一定程度上克服了这些缺点，但因为PCP的极性较高，而且仪器投资费用昂贵，使得这些新技术的应用还存在一定的限制。

在众多的分析方法中，虽然气相色谱以其高效、高选择性等特点被广泛应用于有机氯的分析(李梦耀，杨婧晖，钱会.五氯苯酚测定方法研究进展[J].分析测试技术与仪器，2007，13(4)：285-290.)。但是，五氯苯酚的极性高、蒸汽压低使得采用气相色谱测定还存在一定的制约性，一些监测方法以及水标准中五氯苯酚的测定方法大都是采用衍生化气相色谱测定的(张红雨，张杰，黄秀华.固相微萃取/GC直接测定废水中的三种氯酚.分析科学学报，2002，18(5)：421-423；王欣，方瑞斌，朱熔刚.SPME联用GC/ECD测定饮用水中氯酚.云南化工，2001，28(3)：23-25；黄秀华，孙郁莉.气相色谱法测定水中酚类化合物.中国给水排水，2000，16(3)：52-53)。衍生化过程复杂，并且耗费试剂多且毒性大。高效液相色谱法具有分离效能高，分析速度快，操作简易，特别适用于高沸点、热稳定性差、强极性物质的分析(李梦耀，杨婧晖，钱会.五氯苯酚测定方法研究进展[J].分析测试技术与仪器，2007，13(4)：285-290)。将该分析技术用于土壤中PCP的分析具有快捷、准确、操作简单等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单快速、操作方便、灵敏度高，通用性强，适于各种土壤类型中PCP的定量检测方法。它包括如下步骤，图1给出了流程简图：

a)调节待测土壤样品的pH值，使五氯苯酚以分子形式析出；

b)向所述样品中加入萃取剂和正己烷，使用超声振荡提取方法将五氯苯酚浸提到萃取剂中；

c)向萃取液中加入选定的吸附剂，净化萃取液；

d)通过液相色谱检测所述萃取液中的五氯苯酚。

本方法是在液液萃取的基础上发展起来的，并与QuEChERS(基质分散固相萃取，参见Anastassiades M.，Lehotay S.J.，Stajnbaher D.，et al.Fast and easy multiresidue methodemploying acetonitrile extraction/partitioning and″dispersive solid-phase extraction″for thedetermination ofpesticide residues in produce[J].JAOAC International，2003，86(2)：412-431.)的净化技术(其核心在于吸附剂对萃取液的净化)相结合，充分利用了两个方法的优点，既保证了液液萃取方法的提取效果的稳定性，又利用快捷、简单的净化技术将实验浸提过程中提出的干扰物质去除，保证了样品测定的准确性。

该步骤中主要包括以下几个技术要点：

第一，五氯苯酚的P_Ka值是4.93，当土壤溶液pH大于4.93时，土壤中的五氯苯酚一部分是以离子态存在的，降低浸提溶液的pH值至4.93以下，可以使得五氯苯酚以分子态形式析出，提高其在有机溶剂中的分配效率；

第二，首次将超声振荡提取方法与QuEChERS技术结合起来，保证了测定样品的稳定、干净、快捷；

第三，加入正己烷后浸提液自动分为三层，一些土壤中的杂质物质自动沉淀为底层，这一步就去除了很多的干扰物质；

第四，该方法采用液相色谱上机测定，因此省去了气相色谱操作过程中的衍生化过程，操作更加简单，并且毒性小，所用试剂少，时间短，样品测定结果的重现性好。

本发明在研究过程中比较了不同硫酸用量对样品提取效果的影响，结果显示添加2.0mL(6mol/L)H₂SO₄(土壤样品质量为2g)处理后测定样品的加标回收率最符合要求并且稳定，可达75％以上，见表1。这样的酸用量可以将土壤pH值调节到1-3之间，有利于PCP的析出。加入过量的酸不但不会提高样品的回收效果，反而增加后续处理的步骤，影响测定结果。

表1不同体积6mol/L H₂SO₄添加后的回收率

考虑到提取方式可能会对测定结果的影响，在比较了三种单独的提取方式：单振荡30min、40℃单超声60min、振荡30min加40℃超声60min后，利用高(50mg/kg)、中(25mg/kg)、低(10mg/kg)三个不同浓度土壤样品进行验证，结果显示振荡30min加40℃超声60min提取的回收率一直在75％-120％之间，稳定且满足回收率要求。

正己烷的加入是本发明的一个亮点。在液液萃取过程中，往往会同时将土壤中的色素以及其他物质一起浸提出来，再进入液相色谱测定时不但对测定结果产生影响，而且会污染整个测定系统。本发明通过加入正己烷成功的将萃取液分成三层，中间的乙腈层是想要的萃取层，底层为一层粘稠物质同时含有大量的色素。由于正己烷比乙腈相密度低，且两者互不相溶，因此最上层就是正己烷层。将最上层上机测定后，没有检测出目标化合物PCP。因此，正己烷的加入使得整个萃取液分层同时完成萃取液的初步净化，去除了大部分色素干扰。

如果不加入正己烷，则浸提液不分层，色素物质都被保留在乙腈相中，液相色谱上机测定时，色素峰明显，导致最终的检测结果存在较大偏差，无法使用。

经液液萃取的样品虽然经完成了初步净化步骤，但仍存在很多的干扰峰。QuEChERS法常用的吸附剂有：PSA、ODSC₁₈、石墨化碳黑(Pesticarb)和弗罗里硅土(Florisil)。PSA能够有效去除脂肪酸，但对色素、甾醇和维生素去除效果一般，而ODSC₁₈和石墨化碳黑(Pesticarb)去除维生素、色素和甾醇的能力很强。弗罗里硅土(Florisil)是固相微萃取小柱的常用材料，对色素也有很好的去除作用。利用这几种吸附剂组合比较后，认为ODSC₁₈加无水硫酸镁是最佳的选择。

ODSC₁₈和无水硫酸镁能够很好地吸附五氯苯酚提取过程中产生的杂质。为了进一步确认ODSC₁₈、无水硫酸镁、净化离心转速是否会对结果产生影响，设计了正交试验。综合考虑三个因素后分为四组，回收率见表2。从结果可以看出，离心转速对回收率影响很小，因此选用的离心条件为9000r/mim，5min。ODSC₁₈和无水硫酸镁用量是回收率的主要影响因素，初步认为，ODSC₁₈用量增加后会使得回收率降低，但肯定也与ODSC₁₈和无水硫酸镁用量比有关。

表2正交试验回收率

根据正交试验的初步结果，选用ODSC₁₈的两个用量水平，分别为20mg和40mg，进一步确定无水硫酸镁与ODSC₁₈质量比值(质量比)为3.75、5、7.5、10、15时，对样品的回收率的影响，结果比较见图2。

从图2显示的结果可以明显看出，无论土壤中PCP浓度为10mg/kg还是25mg/kg，回收率的变化趋势一致，都是当无水硫酸镁与ODSC₁₈用量比值为10时，测定样品的回收率最高，再增加两者用量的比值回收率反而降低。不同ODSC₁₈的两个用量水平会对回收率产生影响，根据本实验的结果选用20mg ODSC₁₈+200mg无水硫酸镁时，测定结果回收率高且稳定，重复性好，因此认为该条件为最佳。

本发明适用于土壤中PCP的定量测定。操作简单、方便、快速、毒性小，弥补了土壤中PCP测定没有标准方法的空缺。该方法通用性强，可以测定各种类型的土壤样品，并且保证测定样品定量的准确性。只要首先将土壤样品的pH值调节到合适的范围，按照步骤顺序操作就可以准确测定。

和现有技术相比，本方法的有益效果在于：

一是利用该方法提取样品后上机测定干扰少，回收率稳定，测定结果定量准确；二是该方法的重现性好，灵敏度高，方法的最低检出限为1.413mg/kg；三是方法所涉及的仪器都是常规仪器，通用性好，所用试剂常见且用量少，省钱、省时、省力。这使得本方法可以被许多检测机构及相应部门直接使用，作为检测土壤中PCP的手段。

综上所述，本方法具有快速、简单、通用性好、毒性小、操作简单、重现性好、检出限低等特点。可以进一步作为土壤中PCP测定的标准方法被广泛采用。

附图说明

图1表示本发明方法流程简图。

图2表示无水硫酸镁与ODSC₁₈不同用量比值时样品的回收率，其中图2A：测定样品浓度为10mg/kg；图2B：测定样品浓度为25mg/kg。

具体实施方法

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：土壤中PCP的萃取和净化

1)PCP的萃取

准确称取土壤样品2.0g置于30mL离心管中，加入2mL浓度为6mol/L的硫酸，加入10mL乙腈在旋涡混合仪上振荡混匀，再加入2mL正己烷，振荡混匀。摇床上振荡30min，40℃超声1h，5000r/min离心5min，待净化。

2)提取液的净化

称取20mg ODSC₁₈、200mg无水硫酸镁置于15mL离心管，旋涡混匀。取待净化的提取液2mL，加入混匀的净化体系中，在旋涡仪上混合2min，9000r/min离心5min。取1mL上清液过0.45μm滤膜，供上机测定。

实施例2：本发明的高效液相色谱(HPLC)条件及工作曲线的选择

以德国DR.Ehrenstorfer公司的色谱标准物质配制标准溶液，分别配制成甲醇标准系列和基质标准系列。用HPLC进行测定。

1)HPLC测定条件

色谱柱：Aglient 5m SB-C₁₈反相柱，4.6×250mm；

流动相：85％甲醇+15％含0.1％冰醋酸的水，采用等度洗脱10min。流速为1.0mL/min；

进样量：进样量10L；

柱温：35℃；

检测器：紫外检测器(DAD)，检测波长225nm。

2)工作曲线的选择

基质溶液是由土壤经上述前处理方法制备而得。分别用甲醇和基质溶液配制标准浓度为0.0500mg/L、0.100mg/L、0.200mg/L、0.500mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、5.00mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L的PCP标准系列上机测定。计算五氯苯酚的浓度(x)与色谱峰面积(y)之间的关系，建立回归方程，得到两组标准曲线：y＝6.93x+1.21，R＝0.9994，R²＝0.9991和y＝7.53x+1.28，R＝0.9995，R²＝0.9991。比较两组标准曲线，可以认为基质中的干扰因素对标准曲线定量影响很小。由于基质配制的标准曲线能够将前处理过程中的干扰因素排除，因此在对样品进行定量分析时，采用基质标准曲线定量结果更准确。

实施例3：本发明检测方法的最低检出限及线性范围

用基质溶液配制标准浓度为0.0500mg/L、0.100mg/L、0.200mg/L、0.500mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、5.00mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L的PCP标准系列上机测定。得到标准曲线y＝7.53x+1.28，R＝0.9995，R²＝0.9991，线性范围为0.1-20mg/L。

按照优化的前处理和仪器上机条件，连续测定7个相同低浓度加标样品，利用公式MDL＝S×t_{(n-1，1-a＝0.99)}，计算方法的检出限。其中MDL为方法检出限，t为置信度取99％、自由度为为n-1时的值，S为n次加标测定浓度的标准偏差。经过查表和计算得到，S＝0.45g/g，t＝3.14，n＝7，代入得到MDL＝1.413mg/kg。美国EPASW-846中规定4MDL为定量下限(RQL)，该方法的定量下限为

实施例4：本发明方法的回收率测定

以杭州水稻土为基体，加入PCP标准品，使得土壤中的PCP的最终浓度为0mg/kg、10.0mg/kg、25.0mg/kg和50.0mg/kg，然后按实施1中的提取和净化过程得到PCP，按照实施2中的测定条件进行上机测定。每个点作7个平行，结果见表3。

表3回收率测定结果

相对标准偏差表示测量的精密度，用多次测量后的标准差与测量平均值的比值百分数表示。该方法的回收率稳定，且保持在75％～120％，符合农药残留的检测要求。

Claims (6)

1.一种土壤中五氯苯酚的定量检测方法，包括下列步骤：

a)用H₂SO₄调节待测土壤样品的pH值直到小于4.93，使五氯苯酚以分子形式析出；

b)向所述样品中加入正己烷和萃取剂乙腈，通过超声振荡提取方法将五氯苯酚浸提到乙腈中；

c)向萃取液中加入吸附剂，净化萃取液；其中吸附剂是ODSC₁₈和无水硫酸镁的混合物；

d)通过液相色谱检测所述萃取液中的五氯苯酚，其中检测所用的流动相为85％甲醇+15％含0.1％冰醋酸的水，柱温为35℃，检测器为紫外检测器。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述pH值在1-3之间。

3.如权利要求1或2任意一项所述的检测方法，其特征在于，步骤a通过浓度为6mol/L的H₂SO₄调节待测土壤样品的pH值。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超声振荡提取方法为：振荡30分钟后在40℃超声60分钟。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述ODSC₁₈和无水硫酸镁的质量比为10∶1。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤d通过液相色谱进行检测前，用0.45μm的滤膜过滤所述萃取液，取滤液进行所述检测。

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